CN118259021A - 一种直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法及系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法及系统，包括：获取反应物和产物信息，对传感器表面进行制备；分别获取总蛋白和疾病标志蛋白的传感器信号；将相应的传感器信号及分子量信息代入比例公式，直接得到疾病标志蛋白占相应总蛋白的比例。为一次性获得多项检测结果提供了便利。该方法具有高灵敏度、高通量、简便操作等优势，可用于医学诊断和治疗监测。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感技术领域，具体为一种直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法及系统。
背景技术
疾病标志物占总待测物的比例是医学上常用的疾病诊断指标。现有的测量方案通常需要多步独立实验分别建立标定总蛋白浓度和待测疾病标志物蛋白的标准曲线，再计算各自浓度，才能获得标志物占总待测物的比例，不仅实验操作繁琐，耗用成本较高，还容易引入更多误差。
现有的检测方法存在一些不足，如：
高效液相色谱法是标准方法，但需要庞大且昂贵的仪器，操作复杂。
酶法通常需要多步独立实验才能分别获得疾病标志蛋白的浓度，实验繁琐，引入更多误差。
其他一些新兴方法如生物传感器、微流控芯片等，虽然具有一定创新性，但大多仍无法实现疾病标志蛋白的直接性联合检测。
总的来说，现有技术还缺乏一种能够直接、准确、高效、原位、低成本的检测疾病标志蛋白占总蛋白比例的简便方法。
发明内容
鉴于上述存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一步检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：包括：
获取反应物和产物信息，对传感器表面进行制备；
分别获取总蛋白和疾病标志蛋白的传感器信号；
将相应的传感器信号及分子量信息代入比例公式，直接得到疾病标志蛋白占相应总蛋白的比例。
作为本发明所述的直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法的一种优选方案，其中：所述传感器表面包括，通过两层识别分子的制备，使样品在反应完成后，形成两种识别分子形成的类三明治结构；
第一层识别分子用于捕获总蛋白，获取总蛋白的传感器信号；第二层识别分子只与待检测蛋白结合，用于特异性捕获疾病标志蛋白，获取疾病标志蛋白的传感器信号。
作为本发明所述的直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法的一种优选方案，其中：通过反应条件控制表，控制捕获蛋白制备过程和识别蛋白的制备过程中的溶液浓度、流速和时间；
所述反应条件控制表包括，通过化学反应的过程和实验，得到表格；当确定反应物质和产物后，通过表格中的记录，输出制备过程中的液浓度、流速、时间以及缓冲液的种类和浓度，并根据输出的数据内容作为设定值，进行捕获蛋白和识别蛋白的制备；
所述捕获蛋白的制备包括，捕获蛋白的固定：将设定浓度的正常蛋白结合蛋白溶液，以设定的流速V通入微流控芯片中，在基底上固定t分钟；
利用设定浓度的缓冲液，冲洗去除未结合的正常蛋白结合蛋白；
将设定浓度的疾病标志蛋白抗体溶液，以相同的流速V通入芯片，固定t分钟；
利用设定浓度的缓冲液，冲洗去除未结合的疾病标志蛋白抗体；
封闭未结合位点：向芯片中注入封闭缓冲液，以流速V通入t分钟，封闭基底上未被捕获蛋白占据的位置；
利用设定浓度的缓冲液，冲洗去除未结合的封闭缓冲液；
捕获总目标蛋白包括，在完成所述捕获蛋白的固定后，进行样品捕获：以设定的流速注入稀释的样品，与正常蛋白结合捕获t分钟；
以设定的流速注入稀释的样品，与疾病标志蛋白抗体结合捕获t分钟；
用缓冲液冲洗去除未结合的样品成分。
作为本发明所述的直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法的一种优选方案，其中：所述识别蛋白的制备包括，在第二层注入识别蛋白：以设定的流速V1注入能够识别疾病标志蛋白复合物的抗体溶液，并结合t分钟；
用缓冲液冲洗去除未结合的抗体。
作为本发明所述的直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法的一种优选方案，其中：通过传感器识别传感器表面的产物信息，得到疾病标志蛋白占总蛋白的比例；
所述第一层识别分子中，抗体Ab1捕获包含正常蛋白和疾病标志蛋白的总蛋白，分别形成正常蛋白复合物和疾病标志蛋白复合物：
对于正常蛋白，反应平衡时：
ka(γ0-cn-ca)·c(1-P)＝kd·cn
对于疾病标志蛋白，反应平衡时：
ka(γ0-cn-ca)·cP＝kd·ca
对于总蛋白，反应平衡时：
ka(γ0-cn-ca)·c＝kd·ct
其中，ka表示反应的结合常数；kd表示反应的解离常数；γ0表示捕获蛋白Ab1的初始浓度；cn表示正常蛋白质复合物的浓度；ca表示疾病标志蛋白复合物的浓度；ct表示总蛋白复合物的浓度，ct＝cn+ca；c表示总蛋白质浓度；P表示疾病标志蛋白占总蛋白的比例；norm表示正常蛋白；Ab1·norm表示正常蛋白复合物；abnorm表示疾病标志蛋白；Ab1·abnorm表示疾病标志蛋白复合物；
总蛋白复合物的浓度为：
疾病标志蛋白复合物的浓度为：
其中，KD表示平衡解离常数，描述总蛋白与的Ab1相互作用，KD＝kd/ka。
作为本发明所述的直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法的一种优选方案，其中：所述总蛋白信号包括，若疾病标志蛋白和正常蛋白的分子质量近似相同，总蛋白的传感器信号表示为：
若疾病标志蛋白和正常蛋白的分子质量不满足近似相同，总蛋白的传感器信号表示为：
其中，K表示传感器常数，γ0表示Ab1的初始浓度，M表示总蛋白的分子质量；
所述近似相同表示，疾病标志蛋白和正常蛋白的分子质量之差，除以正常蛋白的分子质量的数值小于预设的阈值E的情况；
所述第二层识别蛋白Ab2，只与疾病标志蛋白复合物反应，形成疾病标志蛋白夹心复合物：
疾病标志蛋白夹心复合物的传感器信号为：
当cAb2＞＞K'D，疾病标志蛋白夹心复合物的传感器信号可化简为：
其中，cAb2表示Ab2的初始浓度，K'D表示平衡解离常数，描述疾病标志蛋白与Ab2的相互作用，MAb2表示Ab2的分子质量，Ab1·abnorm·Ab2表示疾病标志蛋白夹心复合物。
作为本发明所述的直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法的一种优选方案，其中：获取所述总蛋白的传感器信号、疾病标志蛋白的传感器信号和相关分子量，代入比例公式；
所述比例公式为：
得到疾病标志蛋白的比例，并输出计算结果。
一种采用如本发明所述方法的直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例系统，其特征在于：
传感器表面制备单元，获取反应物和产物信息，对传感器表面进行制备；
数据采集单元，分别获取总蛋白和疾病标志蛋白的传感器信号；
比例计算单元，将数据采集单元中获得的数据代入比例公式，得到疾病标志蛋白的比例。
一种计算机设备，包括：存储器和处理器；所述存储器存储有计算机程序，其中：所述处理器执行所述计算机程序时实现本发明中任一项所述的方法的步骤。
一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，其中：所述计算机程序被处理器执行时实现本发明中任一项所述的方法的步骤。
本发明的有益效果：本发明提供的直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法，通过一步性的直接检测流程，简化了实验步骤，缩短了实验时间。这种方法直接在传感器表面同时获取总蛋白信号和疾病标志蛋白信号，无需多步独立实验，有效减少实验操作的复杂性和可能的误差，降低了实验成本。有效提高检测的准确性和灵敏度。这种类三明治结构的识别分子设计，使得只有目标疾病标志蛋白才能被特异性捕获，减少了背景信号和非特异性绑定的干扰。不仅限于特定疾病标志蛋白的检测，还可以扩展到其他类型的蛋白质或生物分子的检测，支持多种生物医学研究和临床应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明第一个实施例提供的一种直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法的整体流程图；
图2为本发明第二个实施例提供的一种直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法中成像椭圆偏振仪上的联合检测HbA1c％和GA％的三明治式芯片检测过程图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，显然所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明的保护的范围。
实施例1
参照图1，为本发明的一个实施例，提供了一种直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法，包括：
S1：获取反应物和产物信息，对传感器表面进行制备。
进一步的，所述传感器表面包括，通过两层识别分子的制备，使样品在反应完成后，形成两种识别分子形成的类三明治结构；第一层识别分子用于捕获总蛋白，获取总蛋白的传感器信号；第二层识别分子只与待检测蛋白结合，用于特异性捕获疾病标志蛋白，获取疾病标志蛋白的传感器信号。
通过反应条件控制表，控制捕获蛋白的制备过程和识别蛋白的制备过程中的溶液浓度、流速和时间。所述反应条件控制表包括，通过化学反应的过程和实验，得到表格；当确定反应物质和产物后，通过表格中的记录，输出制备过程中的液浓度、流速、时间以及缓冲液的种类和浓度，并根据输出的数据内容作为设定值，进行捕获蛋白和识别蛋白的制备。
所述捕获蛋白的制备包括，捕获蛋白的固定：将设定浓度的正常蛋白结合蛋白溶液，以设定的流速V通入微流控芯片中，在基底上固定t分钟。
利用设定浓度的缓冲液，冲洗去除未结合的正常蛋白结合蛋白。
将设定浓度的疾病标志蛋白抗体溶液，以相同的流速V通入芯片，固定t分钟。
利用设定浓度的缓冲液，冲洗去除未结合的疾病标志蛋白抗体。
封闭未结合位点：向芯片中注入封闭缓冲液，以流速V通入t分钟，封闭基底上未被捕获蛋白占据的位置。
利用设定浓度的缓冲液，冲洗去除未结合的封闭缓冲液。
捕获总目标蛋白包括，在完成所述捕获蛋白的固定后，进行样品捕获：以设定的流速注入稀释的样品，与正常蛋白结合捕获t分钟。
以设定的流速注入稀释的样品，与疾病标志蛋白抗体结合捕获t分钟。
用缓冲液冲洗去除未结合的样品成分。
所述识别蛋白的制备包括，在第二层注入识别蛋白：以设定的流速V1注入能够识别疾病标志蛋白复合物的抗体溶液，并结合t分钟。
用缓冲液冲洗去除未结合的抗体。
要说的是，HbA1c和所述GA，两者的浓度为重要的血糖监测指标。若对测定两者进行传感器表面制备，则进行以下操作。表面预处理：使用经过抛光处理的硅片作为基底，首先用3-氨基丙基三乙氧基硅烷对硅片表面进行化学修饰，形成氨基层。
第一层捕获蛋白的固定：(1)将血浆血红蛋白结合蛋白(haptoglobin,Hp)溶液(浓度为25μg/mL)以1μL/min的流速通入微流控芯片中，在硅基底上固定10分钟。(2)用PBST(磷酸盐缓冲液含0.05％Tween-20)冲洗去除未结合的Hp。(3)将抗人血清白蛋白抗体(Ab_HSA)溶液(浓度为50μg/mL)以相同流速通入芯片，固定10分钟。(4)用PBST冲洗去除未结合的Ab_HSA。
封闭未结合位点：向芯片中注入封闭缓冲液，以1μL/min的流速通入30分钟，封闭基底上未被捕获蛋白占据的位置。
样品捕获：(1)以2μL/min的流速注入稀释的全血样品，与Hp结合捕获总血红蛋白(Hb和HbA1c)10分钟。(2)以2μL/min的流速注入稀释的血清样品，与Ab_HSA结合捕获总血清白蛋白(HSA和GA)10分钟。(3)用PBST冲洗去除未结合的样品成分。
第二层识别蛋白的注入：(1)以2μL/min的流速注入抗HbA1c抗体(Ab_HbA1c)溶液，与HbA1c结合10分钟。(2)以2μL/min的流速注入抗GA抗体(Ab_GA)溶液，与GA结合10分钟。(3)用PBST冲洗去除未结合的抗体。
第一层捕获蛋白(Ab1)被共价结合于传感表面，用于捕获总蛋白；第二层捕获蛋白(Ab2)用于特异性捕获疾病标志蛋白。
S2：分别获取总蛋白和疾病标志蛋白的传感器信号。
进一步的通过传感器识别传感器表面的产物信息，得到疾病标志蛋白占总蛋白的比例。要知道的是，传感器能够捕获到的蛋白质在传感器上形成的复合物将产生可检测的信号，这可能包括电信号、光信号(如荧光或生物发光)等。传感器需要能够分别识别和量化总蛋白信号和疾病标志蛋白信号。这可以通过不同的标记(例如，使用不同的荧光标记)、信号的空间分布(不同区域的传感器表面绑定不同的识别分子)。获取到的信号通过数据处理单元分析，根据预先设定的标准曲线或校准数据，将信号强度转换为蛋白浓度。利用疾病标志蛋白与总蛋白的信号强度的比值，计算出疾病标志蛋白占总蛋白的比例。
所述第一层识别分子中，抗体Ab1捕获包含正常蛋白和疾病标志蛋白的总蛋白，分别形成正常蛋白复合物和疾病标志蛋白复合物：
对于正常蛋白，反应平衡时：
ka(γ0-cn-ca)·c(1-P)＝kd·cn
对于疾病标志蛋白，反应平衡时：
ka(γ0-cn-ca)·cP＝kd·ca
对于总蛋白，反应平衡时：
ka(γ0-cn-ca)·c＝kd·ct
其中，ka表示反应的结合常数；kd表示反应的解离常数；γ0表示捕获蛋白Ab1的初始浓度；cn表示正常蛋白质复合物的浓度；ca表示疾病标志蛋白复合物的浓度；ct表示总蛋白复合物的浓度，ct＝cn+ca；c表示总蛋白质浓度；P表示疾病标志蛋白占总蛋白的比例；norm表示正常蛋白；Ab1·norm表示正常蛋白复合物；abnorm表示疾病标志蛋白；Ab1·abnorm表示疾病标志蛋白复合物。
总蛋白复合物的浓度为：
疾病标志蛋白复合物的浓度为：
其中，KD表示平衡解离常数，描述总蛋白与的Ab1相互作用，KD＝kd/ka。
所述总蛋白信号包括，若疾病标志蛋白和正常蛋白的分子质量近似相同，总蛋白的传感器信号表示为：
若疾病标志蛋白和正常蛋白的分子质量不满足近似相同，总蛋白的传感器信号表示为：
其中，K表示传感器常数，γ0表示Ab1的初始浓度，M表示总蛋白的分子质量。
所述近似相同表示，疾病标志蛋白和正常蛋白的分子质量之差，除以正常蛋白的分子质量的数值小于预设的阈值E的情况。
所述第二层识别蛋白Ab2，只与疾病标志蛋白复合物反应，形成疾病标志蛋白夹心复合物：
疾病标志蛋白夹心复合物的传感器信号为：
当cAb2＞＞K'D，疾病标志蛋白夹心复合物的传感器信号可化简为：
其中，cAb2表示Ab2的初始浓度，K'D表示平衡解离常数，描述疾病标志蛋白与Ab2的相互作用，MAb2表示Ab2的分子质量，Ab1·abnorm·Ab2表示疾病标志蛋白夹心复合物。
S3：将相应的传感器信号及分子量信息代入比例公式，直接得到疾病标志蛋白占相应总蛋白的比例。
进一步的，获取所述总蛋白的传感器信号、疾病标志蛋白的传感器信号和相关分子量，代入比例公式。
所述比例公式为：
得到疾病标志蛋白的比例，并输出计算结果。
另一方面，本实施例还提供了一种直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例系统，其包括：
传感器表面制备单元，获取反应物和产物信息，对传感器表面进行制备数据采集单元，分别获取总蛋白和疾病标志蛋白的传感器信号。
比例计算单元，将数据采集单元中获得的数据代入比例公式，得到疾病标志蛋白的比例。
以上功能如果以软件功能单元的形式实现并作为独立的产品销售或使用时，可以存储在一个计算机可读取存储介质中。基于这样的理解，本发明的技术方案本质上或者说对现有技术做出贡献的部分或者该技术方案的部分可以以软件产品的形式体现出来，该计算机软件产品存储在一个存储介质中，包括若干指令用以使得一台计算机设备(可以是个人计算机，服务器，或者网络设备等)执行本发明各个实施例所述方法的全部或部分步骤。而前述的存储介质包括：U盘、移动硬盘、只读存储器(ROM，Read-Only Memory)、随机存取存储器(RAM，Random Access Memory)、磁碟或者光盘等各种可以存储程序代码的介质。
在流程图中表示或在此以其他方式描述的逻辑和/或步骤，例如，可以被认为是用于实现逻辑功能的可执行指令的定序列表，可以具体实现在任何计算机可读介质中，以供指令执行系统、装置或设备(如基于计算机的系统、包括处理器的系统或其他可以从指令执行系统、装置或设备取指令并执行指令的系统)使用，或结合这些指令执行系统、装置或设备而使用。就本说明书而言，“计算机可读介质”可以是任何可以包含、存储、通信、传播或传输程序以供指令执行系统、装置或设备或结合这些指令执行系统、装置或设备而使用的装置。
计算机可读介质的更具体的示例(非穷尽性列表)包括以下：具有一个或多个布线的电连接部(电子装置)、便携式计算机盘盒(磁装置)、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦除可编辑只读存储器(EPROM或闪速存储器)、光纤装置以及便携式光盘只读存储器(CDROM)。另外，计算机可读介质甚至可以是可在其上打印所述程序的纸或其他合适的介质，因为可以例如通过对纸或其他介质进行光学扫描，接着进行编辑、解译或必要时以其他合适方式进行处理来以电子方式获得所述程序，然后将其存储在计算机存储器中。
应当理解，本发明的各部分可以用硬件、软件、固件或它们的组合来实现。在上述实施方式中，多个步骤或方法可以用存储在存储器中且由合适的指令执行系统执行的软件或固件来实现。例如，如果用硬件来实现，和在另一实施方式中一样，可用本领域公知的下列技术中的任一项或他们的组合来实现：具有用于对数据信号实现逻辑功能的逻辑门电路的离散逻辑电路，具有合适的组合逻辑门电路的专用集成电路，可编程门阵列(PGA)，现场可编程门阵列(FPGA)等。
实施例2
参照图2，为本发明的一个实施例，提供了一种直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法，为了验证本发明的有益效果，通过经济效益计算和仿真实验进行科学论证。
图2为成像椭圆偏振仪上的联合检测HbA1c％和GA％的三明治式芯片检测过程。其检测包括以下步骤：
1.首先，血浆血红蛋白结合蛋白(haptoglobin,Hp)被共价结合到硅基底表面，之后用封闭缓冲液封闭未被Hp占据的位置。
2.稀释的全血样品被注入，Hp与样品中的总血红蛋白(包括HbA1c和Hb)结合，从而获得总血红蛋白的信号。
3.然后注入抗HbA1c抗体(Ab_HbA1c)，它只与HbA1c特异性结合，构成Hp/Hb(HbA1c)/Ab_HbA1c的三明治复合物，从而获得HbA1c的信号。
4.与此同时，抗人血清白蛋白抗体(Ab_HSA)被固定在基底的另一区域，用于捕获总血清白蛋白(HSA和GA)。
5.稀释的血清样品被注入，Ab_HSA与样品中的总血清白蛋白结合，获得总血清白蛋白的信号。
6.最后注入抗GA抗体(Ab_GA)，它只与GA特异性结合，构成Ab_HSA/HSA(GA)/Ab_GA的三明治复合物，从而获得GA的信号。
7.通过对比每一步骤前后表面厚度的变化，可分别获得总血红蛋白、HbA1c、总血清白蛋白和GA的信号，进而计算出HbA1c％和GA％的值。
该三明治式检测设计使得成像椭圆偏振仪能够在单次测试中直接获取HbA1c％和GA％的读数，极大简化了检测流程。
采用成像椭圆偏振生物传感器，利用三明治式检测原理，对人体全血和血清样品中的HbA1c％和GA％进行联合定量检测。具体为：
1.生物传感器芯片表面制备
(1)使用经过抛光的硅片为基底。
(2)向芯片中分别注入浓度为25μg/mL的血浆血红蛋白结合蛋白(haptoglobin,Hp)和50μg/mL的抗人血清白蛋白抗体(anti-HSA antibody,Ab_HSA)，以1μL/min流速通入，固定10分钟。
(3)用PBST冲洗去除未结合部分。
(4)注入封闭缓冲液，以1μL/min流速通入30分钟，封闭基底的未被捕获蛋白占据的位置。
2.标准品检测
(1)分别配制0.05～0.20μg/mL的Hb标准品，0.01～0.25μg/mL的HbA1c标准品，0.20～1.50μg/mL的HSA标准品，0.002～4.000μg/mL的GA标准品。
(2)按上述流程注入标准品，获取不同浓度下的响应信号，绘制出Hb、HbA1c、HSA、GA的标准曲线。
(3)根据标准曲线，Hb、HbA1c、HSA、GA的检测线性范围分别为0.11～0.16μg/mL、0.6～1.1μg/mL，检测下限分别为0.645ng/mL、17.496ng/mL。
3.临床样本检测
(1)收集50例患者的全血和血清样本，按1:20的比例用PBST稀释。
(2)按上述流程注入稀释样本，获取Hb、HbA1c、HSA、GA的响应信号。
(3)将响应信号代入相应的标准曲线方程，计算出样本中Hb、HbA1c、HSA、GA的浓度。
(4)根据HbA1c与总Hb的比值得到HbA1c％，根据GA与总HSA的比值得到GA％。
4.方法学评价
(1)选择性实验：100μg/mL的纤维蛋白原、葡萄糖、GA、HSA分别作为Hb和HbA1c的潜在干扰物，100μg/mL的纤维蛋白原、葡萄糖、HbA1c、Hb作为HSA和GA的潜在干扰物，结果表明本方法具有良好的选择性。
(2)加样回收实验：对Hb、HbA1c、HSA、GA进行加样回收实验，加入量分别为0.06～0.18μg/mL、0.03～0.09μg/mL、0.5～1.5μg/mL和5％～30％，回收率在99.14～103.17％之间，变异系数2.72％～9.36％，表明方法准确可靠。
(3)与HPLC法对比：采用双盲法，与医院的HPLC法对50例临床样本的检测结果进行对比，相关系数分别为0.985(HbA1c％)和0.976(GA％)，两种方法具有良好一致性。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法，其特征在于，包括：
获取反应物和产物信息，对传感器表面进行制备；
分别获取总蛋白和疾病标志蛋白的传感器信号；
将相应的传感器信号及分子量信息代入比例公式，直接得到疾病标志蛋白占相应总蛋白的比例。
2.如权利要求1所述的直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法，其特征在于：所述传感器表面包括，通过两层识别分子的制备，使样品在反应完成后，形成两种识别分子形成的类三明治结构；
第一层识别分子用于捕获总蛋白，获取总蛋白的传感器信号；第二层识别分子只与待检测蛋白结合，用于特异性捕获疾病标志蛋白，获取疾病标志蛋白的传感器信号。
3.如权利要求2所述的直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法，其特征在于：通过反应条件控制表，控制捕获蛋白的制备过程和识别蛋白的制备过程中的溶液浓度、流速和时间；
所述反应条件控制表包括，通过化学反应的过程和实验，得到表格；当确定反应物质和产物后，通过表格中的记录，输出制备过程中的液浓度、流速、时间以及缓冲液的种类和浓度，并根据输出的数据内容作为设定值，进行捕获蛋白和识别蛋白的制备；
所述捕获蛋白的制备包括，捕获蛋白的固定：将设定浓度的正常蛋白结合蛋白溶液，以设定的流速V通入微流控芯片中，在基底上固定t分钟；
利用设定浓度的缓冲液，冲洗去除未结合的正常蛋白结合蛋白；
将设定浓度的疾病标志蛋白抗体溶液，以相同的流速V通入芯片，固定t分钟；
利用设定浓度的缓冲液，冲洗去除未结合的疾病标志蛋白抗体；
封闭未结合位点：向芯片中注入封闭缓冲液，以流速V通入t分钟，封闭基底上未被捕获蛋白占据的位置；
利用设定浓度的缓冲液，冲洗去除未结合的封闭缓冲液；
捕获总目标蛋白包括，在完成所述捕获蛋白的固定后，进行样品捕获：以设定的流速注入稀释的样品，与正常蛋白结合捕获t分钟；
以设定的流速注入稀释的样品，与疾病标志蛋白抗体结合捕获t分钟；
用缓冲液冲洗去除未结合的样品成分。
4.如权利要求3所述的直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法，其特征在于：所述识别蛋白的制备包括，在第二层注入识别蛋白：以设定的流速V1注入能够识别疾病标志蛋白复合物的抗体溶液，并结合t分钟；
用缓冲液冲洗去除未结合的抗体。
5.如权利要求4所述的直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法，其特征在于：通过传感器识别传感器表面的产物信息，得到疾病标志蛋白占总蛋白的比例；
所述第一层识别分子中，抗体Ab1捕获包含正常蛋白和疾病标志蛋白的总蛋白，分别形成正常蛋白复合物和疾病标志蛋白复合物：
对于正常蛋白，反应平衡时：
ka(γ0-cn-ca)·c(1-P)＝kd·cn
对于疾病标志蛋白，反应平衡时：
ka(γ0-cn-ca)·cP＝kd·ca
对于总蛋白，反应平衡时：
ka(γ0-cn-ca)·c＝kd·ct
其中，ka表示反应的结合常数；kd表示反应的解离常数；γ0表示捕获蛋白Ab1的初始浓度；cn表示正常蛋白质复合物的浓度；ca表示疾病标志蛋白复合物的浓度；ct表示总蛋白复合物的浓度，ct＝cn+ca；c表示总蛋白质浓度；P表示疾病标志蛋白占总蛋白的比例；norm表示正常蛋白；Ab1·norm表示正常蛋白复合物；abnorm表示疾病标志蛋白；Ab1·abnorm表示疾病标志蛋白复合物；
总蛋白复合物的浓度为：
疾病标志蛋白复合物的浓度为：
其中，KD表示平衡解离常数，描述总蛋白与的Ab1相互作用，KD＝kd/ka。
6.如权利要求5所述的直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法，其特征在于：所述总蛋白信号包括，若疾病标志蛋白和正常蛋白的分子质量近似相同，总蛋白的传感器信号表示为：
若疾病标志蛋白和正常蛋白的分子质量不满足近似相同，总蛋白的传感器信号表示为：
其中，K表示传感器常数，γ0表示Ab1的初始浓度，M表示总蛋白的分子质量；
所述近似相同表示，疾病标志蛋白和正常蛋白的分子质量之差，除以正常蛋白的分子质量的数值小于预设的阈值E的情况；
所述第二层识别蛋白Ab2，只与疾病标志蛋白复合物反应，形成疾病标志蛋白夹心复合物：
疾病标志蛋白夹心复合物的传感器信号为：
当cAb2＞＞K'D，疾病标志蛋白夹心复合物的传感器信号可化简为：
其中，cAb2表示Ab2的初始浓度，K'D表示平衡解离常数，描述疾病标志蛋白与Ab2的相互作用，MAb2表示Ab2的分子质量，Ab1·abnorm·Ab2表示疾病标志蛋白夹心复合物。
7.如权利要求6所述的直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法，其特征在于：获取所述总蛋白的传感器信号、疾病标志蛋白的传感器信号和相关分子量，代入比例公式；
所述比例公式为：
得到疾病标志蛋白的比例，并输出计算结果。
8.一种采用如权利要求1-7任一所述方法的直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例系统，其特征在于：
传感器表面制备单元，获取反应物和产物信息，对传感器表面进行制备；
数据采集单元，分别获取总蛋白和疾病标志蛋白的传感器信号；
比例计算单元，将数据采集单元中获得的数据代入比例公式，得到疾病标志蛋白的比例。
9.一种计算机设备，包括：存储器和处理器；所述存储器存储有计算机程序，其特征在于：所述处理器执行所述计算机程序时实现直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法的步骤。
10.一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，其特征在于：所述计算机程序被处理器执行时实现直接检测疾病标志蛋白占相应总蛋白比例方法的步骤。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118259021A true CN118259021A (zh) | 2024-06-28 |
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