CN118256495A - 修饰的双链寡核苷酸分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种修饰的双链寡核苷酸(dsRNA)分子及其用途，涉及核酸药物技术领域。该双链寡核苷酸包含正义链和反义链；以反义链的5'末端计的1～9位含有至少一个修饰的核苷酸NM，所述核苷酸NM为2'‑含硅原子的基团修饰的核苷酸；所述2'‑含硅原子的基团在空间体积上大于2'‑甲氧基基团(2'‑OMe)。本发明修饰方法下的双链寡核苷酸可以在保持双链寡核苷酸分子的活性及Tm值的同时，有效降低其脱靶效应。

Description

修饰的双链寡核苷酸分子及其用途
技术领域
本发明涉及核酸药物技术领域，尤其是涉及一种可降低脱靶效应的具有特定修饰基序的双链寡核苷酸分子及其用途。
背景技术
脱靶毒性是小核酸药物研发的关键问题和挑战之一，本领域技术人员一直致力于解决由脱靶效应引发的小核酸药物成药障碍。小核酸药物的脱靶毒性主要来源于药物分子与非靶RNA结合引发的毒性反应，而siRNA的主要脱靶效应来源于反义链种子区(5'端第1～9位)与非靶向mRNA的配对，并通过microRNA(miRNA)类似的作用机制造成基因表达异常(miRNA样脱靶效应)。许多临床前药效研究中具备优异活性的核酸药物由于其脱靶效应产生的毒性而难以用于实际的药物研发。
小核酸药物的化学修饰技术可以提高该类型药物的稳定性和疗效、避免免疫反应，同时也是降低脱靶效应的主要手段。在本领域的研究中，现有减弱siRNA脱靶效应解决方案的技术特征均是通过对于活性等理化性质具有潜在负面影响的减弱种子区热力学稳定性(化学修饰后Tm值降低)的手段来实现的，即通过对反义链种子区进行热不稳定核苷酸修饰，减弱siRNA反义链种子区与脱靶基因的结合，进而缓解miRNA样脱靶效应的出现。例如，在大体上不改变双链硫代磷酸(PS)、甲氧基(Ome)和氟代(F)修饰含量和位点的情况下，在siRNA反义链种子区5’端第7位核苷酸引入单个GNA修饰(siRNA修饰策略如图9所示，GNA结构如图10所示)，依据取代碱基不同，可显著降低双链Tm值达4.3～16.8℃，进而选择性地缓解了种子区介导的miRNA样脱靶效应。
此外，也有在反义链种子区5’端第7位核苷酸采用UNA修饰的防脱靶策略(UNA结构参见图10)。或者在该位点核苷酸糖环2’位进行F取代和甲基双取代修饰的策略(F取代和甲基双取代结构参见图10)，也同样显著降低双链Tm值达15℃，从而减弱种子区热力学稳定性，达到缓解脱靶效应的目的。
满足在保持siRNA药物良好药学活性和Tm值的同时，尽可能降低该类型药物的脱靶效应的这一需求是本领域中亟待解决的一类重要问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明提供了有利于降低脱靶效应的双链寡核苷酸(dsRNA)分子的修饰方法，以及用于降低靶基因表达用途的dsRNA分子及其组合物。通常地，该dsRNA分子包括正义链和反义链。本发明通过在dsRNA序列的特定位置上使用基本不减弱Tm值的核苷酸修饰策略，从而降低dsRNA序列的脱靶效应，同时保持良好的药效活性。
由此，本发明的第一目的在于提供一种修饰的双链寡核苷酸(dsRNA)分子，以解决现有技术中存在的缺乏保持dsRNA药物良好药学活性和Tm值的同时，可以降低该类型药物的dsRNA脱靶效应的修饰策略的技术问题。
本发明修饰的dsRNA中，在反义链的种子区域(即，在反义链的5'-末端的位置1-9内)包含至少一个2'-大空间体积基团修饰的核苷酸，其中，该修饰的核苷酸中所述2'-大空间体积基团含有Si原子且其空间体积大于2'-OMe基团的空间体积。通过该在反义链种子区进行上述基团修饰，可使得dsRNA反义链与脱靶基因的结合和识别受空间位阻影响而减弱，从而降低了脱靶效应。
本发明的第二目的在于提供上述修饰的双链寡核苷酸在抑制靶基因表达或制备药物组合物中的应用。该修饰的寡核苷酸比缺乏相应修饰的亲本dsRNA分子在降低脱靶效应方面更为有效。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种修饰的双链寡核苷酸(dsRNA)分子，其包含正义链和反义链；所述正义链和反义链每一个核苷酸独立的为修饰或未修饰的核苷酸。所述正义链和所述反义链的核苷酸序列至少部分地反向互补。且所述反义链的核苷酸序列至少部分地与靶基因mRNA反向互补。
具体地，本发明所述dsRNA分子中，以反义链的5'-末端计的位置1～9位(优选2-9位)含有至少一个修饰的核苷酸NM，所述核苷酸NM为2'-大空间体积基团修饰的核苷酸，所述2'-大空间体积基团中包含Si原子且在空间体积方面大于2'-甲氧基基团(2'-OMe)。在一些实施例中，所述修饰核苷酸NM位于从该dsRNA反义链的5'-端计的位置3-9处。在另一些实施例中，该修饰核苷酸NM位于从该反义链的5'-端的位置5-8处。在另一些实施例中，该修饰核苷酸NM位于从该反义链的5'-端的位置5-7处。其中，所述的修饰核苷酸NM不会导致其所在dsRNA具有明显或显著降低的总解链温度(Tm)。
在本发明一些实施方式中，修饰的核苷酸NM为2'-O-Si-修饰的核苷酸。
在本发明另一些实施方式中，修饰的核苷酸NM结构如下式(Ⅰ)所示，或为式(Ⅰ)的互变异构体；
其中，X选自CH2、O、S或NH；
B选自核苷酸碱基、碳原子数为6～12的杂芳基、杂环碱基或碱基替代基团；
所述核苷酸碱基包括但不限于：尿嘧啶或其衍生物，胸腺嘧啶或其衍生物，胞嘧啶或其衍生物，5-甲基胞嘧啶或其衍生物，腺嘌呤或其衍生物，或，鸟嘌呤或其衍生物；
R1和R2分别独立的为H或-(O)m(CH2)nOR3，且R1和R2不同时为H或-(O)m(CH2)nOR3；m选自0或1，n选自0～3的整数；其中，-(O)m(CH2)nOR3取代基的空间体积(或空间位阻)大于甲氧基的空间体积(或空间位阻)。优选地，R3为含Si的基团。
其中，上述结构中的虚线(---)表示键连接位置，以与相邻的核苷酸相键连。
优选地，B为核苷酸碱基或其衍生物；进一步优选地，B选自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤。
优选地，n为0～2的整数，进一步优选地，n为0或1。
优选地，R3为-Si(R4)3，其中每一个R4各自独立的选自：取代的或未取代的C1～C6烷基，或取代的或未取代的C1～C6烷氧基；所述取代基选自C1～C6烷基、羟基、卤素、碳原子数不超过6的烷氧基、氨基、碳原子数不超过12的环烷基、碳原子数不超过12的芳基或碳原子数不超过12的杂芳基。进一步优选地，R3为TBDMS或TIPS基团。
优选地，R1或R2为-O-TOM基团。
在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸中除了核苷酸NM，还含有其他的修饰核苷酸；其中，所述其他的修饰核苷酸包括下列各项组成的组：无碱基核苷酸、反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸、2′-卤素修饰的核苷酸、2′-甲氧基修饰的核苷酸、2′-脱氧(即2′-H)修饰的核苷酸、2′-O-甲氧基烷基修饰的核苷酸、2′-O-烷基修饰的核苷酸、2′-O-烯丙基修饰的核苷酸、5′-乙烯基修饰的核苷酸、5′-环丙基修饰的核苷酸、BNA、LNA、5'-乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸，5'-环丙基磷酸酯修饰的核苷酸或5'-烷基取代基磷酸酯修饰的核苷酸；优选地，选自2'-甲氧基修饰的核苷酸、2-卤素修饰的核苷酸和2'-脱氧修饰的核苷酸中的一种或多种。
在一些实施方式中，dsRNA的正义链和反义链同时含有2'-甲氧基修饰的核苷酸和2'-卤素修饰的核苷酸；优选地，正义链和反义链分别独立的含有不超过4个2'-氟修饰的核苷酸；以及不低于5个2'-甲氧基修饰。
在一些实施方式中，dsRNA中所述正义链或反义链含有14～40个核苷酸，优选含有14～30个核苷酸，更优选17～25个核苷酸；进一步优选地，所述正义链含有17～23个核苷酸，所述反义链含有19～23个核苷酸。
在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸含有19～21个碱基对的双链体区。
在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸中至少一个连接键被修饰；优选地，连接键的修饰包括硫代磷酸酯核苷酸间键修饰或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰中的至少一种。
在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸还可以连接有配体；优选地，所述配体选自半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺，或其衍生物。
其中，所述配体通过接头共价附于所述双链寡核苷酸正义链的5'或3'端。
在一些实施方式中，所述双链寡核苷酸分子如下式(A)所示，所述双链寡核苷酸包含式A2所示的反义链以及如式A1所示的正义链；
式A1：5'-(NA)x-(NL)s-(NL2)y-3'；
式A2：3'-(NB)z-(NL)t-[NL(NM)]8-NL1-5'(A)；
其中，x选自0～6的整数；s选自10～40的整数；y选自0～3的整数；z选自0～6的整数；t选自10～30的整数；
(NL2)y为不与反义链中的核苷酸发生碱基互补配对的突出端核苷酸；
每一个核苷酸NL独立的为未经修饰的核苷酸或选自如下修饰的核苷酸：无碱基核苷酸、反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸、2'-卤素修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基烷基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、5'-乙烯基修饰的核苷酸、5'-环丙基修饰的核苷酸、BNA、LNA或2'-脱氧修饰的核苷酸；
[NL(NM)]8为位于反义链5'-末端2～9位的由所述核苷酸NL和核苷酸NM组成的8个连续核苷酸，且其中含有至少一个核苷酸NM。核苷酸NM位于反义链5'-末端的2～9位中的任意位置；每一个核苷酸NM分别独立的选自上述式(Ⅰ)、式(Ⅱ)或式(Ⅲ)；
每一个核苷酸NA独立的为未经修饰的核苷酸或选自如下修饰的核苷酸：无碱基核苷酸、反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸、2'-卤素修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基烷基修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸或2'-脱氧修饰的核苷酸；
每一个核苷酸NB独立的为未经修饰的核苷酸或选自如下修饰的核苷酸：无碱基核苷酸、反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸、2'-卤素修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基烷基修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸或2'-脱氧修饰的核苷酸；
核苷酸NL1为所述核苷酸NL所定义的核苷酸，或选自如下核苷酸：5'-乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸、5'-环丙基磷酸酯修饰的核苷酸或5'-烷基取代基磷酸酯修饰的核苷酸；
每一个核苷酸NL2独立的为未经修饰的核苷酸或选自如下修饰的核苷酸：无碱基核苷酸、反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸、2'-卤素修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基烷基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-乙烯基修饰的核苷酸、2'-环丙基修饰的核苷酸、BNA、LNA或2'-脱氧修饰的核苷酸。
优选地，所述[NL(NM)]8中，核苷酸NM位于反义链5'-末端的3～8位中的任意位置；
优选地，核苷酸NL为修饰的核苷酸时，每一个核苷酸NL1独立的选自如下经修饰的核苷酸：2'-甲氧基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸或2'-脱氧(即2'-H)修饰的核苷酸。
优选地，每一个核苷酸NM独立的选自上述式(Ⅰ)、式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示的核苷酸。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的上述双链寡核苷酸分子和药学上可接受的辅料。
优选地，所述药物组合物用于预防、缓解或治疗由特定基因的表达而引起的病理状况或疾病。
优选地，所述药物组合物递送上述dsRNA于受试者的组织或细胞，尤其是肝脏部位。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述dsRNA或上述药物组合物在制备用于治疗和/或预防由特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的药物中的用途。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种抑制靶基因表达的方法，该方法包括向受试者施用上述修饰的双链寡核苷酸，或上述药物组合物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
为了在保持dsRNA良好药效活性的同时，尽可能降低该类型药物的核酸分子脱靶效应，本发明采用一种新的修饰策略，即在dsRNA的反义链特定位置上使用不减弱Tm值的大空间体积基团修饰的核苷酸NM，可以显著的降低siRNA序列的脱靶效应，同时保持良好的药效活性。具体地，本发明提供的修饰的双链寡核苷酸包含正义链和反义链，其中以反义链的5’-末端计的1～9位含有至少一个核苷酸NM，核苷酸NM为2'-含Si基团修饰的核苷酸(其中所述2'-含Si基团相比于2'-甲氧基的修饰具有更大的空间位阻)。本发明发现，在反义链5’-末端计的1～9位的区域中含有至少一个核苷酸NM的dsRNA比缺乏相应修饰的亲本dsRNA分子在降低脱靶效应方面更为有效。
将本发明提供的抑制靶基因表达的双链寡核苷酸应用于制备药物组合物或抑制靶基因表达的方法时，由于dsRNA可以有效抑制靶基因表达，且其防脱靶效应更加优异，因此，含有上述dsRNA分子的药物可以有效降低脱靶带来的药物副作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为HepG2转染了实施例2所测的各受试物后，靶基因CC3 mRNA的相对表达水平；
图2为小鼠原代肝细胞自由摄取实施例3所测的各受试物后，靶基因ANGPTL3mRNA的相对表达水平；
图3为小鼠原代肝细胞自由摄取实施例4所测各受试物后，靶基因FXI mRNA的相对表达水平；
图4为给予实施例5所测各受试物后，小鼠体内目标靶基因的相对表达水平；
图5为给予本实施例6所测各受试物后，小鼠体内目标靶基因的相对表达水平；
图6A～6H为给予实施例7所测各受试物后，体外psiCHECK系统检测的在靶活性IC50曲线，图6A～6H依次为RX597001、RX597002、RX597003、RX597004、RX597005、RX597006、RX597007和RX597008的测试结果；
图7A～7H为给予实施例8所测各受试物后，体外psiCHECK系统检测的脱靶活性IC50曲线，图7A～7H依次为RX597001、RX597002、RX597003、RX597004、RX597005、RX597006、RX597007和RX597008的测试结果；
图8A为给予实施例9所测试的各siRNA缀合物后，ICR小鼠血清ALT浓度检测结果；
图8B为给予实施例9所测试的各siRNA缀合物后，ICR小鼠血清AST浓度检测结果；
图9为siRNA反义链种子区GNA修饰防脱靶策略；
图10为GNA结构式、UNA结构式和F取代和甲基双取代的结构式。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，双链寡核苷酸指的是两条寡核苷酸通过其中部分或全部碱基互补配对形成的双链结构，两条寡核苷酸包括正义链和反义链，正义链和反义链的长度可以相同也可以不相同，只要至少存在部分碱基互补配对区域以形成双连体，具有双链结构的寡核苷酸即属于本发明所述的双链寡核苷酸。本发明中构成双链寡核苷酸中的核苷酸可以为经修饰或未经修饰的核苷酸，当指经修饰的核苷酸时，除非另有说明，本发明所述的修饰不特指修饰的位点。本发明中双链寡核苷酸除去核苷酸经修饰，连接核苷酸之间的连接键也可经修饰，含有经修饰的核苷酸之间的连接键的双链寡核苷酸也属于本发明所述的双链寡核苷酸。本发明中双链寡核苷酸除去核苷酸部分，还可以含有本领域可接受的化合物分子或修饰物，以改善双链寡核苷酸的性质，例如连接配体形成缀合物。
本文中的核苷酸，可指代独立的核苷酸，也可指代在寡核苷酸中的核苷酸残基；本文中的核苷酸可为单数或复数，为复数时，可以指代一类核苷酸，例如文中核苷酸NL可指代一个核苷酸NL，或指代本文中dsRNA通式中若干个核苷酸NL。本文中，双链寡核苷酸也可以由dsRNA、siRNA或双链寡聚核苷酸表示，双链寡核苷酸、双链寡聚核苷酸、dsRNA和siRNA在本文中可以相互代替使用。本文中2-甲氧基也可以由2'-OMe表示，2-甲氧基和2'-OMe在本文中可以相互代替使用。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种修饰的双链寡核苷酸分子，该双链寡核苷酸分子包含正义链和反义链。其中该反义链与靶序列具有足够的互补性以介导RNA干扰。该双链寡核苷酸以反义链的5'-末端计1～9位含有至少一个经2'-大空间体积基团修饰的核苷酸NM，所述2'-大空间体积基团中包含Si原子且空间体积大于2'-甲氧基基团(2'-OMe)。本发明发现，在反义链的5'-末端计1～9位含有至少一个核苷酸NM不会导致dsRNA具有明显或显著降低的总解链温度(Tm)，且比缺乏相应修饰的亲本dsRNA在降低脱靶效应方面更为有效。本发明中，该双链寡核苷酸以反义链的5'-末端计1～9位含有至少一个核苷酸NM，以反义链5'-末端计，在反义链的第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8或第9中的至少一个位点为核苷酸NM。在一些可选的实施方式中，至少一个核苷酸NM位于2～9位中，在一些可选的实施方式中，至少一个核苷酸NM位于3～9位中；在一些可选的实施方式中，至少一个核苷酸NM位于3～8位中，在一些可选的实施方式中，至少一个核苷酸NM位于5～8位中，在一些可选的实施方式中，至少一个核苷酸NM位于6～8位中。
在本发明一些实施方式中，所述修饰的核苷酸NM为2'-O-Si-基修饰的核苷酸。
在另一些实施方式中，核苷酸NM如式(Ⅰ)所示，或为式(Ⅰ)的互变异构体；
其中，X为CH2、O、S或NH；
B选自核苷酸碱基、碳原子数为6～12的杂芳基、碳原子数为6～12的杂环碱基或碳原子数为6～12的碱基替代基团。
所述核苷酸碱基选自：选自尿嘧啶或其衍生物，胸腺嘧啶或其衍生物，胞嘧啶或其衍生物，5-甲基胞嘧啶或其衍生物，腺嘌呤或其衍生物，或，鸟嘌呤或其衍生物的碱基。
在一些可选的实施方式中，B为选自核苷酸碱基，优选包括尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤的碱基。
R1和R2分别独立的为H或-(O)m(CH2)nOR3，且R1和R2不同时为H或不同时为-(O)m(CH2)nOR3；m选自0或1，n为0～3的整数；其中，R3为含Si的基团且所述-(O)m(CH2)nOR3取代基的空间体积(或空间位阻)大于甲氧基的空间体积(或空间位阻)。
在一些可选的实施方式中，n为0～2的整数。
在一些可选的实施方式中，n为0或1，R3为-Si(R4)3，其中每一个R4各自独立的选自：选自取代的或未取代的C1～C6烷基，取代的或未取代的C1～C6烷氧基；所述取代基选自C1～C6烷基、羟基、卤素、碳原子数不超过6的烷氧基、氨基、碳原子数不超过12的环烷基、碳原子数不超过12的芳基和碳原子数不超过12的杂芳基中的一种或多种。
在一些可选的实施方式中，R3为TBDMS(叔丁基二甲基氯硅烷)或TIPS(三异丙基甲硅烷基)基团，TBDMS的结构式如式(α)所示，TIPS基团的结构式如式(β)所示：
在另一些可选的实施方式中，R1或R2为-O-TOM基，其中TOM为三异丙基甲氧基硅烷，且R1和R2不同时为-O-TOM基团；TOM基团的结构式如(γ)所示：
在一些可选的实施方式中，核苷酸NM如式(Ⅱ)所示，或为式(Ⅱ)的互变异构体：
其中，B为核苷酸碱基；所述核苷酸碱基选自尿嘧啶或其衍生物，胸腺嘧啶或其衍生物，胞嘧啶或其衍生物，5-甲基胞嘧啶或其衍生物，腺嘌呤或其衍生物，或，鸟嘌呤或其衍生物。
R1和R2独立地选自H或-(O)m(CH2)nOR3，并且R1和R2不同时为H或-(O)m(CH2)nOR3；m选自0或1，n选自0～2的整数，优选为0或1；其中，-(O)m(CH2)nOR3取代基的空间体积大于甲氧基的空间体积；
其中，R3为-Si(R4)3，其中每一个R4各自独立的选自：取代的或未取代的C1～C6烷基，取代的或未取代的C1～C6烷氧基，其中，所述取代基选自C1～C6烷基、羟基、卤素、碳原子数不超过6的烷氧基、氨基、碳原子数不超过12的环烷基、碳原子数不超过12的芳基或碳原子数不超过12的杂芳基。R1或R2优选为-O-TOM基，且R1和R2不同时为-O-TOM基。
在一些可选的实施方式中，核苷酸NM如式(Ⅲ)所示，或为式(Ⅲ)的互变异构体：
其中，B为核苷酸碱基，所述核苷酸碱基选自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤；
R3为-Si(R4)3，其中每一个R4各自独立的选自：取代的或未取代的C1～C6烷基，或，取代的或未取代的C1～C6烷氧基；取代基选自C1～C6烷基、羟基、卤素、碳原子数不超过6的烷氧基或氨基；R3优选自TBDMS或TIPS。
其中，上述结构式(Ⅰ)、(Ⅱ)和(Ⅲ)中的虚线(---)表示连接位置。并且，上述结构式(Ⅰ)、(Ⅱ)和(Ⅲ)中2'-位置取代基R1和R2可以存在特定的几何或立体异构体形式，包括顺反异构体和其他对映异构体形式。本发明提供的双链寡核苷酸中，除去核苷酸NM，其他双链寡核苷酸中的核苷酸可选地为经修饰的核苷酸或不经修饰的核苷酸；各核苷酸之间的修饰可以相同也可以不相同。除核苷酸NM外，本发明不限制其他经修饰的核苷酸和未经修饰的核苷酸在双链寡核苷酸中的分布。可选地，经修饰的核苷酸可以是交替模式的，本文所述的“交替”是指一条链具有两个或多个修饰时，每个或多个修饰可以间隔性地发生在该条链的任意核苷酸位置上，并且正义链上的修饰交替模式可以与反义链相同或不同，并且正义链上的修饰的交替模式可以相对于反义链上的修饰交替模式具有偏移。
在一些可选的实施方式中，正义链和反义链均可包含至少两种核苷酸修饰。例如，2'-O-甲基、2'-氟修饰可以在正义链或反义链上以交替模式发生。正义链上的修饰交替模式可以与反义链相同或不同，并且正义链上的修饰的交替模式可以相对于反义链上的修饰交替模式具有偏移。可选地，经修饰的核苷酸可以是连续模式的，连续是指一条链具有两个或多个修饰时，多个修饰可以相邻分布。
本发明所述双链寡核苷酸中，除去核苷酸NM，其他双链寡核苷酸中的修饰可选择本领域一般的、成熟的对双链寡核苷酸的修饰策略，本发明对此不做限制，具体的修饰包括但不限于如下修饰的核苷酸中的一种或多种：无碱基核苷酸、反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸、2′-卤素修饰的核苷酸，例如2′-氟修饰、2′-甲氧基修饰的核苷酸、2’-OH修饰的核苷酸、2’-H修饰的核苷酸、2′-O-甲氧基烷基修饰的核苷酸、2′-O-烷基修饰的核苷酸、2′-O-烯丙基修饰的核苷酸、5′-乙烯基修饰的核苷酸、5′-环丙基修饰的核苷酸、BNA、LNA、5'-乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸、5'-环丙基磷酸酯修饰的核苷酸或5'-烷基取代基磷酸酯修饰的核苷酸，优选2'-甲氧基修饰的核苷酸、2'-卤素修饰的核苷酸和2'-脱氧修饰的核苷酸中的至少两种。
在一些可选的实施方式中，正义链和反义链同时含有2'-甲氧基修饰的核苷酸和2-卤素修饰的核苷酸。更优选地，正义链和反义链分别独立的含有不超过4个2'-氟修饰的核苷酸；以及不低于5个2'-甲氧基修饰。
在一些可选的实施方式中，所述双链寡核苷酸中各核苷酸之间的连接键也可以被修饰，所述双链寡核苷酸可选地至少含有一个修饰的连接键，连接键的修饰可选自硫代磷酸酯核苷酸间键修饰或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰；当双链寡核苷酸中至少含有两个修饰的连接键时，各修饰的连接键之间的修饰可以相同也可以不相同。修饰的连接键可以发生在正义链或反义链或两者的任何核苷酸位置上。
在一些可选的实施方式中，所述双链寡核苷酸中，反义链或正义链含有14～40个核苷酸；优选含有14～30个核苷酸；更优选含有17～25个核苷酸，进一步优选含有17～23个核苷酸。
在一些可选的实施方式中，反义链和正义链的序列彼此充分互补以形成19～21个碱基对的双链体区。
在另一些可选的实施例中，本发明所述dsRNA分子包含长度为17-23个核苷酸的正义链和长度为19-23个核苷酸的反义链；其中：在反义链从5′端开始计数的位置2-9处的修饰核苷酸中至少一个是2′-O-Si-修饰形态的核苷酸NM；在正义链的与反义链的其他位置处还含有选自2′-甲氧基、2′-氟修饰、2′-OH或2′-H等其他修饰的核苷酸。
在一些可选的实施方式中，所述双链寡核苷酸还含有配体，以形成dsRNA缀合物，促进dsRNA向特定组织或细胞的递送或摄取。所述配体选自例如可以为但不限于为半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺或其衍生物，配体可选地通过接头共价附于所述双链寡核苷酸正义链的5'-末端或3'-末端。
在一些可选的实施方式中，所述正义链的3'-末端和/或5'-末端包含一个或多个突出端区域和/或加帽基团。在一些可选的实施方式中，所述反义链的3'-末端和/或5'-末端包含一个或多个突出端区域和/或加帽基团。其中突出端区域可选地含有1～6个核苷酸，该突出端可选地与靶序列错配，或者可选地与靶序列碱基互补配对。在一些可选的实施方式中，修饰的双链寡核苷酸包含如A1所示的正义链和如A2所示的反义链，此该寡核苷酸的通式如下式(A)所示：
A1：5'-(NA)x-(NL)s-(NL2)y-3'；
A2：3'-(NB)z-(NL)t-[NL(NM)]8-NL1-5'；式(A)；
其中，x和z分别独立的为0～6的整数；s为10～40的整数；t为10～30的整数；y为0～3的整数；其中，s优选为10～25的整数，t优选为10～16的整数。(NL2)y为不与反义链中的核苷酸发生碱基互补配对的突出端核苷酸。
每一个核苷酸NL分别独立的为未经修饰的核苷酸或选自如下修饰的核苷酸：无碱基核苷酸、反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸、2'-卤素修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基烷基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、5'-乙烯基修饰的核苷酸、5'-环丙基修饰的核苷酸、BNA、LNA或2'-脱氧修饰的核苷酸；
[NL(NM)]8为位于反义链5'-末端2～9位的由所述核苷酸NL和核苷酸NM组成的8个连续核苷酸，且其中含有至少一个核苷酸NM。核苷酸NM位于反义链5'-末端的2～9位中的任意位置；每一个核苷酸NM分别独立的选自上述式(Ⅰ)、式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示的核苷酸中；
每一个核苷酸NA分别独立的为未经修饰的核苷酸或选自如下修饰的核苷酸：无碱基核苷酸、反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸、2'-卤素修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基烷基修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸或2'-脱氧修饰的核苷酸中；
每一个核苷酸NB分别独立的为未经修饰的核苷酸或选自如下修饰的核苷酸：无碱基核苷酸、反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸、2'-卤素修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基烷基修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸或2'-脱氧修饰的核苷酸；
核苷酸NL1选自所述核苷酸NL所定义的核苷酸，或选自如下核苷酸：5'-乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸、5'-环丙基磷酸酯修饰的核苷酸或5'-烷基取代基磷酸酯修饰的核苷酸；
每一个核苷酸NL2分别独立的为未经修饰的核苷酸或选自如下修饰的核苷酸：无碱基核苷酸、反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸、2'-卤素修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基烷基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-乙烯基修饰的核苷酸、2'-环丙基修饰的核苷酸、BNA、LNA或2'-脱氧修饰的核苷酸中。在一些可选的实施方式中，核苷酸NL为修饰的核苷酸时，每一个核苷酸NL分别独立的选自如下修饰的核苷酸：2'-甲氧基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸和2'-脱氧修饰的核苷酸；尤其是当核苷酸NL为所述[NL(NM)]8中的核苷酸NL时，每一个核苷酸NL分别独立的优选为2'-甲氧基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸或2'-脱氧修饰的核苷酸。
所述如式(A)所示双链寡核苷酸除了满足由上述A1和A2组成的通式，还优选具有如下特征中的至少一个：
(i)基本上不显著降低的熔融温度Tm值，所述不显著降低熔融温度Tm值指的是Tm值升高或不变，或降低幅度不超过10％(相比于未经核苷酸NM修饰的亲本寡聚双链核苷酸)；
(ii)正义链和反义链分别独立的含有不超过4个2′-卤素修饰的核苷酸，优选正义链和反义链分别独立的含有不超过4个2′-氟修饰的核苷酸；更优选反义链含有不超过4个2′-氟修饰的核苷酸；正义链含有不超过3个2′-氟修饰的核苷酸。
(iii)正义链和反义链分别独立的含有1～4个硫代磷酸酯核苷酸间键，例如可以为但不限于为含有1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键，优选正义链和反义链分别独立的至少含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键。
(iv)正义链和反义链分别独立的含有至少2个2'-甲氧基修饰，优选正义链和反义链分别独立的含有至少3个2'-甲氧基修饰，更优选至少含有5个2'-甲氧基修饰。
和/或，(v)所述双链寡核苷酸包含长度为17～25个核苷酸对的双链体区域，双链体区域长度例如可以为但不限于为17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸，优选正义链和反义链分别独立的含有17～23个核苷酸；更分别独立的优选含有19～23个核苷酸；进一步分别独立的优选含有19～21个核苷酸。
在一些可选的实施例中，式(A)所示的dsRNA每条链独立地具有17～23个核苷酸的长度；该反义链包含至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键联；正义链和/或反义链上独立地至少具有3个2'-甲氧基修饰。
在一些可选的实施例中，式(A)所示的dsRNA每条链独立地具有19～23个核苷酸的长度；且正义链和/或反义链上独立地至少具有5个2'-甲氧基修饰。
在一些可选的实施例中，式(A)所示的dsRNA每条链独立地具有19～21个核苷酸的长度，正义链和/或反义链上独立地至少具有5个2'-甲氧基修饰，且每条链独立地具有不超过4个2'-卤素修饰。并且，所述dsRNA可以连接配体，配体可与肝细胞或受体结合或靶向肝细胞或受体，在一些实施方案中，配体是多价配体，例如配体可以是GalNAc衍生物。
在一些可选的实施例中，式(A)所示的dsRNA在每条链的3'-末端或5’-末端或两端处包含一个或多个突出端区域和/或加帽基团。突出端的长度可以是1～6个核苷酸。突出端可以与靶序列形成错配，或者它可以与被靶向的基因序列互补。
在一些可选的实施例中，式(A)所示的dsRNA除修饰的核苷酸NM外，dsRNA正义链和反义链上还可以存在至少两种不同的修饰。在一些实施方案中，这种修饰是2'-O甲基、2'-氟或2’-脱氧修饰的组合。另外，在一些实施方案中，正义链和反义链还可以独立地采用2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2’-氟核苷酸之外的修饰基团，例如2’-叔丁基二甲基硅基核苷酸(TBDMS)修饰。
在一些可选的实施例中，式(A)所示的dsRNA还具有如下特征中的至少一个：(i)所述反义链包含不超过4个2’-氟修饰，正义链包含不超过3个2’-氟修饰；(ii)所述反义链和正义链每条链独立地包含至少2个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)反义链和正义链每条链均包含不低于5个2’-甲氧修饰；(iv)反义链包含一个或多个修饰核苷酸NM，所述核苷酸NM如上述式(Ⅰ)、式(Ⅱ)或式(Ⅲ)中的任一项所示。
在一些优选的实施方式中，所述双链寡核苷酸包含如A1b所示的正义链和如A2b所示的反义链，其中每条链的长度是14～30个核苷酸，该实施方式中反义链包含与靶基因序列互补的序列，并且该正义链包含与该反义链序列充分地互补以形成双链体区的序列，该实施方式中所述双链寡核苷酸如式(B)所示：
A1b：5’-(NA)x-(NL)s-(NL2)y-3'；
A2b：3'-(NB)z-(NL)t-[(NL)i-NM-(NL)7-i]8-NL1-5’式(B)；
其中，x和z分别独立的为0～6的整数，s为10～25的整数，y为0～3的整数，t为9～16的整数，i为0～7的整数；
其中，[(NL)i-NM-(NL)7-i]8为上述[NL(NM)]8中，只含有一个核苷酸NM的形式，因此其具有上述[NL(NM)]8的一般特征。i表示在[(NL)i-NM-(NL)7-i]8中，位于核苷酸NM的3'端的核苷酸NL数量，7-i表示位于核苷酸NM的5'端的核苷酸NL数量。
其中，在上述式(B)中，核苷酸NM选自上述式(Ⅰ)、式(Ⅱ)或式(Ⅲ)中的任一项结构所示；每一个核苷酸NL、每一个核苷酸NL1和每一个核苷酸NL2分别独立的选自未经修饰的核苷酸或选自如下经修饰的核苷酸：2′-脱氧修饰的核苷酸、无碱基核苷酸、2′-氟修饰的核苷酸和2′-O-甲基修饰的核苷酸中。其中，每一个核苷酸NA和每一个核苷酸NB分别独立的选自未经修饰的核苷酸或选自如下修饰的核苷酸：无碱基核苷酸、2′-氟修饰的核苷酸、2′-O-甲基修饰的核苷酸或2′-脱氧修饰的核苷酸。正义链A1b中的一个或多个核苷酸可以和反义链A2b中的一个或多个核苷酸互补，如上所述，互补不发生在(NL2)y区域中。
在另一些优选的实施方式中，所述双链寡核苷酸包含如A1c所示的正义链和如A2c所示的反义链，其中每条链的长度是17～25个核苷酸，该实施方式中反义链包含与靶基因序列互补的序列，并且该正义链包含与该反义链序列充分地互补以形成双链体区的序列，该实施方式中所述双链寡核苷酸如式(C)所示：
A1c：5’-(NA)x-(NL)s-3'；
A2c：3'-(NB)z-(NL)t-[(NL)i-NM-(NL)7-i]8-NL1-5’式(C)；
其中，x为0～3的整数，s为14～23的整数，z为1～3的整数，t为10～16整数，i为1～6的整数；式(C)中核苷酸NA、核苷酸NB、核苷酸NL、核苷酸NM和核苷酸NL1的定义分别与式(B)中所定义相同。并且，反义链上至少一个核苷酸NB经由硫代磷酸酯键联连接到相邻核苷酸上。
在一些可选的实施方式中，上述式(B)或式(C)表示的双链寡核苷酸，包含长度为19～21个核苷酸的正义链和长度为19-23个核苷酸的反义链，其中该反义链和正义链的序列彼此充分互补以形成17～21个碱基对的双链体区；并且正义链或反义链均独立地不具有超过5个的2′-氟修饰的核苷酸；该dsRNA在正义链和反义链的3′端处可以具有核苷酸突出端。例如，在反义链的3′端具有核苷酸突出端并且在反义链的5′端具有平端。
在一些可选的实施方式中，上述式(B)或式(C)表示的dsRNA进一步具有以下特征中的至少一个：(i)该反义链从5′-端开始计数的位置3-8处至少包含一个修饰核苷酸NM；核苷酸NM选自上述式(Ⅰ)、式(Ⅱ)或式(Ⅲ)中的任一项所示；(ii)该反义链或正义链均独立地包含1～4个硫代磷酸酯核苷酸间键，例如可以为但不限于为1、2、3或4个；(iii)该dsRNA的反义链或正义链上每条链均独立地包含至少5个2'-甲氧基修饰，以及每条链不超过4个2'-氟修饰；(iv)该正义链与配体缀合；(v)该dsRNA上包含一个或多个脱氧核糖核苷酸修饰；以及(v)该dsRNA上每条链上至少包含2′-O-甲基、2′-脱氧或2′-氟代修饰中的一种。
在一些可选的实施方式中，上述式(B)或式(C)表示的dsRNA具有如下特征的一个或多个或全部：
(a)正义链具有如下特征的一个或多个或全部：(i)19～21个核苷酸的长度；(ii)一个附接至3'端的配体，其中所述的配体包括通过支链接头附接的GalNAc衍生物；(iii)不低于5个的2'-OMe修饰以及不超过4个的2'-F修饰，以及0或1个的脱氧核苷酸；和，(iv)从正义链5’-末端计在核苷酸位置1～3之间至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键连接相邻核苷酸；
(b)反义链具有如下特征的一个或多个或全部：(i)21～23个核苷酸的长度，以及不低于5个的2'-OMe修饰以及不超过4个的2'-F修饰；(ii)以5’-末端计，第6～8位中至少存在一个上述式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示的核苷酸NM；(iii)从5’-末端计，在核苷酸位置1～3之间、和/或核苷酸位置21～23之间具有至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键联；以及任意地，该dsRNA具有在该反义链的3'-端的两个核苷酸突出端和在该反义链的5'-端的一个平端。
在一些可选的实施方式中，上述式(B)或式(C)表示的dsRNA具有如下特征的一个或多个或全部：
(a)正义链具有如下特征的一个或多个或全部：(i)19～21个核苷酸的长度；(ii)包含一个附接至3'端的配体，其中所述的配体包括通过支链接头附接的GalNAc衍生物；(iii)不低于5个的2'-OMe修饰以及不超过4个的2'-F修饰，以及0或1个的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸；和，(iv)从5’-末端计数，在核苷酸位置1～3之间至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键连接相邻核苷酸。
其中，优选地，2'-F、2'-脱氧等修饰优选在正义链中的位置是位于反义链第11、12、13位的对位。
(b)反义链具有如下特征的一个或多个或全部：(i)21-23个核苷酸的长度，以及不低于5个的2'-OMe修饰以及不超过4个的2'-F修饰；其中，从5’-末端计，2'-F修饰优选位于反义链2位，6位，14位和16位中的至少一个；(ii)以5’-末端计，第5～8位中至少存在一个上述式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示的核苷酸NM，优选为第5位、6位和7位中的至少一个为上述式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示的核苷酸NM；(iii)从5’-末端计，在核苷酸位置1～3之间、和/或核苷酸位置21～23之间具有至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键；以及任意地，该dsRNA具有在该反义链的3'-端的两个核苷酸突出端和在该反义链的5'-端的一个平端。
需要说明的是，本发明不限制上述式(A)、(B)和(C)中核苷酸的序列，在一些可选的实施例中，寡聚双链核苷酸的正义链和反义链的碱基序列如下所示，其中，大写字母A、U、G、C、T分别表示核苷酸的碱基种类：
表1.
编号 正义链(5′至3′方向) 反义链(5′至3′方向)
1 CCAAGAGCACCAAGAACUA UAGUUCUUGGUGCUCUUGGCU
2 CAGACAGACAAGACCAUCU AGAUGGUCUUGUCUGUCUGGA
3 GUACGUGGACUGGAUUCUG CAGAAUCCAGUCCACGUACUU
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了包含上述双链寡核苷酸药物组合物，该药物组合物含有本发明的双链寡核苷酸和药学上可接受的辅料。该药物组合物包含上述治疗有效量的双链寡核苷酸，该药物组合物适用于减少或抑制受试者的细胞中的特定靶基因的表达，特别是当受试者中的靶基因产物的过表达与某种/某类疾病相关时，由于上述dsRNA可以有效抑制靶基因表达，且其防脱靶效应更加优异，其中作为主要或辅助活性物质的dsRNA可以有效缓解或治疗各种相关疾病。
在一些可选的实施方式中，所述药物组合物用于预防、缓解或治疗由特定基因的表达而引起的病理状况或疾病。在一些可选的实施方式中，当上述dsRNA中携带GalNAc配体时，可以实现向肝细胞的RNA递送，从而可以减少或抑制受试者的细胞中的特定靶基因的表达，进而用于研究、治疗或缓解相关疾病。
药学上可接受的辅料包括但不限于溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、抗结块剂、矫味剂、抑菌剂、助悬剂、包衣剂、成膜剂、芳香剂、增黏剂、抗黏着剂、抗氧剂、抗氧增效剂、螯合剂、pH调节剂、吸附剂、增塑剂、表面活性剂、增稠剂、包合剂、保护剂、保湿剂、柔软剂、吸收剂、稀释剂、释放调节剂、压敏胶黏剂、硬化剂、空心胶囊、基质和药物载体材料中的一种或多种。
在一些可选的实施例中，所述药物组合物包含：(1)治疗有效量的本发明所述式A-C所示的dsRNA，(2)药学上可接受的载体或赋形剂。
在一些可选的实施例中，药物组合物中的dsRNA每条链具有19～23个核苷酸，且进一步地具有如下特征的至少一个：(i)在反义链位置2-9处的至少一个位置(从5'端计数)采用上述式(Ⅲ)中所示的修饰核苷酸NM；(ii)该反义链和有义链还独立地包含选自2’-甲氧基修饰、2’-氟修饰或2’-脱氧的其他种类修饰的至少两种；(iii)该反义链包含1～6个硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一些可选的实施例中，药物组合物中的dsRNA包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键，硫代磷酸酯核苷酸间键可位于正义链和/或反义链的3′或5′端。另外，该dsRNA可以在反义链的3′端具有核苷酸突出端并且在反义链的5′端具有平端。
在一些可选的实施例中，药物组合物中的dsRNA为包含配体形成dsRNA缀合物试剂，以促进dsRNA向特定组织或细胞的递送或摄取。该配体可以包含半乳糖、半乳糖胺、或N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)或其衍生物。该配体可以通过接头共价附于dsRNA正义链的5′或3′端。
本发明还提供了包含本发明的式A-C所示的双链寡核苷酸或药物组合物在制备用于治疗和/或预防由特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的药物中的用途。
在一些可选的实施方式中，上述用途中双链寡核苷酸或药物组合物中含有的双链寡核苷酸的核苷酸NM选自上述式(Ⅰ)、式(Ⅱ)或式(Ⅲ)中至少一种结构所示的修饰核苷酸。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种抑制靶基因表达的方法，将其应用于抑制靶基因表达时，能够有效抑制靶基因表达，脱靶效应低。
该方法包括通过皮下或静脉内给药向受试者递送本发明的dsRNA分子。其中，优选施用的dsRNA采用了上述式(Ⅰ)、式(Ⅱ)或式(Ⅲ)中的任一项结构所示的新型核苷类似物以及修饰模式，以消除或降低dsRNA的脱靶效应。在一个实施例中，这些方法包括将细胞或组织与本发明所述的dsRNA接触。该细胞或组织可以是体外或体内的。该受试者可以是任何动物，优选地是哺乳动物，包括但不限于：人，以及小鼠、大鼠、羊、牛、狗、猫等哺乳动物。优选地，所述的哺乳动物为人类。
本发明提供的抑制靶基因表达的方法可选地为疾病诊断和治疗目的的，或非疾病诊断和治疗目的的。在非疾病诊断和治疗目的的实施方式中，抑制靶基因表达可用于研究相关细胞信号通路研究、基因表达研究、药物研发或动物模型建立等领域；在疾病诊断和治疗目的的实施方式中，通过给予这些dsRNA试剂来抑制靶基因的表达的方法，以用于治疗各种疾病。例如当上述dsRNA中携带GalNAc配体时，可以实现向肝细胞的RNA递送，以治疗和肝脏相关的疾病。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
除非另有说明，本文各实施例中所述的碱基组成及修饰含义如下：大写字母A、U、G、C、T表示核苷酸的碱基组成，小写字母m表示其之前一位字母表示的核苷酸为2’-甲氧基修饰核苷酸；小写字母f表示其之前一位字母表示的核苷酸为2’-氟代修饰核苷酸；小写字母d表示其之前一位字母表示的核苷酸为脱氧核糖核苷酸(即2’-脱氧或2’-H修饰的核苷酸)；括号加大写字母TBDMS，即(TBDMS)，表示其前一位字母表示的核苷酸为2’-叔丁基二甲基硅基修饰核苷酸；括号加大写字母TOM，即(TOM)，表示其前一位字母表示的核苷酸为2’-三异丙基甲氧基硅烷修饰核苷酸；小写字母s表示其前后两位字母表示的核苷酸之间为硫代磷酸酯键连接。L96表示式(Ⅳ)所示的GalNAc缀合载体结构。L96载体结构如下所示：
除非另有说明，下述实施例中使用的试剂耗材(表2)及仪器设备(表3)均来源于下述厂家的市售产品。
表2.试剂耗材
表3.主要仪器设备
名称 生产厂家
全自动核酸提取仪 浙江瀚维科技有限责任公司
高速冷冻离心机 Eppendorf
NANODROP OneC Thermo Fisher Scientific
梯度PCR扩增仪 Eppendorf
荧光定量PCR仪 ABI StepOne Plus
凝胶成像仪 上海天能生命科学有限公司
电泳仪 北京六一仪器厂
CO2恒温培养箱 Thermo Fisher Scientific
生物安全柜 Esco Lifesciences
Tissuelyser II型全自动组织匀浆仪 上海净信实业发展有限公司
Synergy H1型酶标仪 Biotek
除非另有说明，下述实施例中的dsRNA(下述实施例中也使用siRNA指代dsRNA)序列均委托苏州贝信生物技术有限公司合成；质粒构建和PCR引物合成均委托北京擎科生物科技有限公司完成；实验动物C57BL/6J小鼠、ICR小鼠均购自斯贝福(北京)生物技术有限公司；血生化指标检测均委托北京希诺因生物科技有限公司完成。
除非另有说明，下述实施例中涉及体内/体外siRNA活性实验的Real-time PCR检测数据均采用ΔΔCt法对各测试组中目标基因mRNA进行相对定量计算，计算方法概述如下：
ΔCt(测试组)＝Ct(测试组目标基因)–Ct(测试组内参基因)；
ΔCt(对照组)＝Ct(对照组目标基因)–Ct(对照组内参基因)；
ΔΔCt(测试组)＝ΔCt(测试组)-ΔCt(对照组平均)；
ΔΔCt(对照组)＝ΔCt(对照组)-ΔCt(对照组平均)。
以对照组为基准，对测试组目标基因的mRNA表达水平进行归一化，定义对照组目标基因mRNA剩余表达水平为100％。
测试组目标基因mRNA相对剩余表达水平＝2-ΔΔCt(测试组)×100％；
测试组目标基因mRNA抑制率＝100％-测试组目标基因mRNA相对表达水平。
除非另有说明，下述实施例中所述试剂比例均按体积比(v/v)计算；体内/体外活性实验数据均以表示，实验数据均采用GraphPad prism 8.0软件进行制图和分析。
实施例1
siRNA的合成：
siRNA合成与通常的亚磷酰胺固相合成方法无异，当合成含TBDMS、TOM、TIPS等大空间体积基团结构的反义链，在需要引入大空间体积基团修饰的核苷酸时，将上述亚磷酰胺单体替换原母序列相应位点的核苷酸单体。
在ABI394合成仪上导入需要合成的siRNA序列(siRNA单链)，以Universal CPG/PS为载体，根据设定的合成程序进行合成，每个碱基的引入均需经过脱DMTr、偶联、氧化及盖帽四步反应。2'-TBDMS，2'-OMe，2'-F以及2'-TOM修饰的核苷亚磷酰胺单体均购自上海兆维科技发展有限公司。采用5-乙巯基-1H-四氮唑(ETT)作为活化剂(0.6M的乙腈溶液)，使用0.2M的氢化黄原素溶于1:1体积比的乙腈和吡啶(苏州柯乐玛)溶液作为硫代试剂，使用0.05M碘溶于9:1体积比的吡啶和水溶液(苏州柯乐玛)作为氧化剂。
合成结束后卸下载体吹干，使用浓氨水进行脱保护(50℃，16h)，反应结束后放入-20℃冰箱冷却10min。离心后将上清液转移到另一个离心管中，浓缩干后，采用RP-HPLC的方法进行纯化，流动相A为0.1M TEAA，流动相B为乙腈。对纯化收集的馏分进行HPLC、MS及UV检测，合格的馏分收集后进行冻干，得到siRNA单链。所得到的siRNA单链，进行退火最后得到siRNA双链。
下述实施例所涉及的siRNA化合物序列及修饰信息见表4。
表4.siRNA化合物的序列及修饰信息
实施例2
反义链不同位点TBDMS修饰的siRNA在HepG2细胞中对补体成分3(complementcomponent 3,CC3)mRNA的体外抑制活性。
本实施例采用体外细胞筛选方法评价了反义链不同位点TBDMS修饰化合物RX502002、RX502003、RX502004、RX502005、RX502006、RX502007、RX502008、RX502009、RX502010，无TBDMS修饰的对照化合物RX502001、以及阴性对照化合物RX000002在HepG2细胞中对目标靶基因CC3的抑制活性。
2.1供试品配制：将上述每一个siRNA供试品离心后按照每管的规格加适量1×PBS溶解，配置成20μM母液，再进一步用1×PBS稀释至5μM工作液。
2.2细胞培养与铺板：
将HepG2细胞在含10％ FBS的DMEM培养基中，37℃，5％ CO2培养箱中培养增殖。铺板前弃去培养基，0.25％胰酶漂洗，胰酶消化细胞后培养基终止消化，重悬细胞，800rpm离心5min，用新鲜的含10％FBS的DMEM培养基重悬，计数，稀释细胞密度至1×105cells/mL，充分混匀后，24孔板铺板，500μL/孔；培养24h后进行转染操作。
2.3细胞转染
2.3.1配制溶液1-siRNA混合液：按每细胞孔49.4μL Opti-MEM与0.6μL siRNA受试物工作液(5μM)混合均匀。每个siRNA供试品配制3个细胞复孔。
2.3.2配制溶液2-Lipofectamine 3000混合液：轻轻颠倒混匀转染试剂，按照每个细胞孔48μL Opti-MEM稀释2μL Lipo3000，轻轻吹吸3～5次，混匀，静置5min；每个siRNA供试品配制3个细胞复孔。
2.3.3配制溶液3-溶液1与溶液2混合物：将一份(50μL)溶液1与一份(50μL)溶液2轻柔混合，配置成溶液3(100μL)转染复合物，室温下孵育20min。
2.3.4取出待转染的细胞培养板，弃去原培养基，加入500μL Opti-MEM。加入孵育完成的溶液3(100μL)逐滴加入细胞培养孔中，得到每个细胞转染孔siRNA受试物浓度约为5nM。将细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱继续培养4小时，每孔补加1mL含20％ FBS的DMEM培养基。继续置于37℃，5％CO2培养箱培养24小时。
Blank对照组为正常培养HepG2细胞，不经任何转染操作；Mock对照组为转染复合物中不加入任何siRNA，仅加入Lipofectamine 3000转染试剂的对照组。
2.4检测：
RNA提取：使用浙江瀚维科技有限责任公司的全自动核酸提取仪及核酸提取试剂盒，按照说明书记载的方法提取各孔细胞中的总RNA。
逆转录反应：将每孔细胞提取的总RNA分别取1μg，使用Promega公司反转录试剂盒(Reverse Transcription System，A3500)并选取Oligo(dT)15逆转录引物，按照试剂盒说明书记载的方法配置20μL逆转录体系并完成逆转录反应。反应结束后，向逆转录体系中加入80μL RNase-Free水，得到用于Real-time PCR检测的cDNA溶液。
Real-time PCR检测：使用ABI公司SYBRTMSelect Master Mix(Catalog number:4472908)试剂，按照试剂盒说明书记载的方法配置每PCR检测孔20μL Real-time PCR反应体系，每个检测体系中含有5μL上述逆转录反应得到的cDNA模板、10μL SYBRTMSelectMaster Mix、0.5μL 10μM上游引物、0.5μL 10μM下游引物(引物信息见表5)、4μLRNase-FreeH2O。将配置好的反应体系置于ABI StepOnePlus PCR仪上，使用三步法进行Real-time PCR扩增，扩增程序为95℃预变性10min，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复变性、退火、延伸的过程40个循环。程序完成后通过上述ΔΔCt法计算基因表达差异。
表5序列信息
2.5分析：
由实施例2结果可知，siRNA反义链不同位点TBDMS修饰对siRNA的体外细胞活性影响存在一定差异，反义链6位(RX502007)、7位(RX502008)、8位(RX502009)、9位(RX502010)TBDMS修饰与无TBDMS修饰的对照序列(RX502001)活性相当(图1，表6)。
表6.HepG2转染了本实施例所测各受试物后，对靶基因CC3 mRNA的抑制活性
组别 抑制率平均值 SD值
Blank -5.78％ ±0.2363
Mock 0.00％ ±0.0605
RX000002 -8.37％ ±0.0643
RX502001 65.64％ ±0.0394
RX502002 47.78％ ±0.0477
RX502003 10.39％ ±0.0929
RX502004 30.85％ ±0.1613
RX502005 18.25％ ±0.1656
RX502006 35.20％ ±0.0516
RX502007 59.27％ ±0.1073
RX502008 57.67％ ±0.1325
RX502009 58.46％ ±0.1111
RX502010 60.98％ ±0.1312
实施例3
反义链不同位点TBDMS修饰的siRNA缀合物在小鼠原代肝细胞中对血管生成素样蛋白3(angiopoietin-like 3，ANGPTL3)mRNA的体外抑制活性
本实施例采用体外小鼠原代肝细胞筛选方法评价了反义链不同位点TBDMS修饰的siRNA缀合物RZ597025、RZ597026、RZ597027、RZ597028、RZ597029、RZ597030、RZ597031，无TBDMS修饰的对照缀合物RZ597024、以及不靶向任何基因的阴性对照缀合物RZ000002在小鼠原代肝细胞中对目标靶基因ANGPTL3的抑制活性。
3.1供试品配制：
将上述每一个siRNA缀合物供试品离心后按照每管的规格加适量1×PBS溶解，配置成20μM母液，再进一步用1×PBS稀释至5μM工作液。
3.2小鼠原代肝细胞分离：
(1)麻醉：将C57BL/6j小鼠腔注射0.04mL/10g的10％水合氯醛溶液。
(2)灌流：固定动物并用75％乙醇消毒其腹部和胸部，打开腹腔找到肝门静脉和下腔静脉。将留置针由下腔静脉靠下端进针，开始以120滴/min的速率灌注HBSS溶液，剪开肝门静脉，确认灌流液从被剪断的肝门静脉流出，固定好输液器，继续灌注4分钟。
(3)消化肝细胞：更换含0.08％ IV型胶原酶(Collagenase from Clostridiumhistolyticum,Sigma)的HBSS以120滴/min的速度继续灌注8分钟。
(4)分离原代肝细胞：从动物体内取出灌注后的肝脏，置于含10mL DMEM的无菌培养皿中撕碎。用细胞筛(75μm)过滤除去未消化的肝组织及结缔组织。离心，用DMEM重悬清洗细胞两次。加入10mL含10％FBS的DMEM培养基重悬、计数，待进行药物自由摄取操作。
3.3siRNA缀合物的自由摄取：
将新鲜分离的小鼠原代肝细胞铺板至I型胶原包被的12孔细胞培养板(Corning公司)中，每孔含5×105活细胞、2mL含10％FBS的DMEM培养基。
每个细胞孔分别加入上述5μM siRNA缀合物工作液4μL，轻柔混合。得到每个细胞孔中siRNA缀合物的终浓度为10nM。Blank对照组为未进行任何siRNA缀合物自由摄取操作的原始小鼠原代肝细胞。将自由摄取处理后的小鼠原代肝细胞置于37℃，5％CO2培养箱继续培养24h。
3.4检测：
RNA提取：使用浙江瀚维科技有限责任公司的全自动核酸提取仪及核酸提取试剂盒，按照说明书记载的方法提取各孔细胞中的总RNA。
逆转录反应：将每孔细胞提取的总RNA分别取1μg，使用Promega公司反转录试剂盒(Reverse Transcription System，A3500)选取Oligo(dT)15逆转录引物，按照试剂盒说明书记载的方法配置20μL逆转录体系并完成逆转录反应。反应结束后，向逆转录体系中加入80μL RNase-Free水，得到用于Real-time PCR检测的cDNA溶液。
Real-time PCR检测：使用ABI公司SYBRTMSelect Master Mix(Catalog number：4472908)按照试剂盒说明书记载的方法配置每PCR检测孔20μL Real-time PCR反应体系，每个检测体系中含有5μL上述逆转录反应得到的cDNA模板、10μL SYBRTMSelect MasterMix、0.5μL 10μM上游引物、0.5μL 10μM下游引物(引物信息见表7)、4μLRNase-Free H2O。将配置好的反应体系置于ABI StepOnePlus PCR仪上，使用三步法进行Real-time PCR扩增，扩增程序为95℃预变性10min，然后95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，重复变性、退火、延伸的过程40个循环。程序完成后通过上述ΔΔCt法计算基因表达差异。
表7.引物序列表
3.5分析：
由实施例3结果可知，siRNA反义链5位(RZ597027)、6位(RZ597028)、7位(RZ597029)、8位(RZ597030)、9位(RZ597031)对TBDMS修饰耐受性良好，RZ597027和RZ597028与无TBDMS修饰的对照序列(RZ597024)的体外活性大体相当，RZ597029、RZ597030、RZ597031甚至比无TBDMS修饰的对照序列(RZ597024)的体外活性更优(图2，表8)。
表8.显示小鼠原代肝细胞自由摄取本实施例所测各受试物后，对靶基因ANGPTL3mRNA的抑制活性。
实施例4
反义链不同位点TOM修饰的siRNA缀合物在小鼠原代肝细胞中对凝血因子XI(Factor XI,FXI)mRNA的体外抑制活性
采用与实施例3相同的实验方法，评价了反义链不同位点TOM修饰的siRNA缀合物在小鼠原代肝细胞中对目标靶基因FXI的抑制活性。区别在于，本实施例使用了反义链不同位点TOM修饰的siRNA缀合物RZ594002、RZ594003、RZ594004、RZ594005、RZ594006，无TOM修饰的对照缀合物RZ594001替换了实施例3中使用的siRNA缀合物；区别在于，本实施例使用了表9所示的靶基因FXI检测引物替换了实施例3中使用的靶基因检测引物。根据前述ΔΔCt法对各测试组中目标基因mRNA进行相对定量计算。
表9.引物序列表
实施例4的结果表明，siRNA反义链5位(RZ594002)、6位(RZ594003)、7位(RZ594004)、8位(RZ594005)、9位(RZ594006)TOM修饰与无TOM修饰的对照序列(RZ594006)的体外活性大体相当，其中RZ594004、RZ594005具有比无TOM修饰的对照序列(RZ594001)更好的体外活性(图3，表10)。
表10.小鼠原代肝细胞自由摄取本实施例所测各受试物后，对靶基因FXI mRNA的抑制活性
组别 抑制率平均 SD值
Blank 0.00％ ±0.1536
RZ000002 1.53％ ±0.1145
RZ594001 51.03％ ±0.0469
RZ594002 39.72％ ±0.0858
RZ594003 33.89％ ±0.0995
RZ594004 57.94％ ±0.0651
RZ594005 60.03％ ±0.1274
RZ594006 47.90％ ±0.1594
实施例5
反义链不同位点TBDMS修饰的siRNA缀合物在小鼠体内对ANGPTL3 mRNA的抑制活性
本实施例采用小鼠体内靶基因抑制活性评估方法评价了反义链不同位点TBDMS修饰的siRNA缀合物RZ597027、RZ597028、RZ597029、RZ597030、RZ597031，以及无TBDMS修饰的对照缀合物RZ597024在小鼠体内对目标靶基因ANGPTL3的抑制活性
将6-8周龄C57BL/6j小鼠按体重随机分组，每组15只，共7组。每组小鼠分别采用腹部皮下给药方式给予上述siRNA缀合物，每只给药剂量3mg/kg，给药体积5mL/kg。PBS对照组给予同样体积的无siRNA缀合物PBS溶液。给药当天记为第一天(D1)，给药后分别于D8、D15和D29每组处死5只小鼠。对动物进行大体解剖，收集肝组织，切割成数个2mm3小块用RNAlater保存。从RNAlater中取出适量肝组织样本在Tissuelyser II型全自动组织匀浆仪中破碎60s，按照实施例3中记载的检测方法完成RNA提取、逆转录反应和Real-time PCR检测，并根据前述ΔΔCt法对各测试组中目标基因mRNA进行相对定量计算。
实施例5的结果表明，siRNA反义链5位(RZ597027)TBDMS修饰对序列体内活性影响相对较大，但反义链6位(RZ597028)、7位(RZ597029)、8位(RZ597030)、9位(RZ597031)对TBDMS修饰耐受性良好，RZ597028、RZ597029体内活性和持续时间与无TBDMS修饰的对照序列(RZ597024)相当，RZ597030、RZ597031具有比无TBDMS修饰的对照序列(RZ597024)更好的体内活性和药效持续作用(图4，表11)。
表11.给予本实施例所述siRNA缀合物后，小鼠体内目标靶基因的抑制活性
实施例6
反义链不同位点TOM修饰的siRNA缀合物在小鼠体内对CC3 mRNA的抑制活性
本实施例采用小鼠体内靶基因抑制活性评估方法评价了反义链不同位点TOM修饰的siRNA缀合物RZ502014、RZ502015，以及无TOM修饰的对照缀合物RZ002001在小鼠体内对目标靶基因CC3的抑制活性。
按照实施例5中记载的体内实验方法，将6-8周龄C57BL/6j小鼠按体重随机分组，每组5只，共4组。每组小鼠分别采用腹部皮下给药方式给予上述siRNA缀合物，每只给药剂量3mg/kg，给药体积5mL/kg。PBS对照组给予同样体积的无siRNA缀合物PBS溶液。给药当天记为第一天(D1)，给药后分别于D8处死小鼠。收集肝组织进行RNA提取、逆转录反应和Real-time PCR检测，并根据前述ΔΔCt法对各测试组中目标基因mRNA进行相对定量计算。
区别在于，本实施例使用了反义链不同位点TOM修饰的siRNA缀合物RZ502014、RZ502015，无TOM修饰的对照缀合物RZ002001替换了实施例5中使用的siRNA缀合物，并使用实施例1中记载的引物(CC3靶点)进行了Real-time PCR检测。
实施例6的结果表明，siRNA反义链7位(RZ502014)、9位(RZ502015)对于TOM修饰耐受性良好，对靶基因CC3的抑制活性仅略弱于无TOM修饰的对照序列(RZ002001)(图5，表12)。
表12.给予本实施例所述siRNA缀合物后，小鼠体内目标靶基因的抑制活性
组别 抑制率平均值 SD值
PBS 0.00％ ±0.2104
RZ000002 77.47％ ±0.0817
RZ502014 65.89％ ±0.1370
RZ502015 57.31％ ±0.1127
实施例7
反义链不同位点TBDMS修饰的siRNA在体外psiCHECK系统中的在靶活性评估
根据Ui-Tei，K等(Ui-Tei,K.,et al.,Functional dissection of siRNAsequence by systematic DNA substitution:modified siRNA with a DNA seed arm isa powerful tool for mammalian gene silencing with significantly reduced off-target effect.Nucleic Acids Res,2008.36(7):p.2136-51.)记载的体外siRNA脱靶评估方法构建siRNA在靶效应评估psiCHECK质粒，并通过双荧光素酶报告系统反应所测试siRNA对靶标序列的抑制活性。
本实施例评价了反义链不同位点TBDMS修饰的siRNA缀合物RX597002、RX597003、RX597004、RX597005、RX597006、RX597007、RX597008，以及无TBDMS修饰的对照缀合物RX597001在psiCHECK系统中对靶标序列的在靶活性。
7.1质粒构建：
依据RX597001的碱基序列设计相应靶标序列，该靶标序列与RX597001及本实施例中所述的各TBDMS修饰siRNA的反义链完全反向互补，因此各siRNA对靶标序列的抑制效果可以反映出各siRNA对目标基因表达的抑制作用。该靶标序列的碱基组成为5'-AGCCAAGAGCACCAAGAACTA-3'(Seq_83)，将该序列插入到psiCHECKTM-2(Promega)的多克隆位点位点中，构建成GSCM在靶质粒。该质粒的构建和纯化委托北京擎科生物科技有限公司完成。
7.2供试品配制：
(1)siRNA供试品配制：将上述每一个siRNA供试品离心后按照每管的规格加适量1×PBS溶解，并进一步用PBS将每一个siRNA供试品分别稀释至4000nM、1000nM、250nM、62.5nM、15.625nM、3.91nM、0.977nM、0.244nM、0.061nM、0.0153nM以及0.0038nM共11个不同的工作液浓度。
(2)质粒配置：将GSCM质粒用PBS稀释至200ng/μL工作液浓度。
7.3细胞培养与铺板：
将HEK293A细胞在含10％ FBS的DMEM培养基，37℃，5％CO2培养箱中培养增殖。铺板前弃去培养基，0.25％胰酶漂洗，胰酶消化细胞后培养基终止消化，重悬细胞，800rpm离心5min，用新鲜含10％FBS的DMEM培养基重悬，计数，调整至8×104细胞/mL，铺板至96孔培养板中，每孔100μL，8×103细胞/孔，继续培养24h后进行转染操作。转染前弃去培养板中的DMEM培养基，更换为80μL Opti-MEM培养基。
7.4细胞转染：
7.4.1配置溶液1——siRNA和质粒混合液：针对每一siRNA供试品的11个不同浓度工作液，每个细胞复孔分别取每个浓度的siRNA工作液1μL、质粒工作液(200ng/μL)0.05μL，加入到8.95μL Opti-MEM培养基中，混匀，配制成转染1个细胞孔的溶液1。每个siRNA供试品的每个浓度配制3个细胞复孔的溶液1。
7.4.2配置溶液2——Lipofectamine 3000混合液：轻轻颠倒混匀转染试剂，按照每个细胞孔9.8μL Opti-MEM和0.2μL Lipo3000混合，轻轻吹吸3～5次混匀，静置5min；每个siRNA供试品的每个浓度配制3个细胞复孔的溶液2。
7.4.3配置溶液3——溶液1与溶液2混合物：将一份(10μL)溶液1与一份(10μL)溶液2轻柔混合，配置成溶液3(20μL)转染复合物，室温下孵育20min。
取出待转染的细胞培养板，弃去原培养基，加入80μL Opti-MEM。加入孵育完成的溶液3(20μL)逐滴加入细胞培养孔中，配置成每个siRNA供试品终浓度分别40nM、10nM、2.5nM、0.625nM、0.15625nM、0.0391nM、0.00977nM、0.00244nM、0.00061nM、0.000153nM和0.000038nM的转染体系。将细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱继续培养4小时，每孔补加100μL含20％ FBS的DMEM培养基。继续置于37℃，5％CO2培养箱培养24小时。
将以仅含有质粒，不含有siRNA的转染复合物组作为空白对照组。
7.5检测：
弃去96孔培养板中培养基，按照Luciferase Assay System(Promega)试剂盒说明书记载的方法，加入LAR II底物，在摇床上室温孵育10min；取120μL底物I，转移到96孔酶标板上，在Synergy H1酶标仪(Biotek)上读取Firefly化学发光值；再向每孔加入60μL Stop&Glo底物，在摇床上室温孵育10min，在酶标仪上读取Renilla化学发光值。根据每孔检测到的Firefly和Renilla发光值计算siRNA的抑制活性，计算方法如下：
每孔发光相对值：Ratio＝Renilla/Firefly
siRNA供试品组的靶标相对表达水平＝(Ratio(供试品)/Ratio(对照))×100％
siRNA对目标序列的抑制率＝(1-siRNA供试品组的靶标相对表达水平)×100％。
半抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration，IC50)的计算：依据每个siRNA供试品的不同浓度下的靶标相对表达水平，利用GraphPad Prism 8.0的非线性回归(Nonlinear regression(curve fit))分析功能拟合log(inhibitor)vs.response—Variable slope(four parameters)剂量-效应曲线，获得IC50求解公式Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))；
其中Y为靶标相对表达水平，取值50；X为转染siRNA浓度的log对数值；Bottom是稳态期底部的Y值；Top是稳态期顶部的Y值，LogIC50是Y值稳态期底部和顶部之间一半时对应的X值，而HillSlope则是曲线在LogIC50处的斜率。
实施例7的结果表明，siRNA反义链3位(RX597002)、4位(RX597003)、5位(RX597004)、6位(RX597005)、7位(RX597006)、8位(RX597007)、9位(RX597008)均对TBDMS修饰耐受性良好，体外psiCHECK活性与无TBDMS修饰的对照序列(RX597001)大体相当，其中RX597007(IC50＝0.0160)、RX597008(IC50＝0.0112)的psiCHECK系统体外活性更是明显优于RX597001(IC50＝0.0420)(图6A～6H，表13)。
表13.给予本实施例所测试的各siRNA受试物后，体外psiCHECK系统检测的在靶活性IC50值
组别 IC50(nM) R2
RX597001 0.0420 0.9927
RX597002 0.0392 0.9798
RX597003 0.0946 0.9713
RX597004 0.0448 0.9854
RX597005 0.0568 0.9463
RX597006 0.0604 0.9484
RX597007 0.0160 0.9842
RX597008 0.0112 0.9935
实施例8
反义链不同位点TBDMS修饰的siRNA在体外psiCHECK系统中的脱靶活性
采用与实施例7相同的实验和数据分析方法，评估反义链不同位点TBDMS修饰的siRNA缀合物RX597002、RX597003、RX597004、RX597005、RX597006、RX597007、RX597008，以及无TBDMS修饰的对照缀合物RX597001在psiCHECK系统中的脱靶活性。与实施例7的区别仅在于，本实施例采用的脱靶评估质粒(GSSM质粒)插入序列为5'-CTAACCTCTACACAAGAACTA-3'(Seq_84)，该序列仅与siRNA反义链5’-末端1-9位核苷酸反向互补配对，其余位点均为碱基错配，因此可以用于siRNA的miRNA样脱靶效应模拟评估。siRNA受试物对插入的目标序列抑制活性越高，表明miRNA样脱靶效应越强。
实施例8的结果表明，无TBDMS修饰的对照序列(RX597001)具有miRNA样脱靶作用，脱靶IC50值为11.479nM。而反义链3位(RX597002)、4位(RX597003)、5位(RX597004)、6位(RX597005)、7位(RX597006)、8位(RX597007)、9位(RX597008)TBDMS修饰后的siRNA受试物均未检测出脱靶IC50值，表明该修饰方案在保持甚至提高序列活性的同时，显著改善或消除了对照序列的miRNA样脱靶作用(图7A～7H，表14)。
表14.给予本实施例所测试的各siRNA受试物后，体外psiCHECK系统检测的脱靶活性IC50值
组别 IC50(nM) R2
RX597001 11.479 0.7810
RX597002 未检出 N/A
RX597003 未检出 N/A
RX597004 未检出 N/A
RX597005 未检出 N/A
RX597006 未检出 N/A
RX597007 未检出 N/A
RX597008 未检出 N/A
实施例9
反义链不同位点TBDMS修饰的siRNA在小鼠中的毒性评估：
本实施例评估了siRNA反义链不同位点TBDMS修饰的siRNA缀合物RZ597027、RZ597028、RZ597029、RZ597030，以及无TBDMS修饰的对照缀合物RZ597024在ICR小鼠体内的肝毒性效果。
将6-8周龄的ICR小鼠按体重随机分组，每组6只，雌雄各半。每组小鼠分别采用颈背部皮下注射的方式给予上述siRNA缀合物，给药剂量300mg/kg，给药体积10mL/kg。PBS对照组给予同样体积的无siRNA缀合物PBS溶液。给药当天记为(第一天)D1，给药后于D8对每只小鼠进行眼眶采血，采血量为0.6mL，采血后在37℃下孵育60min后，在4℃下，3000rpm转速离心15min获得血清。血清样本送至北京希诺因生物科技有限公司进行肝功指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)浓度检测。
实施例9的结果表明，与PBS对照组相比，给予ICR小鼠300mg/kg无TBDMS修饰的siRNA缀合物(RZ597024)后，在雌性及雄性小鼠中均出现显著的ALT和AST水平升高，表明该siRNA缀合物具有较为严重的肝毒性。而反义链5位(RZ597027)、6位(RZ597028)、7位(RZ597029)TBDMS修饰后的siRNA缀合物与RZ597024组相比，ALT和AST水平显著降低，接近PBS对照组水平，表明修饰后化合物对肝毒性有明显改善。RZ597030(反义链8位TBDMS修饰)对ALT和AST水平亦有改善趋势(图8A和图8B)。
实施例10
反义链不同位点TBDMS修饰的siRNA的双链解离温度(Tm值)测定：
本实施例评估了siRNA反义链不同位点TBDMS修饰的siRNA缀合物RZ597027、RZ597028、RZ597029，以及无TBDMS修饰对照缀合物RZ597024的双链解离温度(Tm值)，通过将上述siRNA缀合物配制成0.02mg/mL的水溶液，在Agilent Cary紫外工作站的UV-Vis双池温控检测器模块上测定260nm波长下的温度-吸光度曲线，程序设定光谱带宽2nm，起始温度20℃，加热速率0.5℃/min，结束温度95℃。双链热解离温度Tm按照仪器说明书由温度-吸光度曲线的一阶导数计算获得。各siRNA缀合物的Tm值、以及与无tndms修饰的对照缀合物RZ597024的ΔTm值计算结果如下表15。
表15.反义链不同位点TBDMS修饰的siRNA的双链解离温度(Tm值)
实施例10的结果表明，与无TBDMS修饰对照缀合物RZ597024相比，反义链5位(RZ597027)、6位(RZ597028)、7位(RZ597029)TBDMS修饰后，siRNA缀合物Tm值小幅增加，提示上述TBDMS修饰后的siRNA缀合物热力学稳定性保持稳定或略有提高。
实施例11
反义链不同位点TOM修饰的siRNA的双链解离温度(Tm值)测定：
采用与实施例10相同的实验方法，本实施例评估了siRNA反义链不同位点TOM修饰的siRNA缀合物RZ502014、RZ502015，以及无TOM修饰对照缀合物RZ002001的双链解离温度(Tm值)。区别仅在于，本实施例采用siRNA缀合物RZ502014、RZ502015和RZ002001取代了实施例10中的siRNA缀合物。
本实施例中各siRNA缀合物的Tm值、以及与无TOM修饰的对照缀合物RZ002001的ΔTm值计算结果如下表16。
表16.反义链不同位点TOM修饰的siRNA的双链解离温度(Tm值)
siRNA缀合物 Tm △Tm
RZ002001 85.5 N/A
RZ502014 86.5 1
RZ502015 85.5 0.0
实施例11的结果表明，与无TOM修饰对照缀合物RZ002001相比，反义链7位(RZ502014)和9位(RZ502015)TOM修饰后，siRNA缀合物Tm值基本保持稳定或小幅升高，提示上述TOM修饰方法基本不影响双链siRNA缀合物的热力学稳定性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种修饰的双链寡核苷酸分子，其包含正义链和反义链，所述正义链和所述反义链的核苷酸序列至少部分地反向互补；其特征在于，以反义链的5'-末端计的位置1～9位含有至少一个修饰的核苷酸NM，所述核苷酸NM为2'-含Si基团修饰的核苷酸；且在该修饰的核苷酸中，所述2'-含Si基团的空间体积大于2'-甲氧基基团的空间体积。
2.根据权利要求1所述的双链寡核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸NM为2'-O-Si-基修饰的核苷酸；
或者，所述核苷酸NM的结构如下式(Ⅰ)所示，或为式(Ⅰ)的互变异构体：
其中，X选自CH2、O、S或NH；
B选自核苷酸碱基、碳原子数为6～12的杂芳基、杂环碱基或碱基替代基团；
所述核苷酸碱基选自：尿嘧啶或其衍生物，胸腺嘧啶或其衍生物，胞嘧啶或其衍生物，5-甲基胞嘧啶或其衍生物，腺嘌呤或其衍生物，或，鸟嘌呤或其衍生物；
R1和R2分别独立的选自H或-(O)m(CH2)nOR3，且R1和R2不同时为H或-(O)m(CH2)nOR3；m选自0或1，n选自0～3的整数；其中，-(O)m(CH2)nOR3取代基的空间体积大于甲氧基的空间体积，R3为含Si的基团。
3.根据权利要求1所述的双链寡核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸NM结构如下式(Ⅱ)所示，或为式(Ⅱ)的互变异构体：
其中，B选自：尿嘧啶或其衍生物，胸腺嘧啶或其衍生物，胞嘧啶或其衍生物，5-甲基胞嘧啶或其衍生物，腺嘌呤或其衍生物，或，鸟嘌呤或其衍生物；
R1和R2独立地选自H或-(O)m(CH2)nOR3，并且R1和R2不同时为H或-(O)m(CH2)nOR3；m选自0或1，n选自0～2的整数；其中，-(O)m(CH2)nOR3取代基的空间体积大于甲氧基的空间体积；
其中，R3为-Si(R4)3，其中每一个R4各自独立的选自：取代的或未取代的C1～C6烷基，取代的或未取代的C1～C6烷氧基，其中，取代基选自C1～C6烷基、羟基、卤素、碳原子数不超过6的烷氧基、氨基、碳原子数不超过12的环烷基、碳原子数不超过12的芳基或碳原子数不超过12的杂芳基；
优选地，n为0或1；
进一步优选地，R1或R2为-O-TOM基，且R1和R2不同时为-O-TOM基；
优选地，所述的核苷酸NM结构如下式(Ⅲ)所示，或为式(Ⅲ)的互变异构体：
B选自尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤；
R3为-Si(R4)3，其中，每一个R4各自独立的选自：取代的或未取代的C1～C6烷基，或，取代的或未取代的C1～C6烷氧基；其中，取代基选自C1～C6烷基、羟基、卤素、碳原子数不超过6的烷氧基或氨基；
优选地，R3选自TBDMS基或TIPS基。
4.根据权利要求1所述的双链寡核苷酸分子，其特征在于，所述双链寡核苷酸分子中除了修饰的核苷酸NM，还含有其他修饰的核苷酸；
其中，所述其他修饰的核苷酸选自如下中的至少一种：无碱基核苷酸、反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸、2'-卤素修饰的核苷酸、2'-甲氧基修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基烷基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、5'-乙烯基修饰的核苷酸、5'-环丙基修饰的核苷酸、BNA、LNA、5'-乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸、5'-环丙基磷酸酯修饰的核苷酸或5'-烷基取代基磷酸酯修饰的核苷酸；
优选地，所述其他修饰的核苷酸选自2'-甲氧基修饰的核苷酸、2'-卤素修饰的核苷酸和2'-脱氧修饰的核苷酸中的至少两种；
优选地，所述正义链和所述反义链同时含有2'-甲氧基修饰的核苷酸和2'-卤素修饰的核苷酸；
优选地，所述正义链和所述反义链分别独立的含有不超过4个2'-氟修饰的核苷酸；以及不低于5个2'-甲氧基修饰；
优选地，所述正义链含有14～40个核苷酸，优选含有14～30个核苷酸，更优选17～25个核苷酸，进一步优选含有17～23个核苷酸；
优选地，所述反义链含有14～40个核苷酸，优选含有14～30个核苷酸，更优选17～25个核苷酸，进一步优选含有19～23个核苷酸；
优选地，所述双链寡核苷酸分子含有19～21个碱基对的双链体区；
优选地，所述双链寡核苷酸分子中至少一个连接键被修饰；其中，连接键的修饰包括硫代磷酸酯核苷酸间键修饰或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的双链寡核苷酸分子，其特征在于，所述双链寡核苷酸分子还可以含有配体；
优选地，所述配体选自半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺或其衍生物；
优选地，所述配体通过接头共价附于所述双链寡核苷酸分子正义链的5'-末端或3'-末端；
优选地，所述正义链和所述反义链的3'-末端和/或5'-末端包含一个或多个突出端区域和/或加帽基团；
优选地，所述突出端区域含有1～6个核苷酸。
6.根据权利要求1～5任一项所述的双链寡核苷酸分子，其特征在于，所述双链寡核苷酸分子如下式(A)所示，所述双链寡核苷酸分子包含式A2所示的反义链以及如式A1所示的正义链；
式A1：5'-(NA)x-(NL)s-(NL2)y-3'；
式A2：3'-(NB)z-(NL)t-[NL(NM)]8-NL1-5'(A)；
其中，x选自0～6的整数；s选自10～40的整数；y选自0～3的整数；z选自0～6的整数；t选自10～30的整数；(NL2)y为不与反义链中的核苷酸发生碱基互补配对的突出端核苷酸；
每一个核苷酸NL独立的为未经修饰的核苷酸或选自如下修饰的核苷酸：无碱基核苷酸、反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸、2'-卤素修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基烷基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、5'-乙烯基修饰的核苷酸、5'-环丙基修饰的核苷酸、BNA、LNA或2'-脱氧修饰的核苷酸；
[NL(NM)]8为位于反义链5'-末端2～9位的由所述核苷酸NL和核苷酸NM组成的8个连续核苷酸，且其中含有至少一个核苷酸NM；核苷酸NM位于反义链5'-末端的2～9位中的任意位置；每一个核苷酸NM分别独立的选自上述式(Ⅰ)、式(Ⅱ)或式(Ⅲ)；
每一个核苷酸NA独立的为未经修饰的核苷酸或选自如下修饰的核苷酸：无碱基核苷酸、反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸、2'-卤素修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基烷基修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸或2'-脱氧修饰的核苷酸；
每一个核苷酸NB独立的为未经修饰的核苷酸或选自如下修饰的核苷酸：无碱基核苷酸、反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸、2'-卤素修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基烷基修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸或2'-脱氧修饰的核苷酸；
核苷酸NL1选自所述核苷酸NL所定义的核苷酸，或选自如下核苷酸：5'-乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸、5'-环丙基磷酸酯修饰的核苷酸或5'-烷基取代基磷酸酯修饰的核苷酸；
每一个核苷酸NL2独立的为未经修饰的核苷酸或选自如下修饰的核苷酸：无碱基核苷酸、反向无碱基核苷酸、反向脱氧核糖核苷酸、2'-卤素修饰的核苷酸、2'-O-甲氧基烷基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-乙烯基修饰的核苷酸、2'-环丙基修饰的核苷酸、BNA、LNA或2'-脱氧修饰的核苷酸；
优选地，所述[NL(NM)]8中，核苷酸NM位于反义链5'-末端的3～8位中的任意位置；
优选地，核苷酸NL为修饰的核苷酸时，每一个核苷酸NL1独立的选自如下修饰的核苷酸：2'-甲氧基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸或2'-脱氧修饰的核苷酸；
优选地，s选自10～25的整数，t选自10～16的整数；
优选地，所述[NL/NM]8中的每一个核苷酸NL1独立的选自如下修饰的核苷酸：2'-甲氧基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸或2'-脱氧修饰的核苷酸；每一个核苷酸NM独立的选自所述式(Ⅱ)或所述式(Ⅲ)所示的核苷酸；
更进一步优选地，所述双链寡核苷酸分子还具有如下特征中的至少一个：
(i)不显著降低的熔融温度Tm值；
(ii)所述正义链和反义链分别独立的含有不超过4个2'-卤素修饰的核苷酸，优选正义链和反义链分别独立的含有不超过4个2'-氟修饰的核苷酸；更优选反义链含有不超过4个2'-氟修饰的核苷酸，正义链含有不超过3个2'-氟修饰的核苷酸；
(iii)所述正义链和反义链分别独立的含有1～4个硫代磷酸酯核苷酸间键，优选正义链和反义链分别独立的至少含有2个硫代磷酸酯核苷酸间键；
(iv)所述正义链和反义链分别独立的含有至少2个2'-甲氧基修饰，优选正义链和反义链分别独立的含有至少3个2'-甲氧基修饰，更优选至少含有5个2'-甲氧基修饰；
(v)所述双链寡核苷酸分子包含长度为17～25个核苷酸对的双链体区域。
7.根据权利要求6所述的双链寡核苷酸分子，其特征在于，所述修饰的双链寡核苷酸分子包含如式A1b所示的正义链和如式A2b所示的反义链，其中每条链的长度是14～30个核苷酸，所述反义链包含与靶基因序列互补的序列，并且所述正义链包含与该所述反义链序列充分地互补以形成双链体区的序列，所述修饰的双链寡核苷酸分子如下式(B)所示：
式A1b：5'-(NA)x-(NL)s-(NL2)y-3'；
式A2b：3'-(NB)z-(NL)t-[(NL)i-NM-(NL)7-i]8-NL1-5'式(B)；
其中，x和z分别独立的选自0～6的整数，s选自10～25的整数，y选自0～3的整数，t选自9～16的整数，i选自0～7的整数；每一个核苷酸NL、每一个核苷酸NL1和每一个核苷酸NL2分别独立的选自未经修饰的核苷酸或选自如下经修饰的核苷酸：2'-脱氧修饰的核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸或2'-O-甲基修饰的核苷酸；其中，每一个核苷酸NA和每一个核苷酸NB分别独立的选自未经修饰的核苷酸或选自如下修饰的核苷酸：无碱基核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸或2'-脱氧修饰的核苷酸；
优选地，所述反义链上至少一个核苷酸NB经由硫代磷酸酯键联连接到相邻核苷酸上；
优选地，x选自0～3的整数，s选自14～23的整数，z选自1～3的整数，t选自10～16整数，i选自1～6的整数；
进一步优选地，所述双链寡核苷酸分子中，所述正义链或反义链分别具有如下特征：
(a)所述正义链具有如下特征(i)-(iv)的一个或多个或全部：
(i)19～21个核苷酸的长度；(ii)一个附接至3'端的配体，其中所述的配体包括通过支链接头附接的GalNAc衍生物；(iii)不低于5个的2'-OMe修饰以及不超过4个的2'-F修饰，以及0或1个的脱氧核苷酸；和，(iv)从正义链5'端计在核苷酸位置1～3之间至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键连接相邻核苷酸；
(b)所述反义链具有如下特征(i)-(iii)的一个或多个或全部：
(i)21～23个核苷酸的长度，以及不低于5个的2'-OMe修饰以及不超过4个的2'-F修饰；(ii)以5'-末端计，第6～8位中至少存在一个上述式(Ⅱ)或式(Ⅲ)所示的核苷酸NM；(iii)从5'-末端计，在核苷酸位置1～3之间，和/或核苷酸位置21～23之间具有至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键联；以及任意地，该dsRNA具有在该反义链的3'-端的两个核苷酸突出端和在该反义链的5'-末端的一个平端；
更进一步优选地，所述修饰的双链寡核苷酸分子的所述正义链及所述反义链的具体核苷酸序列选自下列各项组成的组：
正义链的核苷酸序列如Seq_41所示，反义链的核苷酸序列如Seq_42所示；
或，正义链的核苷酸序列如Seq_43所示，反义链的核苷酸序列如Seq_44所示；
或，正义链的核苷酸序列如Seq_45所示，反义链的核苷酸序列如Seq_46所示；
更进一步优选地，所述修饰的双链寡核苷酸分子的所述正义链及所述反义链选自下列各项组成的组：
正义链如Seq_2所示，反义链如Seq_7、8、9、10、11、12、13、14或15所示；
或，正义链如Seq_3所示，反义链如Seq_17、18、19、20、21、22或23所示；
或，正义链如Seq_4所示，反义链如Seq_25、26、27、28或29所示；
或，正义链如Seq_57所示，反义链如Seq_31或32所示；
或，正义链如Seq_58所示，反义链如Seq_34、35、36、37、38、39或40所示。
8.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-7任一项所述的双链寡核苷酸分子和药学上可接受的辅料。
9.权利要求1-7任一项所述的双链寡核苷酸分子或权利要求8所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防由特定基因的表达而引起的病理状况或疾病的药物中的用途。
10.一种抑制靶基因表达的方法，其特征在于，向受试者施用有效量的权利要求1-7任一项所述的双链寡核苷酸分子或权利要求8所述的药物组合物；
其中，所述施用包括采用皮下或静脉内给药的方式施用；
其中，所述受试者为哺乳动物，优选为人。
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