CN118259022A - 一种样本检测方法及试剂卡 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种样本检测方法及试剂卡，检测方法包括以下步骤：将样本释放剂与待测样本混合，形成含有游离25‑羟基维生素D的反应液；将反应液中游离25‑羟基维生素D与过量荧光标记的25‑羟基维生素D单克隆抗体进行免疫反应；通过25‑羟基维生素D抗原检测过量反应后剩余的荧光标记的25‑羟基维生素D单克隆抗体；根据剩余的荧光标记的25‑羟基维生素D单克隆抗体推算得到待测样本中25‑羟基维生素D的含量。本发明通过解离与预反应结合的方式，让从结合蛋白上解离下来的25‑羟基维生素D可以在液相中充分与标记的25‑羟基维生素D单克隆抗体结合，在免疫层析平台上实现更准确的检测。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断领域，具体涉及一种样本检测方法及试剂卡。
背景技术
维生素D是一种脂溶性类固醇激素前体，主要由皮肤经光照后产生，本身无生物活性。在人体内，维生素D3和维生素D2与血浆中维生素D结合蛋白结合，并转运到肝脏，两者经羟基化成为25-羟基维生素D。25-羟基维生素D是在血中被检测的代谢物，由于它是人体内维生素D的主要储存形式，通过检测它可以确定总维生素D的情况。
维生素D是维持骨骼健康的主要元素，维生素D缺乏与糖尿病、不同种类的心血管疾病、自身免疫性疾病和先天性免疫性疾病有关。25-羟基维生素D含量与骨密度低有关，与其他临床资料结合，检测结果有助于判定骨代谢。目前临床实验室常用的检测方法有荧光免疫层析、微流控免疫荧光法、酶联免疫法及化学发光法等。
由于25-羟基维生素D主要与结合蛋白结合且分子量小，游离的25-羟基维生素D只占据非常小的一部分，常规的免疫层析方法无法充分的检验样本中的25-羟基维生素D的含量，而微流控免疫荧光法、酶联免疫法及化学发光法又存在成本高，操作难度大，检测时间长，仪器设备要求高等问题，无法满足基层医学检验的需求。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种样本检测方法及试剂卡，以解决现有技术中存在的25-羟基维生素D含量检测不充分的问题。
为解决上述问题，本发明采取如下的解决方案：
一种样本检测方法，包括以下步骤：
将样本释放剂与待测样本混合，形成含有游离25-羟基维生素D的反应液；
将反应液中游离25-羟基维生素D与过量荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体进行免疫反应；
通过25-羟基维生素D抗原检测过量反应后剩余的荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体；
根据剩余的荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体推算得到待测样本中25-羟基维生素D的含量。
一种样本检测试剂卡，包括上壳体和下壳体；所述上壳体和下壳体之间固定有检测试纸条；所述检测试纸条包括NC膜；所述NC膜的两端分别设置有样品垫和吸水纸；所述NC膜上包被有25-羟基维生素D-BSA抗原；所述上壳体上还设置有加样孔和混匀槽；所述加样孔与样品垫对应；所述混匀槽内添加有荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体。
进一步的，所述25-羟基维生素D单克隆抗体在混匀槽内的添加过程如下：
对羧基荧光微球进行活化；
将25-羟基维生素D单克隆抗体偶联至活化后的羧基荧光微球，得到荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体；
将荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体通过胶乳缓冲液复溶后点样至混匀槽中。
进一步的，所述羧基荧光微球的直径为200-300nm；所述羧基荧光微球进行活化使用的溶剂为EDC溶液和NHS溶液；所述EDC溶液和NHS溶液的浓度均为5-15mg/mL；所述羧基荧光微球与25-羟基维生素D单克隆抗体的体积质量比为1:1-3mL/mg。
进一步的，所述羧基荧光微球与EDC溶液、NHS溶液的体积比均为10-40：1。
进一步的，所述25-羟基维生素D-BSA抗原的包被过程包括：
通过缓冲液将25-羟基维生素D-BSA配置成1.0-1.5mg/mL的溶液，在NC膜上以0.5-1.0ul/cm的量包被T线。
进一步的，所述NC膜上还包被有抗鼠IgG。
进一步的，所述抗鼠IgG的包被过程包括：将抗鼠IgG配制成1.0-1.5 mg/mL的溶液，在NC膜上以0.5-1.0ul/cm的量包被C线。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明将样本释放剂与待测样本混合进行预反应，通过样本释放剂的作用将血液中与结合蛋白相结合的25-羟基维生素D解离出来，形成游离的25-羟基维生素D，再利用过量的25-羟基维生素D的特异性标记抗体与解离出的游离25-羟基维生素D充分反应，然后将剩余的荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体通过25-羟基维生素D抗原-BSA结合检测，根据剩余的荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体的检测推算得到待测样本中25-羟基维生素D的含量；本发明将解离与预反应结合，让而从结合蛋白上解离下来的25-OH-VD可以在液相中充分与标记的25-羟基维生素D单克隆抗体结合，实现在免疫层析平台上实现更准确的检测。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种样本检测试剂卡，包括上壳体和下壳体；上壳体和下壳体之间固定有检测试纸条；检测试纸条包括NC膜；NC膜的两端分别设置有样品垫和吸水纸；NC膜上包被有25-羟基维生素D-BSA抗原的T线和抗鼠IgG的C线；上壳体上设置有与样品垫对应的加样孔。
上壳体上还设置有混匀槽；混匀槽内设置有干燥过的荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体。
荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体的制备过程包括：
对羧基荧光微球进行活化；
将25-羟基维生素D单克隆抗体偶联至活化后的羧基荧光微球，得到荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体。
荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体通过胶乳缓冲液复溶后点样至混匀槽中，得到荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体的混匀槽。
其中，羧基荧光微球的直径为200-300nm；羧基荧光微球活化使用的溶剂为EDC溶液和NHS溶液，EDC溶液和NHS溶液的浓度均为5-15mg/mL；羧基荧光微球与EDC溶液、NHS溶液的体积比均为10-40：1；羧基荧光微球与25-羟基维生素D单克隆抗体的体积质量比为1:1-3mL/mg。
NC膜抗原的包被过程为：
使用0.02M Ph 7.0 磷酸盐缓冲液将25-羟基维生素D-BSA配置成1.0-1.5mg/mL的溶液，在NC膜上用喷金划膜仪以0.5-1.0ul/cm的量包被T线；另将抗鼠IgG配制成1.0-1.5mg/mL的溶液，在NC膜上用喷金划膜仪以0.5-1.0ul/cm的量包被C线，划线后将NC膜置干燥间干燥4-6h。制备成包被25-羟基维生素D抗原-BSA的T线和抗鼠IgG的C线的NC膜。
本发明还公布了一种样本的检测方法，包括以下步骤：
将样本释放剂与待测样本混合，形成含有游离25-羟基维生素D的反应液；
将反应液中游离25-羟基维生素D与过量荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体进行免疫反应；
通过25-羟基维生素D抗原检测过量反应后剩余的荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体；
根据剩余的荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体推算得到待测样本中25-羟基维生素D的含量。
本发明使用的样本释放剂均为常规现有技术，这里不做过多介绍。
将样本释放剂与一定量的待测血液样本混合进行预反应，通过样本释放剂的作用将血液中与结合蛋白相结合的25-羟基维生素D解离出来，形成游离的25-羟基维生素D。再利用25-羟基维生素D的特异性标记抗体与解离出的游离25-羟基维生素D充分反应。然后在NC膜上层析，在遇到包被抗原时，剩余的荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体与检测线包被的25-羟基维生素D抗原-BSA结合，检测线形成25-羟基维生素D抗原-BSA/荧光标记25-羟基维生素D抗体复合物。在一定条件下，T线的强弱和样品中浓度呈负相关。采用荧光免疫层析分析仪可以实现定量检测。
实施例1
一种样本检测试剂卡，包括上壳体和下壳体；上壳体上依次形成有混匀槽、加样孔和观察窗；上壳体和下壳体通过突起与插孔柱插接结合；上壳体和下壳体之间设置有检测试纸条；检测试纸条包括NC膜；NC膜的两端分别设置有样品垫和吸水纸；上壳体上的加样孔与样品垫对应。NC膜上包被有25-羟基维生素D-BSA抗原的T线和抗鼠IgG的C线。
上壳体上还设置有中心滴有干燥过的荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体的混匀槽。
其中，荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体的混匀槽制备过程为：
直径为200-300nm的羧基荧光微球0.4mL，分别使用0.02mL 10mg/mL的EDC溶液和0.02mL 10mg/mL的NHS溶液进行活化，加入0.8mg 25-羟基维生素D单克隆抗体，摇床反应30min，离心弃上清。加入终浓度为1%牛血清白蛋白封闭30min，离心弃上清，使用胶乳缓冲液复溶至0.4mL。制备好的胶乳使用胶乳缓冲液稀释后按2ul/个的比例点样在试剂壳混匀槽中心，再置干燥间干燥30min，制成中心滴有干燥过的荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体的混匀槽。
2、NC膜上抗原的包被过程为：
使用0.02M Ph 7.0 磷酸盐缓冲液将25-羟基维生素D-BSA配置成1.0-1.5mg/mL的溶液，在NC膜上用喷金划膜仪以0.5-1.0ul/cm的量包被T线；另将抗鼠IgG配制成1.0-1.5mg/mL的溶液，在NC膜上用喷金划膜仪以0.5-1.0ul/cm的量包被C线，划线后将NC膜置干燥间干燥4-6h。制备成包被25-羟基维生素D抗原-BSA的T线和抗鼠IgG的C线的NC膜。
在相对湿度20-26%的条件下，将PVC底板，已包被的NC膜，样品垫，吸水纸一一组装。组装好的大板切成4mmm宽度的检测试纸条组装至含有混匀槽的试剂壳中。
实施例2
一种样本荧光定量免疫层析检测试剂卡，包括依次形成有混匀槽、加样孔和观察窗的试剂壳，壳体底部有反应混匀槽与试剂条卡槽，壳盖底面形成的插突起与壳体的插孔柱插接结合；以及沿检测试纸条卡槽平铺的检测试纸条，检测试纸条的PVC底板两端分别设置的样品垫和吸水纸，中心滴有干燥过的荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体的混匀槽，分别包被有25-羟基维生素D-BSA抗原的T线和抗鼠IgG的C线的NC膜。
其中，荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体的混匀槽制备过程为：
直径为200-300nm的羧基荧光微球0.4mL，分别使用0.01mL 5mg/mL的EDC溶液和0.01mL 5mg/mL的NHS溶液进行活化，加入0.4mg 25-羟基维生素D单克隆抗体，摇床反应30min，离心弃上清。加入终浓度为1%牛血清白蛋白封闭30min，离心弃上清，使用胶乳缓冲液复溶至0.4mL。制备好的胶乳使用胶乳缓冲液稀释后按2ul/个的比例点样在试剂壳混匀槽中心，再置干燥间干燥30min，制成中心滴有干燥过的荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体的混匀槽。
2、所述NC膜抗原的包被过程为：
使用0.02M Ph 7.0 磷酸盐缓冲液将25-羟基维生素D-BSA配置成1.0-1.5mg/mL的溶液，在NC膜上用喷金划膜仪以0.5-1.0ul/cm的量包被T线；另将抗鼠IgG配制成1.0-1.5mg/mL的溶液，在NC膜上用喷金划膜仪以0.5-1.0ul/cm的量包被C线，划线后将NC膜置干燥间干燥4-6h。制备成包被25-羟基维生素D抗原-BSA的T线和抗鼠IgG的C线的NC膜。
在相对湿度20-26%的条件下，将PVC底板，已包被的NC膜，样品垫，吸水纸一一组装。组装好的大板切成4mmm宽度的检测试纸条组装至含有混匀槽的试剂壳中。
实施例3
一种样本荧光定量免疫层析检测试剂卡，包括依次形成有混匀槽、加样孔和观察窗的试剂壳，壳体底部有反应混匀槽与试剂条卡槽，壳盖底面形成的插突起与壳体的插孔柱插接结合；以及沿检测试纸条卡槽平铺的检测试纸条，检测试纸条的PVC底板两端分别设置的样品垫和吸水纸，中心滴有干燥过的荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体的混匀槽，分别包被有25-羟基维生素D-BSA抗原的T线和抗鼠IgG的C线的NC膜。
其中，荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体的混匀槽制备过程为：
直径为200-300nm的羧基荧光微球0.4mL，分别使用0.04mL15mg/mL的EDC溶液和0.04mL 15mg/mL的NHS溶液进行活化，加入1.2mg 25-羟基维生素D单克隆抗体，摇床反应30min，离心弃上清。加入终浓度为1%牛血清白蛋白封闭30min，离心弃上清，使用胶乳缓冲液复溶至0.4mL。制备好的胶乳使用胶乳缓冲液稀释后按2ul/个的比例点样在试剂壳混匀槽中心，再置干燥间干燥30min，制成中心滴有干燥过的荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体的混匀槽。
2、所述NC膜抗原的包被过程为：
使用0.02M Ph 7.0 磷酸盐缓冲液将25-羟基维生素D-BSA配置成1.0-1.5mg/mL的溶液，在NC膜上用喷金划膜仪以0.5-1.0ul/cm的量包被T线；另将抗鼠IgG配制成1.0-1.5mg/mL的溶液，在NC膜上用喷金划膜仪以0.5-1.0ul/cm的量包被C线，划线后将NC膜置干燥间干燥4-6h。制备成包被25-羟基维生素D抗原-BSA的T线和抗鼠IgG的C线的NC膜。
在相对湿度20-26%的条件下，将PVC底板，已包被的NC膜，样品垫，吸水纸一一组装。组装好的大板切成4mmm宽度的检测试纸条组装至含有混匀槽的试剂壳中。
本发明试剂卡检测方法：
1、临床样本：由医院获得，共120份，其中血清、血浆、全血各40份，25-羟基维生素D含量分布区间为5-80ng/mL。
2、检测过程：使用全自动荧光免疫分析仪，首先吸取150ul样本释放剂，再吸取10ul血液样本至中心滴有干燥过的荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体的混匀槽中进行混匀10-15次，结束后去除废弃Tip头，静置10min。10min后吸取65uL混合样本进行加样，待展板完全后进行荧光信号的测试，得到信号值。
5、检测结果：对120例临床样本进行测试，102份在线性范围内的样本检测值与样本靶值偏差均≤20%，15份低于8ng/mL的样本检测结果均低于8ng/mL，3份高于70ng/mL的样本检测结果均高于70ng/mL。R2＞0.99。检测结果表明制备25羟基维生素D荧光定量免疫层析检测试剂卡性能良好，适合用于临床检测，特别是满足了客户对快速现场检测的需要。
本发明能够用于快速定量体外检测人血液中的25羟基维生素D含量，检测范围为8.0-70.0ng/mL，可以辅助诊断人体骨代谢情况以及与之相关的疾病。
本发明可以实现定量检测，相比于传统胶体金免疫层析试剂，荧光检测灵敏度更高，检测范围更宽，相比于普通荧光免疫层析试剂，由于解离及反应的充分性，检测准确度更高，重复性更好。
本发明适合血清，血浆，全血以及末梢血样本，适合临床上单人份检测，配合全自动荧光免疫层析分析仪，具有操作简便、反应快速、特异性强、灵敏度高、检测通量高和经济实用等优点。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种样本检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将样本释放剂与待测样本混合，形成含有游离25-羟基维生素D的反应液；
将反应液中游离25-羟基维生素D与过量荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体进行免疫反应；
通过25-羟基维生素D抗原检测过量反应后剩余的荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体；
根据剩余的荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体推算得到待测样本中25-羟基维生素D的含量。
2.一种样本检测试剂卡，其特征在于，包括上壳体和下壳体；所述上壳体和下壳体之间固定有检测试纸条；所述检测试纸条包括NC膜；所述NC膜的两端分别设置有样品垫和吸水纸；所述NC膜上包被有25-羟基维生素D-BSA抗原；所述上壳体上还设置有加样孔和混匀槽；所述加样孔与样品垫对应；所述混匀槽内添加有荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的一种样本检测试剂卡，其特征在于，所述25-羟基维生素D单克隆抗体在混匀槽内的添加过程如下：
对羧基荧光微球进行活化；
将25-羟基维生素D单克隆抗体偶联至活化后的羧基荧光微球，得到荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体；
将荧光标记的25-羟基维生素D单克隆抗体通过胶乳缓冲液复溶后点样至混匀槽中。
4.根据权利要求3所述的一种样本检测试剂卡，其特征在于，所述羧基荧光微球的直径为200-300nm；所述羧基荧光微球进行活化使用的溶剂为EDC溶液和NHS溶液；所述EDC溶液和NHS溶液的浓度均为5-15mg/mL；所述羧基荧光微球与25-羟基维生素D单克隆抗体的体积质量比为1:1-3mL/mg。
5.根据权利要求4所述的一种样本检测试剂卡，其特征在于，所述羧基荧光微球与EDC溶液、NHS溶液的体积比均为10-40：1。
6.根据权利要求2所述的一种样本检测试剂卡，其特征在于，所述25-羟基维生素D-BSA抗原的包被过程包括：
通过缓冲液将25-羟基维生素D-BSA配置成1.0-1.5mg/mL的溶液，在NC膜上以0.5-1.0ul/cm的量包被T线。
7.根据权利要求2所述的一种样本检测试剂卡，其特征在于，所述NC膜上还包被有抗鼠IgG。
8.根据权利要求7所述的一种样本检测试剂卡，其特征在于，所述抗鼠IgG的包被过程包括：将抗鼠IgG配制成1.0-1.5 mg/mL的溶液，在NC膜上以0.5-1.0ul/cm的量包被C线。
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2022
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