KR20230170691A - MicroRNA-27b 억제제들 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 miR-27b의 활성을 강력하게(potently) 억제할 수 있는, miR-27b에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 제공한다. 이러한 화합물들은 신경 질환들(neurological diseases)을 포함하는 PNS에서 또는 CNS에서 질병들의 치료를 위한 제약(pharmaceuticals)으로 유용하다.
Description
본 발명은 인간들과 같은 포유동물들에서 microRNA-27b (miR-27b)의 활성을 억제할 수 있는 새로운 화합물들 및 조성물들에 대한 것이다. 특히, 본 발명은 간질(epilepsy) 및 기억 장애들(memory disorders)을 포함하는, CNS 장애들을 치료하는 데 유용한 인간 인 비보(in vivo)에서 miR-27b의 활성을 조절할(modulating) 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물들을 제공한다.
간질은 전 세계적으로 약 5천만 명의 사람들에게 영향을 미치는 반복적인(recurrent) 자발적(spontaneous) 발작들(seizures)로 특징되는 하는 심각한 만성 신경 장애(neurological disorder)이다.
현재 이용 가능한 항간질제들(anti-epileptic drugs)은 일반적으로 환자들의 삼 분의 이에서 발작들을 통제하지만, 근본적인 병태생리학(pathophysiology)에는 영향을 미치지 않는다. 간질 환자들의 나머지 삼분의 일은 약물 내성이 있거나 또는 현재 이용 가능한 약물들로부터 심각한 부작용들(side effects)로 고통받는다.
약물 치료를 받을 선택이 없는 환자들에서 발작들을 피하는 대안은 케톤 생성 식단(ketogenic diet), 뇌 수술, 미주 신경(vagus nerve) 또는 두개내(intracranial) 자극이다.
증상성 (symptomatic) (후천성(acquired)) 간질의 발달(development)은 이온 채널들 및 신경전달물질 수용체들의 변화된 발현(altered expression), 시냅스(synaptic) 리모델링, 염증, 신경교증(gliosis) 및 신경세포 사멸(neuronal death)을 특히 포함하는 것으로 생각된다. 그러나 세포(cellular)와 분자 메커니즘에 대한 우리의 이해는 여전히 불완전하다. 현재 간질을 촉진할(precipitate) 가능성이 있는 뇌 손상(brain injury) 후 예방적 치료법들("항간질 유발(anti-epileptogenic)")은 없다. 유사하게, 예컨대, 뇌졸중(stroke), 또는 외상(trauma)인, 뇌 손상(brain damage) 또는 간질을 야기할 가능성이 있는 급성 신경 손상들(neurolgic injuries)을 치료하는, 또는 간질 지속증(status epilepticus) (SE)에 대한 특별한 신경 보호(neuroprotective) 치료법은 없다.
최근 데이터는 microRNAs (miRNAs)가 간질을 포함하는, 여러 신경학적 장애들(neurologic disorders)의 발병(pathogenesis)에 매우 중요하다는 것을 시사한다. MiRNAs는 유전자 발현의 전사 후 조절을 중재하는 짧은 (~ 22 nt) 내인성(endogenous) 논-코딩 RNA들의 클래스를 포함한다 (Ambros, Nature, 2004 Sep 16;431(7006):350-5/; Bartel, 2009 Jan 23;136(2):215-33).
성숙한 miRNAs는 miRISC 복합체를 타겟 mRNAs의 3' 비번역 영역 (untranslated regions) (UTRs)에 주로 위치한 부분적으로 상보적인 타겟 부위들로 디렉팅하여(directing), 타겟들의 번역 억제 및/또는 mRNA 분해를 야기하는 miRISC 복합체들에 대한 가이드 분자들로 역할을 한다 (van Rooij & Kauppinen, EMBO Mol Med, 2014 Jul;6(7):851-64). miRNA 타겟 인식을 인도하는 중요한 결정 요인은 타겟 mRNA 3' UTR에서 완벽하게 상보적인 시드 매치 부위와 miRNA 시드 영역 (성숙한 miRNA의 뉴클레오타이드들 2-7)의 염기쌍(base pairing)이다 Bartel, 2009 Jan 23;136(2):215-33). MicroRNA-27b (miR-27b)는 Nrf2/ARE 경로의 활성의 그것의 조절(regulation)을 통해 다수의 신경학적 컨디션들(neurological conditions)에 관련되는 것으로 보여져왔다. MiR-27b 안타고미르(antagomir)는 ICH-유도된(induced) Nrf2/ARE 경로의 활성화를 촉진하였고 지질 과산화(lipid peroxidation), 신경 염증(neuroinflammation), 세포사(cell death) 및 신경학적 결손들(neurological deficits)로 ICH 후 달리 보여지는(otherwise seen) 것을 감소시켰다. PC12 세포들에서, miR-27b 억제제(inhibitor)는 철-유도된 산화 스트레스(iron-induced oxidative stress), 염증(inflammation) 및 세포자멸사(apoptosis)를 감소시켰고, 그리고 이들 효과들은 Nrf2 넉다운(knockdown)에 의해 차단되었다. 이들 결과들은 miR-27b 억제가 ICH-유도된 뇌 손상(ICH-induced brain injury)을 완화한다(alleviates)는 것을 입증하였고, 이는 Nrf2/ARE 경로의 그것의 조절(regulation)에 의해 부분적으로 설명될 수 있다. Nrf2/ARE 경로의 유도는 간질의 치료에 유익한 것으로 보여져왔다.
산화 스트레스 및 활성 산소종(reactive oxygen species)의 증가된 생성은 특히 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 프리드리히 운동실조증(Friedrich's ataxia), 다발성 경화증(multiple sclerosis) 및 뇌졸중(stroke)을 포함하는 수많은 신경변성 컨디션들(neurodegenerative conditions)의 발병(pathogenesis)과 연루되어(implicated) 왔다. 내생(endogenous) 항산화 반응 경로는 세포 보호 효소들(cytoprotective enzymes)의 발현을 증가시켜 산화 스트레스로부터 세포들을 보호하고 그리고 전사 인자 핵 인자 적혈구 2-관련 인자 2
(nuclear factor erythroid 2-related factor 2) (NRF2)에 의해 조절된다(regulated). 항산화 유전자의 발현을 조절하는 것에 더하여, NRF2는 또한 항-염증 효과들을 발휘하고(exert) 미토콘드리아 기능 및 생물 발생(biogenesis) 둘다를 조절하는(modulate) 것으로 보여져왔다. 미토콘드리아 기능 장애(Mitochondrial dysfunction) 및 신경염증(neuroinflammation)은 신경변성 질환들(neurodegenerative diseases)의 치료를 위한 유망한 치료적 타겟으로 NRF2의 잠재력(potential)을 강조하는(underscores) 많은 신경변성 질환들(neurodegenerative diseases)의 특징들이다.
요약하면, 상기-언급된 문제들 중 일부를 극복하고 뇌 손상(brain damage)을 야기할 가능성이 있는 간질 및 다른 신경 손상들(neurological injuries)이 발달하는(develop) 프로세스들을 특이적으로(specifically) 타겟으로 하는 개선된 치료 또는 예방(prevention) 양식들(modalities)에 대한 필요가 여전히 있다.
도 1은 빈 벡터(empty vector)의 퍼센트로 반딧불이(Firefly)로 정규화된(normalized) 레닐라(Renilla) 신호의 억제(repression)의 수준들을 보여준다. n,N=2-3,4-6, 평균±SEM. 가장 강력한 안티-센스 올리고뉴클레오타이드들은 SEQ ID NO.: 8, 12, 16, 19 및 20이다.
도 2는 PC-12 세포들에서 측정되는 다섯 개의 miR-27b 안티센스 올리고뉴클레오타이드들의 도즈-반응 곡선들 및 IC50 값들을 보여준다. 도즈-반응 곡선들 및 IC50 값들, n,N=1,2, 기술적 복제들(technical replicates) 둘 다 보여진다, 3-파라미터 비-선형 곡선 적합도(fit).
도 3은 U-87 mg 세포들에서 레닐라 루시페라제 활성의 억제 해제(derepression)에 의하여 측정된, Seq ID 8, 12, 16, 19 및 20에 대한 IC50 값들을 보여준다, n,N=2, 4-6, 모든 생물학적 복제들이 표시된다. IC50 곡선들은 피트되었고(fitted), log(억제제) vs. 삼-파라미터 반응으로 최소 제곱 회귀(least squares regression)를 사용하여 효능(potency)이 계산되었다.
도 4는 PC-12 Adh 세포들 내로 antimiR-27b 올리고뉴클레오타이드들의 트랜스펙션(transfection) 후 miR-27b 직접(direct) (nrf2) 및 다운스트림(downstream) (hmox1, nqo1) 타겟 mRNA들의 발현에서 증가를 보여준다; n,N=3,6; 평균±SEM, 모든 기술적 복제들(technical replicates)이 표시된다(depicted). 정규화(normalisation)를 위해 스크램블된(scrambled) 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 ΔΔCt 방법을 사용하여 qPCR 결과들이 분석되었다. (이 실험에 사용된 Seq ID 20으로 정의된 올리고뉴클레오타이드는 Seq ID 22에 그것이 대응하도록(correspond) 하나의 구아닌(guanine)이 이노신(inosine)으로 치환한 것이다.)
도 5는 Seq ID 20 및 이노신-치환된(inosine-substituted) Seq ID 22의 효능(potency)을 보여준다. A: PC-12 Adh 세포들 내로 0.2, 1 및 5 nM antimiRs으로 트랜스펙션 후 레닐라 루시페라제 활성의 억제 해제. n,N=1,2; 평균±SEM. 모든 기술적 복제들이 표시된다. B: Seq ID 20 및 Seq ID 22의 IC50 값들 및 도즈-반응 곡선들. Seq ID 22는 하나의 구아닌(guanine)이 이노신 치환되지만 그 외에는 Seq ID 20과 동일하다. 도즈-반응 곡선들 및 IC50 값들, n,N=1,3, 평균, 3-파라미터 비-선형(non-linear) 곡선 적합도(fit)
도 2는 PC-12 세포들에서 측정되는 다섯 개의 miR-27b 안티센스 올리고뉴클레오타이드들의 도즈-반응 곡선들 및 IC50 값들을 보여준다. 도즈-반응 곡선들 및 IC50 값들, n,N=1,2, 기술적 복제들(technical replicates) 둘 다 보여진다, 3-파라미터 비-선형 곡선 적합도(fit).
도 3은 U-87 mg 세포들에서 레닐라 루시페라제 활성의 억제 해제(derepression)에 의하여 측정된, Seq ID 8, 12, 16, 19 및 20에 대한 IC50 값들을 보여준다, n,N=2, 4-6, 모든 생물학적 복제들이 표시된다. IC50 곡선들은 피트되었고(fitted), log(억제제) vs. 삼-파라미터 반응으로 최소 제곱 회귀(least squares regression)를 사용하여 효능(potency)이 계산되었다.
도 4는 PC-12 Adh 세포들 내로 antimiR-27b 올리고뉴클레오타이드들의 트랜스펙션(transfection) 후 miR-27b 직접(direct) (nrf2) 및 다운스트림(downstream) (hmox1, nqo1) 타겟 mRNA들의 발현에서 증가를 보여준다; n,N=3,6; 평균±SEM, 모든 기술적 복제들(technical replicates)이 표시된다(depicted). 정규화(normalisation)를 위해 스크램블된(scrambled) 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 ΔΔCt 방법을 사용하여 qPCR 결과들이 분석되었다. (이 실험에 사용된 Seq ID 20으로 정의된 올리고뉴클레오타이드는 Seq ID 22에 그것이 대응하도록(correspond) 하나의 구아닌(guanine)이 이노신(inosine)으로 치환한 것이다.)
도 5는 Seq ID 20 및 이노신-치환된(inosine-substituted) Seq ID 22의 효능(potency)을 보여준다. A: PC-12 Adh 세포들 내로 0.2, 1 및 5 nM antimiRs으로 트랜스펙션 후 레닐라 루시페라제 활성의 억제 해제. n,N=1,2; 평균±SEM. 모든 기술적 복제들이 표시된다. B: Seq ID 20 및 Seq ID 22의 IC50 값들 및 도즈-반응 곡선들. Seq ID 22는 하나의 구아닌(guanine)이 이노신 치환되지만 그 외에는 Seq ID 20과 동일하다. 도즈-반응 곡선들 및 IC50 값들, n,N=1,3, 평균, 3-파라미터 비-선형(non-linear) 곡선 적합도(fit)
발명의 개요
miR-27b 활성의 변형(modification)이 유익한, 질병들의 치료에서 사용(use)을 위해 miR-27b를 타겟으로 하는 강력한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 화합물들에 대한 시장에서의 필요가 있다. 본 발명은 miR-27b에 상보적인 신규한 매우 강력한(potent) 안티센스 올리고뉴클레오타이드들, SEQ ID NO: 5-22 중 어느 하나와 같은 안티센스 올리고뉴클레오타이드들의 유효 투여량(effective dosage)을 포함하는 약학적 조성물들을 포함하는, 조성물들, 및 miR27b의 조절(modulation)이 유익한 질병들의 치료를 위한 이러한 조성물들의 용도들(uses)을 제공한다. miR-27b에 상보적인 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드들, 및 약학적 조성물들을 포함하는, 이러한 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 포함하는 조성물들은 miR-27b의 강력한 억제제들이고, 그리고 결과적으로 인 비보(in vivo)로 사용될 때 Nrf2/ARE 경로의 상향조절(upregulation)을 야기한다. 일부 구현예들(embodiments)에서, 화합물들, 조성물들 예를 들어 약학적 조성물들을 사용하여 치료되는 질병들은 Nrf2/ARE 경로의 상향조절이 유익한 질병들이다. 일부 구현예들에서, 치료되는 질병(disease)은 신경 질환(neurological disease)과 같은, CNS의 질병이다.
한 측면에 따라, 본 발명은 길이가 18-19 핵염기들(nucleobases)의 서열을 포함하는 miR-27b (SEQ ID NO 1)에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이며, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 LNA/DNA 믹스머들(mixmers)이고 삼 초과의 연속(contiguous) DNA 뉴클레오타이드들의 스트레치를 함유하지 않고, 그리고 여기서 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 1 및 18 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결들(phosphorothioate internucleotide linkages)을 포함한다.
또다른 측면에 따라, 본 발명은 본 발명 및/또는 구현예들에 따른 miR-27b에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드들의 유효 투여량을 포함하는 miR-27b 억제(inhibitory) 조성물에 관한 것이다.
또 다른 측면에 따라, 본 발명은 본 발명 및/또는 구현예들에 따른 miR-27b에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드들의 유효 투여량 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
또다른 측면에 따라, 본 발명은 본 발명 및/또는 구현예들에 따른 miR-27b에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이며, 여기서 miR-27b에 상보적인 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 유일한 활성 약학적 성분(sole active pharmaceutical ingredient)이다.
또 다른 측면에 따라, 본 발명은 의약(medicament)으로서 사용을 위한 SEQ ID NO: 5-22 중 어느것(anyone)과 같은, 본 발명에 따른 miR-27b에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드들의 용도(use)에 관한 것이다.
바람직한(preferred) 구현예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO 8을 포함한다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO 12를 포함한다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO 16을 포함한다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO 19를 포함한다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO 20을 포함한다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO 22를 포함한다.
또 다른 측면에 따라, 본 발명은 본 발명 및/또는 구현예들에 따른 조성물 또는 본 발명 및/또는 구현예들에 따른 miR-27b에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드들의 사용에 의하여 본 발명 및/또는 구현예들에 따른 질병들의 치료를 위한 방법에 관한 것이다.
또다른 측면에 따라, 본 발명은 본 발명 및/또는 구현예들에 따른 조성물 또는 본 발명 및/또는 구현예들에 따른 miR-27b에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드들의 사용(use)에 의해 본 발명 및/또는 구현예들에 따른 질병을 진단하는 방법에 대한 것이다.
앞서 언급한 질병들 중 다수가 충분한 방식으로 치료될 수 없고, 그리고/또는 현재 이용 가능한 치료들이 심각한 부작용들(side effects)을 야기하기 때문에, 본 발명의 화합물들에 대한 필요가 있다.
발명의 상세한 서술
본 발명의 구현예들을 서술할 때, 명확성을 위해 특정 용어들(terminology)이 사용될(resorted) 것이다. 그러나, 본 발명은 선택된 특정 용어들에 한정되는 것으로 의도되지 않으며, 각각의 특정 용어는 유사한 목적을 달성하기 위해 유사한 방식으로 동작하는, 모든 기술적 등가물들을 포함하는 것으로 이해된다.
용어 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)", "유효량(effective amount)" 또는 "유효 도즈(effective dose)"는 제제(agent)가 필요한 개인에게 원하는 치료적 효과를 부여하는 치료적 제제(therapeutic agent)의 양을 나타낸다. 유효량은 치료 받을 개인의 건강 및 신체 컨디션, 치료 받을 개인들의 분류학적(taxonomic) 그룹, 조성물의 제형(formulation), 투여의 방법, 개인의 의학적(individual's) 컨디션의 평가 및 다른 관련 요인들(relevant factors)에 따라 개인들 사이에 서로 다를 수 있다.
용어 "치료(treatment)"는 여기에서 주어진 질병의 하나 이상의 증상들 또는 특징들을 부분적으로 또는 완전히 치유하거나(cures) 또는 감소시키는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 치료적(therapeutic) 의약의 임의의 투여를 나타낸다.
여기에서 사용된 용어 "화합물(compound)"은 본 발명에 따른 anti miR-27b 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화합물을 나타낸다. 일부 구현예들에서, 화합물은 본 발명의 올리고뉴클레오타이드로부터 일부(a part from the oligonucleotide) 다른 요소들(elements)을 포함할 수 있다. 이러한 다른 요소들은 비제한적인 예에서 올리고뉴클레오타이드에 콘쥬게이트되거나(conjugated) 또는 다른 방식으로 결합되는(bound) 전달(delivery) 비히클일 수 있다.
"안티센스 올리고뉴클레오타이드(Antisense oligonucleotide)"는 타겟 핵산의 상응하는 영역 또는 세그먼트에 대한 혼성화(hybridization)를 허용하는 핵염기(nucleobase) 서열을 갖는 단일-가닥(single-stranded) 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 "믹스머(mixmer)"이다.
"믹스머(mixmer)"는 LNA 및 DNA 뉴클레오사이드들과 같은 뉴클레오사이드 아날로그들(analogues)의 믹스(mix)를 포함하는 (LNA/DNA 믹스머), 안티센스 올리고뉴클레오타이드이고, 그리고 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 RNAseH와 같은, RNAse를 리크루팅(recruiting)할 수 있는, (적어도 6 또는 7 DNA 뉴클레오타이드들의 영역과 같은) 다수의 뉴클레오사이드들을 갖는 내부 영역(internal region)을 포함하지 않고, 그리고 여기서 내부 영역을 포함하는 뉴클레오사이드들은 외부 윙들(external wings)을 포함하는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드들과 화학적으로 구별(distinct)된다.
"뉴클레오사이드 아날로그들(Nucleoside analogues)"은 예컨대 Freier & Altmann; Nucl. Acid. Res., 1997, 25, 4429 - 4443 and Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213에 의해 서술되고, 그리고 적합하고 바람직한 뉴클레오사이드 아날로그들의 예들은 WO2007031091에 의해 제공되며, 이는 여기에 참고로 포함된다.
"5-메틸사이토신(5-methylcytosine)"은 5' 위치에 부착된 메틸기로 변형된 사이토신을 의미한다. 5-메틸사이토신은 변형된 핵염기(nucleobase)이다.
"2'-O-메톡시에틸(2'-O-methoxyethyl)" (또한 2'-MOE 및 2'-O(CH~)~-OCH3)은 푸라노스(furanose) 고리의 2' 위치에서 O-메톡시-에틸 변형을 나타낸다.
"2'-MOE 뉴클레오사이드(nucleoside)" (또한 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오사이드)는 2'-MOE 변형된(modified) 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오사이드를 의미한다.
"잠금 핵산(locked nucleic acid)" 또는 " LNA "는 종종 접근 불가능한(inaccessible) RNA로 나타내어지며 변형된 RNA 핵염기(nucleobase)이다. LNA 핵염기의 리보스(ribose) 모이어티는 2' 산소 및 4' 탄소를 연결하는 엑스트라 브리지로 변형된다. LNA 올리고뉴클레오타이드는 전통적인 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오타이드에 비교해, 그것의 상보적 가닥에 대해 실질적으로(substantially) 증가된 친화성(affinity)을 제공한다. 일부 측면들에서 바이사이클릭(bicyclic) 뉴클레오사이드 아날로그들은 LNA 뉴클레오타이드들이고, 따라서 이들 용어는 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 이러한 구현예들에서, 둘 다 리보스 당 고리(ring)의 C2' 및 C4' 사이에 (브리지와 같은) 링커 그룹의 존재에 의해 특징된다. 본 문맥에서 사용될 때, 용어들 "LNA 단위(unit)", "LNA 모노머", "LNA 잔기(residue)", "잠금 핵산 단위(locked nucleic acid unit)", "잠금 핵산 모노머(locked nucleic acid monomer)" 또는 "잠금 핵산 잔기(locked nucleic acid residue)"는 바이사이클릭 뉴클레오사이드 아날로그를 나타낸다. LNA 단위들은 특히 WO 99/14226 , WO 00/56746 , WO 00/56748 , WO 01/25248 , WO 02/28875 , WO 03/006475, WO2015071388, 및 WO 03/095467에 기재되어 있다.
"베타-D-옥시 LNA (Beta-D-Oxy LNA)"는 바람직한(preferred) LNA 변종(variant)이다.
"바이사이클릭 핵산(Bicyclic nucleic acid)" 또는 "BNA" 또는 "BNA 뉴클레오사이드들(BNA nucleosides)"은 뉴클레오사이드 당 단위의 4' 및 2' 위치 사이에 두 개의 탄소 원자들을 연결하여 바이사이클릭 당을 형성하는 브리지(bridge)를 갖는 핵산 모노머들을 의미한다. 이러한 바이사이클릭 당의 예들은 A) pt-L-메틸렌옥시 (pt-L-methyleneoxy) (4'-CH2-0-2') LNA, (B) P-D-메틸렌옥시 (P-D-Methyleneoxy) (4'-CH2-0-2') LNA, (C) 에틸렌옥시 (Ethyleneoxy) (4'- (CH2)2-0-2') LNA, (D) 아미노옥시 (Aminooxy) (4'-CH2-0-N(R)-2') LNA 및 (E) 옥시아미노 (Oxyamino) (4'-CH2-N(R)-0-2') LNA를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
여기에서 사용되는 대로, LNA 뉴클레오타이드들은 당의 4' 및 2' 위치 사이에 적어도 하나의 브리지를 갖는 뉴클레오타이드들을 포함하지만 이에 한정되지 않고, 여기서 브리지들의 각각은 -[C(R~)(R2)],,-, -C(R~)=C(R2)-, -C(R~)=N, -C(=NREM)-, -C(=0)-, -C(=S)-, -0-, -Si(Ri)q-, -S(=0) - 및 -N(R&)-로부터 독립적으로 선택되는 1 또는 2 부터 4 까지 연결된(linked) 그룹들을 독립적으로 포함하고; 여기서 x는 0, 1, 또는 2이고; n 은 1, 2, 3, 또는 4이고; R& 및 R2 각각은, 독립적으로, H, 보호 기(protecting group), 하이드록실(hydroxyl), CC 알킬(alkyl), 2' 산소 원자 및 4' 탄소 원자를 연결하는(connecting) 치환된(substituted) C (-CHz-) 기(group)이고, 이는 용어 메틸렌옥시 (methyleneoxy) (4'-CH&-0-2') LNA가 사용되는 것이다.
게다가; 이 위치에 에틸렌 브릿징 기(bridging group)를 갖는 바이사이클릭 당 모이어티의 경우, 에틸렌옥시 (ethyleneoxy) (4'-CH&CH&-0-2') LNA가 사용된다. n -L- 메틸렌옥시 (n -L- methyleneoxy) (4'-CH&-0-2'), 메틸렌옥시 (methyleneoxy) (4'-CH&-0-2') LNA의 이소머(isomer) 또한, 여기에서 사용되는 대로, LNA의 정의 내에 포함된다.
일부 구현예들에서, 뉴클레오사이드 단위는 베타-D-옥시-LNA (beta-D-oxy-LNA), 알파-록시-LNA (alpha-Loxy-LNA), 베타-D-아미노-LNA (beta-D-amino-LNA), 알파-L-아미노-LNA (alpha-L-amino-LNA), 베타-D-티오-LNA (beta-D-thio-LNA), 알파-L-티오-LNA (alpha-L-thio-LNA), 5'-메틸-LNA (5'-methyl-LNA), 베타-D-ENA (beta-D-ENA) 및 알파-L-ENA (alpha-L-ENA)의 리스트로부터 선택되는 LNA 단위이다.
"cEt" 또는 "제약된 에틸(constrained ethyl)"은 4'-탄소 및 2'-탄소를 연결하는 브리지(bridge)를 포함하는 바이사이클릭 당 모이어티를 의미하며, 여기서 브리지는 식: 4'-CH(CHq)-0-2' 을 갖는다.
"제약된 에틸 뉴클레오사이드 (Constrained ethyl nucleoside)" (또한 cEt 뉴클레오사이드)는 4'-CH(CH3)-0-2' 브리지를 포함하는 바이사이클릭 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오사이드를 의미한다. cEt 및 그것의 특성들 중 일부는 Pallan et al. Chem Commun (Camb). 2012, August 25; 48(66): 8195-8197에 기재되어 있다.
"트리사이클로 (tc)-DNA (Tricyclo (tc)-DNA)"는 DNA 및 RNA에 대한 향상된 결합 특성들을 보이는 구조적으로 제약된 (conformationally constrained) DNA 아나로그들(analogs)의 클래스에 속한다. 생산의 구조 및 방법은 Renneberg et al. Nucleic Acids Res. 2002 Jul 1; 30(13): 2751-2757에서 볼 수 있다.
여기에서 언급되는 "2'-플루오로(2'-fluoro)"는 당 고리의 2' 위치에 플루오로 기를 포함하는 뉴클레오사이드이다. 2'-플루오르화 뉴클레오타이드들(2'-fluorinated nucleotides)은 Peng et al. J Fluor Chem. 2008 September; 129(9): 743-766에 서술되어 있다.
여기에서 언급된 "2'-O-메틸 (2'-O-methyl)"은 당 고리의 2' 위치에 -OCH3 기(group)를 포함하는 당을 포함하는 뉴클레오사이드이다.
여기에 언급된 "구조적으로 제한된 뉴클레오사이드들 (Conformationally Restricted Nucleosides) (CRN)" 및 그것들의 합성 방법들은 WO2013036868에 서술되어 있으며, 이는 여기에 참조로 포함된다. CRN은, LNA와 유사하게, 리보스의 C2' 및 C4' 탄소들을 화학적 브리지가 연결하는 당-변형 뉴클레오사이드들이다. 그러나, CRN에서, C2' - C4' 브리지는 LNA 분자에서보다 한 개 탄소 더 길다. CRN의 리보스에서 화학적 브리지는 리보스를 고정된 위치에 잠금시켜(locks), 결과적으로 핵염기와 포스페이트 그룹의 유연성(flexibility)을 제한한다. RNA- 또는 DNA-기반의(based) 올리고뉴클레오타이드 내의 CRN 치환은 증가된 혼성화 친화성(affinity) 및 뉴클레아제 분해에 대한 향상된 저항성(resistance)의 장점들이 있다.
"잠금 해제된 핵산(Unlocked Nucleic Acid)" 또는 " UNA"는 여기에서 언급된 대로 일반적으로 리보스의 C2 - C3 C-C 결합이 제거되어, 잠금 해제된(unlocked) "당" 잔기를 형성하는 잠금 해제된 핵산이다 (Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039, 여기에 참조로 포함됨, 및 Snead et al. Molecular Therapy-Nucleic Acids (2013) 2, e103; 참조).
"타겟 영역 (Target region)"은 하나 이상의 안티센스 화합물들이 타겟이 되는 타겟 핵산의 부분을 의미한다.
여기에 사용되는 대로 "타겟되는 전달(Targeted delivery)"은 전달을 의미하며, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 특정 조직들 또는 세포들에서 효율적인 전달을 촉진할(facilitate) 방식으로 제형화되었거나(formulated), 또는 여기서 다른 방식으로 안티센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 타겟팅 모이어티를 포함하도록 변형되거나, 또는 특정 타겟 세포들에서 흡수(uptake)를 촉진하기 위해 다른 방식으로 변형되었다.
화합물들
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 microRNA-27b (miR-27b)을 타겟으로 하도록 설계되었다.
특정 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 성숙한 서열 5' uucacaguggcuaaguucugc 3' (SEQ ID NO: 1) (miRBase acc # MIMAT0000419)를 갖는 miR-27b의 영역들을 타겟으로 하도록 설계되어 왔다.
" miRBase"에 대한 상기 참조는 miRBase release 22.1에 따른다.
여기에 사용된 대로 용어 " miR-27b 관련 신경 질환 (miR-27b related neurological disease)"은 질병 병리(pathology)가 miR-27b 활성의 상향 조절과 관련되거나 또는 miR-27b 활성의 하향 조절이 질환 치료에 유익할 질환들을 의미한다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 5' ucacaguggcuaaguucug 3' (SEQ ID NO: 2)의 전체 또는 일부를 타겟으로 하도록 설계된 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 제공한다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 적어도 5' ucacaguggcuaaguucu 3' (SEQ ID NO: 3)을 타겟으로 하도록 설계된다.
일부 구현예들에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 서열 5'agaacttagccactgtga3' (SEQ ID NO: 4)를 포함한다.
일부 구현예들에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 길이가 18 또는 19 뉴클레오타이드들이고, 그리고 서열 5' agaacttagccactgtga 3' (SEQ ID NO: 4)을 포함한다.
일부 구현예들에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 길이가 18 또는 19 뉴클레오타이드들이고, 서열 5' agaacttagccactgtga 3' (SEQ ID NO: 4)을 포함하고 그리고 믹스머(mixmer)이다.
일부 구현예들에서, miR-27b를 타겟팅하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 길이가 18 또는 19 뉴클레오타이드들이고, 서열 5' agaacttagccactgtga 3' (SEQ ID NO: 4)를 포함하며 LNA/DNA 믹스머이다. 놀랍게도 길이가 18 또는 19 뉴클레오타이드들인 LNA/DNA 믹스머들이고 SEQ ID NO: 4를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드들이 miR-27b 활성을 하향조절하는데 특히 강력하다는 것이 발견되었다.
miR-27b에 상보적인 이러한 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 그것들이 길이가 18 또는 19 뉴클레오타이드들이고, 50-70 % LNA를 포함하는, LNA/DNA 믹스머들이고 셋 이하의 연속(consecutive) DNA 뉴클레오타이드들을 가질 때 그것들의 타겟 miR-27b를 하향조절하는데 우수한 효율을 보인다.
일부 구현예들에서, 본 발명은 셋 초과의 연속 DNA 뉴클레오타이드들의 영역을 포함하지 않고, 칠 및 14 사이의 친화성-향상 뉴클레오타이드 아날로그들(affinity-enhancing nucleotide analogues)을 포함하는 믹스머인 길이가 18-19 핵염기들의 서열로 구성되는 miR-27b에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제공하고, 그리고 여기서 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 1 및 18 사이의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결들(phosphorothioate internucleotide linkages)을 포함하고, 그리고 여기서 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 2 - 3 중 어느것에 상보적이거나 또는 SEQ ID NO: 4를 포함한다.
일부 구현예들에서, miR-27b에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 길이가 18 또는 19 뉴클레오타이드들이고, SEQ ID NO: 4를 포함하며 50 및 70 % 사이 LNA, 예를 들어 52 및 68 % 사이 LNA, 예를 들어 적어도 50% LNA, 예를 들어 적어도 52% LNA를 갖는 LNA/DNA 믹스머이다.
일부 구현예들에서, 상기 구현예들 중 어느 하나에 따른 miR-27b에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 각 끝(end)에 두 개의 말단(terminal) LNA 뉴클레오타이드들을 갖는다. 추가로, 바람직한 구현예들에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드들에서 사용되는 LNA는 베타-D-옥시 LNA (Beta-D-Oxy LNA)이다.
일부 바람직한 구현예들에서, 모든 LNA 사이토신들은 5-메틸사이토신(5-methylcytosine)이고, 즉, 서열 목록에서, 모든 대문자(Capital) C's는 메틸 C's 이다.
인 비보 사용(use)을 위해 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 안정성은 하나 이상의 포스포로티오에이트 연결들을 갖는 것으로부터 이익을 얻을(benefit) 것이다. 일부 구현예들에서, miR-27b에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 결합들(phosphorothioate internucleoside bonds)을 포함하고, 예를 들어 적어도 하나의 결합은 포스포로티오에이트이거나, 또는 일부 경우들에서, 올리고뉴클레오타이드들은 완전한 포스포로티오에이트 백본(backbone)을 가지며, 즉 모든 뉴클레오사이드간 연결들은 포스포로티오에이트 연결들이다.
발명자들은 모두 상기 구현예들에 리스트된 특징들을 갖는 miR-27b에 상보적인 일련의 매우 강력한 안티센스 올리고뉴클레오타이드들을 확인했다(identified). 이들 화합물들은 표 1에 SEQ ID NO's: 5 - 22로 리스트되어 있다. 이들 화합물들 모두가 바람직하다(preferred). 일부 구현예들에서, SEQ ID NO's: 8, 12, 16, 19, 20 및 22 중 어느 하나를 갖는 화합물들이 특히 바람직하다.
표 1은 miR-27b에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드들인 LNA/DNA 믹스머들인 SEQ ID NO: 5-22를 서술한다. 표 1의 모든 서열들에서, 대문자 C는 메틸-C (5-메틸사이토신)이다.
표 1
AntimiR-27b 화합물들
| SEQ ID NO | 길이 | # LNA | % LNA | |
| 5 | AGaaCTtAgCCaCtGtGA | 18 | 11 | 61 |
| 6 | AGaAcTTaGcCACtGtGA | 18 | 12 | 67 |
| 7 | AGaaCTTaGCcaCtGtGA | 18 | 11 | 61 |
| 8 | AGaActTAgcCaCTGtGA | 18 | 11 | 61 |
| 9 | AGaaCTtAGcCaCTgTGA | 18 | 12 | 67 |
| 10 | AGaaCTtAgCCAcTgTGA | 18 | 12 | 67 |
| 11 | AGaAcTTaGcCACtgTGA | 18 | 12 | 67 |
| 12 | AGaaCTtAGcCaCtgTGA | 18 | 11 | 61 |
| 13 | AGAacTTagCcACTgtGA | 18 | 11 | 61 |
| 14 | AGaaCTtaGccAcTgTGA | 18 | 10 | 55 |
| 15 | AGaActTaGccACTgTGA | 18 | 11 | 61 |
| 16 | AGaActTagCcaCTgTGA | 18 | 10 | 55 |
| 17 | CAgaAcTTagCcaCTgTGA | 19 | 11 | 58 |
| 18 | CAGaACtTAgcCaCTGtGA | 19 | 13 | 68 |
| 19 | CAgaaCTtaGccACtgTGA | 19 | 10 | 52 |
| 20 | AGAacTTagCcACTgtGA | 18 | 11 | 61 |
| 21 | CAGaACtTAgcCaCTGtGA | 19 | 13 | 68 |
| 22 | AGAacTTaiCcACTgtGA | 18 | 11 | 61 |
표 1에서, 대문자 글자들(upper case letters)은 LNA를 나타내고, 소문자 글자들(lower case letters)은 DNA이다. 글자 "i"는 이노신(inosine)이다. 대문자(Capital) C는 LNA 5-메틸사이토신(5-methylcytocine)이다. 모든 뉴클레오사이드간 결합들은 포스포로티오에이트 결합들이다.
일부 경우들에서, 그것은 LNA 외(than) 다른 친화성 향상(affinity enhancing) 뉴클레오타이드들을 포함하는 LNA/DNA 믹스머의 DNA 뉴클레오타이드들 중 하나 이상을 대체하는(replace) 화합물의 효능(potency) 또는 다른 특성들을 추가할 것이다.
일부 경우에서, 본 발명의 miR-27b에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 LNA/DNA 믹스머들이고 여기서 하나 이상의 DNA 뉴클레오타이드들이 트리사이클로-DNA (tricyclo-DNA), 2'-플루오로 (2'-Fluoro), 2'-0-메틸(2'-0-methyl), 2'메톡시에틸 (2'methoxyethyl) (2'MOE), 2' 사이클릭 에틸 (2' cyclic ethyl) (cET), UNA,, 2'플루오로(2'fluoro) 및 구조적으로 제한된 뉴클레오사이드 (Conformationally Restricted Nucleoside) (CRN) 중 어느것인 하나 이상의 뉴클레오사이드들로 대체되었다(replaced).
조성물들 및 용도들
본 발명의 miR-27b에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 의약으로서 용도에 아주 적합하다. 추가로, 본 발명의 miR-27b에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 miR-27 억제 조성물들이 제공된다. 이러한 조성물들은 인간에서와 같은 포유동물에서 Nrf-2/ARE 경로를 유도하는데 사용될 수 있다. 일부 바람직한 구현예들에서, 의약으로서 사용을 위한 miR-27b에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 억제 조성물에 포함되는 miR-27b에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO's: 5-22 중 어느것이다).
miR-27b에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 본 발명의 조성물들은 miR-27b 활성의 변형, 또는 Nrf-2/ARE 경로의 유도가 유익한 miR-27b 관련 질병의 치료(treatment), 완화(alleviation), 선제적 치료(pre-emptive treatment) 또는 예방(prophylaxis)을 위한 것과 같은, 의학적 용도에서 큰 잠재력(potential)을 보인다. CNS 또는 PNS의 질병들을 포함하는, 다수의 이러한 질병들이 확인되었다. 따라서, 일부 구현예들에서 본 발명의 anti miR-27b 올리고뉴클레오타이드들은 CNS 또는 PNS의 miR-27b 관련 질병의 치료(treatment), 완화(alleviation), 선제적 치료(pre-emptive treatment) 또는 예방(prophylaxis)을 위한 것이다.
일부 구현예들에서, 이러한 CNS 또는 PNS 장애들은 신경 장애들(neurological disorders), 신경변성 장애들(neurodegenerative disorders) 또는 신경발달 장애들(neurodevelopmental disorders)을 포함하며, 따라서, 일부 구현예들에서 본 발명의 anti miR-27b 화합물들은 신경 장애(neurological disorder), 신경변성 장애(neurodegenerative disorder), 신경발달 장애(neurodevelopmental disorder), 유전 장애(genetic disorder) 및/또는 유전적 신경발달 장애(genetic neurodevelopmental disorder)의 치료(treatment), 완화(alleviation), 선제적 치료(pre-emptive treatment) 또는 예방(prophylaxis)을 위한 것이다.
Nrf2/Are 경로의 유도가 신경 장애들(neurological disorders) 예를 들어 간질, 또는 간질의 여러가지 상태들(states)의 치료에 유익한 것이 보여져왔다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 화합물들은 간질, 예를 들어 약물 저항성 간질(drug resistant epilepsy) 또는 간질에서 발작들(seizures in epilepsy) 또는 간질에서 자연 발작들(spontaneous seizures in epilepsy) 또는 요법 저항성 발작들(therapy resistant seizures)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방에서 용도(use)를 위한 것이다. 일부 구현예들에서, 간질은 국소 간질(focal epilepsy)이며, 바람직하게는 여기서 상기 국소 간질은 전두엽(frontal lobe), 두정엽(parietal lobe), 후두엽(occipital lobe) 또는 측두엽(temporal lobe)에 집중된다. 일부 구현예들에서, 간질은 전신 간질(generalised epilepsy)이고, 바람직하게는 여기서 상기 전신 간질은 소발작들(absences), 근간대 발작들(myoclonic seizures), 강직-간대 발작들(tonic-clonic seizures), 강직 발작들(tonic seizures), 무긴장 발작들(atonic seizures), 간대 발작들(clonic seizures) 및 연축들(spasms) 중에서 선택된다. 일부 구현예들에서, 간질은 간질 지속증(status epilepticus)이다. 일부 구현예들에서, 간질은 상염색체 우성 야간 전두엽 간질(autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy), 느린 수면 중 지속적인 스파이크-및-웨이브들(continuous spike-and-waves during slow sleep), 드라베 증후군(Dravet syndrome), 뇌졸중 후 발생한 간질(epilepsy developed after apoplexy), 간질성 뇌병증(epileptic encephalopathy), 겔라스틱 간질(Gelastic epilepsy), 소발작들(absences), 양성 신생아 발작들(benign neonatal seizures), 제본스 증후군(Jeavons syndrome), 청소년 근간대 간질(Juvenile myoclonic epilepsy), 란도-클레프너 증후군(Landau-Kleffner Syndrom), 레녹스-가스토 증후군(Lennox-Gastaut syndrome), 내측 측두엽 간질(Mesial temporal lobe epilepsy), 근간대 어스태틱 간질(myoclonic astatic epilepsy), 오타하라 증후군(Ohtahara Syndrom), 파나이오토풀로스 증후군(Panayiotopoulos syndrome), PCDH19 증후군(PCDH19 syndrom), 중심측두엽 스파이크를 동반한 양성 소아 간질(benign childhood epilepsy with centrotemporal spikes), 스터지-웨버 증후군(Sturge-Weber syndrome), 증상성 국소 간질(symptomatic focal epilepsy), 일과성 간질 기억상실(transient epileptic amnesia) 및 웨스트 증후군(West syndrome) 중에서 선택된다.
일부 구현예들에서, SEQ ID NO: 5-22 중 어느것과 같은 본 발명의 화합물들은 정신 장애(psychiatric disorder), 인지 장애(cognitive disorder), 수면 장애(sleep disorder), 심혈관 장애(cardiovascular disorder), 호흡기 장애(respiratory disorder), 염증 장애(inflammatory disorder), 정신 장애(psychiatric disorder), 불안(anxiety), 통증(pain), 인지 장애(cognitive impairment), 우울증(depression), 치매(dementia), 두통(headache), 편두통(migraine), 심장병(heart disease), 궤양들(ulcers), 소화성 궤양들(peptic ulcers), 관절염(arthritis) 및 골다공증(osteoporosis) 중에서 선택되는 동반질병(comorbidity)과 함께 간질의 예방(prevention) 또는 예방(prophylaxis) 또는 완화(alleviation) 또는 치료(treatment)를 위한 것이다.
miR-27b 억제의 그리고 Nrf2/ARE 경로의 자극의 신경보호(neuroprotective) 효과들의 증거가 존재하며, 따라서 본 화합물들 및 그것들 화합물들의 유효 투여량들(effective dosages)을 포함하는 조성물들은 해마 손상(hippocampal damage)과 같은 신경 손상(neuronal damage)의 예방(prevention) 또는 예방(prophylaxis) 또는 선제적 치료(pre-emptive treatment) 또는 완화(alleviation) 또는 치료(treatment)에 사용을 위한 것이다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 화합물들 및 조성물들은 산화 스트레스, 염증 및/또는 세포자멸사의 치료(treatment), 완화(alleviation), 선제적 치료(pre-emptive treatment) 또는 예방(prophylaxis)을 위한 것이다. 일부 경우들에서 화합물들 및 조성물들은 뇌내출혈-유도된 뇌손상(intracerebral hemorrhage-induced brain injury), 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke), 출혈성 뇌졸중(hemorrhagic stroke) 또는 뇌졸중(stroke)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 사용(use)을 위한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 화합물은 자가면역 질환(autoimmune disease), 기억 장애(memory disorder), 해마 경화증(hippocampal sclerosis), 파킨슨병(Parkinsons Disease), 탈수초병(demyelinating disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 척수 손상(spinal cord injury), 급성 척수 손상(acute spinal cord injury), 근위축 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 진행 숨뇌 마비(Progressive bulbar palsy), 진행성 근위축증(Progressive muscular atrophy), 일차 측삭 경화증(Primary lateral sclerosis), 운동실조(ataxia), 벨 마비(bell's palsy), 유전성 신경 질환(hereditary neurological disease), 샤르코 마리 투스(Charcot-Marie-Tooth), 두통(headache), 호튼 두통(Horton's headache), 편두통(migraine), 픽병(pick's disease), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 멀티-시스템 변성(multi-system degeneration), 운동 신경세포병들(motor neuron diseases), 헌팅턴병(Huntington's disease), 프리온병(prion disease), 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 피질기저핵 변성(corticobasal degeneration), 실어증(aphasia), 원발 진행성 실어증(primary progressive aphasia) 또는 그 증상들(symptoms) 또는 영향들(effects)의 치료(treatment), 완화(alleviation), 개선(amelioration), 선제적 치료(pre-emptive treatment) 또는 예방(prophylaxis)에서 사용을 위한 것이다.
Nrf2는 CNS에서 편재하여(ubiquitously) 발현되며, 신경 질환 상태들(neurological disease states)과 관련된 신경 보호 프로세스들을 활성화한다. 따라서, 본 발명의 화합물들은 miR-27b의 그것들의 억제 및 Nrf2의 그 다음의(subsequent) 상향 조절, 및 Nrf2/ARE 경로의 자극을 통해 신경보호 약물들로서 작용할 수 있다.
따라서, 일부 구현예들에서, 본 발명의 화합물들은 치매(dementia), 예를 들어 알츠하이머병(Alzheimer disease), 혈관 치매(vascular dementia), 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia) 및 루이소체 치매(Lewy bodies dementia) 중에서 선택된 치매와 같은 치매의 치료, 완화(alleviation), 개선(amelioration), 선제적 치료(pre-emptive treatment) 또는 예방(prophylaxis)에서 사용을 위한 것이다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따른 화합물들은 골관절염(osteoarthritis)과 관련된 통증(pain)과 같은 통증의 치료, 완화, 개선, 선제적 치료 또는 예방에서 사용을 위한 것이다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따른 화합물들은 조현병(schizophrenia), 우울증(depression), 양극성 장애(bipolar disorder), 주의력 결핍 과잉 행동 장애(attention deficit hyperactivity disorder), 자폐증(autism), 불안(anxiety) 또는 투렛(Tourette) 중 어느것과 같은, miR-27b 활성의 조절(modulation)이 유익한 정신 질환(psychiatric disease)의 치료, 완화, 개선, 선제적 치료 또는 예방에서 사용을 위한 것이다.
miR-27b는 혈관신생(angiogenesis) 프로세스에서와 같은, 특정 암들의 병리학(pathology)에 관여하는 것으로 보여져왔고, 그리고 일부 구현예들에서, 본 발명의 화합물들은 혈관신생 관련 질환(angiogenesis related disease)의 치료, 완화, 개선, 선제적 치료 또는 예방에서 사용을 위한 것이다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 화합물들은 비제한적인 예에서 중추신경계에서 암(cancer of the central nervous system), 신경교종(glioma), 피부에서 암(cancer in the skin), 흑색종(melanoma), 두경부암(head or neck cancer), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma), 바람직하게는 혀 편평 세포 암종(tongue squamous cell carcinoma) 또는 구강 편평 세포 암종(oral squamous cell carcinoma), 혈액암(hematologic cancer), 바람직하게는 골수종(myeloma) 또는 림프종(lymphoma), 더 바람직하게는 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma), 유방암(breast cancer), 삼중음성 유방암(triple negative breast cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 역형성 갑상선암(anaplastic thyroid cancer), 간암(liver cancer), 간세포암종(hepatocellular carcinoma), 위암(gastric cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 혈관종(hemangioma), 폐암(lung cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 방광암(bladder cancer), 전립선암(prostate cancer) 및 대장암(colorectal cancer), 예를 들어 대장암(colorectal cancer)에서 이동(migration) 및 침윤(invasion)의 군으로부터 선택되는 암 중 어느 하나와 같은, 암의 치료 완화, 개선, 선제적 치료 또는 예방에서 사용을 위한 것이다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 화합물들은 암 전이(cancer metastasis)의 치료, 완화, 개선, 선제적 치료 또는 예방에서 사용을 위한 것이다.
프라더-윌리스 증후군(Prader-Willis Syndrome), 엔젤만 증후군(Anglemans syndrome), 및 관절염 질환들(arthritis conditions)은 면역염증 특성들(immunoinflammatory traits)을 갖는다. 그러므로, 일부 구현예들에서, 본 발명에 따른 화합물들은 프라더-윌리스 증후군(Prader-Willis Syndrome) 또는 엔젤만 증후군(Anglemans Syndrome), 관절염(arthritis), 골관절염(osteoarthritis)의 치료, 완화, 개선, 선제적 치료 또는 예방에서 사용을 위한 것이다.
miR-27b는 특정 심장 컨디션들(cardiac conditions)에서 과발현되며(overexpressed), 심부전(heart failure)의 발생(development)에 관련된다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 화합물들은 죽상경화증(atherosclerosis), 말초동맥질환(peripheral artery disease), 수술 후 심방세동(postoperative atrial fibrillation), 심부전(heart failure) 및 만성 심부전(chronic heart failure), 뇌내출혈-유도된 뇌 손상(intracerebral haemorrhage-induced brain injury) 또는 뇌졸중(stroke) 중 어느 하나를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 심혈관 장애(cardiovascular disorder)의 치료, 완화, 개선, 선제적 치료 또는 예방에서 사용을 위한 것이다.
miR-27b 발현은 비알코올성 지방간 질환(nonalcoholic fatty liver disease)의 발생(development)을 포함하는, 간 질환들(liver conditions)에 관련되는 것으로 보여져왔다. 본 발명의 화합물들은 간 장애(liver disorder)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방에서 사용을 위한 것이다. 일부 구현예들에서, 간 장애는 비알코올성 지방간(non-alcoholic fatty liver), 지방간(fatty liver), 지방간 섬유증(fatty liver fibrosis), 간 섬유증(liver fibrosis) 및 간암(hepatoma) 중에서 선택된다.
폐 사코이드증(Pulmonary sarcoidosis)은 miR-27b가 환자들의 PB 림프구들(lymphocytes)에서 상향조절되는 것을 특징으로 한다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 화합물들은 자가면역 질환(autoimmune disease), 육아종성 질환(granulomatous disease), 결합 조직병(connective tissue disease) 또는 사코이드증(sarcoidosis), 또는 폐 장애(pulmonary disorder)의 치료, 완화, 개선, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것이다. 일부 구현예들에서, 폐 장애(pulmonary disorder)는 폐 사코이드증(pulmonary sarcoidosis)이다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 화합물들은 감염(infection)의 치료, 완화, 개선, 선제적 치료 또는 예방에서 사용을 위한 것이다. 일부 구현예들에서, 치료되는(treated), 완화되는(alleviated), 개선되는(ameliorated), 선제적 치료되는(pre-emptively treated) 또는 예방적 치료되는(prophylactically treated) 감염은 패혈증(sepsis), 수막염(meningitis) 및 뇌염(encephalitis) 중 어느것이다. 일부 구현예들에서, 본 발명에 따른 화합물들은 헤르페스 바이러스 감염(herpes virus infection), 인간 파필로마 바이러스 감염(human papilloma virus infection), 사이토메갈로바이러스 감염(Cytomegalovirus infection) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 감염(herpes simplex virus infection) 중 어느것을 포함하는, 바이러스 감염의 치료, 완화, 개선, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것이다.
MiR-27b는 혈관형성(angiogenesis) 및 연령 관련 황반 변성(age related macular degeneration)을 포함하는, 망막 질환(retinal disease)의 발생(development)과 관련되는(implicated) 것으로 보여져왔다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 화합물들은 망막병증(retinopathy), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy) 및 연령-관련 황반변성 (age-related macular degeneration) (AMD)의 리스트로부터의 어느 하나와 같은, 망막(retina)의 장애의 치료, 완화, 개선, 선제적 치료 또는 예방에서 사용을 위한 것이다.
miR-27b는 인슐린 저항성(insulin resistance) 및 글루코스 대사(metabolism)의 발달에 관련되며, 따라서 당뇨병(diabetes)과 같은, 대사 장애들(metabolic disorders)의 치료를 위한 타겟이다. 일부 구현예들에, 본 발명의 화합물들은 당뇨병 또는 타입 2 당뇨병과 같은, 대사 장애의 치료, 완화, 개선, 선제적 치료 또는 예방에서 사용을 위한 것이다.
miR-27b는 NF1을 타겟팅 하여 신경섬유종증(neurofibromatosis)의 발생에 관련된다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 화합물들은 신경섬유종증 타입 1을 포함하는 신경섬유종증의 치료, 완화, 개선, 선제적 치료 또는 예방에서 사용을 위한 것이다.
본 발명의 화합물들은 miR-27b의 강력한 억제제들이고, 그리고 유효 투여량들(effective dosages)로 상기 서술된 질병들의 치료, 완화, 개선, 선제적 치료 또는 예방에서 사용을 위한 소중한(valuable) 의약들일 것이다. 일부 경우들에서, 다른 활성(active) 약학적 화합물들과의 조합(combination)은 더 나은(better) 효과, 예를 들어 개선된 효과(improved effect), 예를 들어 추가 효과(additive effect) 또는 시너지 효과(synergistic effect)를 제공할 수 있다.
일부 구현예들에서, SEQ ID NO: 5-22 중 어느 하나와 같은, 본 발명의 anti miR-27b 올리고뉴클레오타이드 화합물들은 신경(neurological) 및 정신 장애들(psychiatric disorders)을 포함하나 이에 제한되지 않는, 상기 언급된 질병들 중 어느 하나의 치료, 완화, 개선, 선제적 치료 또는 예방에서 사용을 위한, 또다른 약학적 화합물과 조합하여 사용을 위한 것이다. 일부 구현예들에서 본 발명의 miR-134에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 신경(neurological) 및 정신 장애들(psychiatric disorders)의 치료와 같은, 구현예들에서 언급된 질병들에 대한 하나 이상의 다른 요법들(therapies)과 조합하여 사용을 위한 것이다. 일부 구현예들에서, SEQ ID NO: 5-22 중 어느 하나와 같은, 본 발명의 anti miR-27b 올리고뉴클레오타이드 화합물들은 상기 언급된 질병들 중 어느 하나의 치료, 완화, 개선, 선제적 치료 또는 예방에서 사용을 위해, miR-134 억제제 또는 아데노신 키나제 억제제(adenosine kinase inhibitor) 또는 둘 다와 조합하여 사용을 위한 것이다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따른 화합물들을 사용하는 요법은 인간과 같은, 포유동물에서 Nrf2/ARE 경로를 유도한다. 일부 구현예들에서, 화합물들, 용도들(uses), 치료(treatment), 완화(alleviation), 개선(amelioration), 선제적 치료(pre-emptive treatment) 또는 예방(prophylaxis)은 인간과 같은, 포유동물에서이다.
일부 구현예들에서, 유일한 활성 약학적 성분으로서 anti miR-27b 올리고뉴클레오타이드 화합물을 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 일부 구현예들에서, 약학적 조성물은 anti miR-27b 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
유효 투여량으로 타겟 조직에 유효 성분(active ingredient)을 이용가능하게 만들기(make available) 위하여, 가장 최적의(optimal) 방식으로 제약(pharmaceuticals)의 투여가 중요하다. miR-27b는 CNS, PNS 및 말초 기관들(peripheral organs)의 질병들에 대한 관련 타겟이다. 따라서, anti miR-27b 화합물들을 투여하는 방법은 치료되는 질병에 따라 선택되어야 한다. 아래 구현예에서 서술된 것들을 포함하여, 약물들의 투여 방법들에 대한 많은 옵션들이 이용 가능하다. 일부 구현예들에서, 본 발명의 anti miR-27b 화합물들을 포함하는 약학적 조성물들과 같은 조성물은 피하 투여(subcutaneous administration), 정맥 투여(intravenous administration), 비경구 투여(parenteral administration), 비강 투여(nasal administration), 폐 투여(pulmonary administration), 직장 투여(rectal administration), 질 투여(vaginal administration), 자궁내 투여(intrauterine administration), 요도내 투여(Intraurethral administration), 눈 투여(administration to the eye), 귀 투여(administration to the ear), 피부 투여(cutaneous administration), 피내 투여(intradermal administration), 근육내 투여(intramuscular administration), 복강내 투여(intraperitoneal administration), 경막외 투여(epidural administration), 뇌실내 투여(intraventricular administration), 뇌내(intracerebral), 척수강내 투여(intrathecal administration) 또는 경구 투여(oral administration) 또는 뇌 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)에 직접 투여 중 어느 하나에 의한 투여를 위한 것이거나, 또는 여기서 상기 조성물은 임플란트(implant)로서 투여된다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 약학적 조성물은 펌프로 투여를 위한 것이며, 바람직하게는 여기서 상기 펌프는 미니-삼투압 펌프(mini-osmotic pump)이다.
일부 구현예들에서, 본 발명의 약학적 조성물은 뇌실내 카테터(intraventricular catheter)에 의해 촉진되는 뇌실내 투여(intraventricular administration)를 위한 것이며, 바람직하게는 여기서 상기 카테터는 저장소(reservoir)에 부착되고, 바람직하게는 여기서 상기 저장소는 Ommaya 저장소이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물들은 그 다음의(subsequent) 투여들에 의해 유지될 수 있는 유효 투여량으로 투여를 위한 것이며, 여기서 상기 조성물은 1 일(day), 2 일, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 또는 바람직하게는 120의 간격으로 투여된다.
일부 구현예들에서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 1 - 200 일, 10 - 190 일, 20 - 180 일, 30 - 170 일, 40 - 160 일, 50 - 150 일, 60 - 140 일, 70 - 130 일, 80 - 120 일, 90 - 110 일 사이 또는 바람직하게는 약 100 일 간격으로 투여된다.
miR-27b에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상기 서술된 질병들의 치료 방법들에 유용하다. 일부 구현예들에서, SEQ ID NO: 5-22의 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 상기 리스트된 CNS 또는 PNS 질병들의 치료를 포함하여, 상기 리스트된 질병들의 치료 방법들에 사용을 위한 것이다.
anti miR-27b 화합물들은 일부 경우들에서 상기 서술된 질병들의 치료(treatment), 선제적 치료(pre-emptive treatment), 개선(amelioration), 완화(alleviation) 또는 예방(prophylaxis)에서 사용을 위한 약학적 조성물들, 조성물들에 포함되고, 그리고 여기서 치료는 예방적(preventive), 치유적(curative) 또는 질병 변형(disease modifying) 중 어느것이다.
상기 서술된 질병들 중 일부에서, 질병이 없는(non diseased) 사람들에 비해 miR-27이 과발현된다(overexpressed). 그러한 경우들에서, 본 발명의 miR-27b에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 질병을 진단하는 방법에서 사용을 위한 것이다.
Dosages(투여량들)
표현 "유효 투여량(effective dosage)"은 바랐던 효과를 달성할 약물의 도즈(dose)를 나타낸다. 본 발명의 맥락에서, 바랐던 효과는 miR-27b의 활성을 낮추는 것이다. miR-27b의 활성의 저하(Lowering)는 예를 들어 miR-27b 또는 miR-27b 전구체들(precursors)의 분해를 야기하는 올리고뉴클레오타이드들을 사용하는 경우 miR-27b의 수준을 측정하여 측정될 수 있거나, 또는 microRNA-27b 타겟들 (예를 들어 miR-27b 결합 부위를 포함하고 그 발현이 miR-27b에 의해 조절되는 mRNAs (miR-27b 타겟 mRNAs)와 같은)의 억제 해제(derepression)를 측정하여 측정될 수 있다. 일부 구현예들에서, 치료의 효능(efficacy)은 Nrf2의 상향조절을 측정함으로써 측정된다. 따라서 miR-27b 억제(inhibition)는 miR-27b 활성의 이차 지표들을 통해 직접적으로 또는 간접적으로 측정될 수 있다.
본 발명의 화합물들은 유효 투여량들로 사용을 위한 것이고, 조성물들은 유효 투여량들의 본 발명의 화합물들을 포함한다.
일부 구현예들에서, 단위 도즈(unit dose)와 같은, 각 도징(dosing)에서 투여되는 화합물의 투여량(dosage)은 0.0001 mg/kg - 25 mg/kg의 범위 내이다.
일부 구현예들에서, 유효 도즈(effective dose)는 대상에게 치료상 이익인 수준과 같은, 연속 투여 투여량들(successive administration dosages) 사이의 기간 동안(over) 상당한 수준으로 miR-134 또는 그것의 활성을 하향-조절하기에 충분한 도즈이다.
본 발명의 약학적 조성물들은 일부 구현예들에서 초기 투여량 빌드 업 단계를 제공하기 위한 투여를 위해 만들어질 수 있으며, 이는 질병 병리(disease pathology)에 따라, 질병의 치료에 효과적일, 대상의 타겟 조직에서와 같은, 대상에서 화합물의 농도를 유지하는 목적을 위한 유지 투여량 계획(maintenance dosage scheme)이 뒤따를 수 있다. 투여량들의 유효성(effectiveness)은 예를 들어 질병의 상태를 나타내는 질병 파라미터의 관찰에 의해 측정될 수 있거나, 또는 타겟 조직에 따라, miR-27b 타겟 RNA의 활성과 같은, 여러가지 조직 파라미터들의 관찰에 의해, 또는 대안적인 예에서 혈장에서 측정 가능한 질병 상태 의존적 파라미터에 대해 측정가능할 수 있다.
약물 전달(Drug delivery)
여러가지 전달 시스템들이 알려져 있으며 본 발명의 치료제(therapeutic)를 투여하는데 사용될 수 있다. 투여의 방법들은 피하 투여(subcutaneous administration), 정맥 투여(intravenous administration), 비경구 투여(parenteral administration), 비강 투여(nasal administration), 폐 투여(pulmonary administration), 직장 투여(rectal administration), 질 투여(vaginal administration), 자궁내 투여(intrauterine administration), 요도내 투여(Intraurethral administration), 눈 투여(administration to the eye), 귀 투여(administration to the ear), 피부 투여(cutaneous administration), 피내 투여(intradermal administration), 근육내 투여(intramuscular administration), 복강내 투여(intraperitoneal administration), 경막외 투여(epidural administration), 뇌실내 투여(intraventricular administration), 뇌 내(intracerebral), 척수강내 투여(intrathecal administration) 또는 경구 투여(oral administration) 또는 뇌 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)으로 직접 투여를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 조성물들은 임의의 편리한 루트, 예를 들어 주입(infusion) 또는 볼루스 주사(bolus injection)에 의하여, 상피(epithelial) 또는 점막피부 조직(mucocutaneous tissue)(예컨대, 구강 점막(oral mucosa), 직장(rectal) 및 장 점막(intestinal mucosa) 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 그리고 다른 생물학적 활성 제제들과 함께 또는 없이 투여될 수 있다. 투여는 전신적(systemic) 또는 국소적(local)일 수 있다. 또한, 뇌실내(intraventricular) 및 척수강내(intrathecal) 투여를 포함하는, 임의의 적합한 루트에 의해 중추신경계에 본 발명의 조성물들을 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 뇌실내 주사(Intraventricular injection)는 Ommaya 저장소(reservoir)와 같은, 저장소에 부착된, 뇌실내 카테터(intraventricular catheter)에 의해 촉진될(facilitated) 수 있다. 예를 들어 흡입기(inhaler) 또는 분무기(nebulizer), 및 에어로졸화제(aerosolizing agent)를 가진 포뮬레이션(formulation)의 사용에 의해 폐 투여(Pulmonary administration)가 또한 사용될(employed) 수도 있다. 바람직하게는 치료제(therapeutic)는 CNS 또는 PNS로 전달된다.
전달 수단은 흡입 전달(inhaled delivery), 주사기(syringe) 또는 미니 삼투압 펌프(mini osmotic pump)로 근육 내로 직접 근육 내 전달(intramuscular delivery directly), 주사기 또는 미니 삼투압 펌프로 복막(peritoneum)에 직접 투여되는 복강내 투여(intraperitoneal administration), 주사기로 피부 아래에(below the skin) 직접 투여되는 피하 투여(subcutaneous administration), 주사(injection)로 또는 삼투압 펌프(osmotic pump)에 부착된 작은 카테터를 사용하여, 뇌의 심실(ventricles in the brain)에 직접 투여 뇌실내 투여(intraventricular administration)를 포함한다. 게다가, 근육들에 또는 척수(spinal cord)에 직접 배치할(placed) 임플란트(예컨대 작은 실리콘 임플란트)가 준비될(prepared) 수 있다. 본 발명의 조성물을 치료가 필요한 부분(area)에 국소적으로(locally) 투여하는 것이 바람직할 수 있다; 이것은 예를 들어 국소 적용(topical application)으로, 주사(injection)로, 카테터를 수단으로, 좌약(suppository)을 수단으로, 임플란트를 수단으로, 달성될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니고, 상기 임플란트는 시알라스틱 막들(sialastic membranes) 또는 섬유들과 같은 막들을 포함하는, 다공성(porous), 비-다공성(non-porous) 또는 젤라틴성(gelatinous) 물질로일 수 있다.
약학적 조성물들
본 발명은 또한 약학적 조성물들(pharmaceutical compositions)을 제공한다. 이러한 조성물들은 치료 유효량(therapeutically effective amount)의 치료제, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 용어 "약학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"은 규제 기관(regulatory agency)에 의해 승인된 것으로 정의될 수 있다. 규제 기관은 예를 들어 유럽 의약청(European Medicines Agency), 연방 또는 주 정부 또는 U.S. 약전(U.S. Pharmacopeia) 또는 동물들, 그리고 더 특히 인간들에서 사용을 위해 일반적으로 인정되는 다른 약전에 등재된(listed) 것일 수 있다. 용어 "치료 유효량(therapeutically effective amount)"은 장애 또는 질병의 발달(development) 또는 발생(occurrence)의 임상적으로 유의한(significant) 억제(inhibition), 개선(amelioration) 또는 역전(reversal)을 야기하는 치료제의 양(amount of therapeutic)으로 정의될 수 있다. 용어 "담체(carrier)"는 치료제가 투여되는 희석제(diluent), 아쥬반트(adjuvant), 부형제(excipient) 또는 비히클을 나타낼 수 있다. 이러한 약학적 담체들(pharmaceutical carriers)은 석유(petroleum), 동물, 식물(vegetable) 또는 합성 기원(synthetic origin), 예를 들어 땅콩유, 대두유, 광유(mineral oil), 참기름(sesame oil) 등과 같은 것을 포함하는, 물 및 오일들과 같은, 멸균 액체(sterile liquids)일 수 있다. 약학적 조성물이 정맥내로(intravenously) 투여되는 경우 물은 바람직한 담체일 수 있다. 식염수 용액들(Saline solutions)과 수성 덱스트로스(aqueous dextrose) 및 글리세롤 용액들 또한 특히 주사용 용액(injectable solutions)에 대해 액체 담체들로 이용될 수 있다. 적합한 약학적 부형제들은 전분(starch), 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아(malt), 쌀, 밀가루(flour), 초크(chalk), 실리카겔, 소듐 스테아레이트(sodium stearate), 글리세롤 모노스테아레이트(glycerol monostearate), 활석(talc), 염화나트륨(sodium chloride), 건조 탈지유(dried skim milk), 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 바라는 경우, 조성물은 또한 습윤(wetting) 또는 유화 제들(emulsifying agents), 또는 pH 완충제들(buffering agents )을 함유할 수 있다. 이들 조성물들은 용액들, 현탁액들(suspensions), 에멀젼, 정제들(tablets), 환제들(pills), 캡슐들, 분말들, 지속-방출 제형들(sustained-release formulations) 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 트리글리세라이드들(triglycerides)과 같은 전통적인 바인더들 및 담체들과 함께 좌약으로 제형화될(formulated) 수 있다. 경구 제형(Oral formulation)은 약학적 등급들의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate), 소듐 사카린(sodium saccharine), 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트(magnesium carbonate) 등과 같은 표준 담체들(standard carriers)을 포함할 수 있다. 이러한 조성물들은 환자에게 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 적절한 양의 담체와 함께, 치료적 유효량의 치료제, 바람직하게는 정제된 형태를 함유할 수 있다. 제형(formulation)은 투여의 모드(mode)에 적합할 수 있다. 정맥내 투여(intravenous administration)를 위한 조성물들은 멸균 등장성 수성 완충액(sterile isotonic aqueous buffer) 중의 용액들일 수 있다. 필요한 경우, 주사 부위의 통증을 완화하기(ease) 위해 가용화제(solubilizing agent) 및 국소 마취제(local anaesthetic) 예를 들어 리그노카인(lignocaine)을 또한 포함할 수 있다. 성분들은 개별적으로(separately) 또는 단위 투여 형태(unit dosage form)로 함께 혼합되어 공급될 수 있으며, 예를 들어 활성제(active agent)의 양을 표시하는 앰플(ampoule) 또는 사체트(sachette)와 같은 밀봉된 용기(hermetically sealed container)의 건조 동결건조(dry lyophilized) 분말 또는 무수 농축물(water free concentrate)로서일 수 있다. 조성물이 주입(infusion)에 의해 투여되는 경우, 멸균된 약학적 등급(sterile pharmaceutical grade) 물 또는 식염수(saline)를 함유하는 주입 병(infusion bottle)으로 조제될(dispensed) 수 있다. 조성물이 주사(injection)에 의해 투여되는 경우, 투여 전에 성분들이 혼합될 수 있도록 식염수 또는 주사를 위한 멸균 수(sterile water)의 앰플이 제공될 수 있다.
실시예들
실시예 1: 세포 배양(culture)
안티센스 올리고뉴클레오타이드의 miRNA에 대한 효과들의 인 비트로(In vitro) 모델링은 보통 포유동물 세포주들에서 수행된다.
부착성(adherent) 래트(rat) 크롬친화세포종(pheochromocytoma) 세포주 PC-12 Adh (ECACC no. 88022401)은 ATCC (ATCC cat. no. CRL-1721.1™)로부터 구입되었고 2.5% 열-불활성화된 소 태아 혈청(heat-inactivated fetal bovine serum) (Sigma-Aldrich cat. no F4135-500 ml), 15% 열-불활성화된 말 혈청 (heat-inactivated horse serum) (Sigma-Aldrich cat. no. H1385-500ml 및 1% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin) (Sigma-Aldrich cat.no. P4333-100 ml) 으로 보충된 Ham's F-12K (Kaighn's) 배지(medium) (ThermoFischer Scientific cat.no. 21127022)에서 Corning® CellBIND® Surface cell culture flasks (Sigma-Aldrich cat.no. CLS3290)에서 성장되었다. 세포들은 37 ℃에서 가습(humidified) 5% CO2 인큐베이터에서 보관되었고(kept) 일주일에 두 번 계대되었다(passaged).
실시예 2: 배양된 세포주들에서 루시페라제 리포터 분석들
간단하고 매우 민감한 접근법은 루시페라제와 같은, 리포터 유전자의 3' UTR에서 단일의 완벽 매치(match) miRNA 결합 부위를 나르는 miRNA 리포터 플라스미드의 구축(construction)을 수반한다. 이 방법은 miRNA 억제를 입증하고(validate) 또한 여러가지(different) antimiR 디자인들의 효능을 비교하기 위하여 배양된 세포들에서 광범위하게 사용되었다.
miR-27b 리포터는 듀얼-루시페라제 psiCHECK2 플라스미드 (Promega)에서 레닐라(Renilla) 루시페라제 유전자의 3' UTR 내로 인간 miR-27b에 대한 단일의 완벽-매치(single perfect-match) 타겟 부위에 해당하는 어닐링된(annealed) 올리고뉴클레오타이드들을 클로닝하여 생성되었다.
루시페라제 분석들을 위해, PC-12 adh 세포들이 트랜스펙션 전 날 웰 당 25,000 세포들의 밀도로 96-웰 Corning® CellBIND® 표면 세포 배양 마이크로웰 클레이트들(Surface cell culture microwell plates) (Sigma-Aldrich cat.no. CLS3330)에서 시딩(seeded)되었다. 세포들은 Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, GlutaMAX™ Supplement (ThermoFischer Scientific cat. no. 51985026)에서 0.5 μL/웰의 최종 농도(concentration)에서 리포펙타민(lipofectamine) 2000 (ThermoFischer Scientific cat. no. 11668-019)을 사용하여 트랜스펙트되었다. 17개의 안티센스 올리고뉴클레오타이드들의 라이브러리가 루시페라제 리포터 플라스미드 및 miR-27b 미믹으로 최종 농도들 0.2nM, 1 nM, 5 nM으로 각 antimiR-27b를 공-트랜스펙트하여 루시레아제(lucirease) 리포터 분석들을 사용하여 스크리닝되었다. 스크램블된(scrambled) 서열 올리고뉴클레오타이드, miRNA 매치 부위를 함유하지 않는 벡터 및 모크(mock) 트랜스펙션이 대조군들로 포함되었다. 모든 샘플들은 기술적 중복들(technical duplicates)로 실행(run)되었다. 4 시간 후 세포들은 Opti-MEM™ 배지에서 세척되었고 신선한 완전 세포 배양 배지 배지가 웰들에 첨가되었다.
트랜스펙션 24 시간 후 제조업자의 지침에 따라 Dual-Glo® 루시페라제 분석 시스템(Luciferase Assay System) (Promega cat.no. E2920)을 사용하여 루시페라제 분석이 수행되었다. 플레이트들에서 시약들의 30분 인큐베이션 후 플레이트 리더(reader) (VarioSkan Lux, ThermoFischer Scientific)에서 발광(luminescence)의 양이 측정되었다.
결과들은 백그라운드 발광을 빼고(subtraction) 그 다음에 구성적(constitutive) 반딧불이(Firefly) 신호로 레닐라 신호를 정규화(normalizing)하여 분석되었다. 그 다음 두 기술 중복들(technical duplicates)의 평균이 빈 벡터(empty vector)로 정규화되고(normalized) 퍼센티지로 표현되었다. 결과들은 Graphpad Prism (version 9.0.2, GraphPad Software)에서 시각화되었다(visualized).
모든 17개 안티센스 올리고뉴클레오타이드들에 대한 반딧불이 루시페라제 활성에 대해 정규화된 레닐라 루시페라제 활성의 억제 해제 수준들이 도 1에 보여진다.
antimiR-27b 안티센스 올리고뉴클레오타이드들의 전체 라이브러리로부터 추가 분석들 및 IC50 측정들(determinations)을 위해 다섯 개의 가장 강력한 antimiR-27b 분자들이 선택되었다.
실시예 3: 배양된 세포주들에서 antimiR-27b 올리고뉴클레오타이드들에 대한 IC50의 측정
miR-27b를 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드들의 효능을 측정하기(determine) 위해, IC50 측정들이 수행되었다. 루시페라제 분석들이 실시예 2에 서술된 대로 수행되었다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 Xu et al (Oncotarget. 2017 Sep 19; 8(41): 70669-70684)로부터 miR-27b 안타고미르(antagomir)와 비교되었다. IC50 값들의 측정(determination)을 위하여, 2-배 희석(2-fold dilutions)에서 80 nM부터 0.0049 nM까지의 범위인 광범위한 antimiR-27b 농도들로 세포들이 트랜스펙트되었다. 레닐라 루시페라제 활성은 반딧불이 루시페라제 활성으로 정규화되었고 Graphpad Prism (version 9.0.2, GraphPad Software)에서 log(M)에 대해(against) 플롯팅되었다(plotted). 도즈-반응 곡선들은 3-파라미터 비-선형 피트(fit) 및 nM으로 계산된 IC50 값들을 사용하여 피트(fitted)되었다. 선택된 농도들 전체에 걸쳐 낮은 반응 때문에 antagomiR 대조군(control) 화합물에 대한 IC50 값을 측정하는(determine) 것은 가능하지 않았다.
도 2는 다섯 개의 antimiR-27b 올리고뉴클레오타이드들의 IC50 값들 및 도즈-반응 곡선들을 보여준다.
실시예 4: 배양된 U-87 Mg 세포들에서 IC50 측정(determination)
U-87 Mg 세포들에서 IC50 곡선들은 Lipofectamine 2000의 양이 웰 당 0.4 μL이었고 트랜스펙션들이 96-웰 Costar 블랙 플레이트들(black plates) (cat. no: 3603, Corning World, Corning, NY, USA)에서 수행되었다는 것을 제외하고는, 상기 실시예들에서 서술된 PC-12 Adh 세포들에서와 같이 수행되었다.
도 3은 다섯 개의 선택된 antimiR-27b 올리고뉴클레오타이드들 (seq id no's: 8, 12, 16, 19 및 20)의 IC50 값들 및 도즈 반응 곡선들을 보여준다.
실시예 5는 배양된 PC-12 Adh 세포주에서 miR-27b 타겟 mRNA 억제 해제(derepression)를 보여준다.
miRNA들은 그것들의 타겟 mRNA들의 수준들을 부정적으로(negatively) 조절하므로, antimiR 올리고뉴클레오타이드들에 의한 miR-27b 억제의 기능적 효과들은 타겟 mRNA들의 그 다음의(subsequent) 상향 조절에 의해 측정될 수 있다. miR-27b의 주요(principal) 타겟은 전사 인자 Nrf2이다; Hmox1 및 Nqo1과 같은 항산화(antioxidant) 및 해독(detoxifying) 인자들의 상향 조절을 담당한다(responsible). 이들 세 마커들에서 상향 조절은 Nrf2 수준들에 대한 기능적 효과를 단지 의미할(signify) 뿐 아니라 Nrf2에 의해 조절되는 다운-스트림 분자적 경로들의 활성화를 보여준다.
루시페라제 리포터가 사용되지 않았고 웰 당 6 μL Lipofectamine2000을 사용하여, 3x105 세포들/웰에서 12-웰 CellBind 플레이트들(plates) (cat. no: CLS3336, Corning World, Corning, NY, USA)에서 세포들이 시딩되었다는 것을 제외하고 상기 실시예들에 서술된 것과 같이 PC-12 Adh 세포들이 트랜스펙트되었다. 직접 현미경 검사(microscopy)로 검사하여 트랜스펙션 효율을 확인하기 위해 별개의 웰에서 FAM-표지된 올리고뉴클레오타이드들이 트랜스펙트되었다. 트랜스펙션 사십-팔 시간 후, 제조업자의 지침에 따라 miRNeasy 미니 키트 (cat. no: 217004, Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 RNA 추출(extraction)이 수행되었다. RNA 는 추가 분석까지 -80℃에서 보관되었다. 랜덤 헥사머(hexamer) 프라이머 (cat. no: SO142, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 그리고 ezDNase™ (cat. no: 11766051, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)에 의해 gDNA 제거(removal)을 포함하는, 제조업자의 지침에 따라 Superscript IV 역전사효소(reverse transcriptase) (cat. no: 18090010, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 역전사가 수행되었다. qPCR이 제조업자의 지침들에 따라 통합된(Integrated) DNA Technologies (Newark, NJ, USA) 및 TaqMan™ Universal Master Mix II, no UNG (cat. no: 4440040, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA)에 의해 합성된 Taqman 분석들 (표 2)를 사용하여 QuantStudio 6 Flex (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA)에서 수행되었다. 모든 qPCR 분석들은 엑손-스패닝(exon-spanning)으로 설계되었으며 특이성은 프라이머들의 블라스트(blast)에 의해 확인되었고 프라이머들의 효율은 다섯-배 희석(five-fold dilution) 시리즈를 사용하여 테스트되었다. Hprt1 은 하우스-키핑 유전자로 사용되었다. 모든 qPCR 결과들은 ΔΔCt 방법 (Livak KJ, Schmittgen TD을 사용하여 분석되었다. 정규화(normalisation)를 위해 스크램블된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 실시간 정량 PCR (Real-Time Quantitative PCR) 및 2-ΔΔCT Method. Methods. 2001;25(4):402-408)을 사용하여 상대적 유전자 발현(Relative Gene Expression) 데이터의 분석.
| 유전자 | 포워드(Forward) 프라이머 | 리버스(Reverse) 프라이머 | 프로브 | Cat.no: |
| Nrf2 | CACTCTGTGGAGTCTTCCATTT | GAATGTGTTGGCTGTGCTTTAG | /56-FAM/ATTTCCGAG/ZEN/TCACTGAACCCAGGC/3IABkFQ/ | 주문제작(Custom-made) |
| Hmox1 | GATGGCCTCCTTGTACCATATC | AGCTCCTCAGGGAAGTAGAG | /5HEX/AGAGCGAAA/ZEN/CAAGCAGAACCCAGT/3IABkFQ/ | 주문제작 |
| Nqo1 | GCTGCAGACCTGGTGATATT | ACATGGTGGCATACGTGTAG | /56-FAM/AGGCTGGTT/ZEN/TGAGAGAGTGCTTGT/3IABkFQ/ | 주문제작 |
| Hprt1 | GGAGAACAATTCTGGGTTTGATC | TGTGAAGTTCCCCATAAGGC | /56-FAM/TGTTGACCC/ZEN/ACCAGCAGTTCAGT/3IABkFQ/ | Rn.PT.39a.22214832 |
도 4에서 막대(bar) 다이어그램은 miR-27b 타겟 유전자 억제 해제 (Nrf2, Hmox1 and Nqo1)에 대한 antimiRs (Seq ID 8, 12, 16, 19 및 20 )의 효과를 보여준다. 이 실험에서 사용된 Seq ID 20으로 정의된 올리고뉴클레오타이드는 그것이 Seq ID 22에 대응하도록 만들기 위해 하나의 구아닌이 이노신 치환되었다(substituted).
실시예 6은 Seq ID 20 및 Seq ID 22의 효능(potency)의 평가를 보여준다.
세포들이 콜라겐 (Sigma-Aldrich cat. no. C8919)으로 전처리된 투명한 바닥의(clear-bottom), 흰색 96-웰 플레이트들 (cat.no 3610, Corning)에서 시딩되었고 IC50 실험을 위해 세 개의 기술적 복제들(technical replicates)이 사용되었고 백그라운드 빼기(substraction)를 수행하지 않았다는 점을 제외하고, 실시예들 2 및 3에서 서술된 대로 트랜스펙션(transfection) 및 루시페라제 분석이 수행되었다. 도즈-반응 실험 및 IC50 실험의 결과들이 각각 도 5 A 및 B에 보여진다.
구현예들(Embodiments)
1) 길이가 18-19 뉴클레오타이드들의 서열을 포함하는 miR-27b (SEQ ID NO: 1 or 2)에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드이며, 여기서 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 칠부터 14, 예를 들어 10-13 부터 친화성-향상(affinity-enhancing) 뉴클레오타이드 아날로그들(analogues)을 갖는 믹스머이고 그리고 셋 초과의 연속(contiguous) DNA 뉴클레오타이드들의 스트레치를 함유하지 않고, 그리고 여기서 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 일 내지 18 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결들(phosphorothioate internucleoside linkages)을 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
2) 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 3에 상보적인, 구현예 1에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
3) SEQ ID NO: 4를 포함하는, 구현예 1 또는 2에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
4) 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 길이가 18 또는 19 뉴클레오타이드들이고, SEQ ID NO: 4를 포함하고 그리고 LNA/DNA 믹스머인, 구현예들 1 내지 3 중 어느 하나에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
5) 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 길이가 18 또는 19 뉴클레오타이드들이고, SEQ ID NO: 4를 포함하고 그리고 50 및 70 % 사이 LNA, 예를 들어 52 및 68 % 사이 LNA, 예를 들어 적어도 50% LNA, 예를 들어 적어도 52% LNA를 갖는 LNA/DNA 믹스머인, 구현예들 1 내지 4 중 어느 하나에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
6) 각 끝(end)에서 두 개의 말단(terminal) 뉴클레오타이드들이 LNA인, 구현예들 1 내지 5 중 어느 하나에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
7) LNA가 베타-D-옥시 LNA (Beta-D-Oxy LNA)인, 구현예들 1 내지 6 중 어느 하나에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
8) 모든 뉴클레오사이드간 결합들(internucleoside bonds)이 포스포로티오에이트 결합들(phosphorothioate bonds)인, 구현예들 1 내지 7 중 어느 하나에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
9) 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO's 5 - 22 중 어느것(anyone)인, 구현예들 1 내지 8 중 어느 하나에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
10) 모든 LNA's가 베타-D-옥시 LNA (beta-D-oxy LNA)이고, 모든 LNA 사이토신들이 5-메틸사이토신(5-methylcytosine)이고, 그리고 모든 뉴클레오사이드간 결합들이 포스포로티오에이트 결합들인, 구현예 9에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
11) LNA/DNA 믹스머가 트리사이클로- DNA (tricyclo-DNA), 2'-플루오로 (2'-Fluoro), 2'-0-메틸 (2'-0-methyl), 2'메톡시에틸 (2'methoxyethyl) (2'MOE), 2' 사이클릭 에틸 (2' cyclic ethyl) (cET), UNA, 2'플루오로(2'fluoro) 및 구조적으로 제한된 뉴클레오사이드 (Conformationally Restricted Nucleoside) (CRN) 중 어느것인 하나 이상의 뉴클레오사이드들을 추가로 포함하는, 구현예들 1 내지 10 중 어느것에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
12) 의약(medicament)으로서 사용을 위한, 구현예들 1 내지 11 중 어느 하나에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
13) 구현예들 1 내지 12 중 어느것에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 miR-27b 억제(inhibitory) 조성물.
14) 포유동물, 예를 들어 인간에서 Nrf-2/ARE 경로를 유도하는데 사용(use)을 위한, 구현예 13에 따른 조성물.
15) 구현예 12에 따른 의약으로서 사용을 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 구현예 13 또는 14에 따른 조성물, 여기서 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO's: 5-22 중 어느것이다).
16) 용도(use)가 miR-27b 활성의 변형(modification), 또는 Nrf-2/ARE 경로의 유도가 유익한 miR-27b 관련 질병의 치료(treatment), 완화(alleviation), 선제적 치료(pre-emptive treatment) 또는 예방(prophylaxis)을 위한 것인, 구현예들 12, 13 , 14 또는 15 중 어느것에 따른 용도(use) 또는 조성물.
17) 용도가 CNS 또는 PNS의 miR-27b 관련 질병의 치료(treatment), 완화(alleviation), 선제적 치료(pre-emptive treatment) 또는 예방(prophylaxis)을 위한 것인, 구현예 12, 13, 14, 15 또는 16에 따른 용도 또는 조성물.
18) 용도가 신경 장애(neurological disorder)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 17에 따른 용도.
19) 용도가 신경변성 장애(neurodegenerative disorder)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 18에 따른 용도.
20) 신경발달 장애(neurodevelopmental disorder), 유전 장애(genetic disorder) 및/또는 유전적 신경발달 장애(genetic neurodevelopmental disorder)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 19에 따른 용도.
21) 용도는 간질(epilepsy)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예들 12 내지 19 중 어느것에 따른 용도.
22) 용도가 약물 저항성 간질(drug resistant epilepsy)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 21에 따른 용도.
23) 용도가 간질에서 발작들(seizures in epilepsy)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 21 또는 22에 따른 용도.
24) 용도가 간질에서 자연 발작들(spontaneous seizures in epilepsy)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 21 내지 23에 따른 용도.
25) 용도가 요법 저항성 발작들(therapy resistant seizures)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 21 내지 24에 따른 용도.
26) 상기 간질은 국소 간질(focal epilepsy)이고, 바람직하게는 여기서 상기 국소 간질은 전두엽(frontal lobe), 두정엽(parietal lobe), 후두엽(occipital lobe) 또는 측두엽(temporal lobe)에 집중되는, 구현예 21 내지 25에 따른 용도.
27) 상기 간질은 전신 간질(generalised epilepsy)이며, 바람직하게는 상기 전신 간질은 소발작들(absences), 근간대 발작들(myoclonic seizures), 강직-간대 발작들(tonic-clonic seizures), 강직 발작들(tonic seizures), 무긴장 발작들(atonic seizures), 간대 발작들(clonic seizures) 및 연축들(spasms) 중에서 선택되는, 구현예 21 내지 25에 따른 용도.
28) 상기 간질은 간질 지속증(status epilepticus)인, 구현예 21 내지 27에 따른 용도.
29) 상기 간질은 상염색체 우성 야간 전두엽 간질(autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy), 느린 수면 중 지속적인 스파이크-및-웨이브들(continuous spike-and-waves during slow sleep), 드라베 증후군(Dravet syndrome), 뇌졸중 후 발생한 간질(epilepsy developed after apoplexy), 간질성 뇌병증(epileptic encephalopathy), 겔라스틱 간질(Gelastic epilepsy), 소발작들(absences), 양성 신생아 발작들(benign neonatal seizures), 제본스 증후군(Jeavons syndrome), 청소년 근간대 간질(Juvenile myoclonic epilepsy), 란도-클레프너 증후군(Landau-Kleffner Syndrom), 레녹스-가스토 증후군(Lennox-Gastaut syndrome), 내측 측두엽 간질(Mesial temporal lobe epilepsy), 근간대 어스태틱 간질(myoclonic astatic epilepsy), 오타하라 증후군(Ohtahara Syndrom), 파나이오토풀로스 증후군(Panayiotopoulos syndrome), PCDH19 증후군(PCDH19 syndrom), 중심측두엽 스파이크를 동반한 양성 소아 간질(benign childhood epilepsy with centrotemporal spikes), 스터지-웨버 증후군(Sturge-Weber syndrome), 증상성 국소 간질(symptomatic focal epilepsy), 일과성 간질 기억상실(transient epileptic amnesia) 및 웨스트 증후군(West syndrome) 중에서 선택되는 구현예 21 내지 28에 따른 용도.
30) 상기 간질은 정신 장애(psychiatric disorder), 인지 장애(cognitive disorder), 수면 장애(sleep disorder), 심혈관 장애(cardiovascular disorder), 호흡기 장애(respiratory disorder), 염증 장애(inflammatory disorder), 정신 장애(psychiatric disorder), 불안(anxiety), 통증(pain), 인지 장애(cognitive impairment), 우울증(depression), 치매(dementia), 두통(headache), 편두통(migraine), 심장병(heart disease), 궤양들(ulcers), 소화성 궤양들(peptic ulcers), 관절염(arthritis) 및 골다공증(osteoporosis) 중 선택되는 동반질병(comorbidity)과 함께 존재하는, 구현예 21 내지 29에 따른 용도.
31) 용도는 신경 손상(neuronal damage)의 예방(prevention) 또는 예방(prophylaxis) 또는 완화(alleviation) 또는 치료(treatment)를 위한 것인, 구현예 16 내지 29에 따른 용도.
32) 용도가 해마 손상(hippocampal damage)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 31에 따른 용도.
33) 용도는 산화 스트레스(oxidative stress), 염증(inflammation) 및/또는 세포자멸사(apoptosis)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 17에 따른 용도.
34) 용도는 뇌내출혈-유도된 뇌손상(intracerebral hemorrhage-induced brain injury), 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke), 출혈성 뇌졸중(hemorrhagic stroke) 또는 뇌졸중(stroke)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 17에 따른 용도.
35) 용도는 자가면역 질환(autoimmune disease), 기억 장애(memory disorder), 해마 경화증(hippocampal sclerosis), 파킨슨병(Parkinsons Disease), 탈수초병(demyelinating disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 척수 손상(spinal cord injury), 급성 척수 손상(acute spinal cord injury), 근위축 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 진행 숨뇌 마비(Progressive bulbar palsy), 진행성 근위축증(Progressive muscular atrophy), 일차 측삭 경화증(Primary lateral sclerosis), 운동실조(ataxia), 벨 마비(bell's palsy), 유전성 신경 질환(hereditary neurological disease), 샤르코 마리 투스(Charcot-Marie-Tooth), 두통(headache), 호튼 두통(Horton's headache), 편두통(migraine), 픽병(pick's disease), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy), 멀티-시스템 변성(multi-system degeneration), 운동 신경세포병들(motor neuron diseases), 헌팅턴병(Huntington's disease), 프리온병(prion disease), 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 피질기저핵 변성(corticobasal degeneration), 실어증(aphasia), 원발 진행성 실어증(primary progressive aphasia) 또는 그 증상들(symptoms) 또는 영향들(effects)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 17 내지 20에 따른 용도.
36) 용도는 치매(dementia)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 17 내지 19 또는 35에 따른 용도.
37) 상기 치매는 알츠하이머병(Alzheimer disease), 혈관 치매(vascular dementia), 전두측두엽 치매(frontotemporal dementia) 및 루이소체 치매(Lewy bodies dementia) 중에서 선택되는 구현예 36에 따른 용도.
38) 골관절염(osteoarthritis)과 관련된 통증과 같은, 통증(pain)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 12 또는 구현예들 14 내지 19 중 어느것에 따른 용도.
39) 용도는 miR-27b의 조절이 유익한 정신 질환(psychiatric disease)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예들 12 내지 19 중 어느 것에 따른 용도.
40) 용도가 조현병(schizophrenia), 우울증(depression), 양극성 장애(bipolar disorder), 주의력 결핍 과잉 행동 장애(attention deficit hyperactivity disorder), 자폐증(autism), 불안(anxiety) 또는 투렛(Tourette)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 39에 따른 용도.
41) 용도가 혈관형성(angiogenesis) 관련 질병의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 12 내지 16에 따른 용도.
42) 용도가 암의 치료 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인ㄷ, 구현예 12 내지 16 또는 41 중 어느 하나에 따른 용도.
43) 상기 암은 신경계(nerve system)에서 암, 바람직하게는 신경교종(glioma)인, 구현예 42에 따른 용도.
44) 상기 암은 피부에서 암, 바람직하게는 흑색종인, 구현예 42에 따른 용도.
45) 상기 암은 두경부암(head or neck cancer)인, 구현예 42에 따른 용도.
46) 상기 암이 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma), 바람직하게는 혀 편평 세포 암종(tongue squamous cell carcinoma) 또는 구강 편평 세포 암종(oral squamous cell carcinoma)인, 구현예 42에 따른 용도.
47) 상기 암이 혈액암(hematologic cancer), 바람직하게는 골수종(myeloma) 또는 림프종(lymphoma), 더 바람직하게는 미만성 거대 B-세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma)인, 구현예 42에 따른 용도.
48) 상기 암이 유방암(breast cancer), 바람직하게는 삼중 음성 유방암(triple negative breast cancer)인, 구현예 42에 따른 용도.
49) 상기 암은 갑상선암(thyroid cancer), 바람직하게는 역형성 갑상선암(anaplastic thyroid cancer)인, 구현예 42에 따른 용도.
50) 상기 암은 간암(liver cancer), 바람직하게는 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)인, 구현예 42에 따른 용도.
51) 상기 암은 위암(gastric cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 혈관종(hemangioma), 폐암(lung cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 방광암(bladder cancer), 전립선암(prostate cancer) 및 대장암(colorectal cancer), 예를 들어 대장암에서 이동(migration) 및 침윤(invasion)의 군으로부터 선택되는, 구현예 42에 따른 용도.
52) 상기 암은 암 전이(metastasis)인, 구현예 42 내지 51에 따른 용도.
53) 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 프라더-윌리스 증후군(Prader-Willis Syndrome) 또는 엔젤만 증후군(Anglemans Syndrome)을 치료하는데 사용(use)을 위한 것인, 구현예들 12 내지 16 또는 20 중 어느 하나에 따른 용도(use).
54) 용도가 관절염(arthritis)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 12 또는 14 내지 16 중 어느 하나에 따른 용도.
55) 상기 관절염은 골관절염(osteoarthritis)인, 구현예 54에 따른 용도.
56) 용도는 심혈관 장애(cardiovascular disorder)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 12 또는 14 내지 17 중 어느 하나에 따른 용도.
57) 상기 심혈관 장애는 죽상경화증(atherosclerosis), 말초동맥질환(peripheral artery disease), 수술후 심방세동(postoperative atrial fibrillation), 심부전(heart failure) 및 만성 심부전(chronic heart failure), 뇌내출혈-유도된 뇌손상(intracerebral haemorrhage-induced brain injury) 또는 뇌졸중(stroke) 중에서 선택되는, 구현예 56에 따른 용도.
58) 용도는 간 장애(liver disorder)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 12 또는 14 내지 16 중 어느 하나에 따른 용도.
59) 상기 간 장애는 비알코올성 지방간(non-alcoholic fatty liver), 지방간(fatty liver), 지방간 섬유증(fatty liver fibrosis), 간 섬유증(liver fibrosis) 및 간암(hepatoma) 중에서 선택되는, 구현예 58에 따른 용도.
60) 상기 용도는 폐 사코이드증(pulmonary sarcoidosis)과 같은, 폐 장애(pulmonary disorder)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 12 또는 14 내지 16 중 어느 하나에 따른 용도.
61) 상기 용도는 자가면역 질환(autoimmune disease), 육아종성 질환(granulomatous disease), 결합 조직 질환(connective tissue disease) 또는 사코이드증(sarcoidosis)의 치료, 완화, 선제 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 12 또는 14 내지 16 중 어느 하나에 따른 용도.
62) 용도는 감염(infection)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 12 중 어느 하나 또는 14 내지 17 중 어느 하나에 따른 용도.
63) 상기 감염은 패혈증(sepsis), 수막염(meningitis) 및 뇌염(encephalitis) 중에서 선택되는, 구현예 62에 따른 용도.
64) 상기 감염이 헤르페스 바이러스(herpes virus) 감염인, 구현예 62에 따른 용도.
65) 상기 감염이 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus) 감염인, 구현예 62에 따른 용도.
66) 상기 헤르페스 바이러스 감염이 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 감염 및 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 감염 사이에서 선택되는, 구현예 64에 따른 용도.
67) 상기 용도는 망막(retina)의 장애의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 12, 또는 14-17 중 어느 하나 또는 41에 따른 용도.
68) 상기 망막의 장애는 망막병증(retinopathy), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy) 및 연령-관련 황반변성(age-related macular degeneration) (AMD) 중에서 선택되는, 구현예 67에 따른 용도.
69) 상기 용도는 대사 장애(metabolic disorder)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 12 또는 14 내지 16 중 어느 하나에 따른 용도.
70) 상기 대사 장애는 당뇨병(diabetes), 바람직하게는 타입 2 당뇨병인, 구현예 69에 따른 용도.
71) 상기 용도는 유전 질환(genetic disorder), 바람직하게는 신경섬유종증(neurofibromatosis)의 치료, 완화, 선제적 치료 또는 예방을 위한 것인, 구현예 12 또는 14 내지 17 중 어느 하나에 따른 용도.
72) 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 또다른 요법(therapy)과 조합하여 사용을 위한 것인, 구현예들 12 내지 71 중 어느것에 따른 용도.
73) 상기 다른 요법은 anti miR-134 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 구현예 72에 따른 용도.
74) 상기 다른 요법은 아데노신 키나제 억제제인, 구현예 72에 따른 용도.
75) 상기 다른 요법은 인간과 같은, 포유동물에서 Nrf-2/ARE 경로를 유도하는, 구현예 72에 따른 용도.
76) 상기 요법은 anti miR-134 안티센스 온리고뉴클레오타이드(onligonucleotide), 아데노신 키나제 억제제 및 Nrf-2/ARE 경로를 유도하는 요법 중 하나 이상인, 구현예 72에 따른 용도.
77) 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 유일한 활성 약학적 성분(active pharmaceutical ingredient)인, 구현예 12 내지 71 중 어느것에 따른 용도.
78) 구현예들 1 내지 12 중 어느것에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
79) 상기 antimiR27b 올리고뉴클레오타이드가 유일한 활성 약학적 성분인, 구현예 1 내지 12 중 어느것에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약학적 조성물.
80) 조성물은 구현예들 12 내지 77 중 어느 하나에 따른 용도를 위한 것인, 구현예 78 내지 80 중 어느 하나에 따른 약학적 조성물.
81) 조성물은 피하 투여(subcutaneous administration), 정맥 투여(intravenous administration), 비경구 투여(parenteral administration), 비강 투여(nasal administration), 폐 투여(pulmonary administration), 직장 투여(rectal administration), 질 투여(vaginal administration), 자궁내 투여(intrauterine administration), 요도내 투여(Intraurethral administration), 눈 투여(administration to the eye), 귀 투여(administration to the ear), 피부 투여(cutaneous administration), 피내 투여(intradermal administration), 근육내 투여(intramuscular administration), 복강내 투여(intraperitoneal administration), 경막외 투여(epidural administration), 뇌실내 투여(intraventricular administration), 뇌내(intracerebral), 척수강내 투여(intrathecal administration) 또는 경구 투여(oral administration)에 의한 투여를 위한 것이거나 또는 뇌 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid) 내로 직접 투여를 위한 것이거나, 또는 여기서 상기 조성물은 임플란트(implant)로서 투여되는, 구현예들 78 내지 80에 따른 약학적 조성물.
82) 상기 조성물은 펌프로 투여되며, 바람직하게는 여기서 상기 펌프는 미니-삼투압 펌프(mini-osmotic pump)인, 구현예 78 내지 81에 따른 약학적 조성물.
83) 상기 조성물은 뇌실내 카테터(intraventricular catheter)에 의해 촉진되는(facilitated) 뇌실내 투여(intraventricular administration)를 위한 것이고, 바람직하게는 여기서 상기 카테터는 저장소(reservoir)에 부착되고, 바람직하게는 여기서 상기 저장소는 Ommaya 저장소인, 구현예 78 내지 82에 따른 약학적 조성물.
84) 상기 조성물은 1 일, 2 일, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 또는 바람직하게는 120일의 간격으로 투여되는, 구현예 81 내지 83에 따른 약학적 조성물.
85) 상기 조성물은 1 - 200 일, 10 - 190 일, 20 - 180 일, 30 - 170 일, 40 - 160 일, 50 - 150 일, 60 - 140 일, 70 - 130 일, 80 - 120 일, 90 - 110 일 또는 바람직하게는 약 100 일 사이의 간격으로 투여되는, 구현예 81 내지 83에 따른 약학적 조성물.
86) 구현예들 12 내지 77 중 어느 하나에 따른 질병들을 치료하는 방법에서 사용을 위한 구현예 13에 따른 조성물 또는 구현예들 1 내지 12 중 어느 하나에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
87) 구현예들 1 내지 12r 중 어느 하나에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드 구현예 13 또는 14에 따른 조성물의 사용(use)에 의해 구현예들 12 내지 77 중 어느 하나에 따른 질병들의 치료를 위한 방법.
88) 치료가 예방적(preventive), 치유적(curative) 또는 질병 변형(disease modifying) 중 어느것인, 구현예들 12 내지 77 중 어느 하나에 따른 용도, 또는 구현예들 78 내지 85 중 어느 하나에 따른 약학적 조성물, 또는 구현예 86 또는 87에 따른 방법.
89) 구현예 13 또는 14에 따른 조성물 또는 구현예들 1 내지 12 중 어느 하나에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 사용(use)에 의해 구현예 12 내지 77 중 어느 하나에 따른 질병을 진단하는 방법.
SEQUENCE LISTING
<110> Neumirna Therapeutics APS
<120> MicroRNA-27b inhibitors
<130> P242999PC00
<150> PA 2021 70146
<151> 2021-03-26
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Claims (15)
- miR-27b에 상보적인 길이가 18-19 뉴클레오타이드들의 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이며, 여기서 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 칠부터 14, 예를 들어 10-13부터의 친화성-향상(affinity-enhancing) 뉴클레오타이드 아날로그들을 갖는 믹스머이고 삼 초과의 연속(contiguous) DNA 뉴클레오타이드들의 스트레치를 함유하지 않으며, 그리고 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 일 내지 18 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결들(phosphorothioate internucleoside linkages)을 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
- 제1항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 3에 상보적인, 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
SEQ ID NO: 4를 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 길이가 18 또는 19 뉴클레오타이드들이고, SEQ ID NO: 4를 포함하고, 그리고 LNA/DNA 믹스머(mixmer)인, 안티센스 올리고뉴클레오티드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 길이가 18 또는 19 뉴클레오타이드들이고, SEQ ID NO: 4를 포함하고 그리고 여기서 상기 믹스머의 뉴클레오사이드들의 50 및 70% 사이가 LNA, 예를 들어 52 및 68 % 사이 LNA, 예를 들어 적어도 50% LNA, 예를 들어 적어도 52% LNA인, 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
각 끝(end)의 상기 두 말단(terminal) 뉴클레오타이드들이 LNA인, 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 LNA가 베타-D-옥시 LNA (Beta-D-Oxy LNA)이고 LNA 사이토신들(cytosines)은 5-메틸사이토신인, 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
모든 뉴클레오사이드간 결합들(internucleoside bonds)이 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 결합들인, 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
- 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO's 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 중 어느것인, 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
- 제9항에 있어서,
상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는:
(SEQ ID NO 22) 5' AGAacTTaiCcACTgtGA 3'
(SEQ ID NO 20) 5' AGAacTTagCcACTgtGA 3'
(SEQ ID NO 19) 5' CAgaaCTtaGccACtgTGA 3'
(SEQ ID NO 16) 5' AGaActTagCcaCTgTGA 3'
(SEQ ID NO 12) 5' AGaaCTtAGcCaCtgTGA 3'
(SEQ ID NO 8) 5' AGaActTAgcCaCTGtGA 3'
중 어느것이고
여기서 대문자들(capital letters)은 LNA, 소문자들(small letters)은 DNA, 대문자(capital) C는 LNA 5-메틸사이토신을 나타내고, LNA는 베타-D-옥시 LNA이고, "i" 는 이노신(inosine)이고 그리고 모든 뉴클레오사이드간 결합들(internucleoside bonds)은 포스포로티오에이트 결합들(phosphorothioate bonds)인, 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
- 제1항 내지 제10항 중 어느것에 있어서,
상기 LNA/DNA 믹스머는 트리사이클로-DNA (tricyclo-DNA), 2'-플루오로 (2'-Fluoro), 2'-0-메틸 (2'-0-methyl), 2'메톡시에틸 (2'methoxyethyl) (2'MOE), 2' 사이클릭 에틸 (2' cyclic ethyl) (cET), UNA,, 2'플루오로 (2'fluoro) 및 구조적으로 제한된 뉴클레오사이드 (Conformationally Restricted Nucleoside) (CRN) 중 어느것인 하나 이상의 뉴클레오사이드들을 추가로 포함하는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
- 의약으로서 용도(use)를 위한, 제1항 내지 제11항 중 어느 하나에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
- 상기 용도(use)가 CNS 또는 PNS의 miR-27b 관련 질병의 치료를 위한 것인, 제1항 내지 제12항에 따른 용도(use)를 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 조성물.
- 상기 용도(use)가 신경 장애(neurological disorder)의 치료를 위한 것인, 제1항 내지 제13항에 따른 용도(use)를 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 조성물.
- 상기 용도(use)는 간질(epilepsy)의 치료, 완화(alleviation), 선제적 치료(pre-emptive treatment) 또는 예방을 위한 것인, 제1항 내지 제14항에 따른 용도(use)를 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 조성물.
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