CN118252921A - Gip受体激动剂的用途 - Google Patents

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CN118252921A CN202311769942.1A CN202311769942A CN118252921A CN 118252921 A CN118252921 A CN 118252921A CN 202311769942 A CN202311769942 A CN 202311769942A CN 118252921 A CN118252921 A CN 118252921A
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谢海松
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Abstract

本发明公开了一种对葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)受体具有激动活性多肽化合物的制药用途，属于生物医药技术领域。本发明提供的化合物与GLP‑1受体激动剂联用，显著提高降糖与减重效果，可用于制备2型糖尿病和减肥相关药物。

Description

GIP受体激动剂的用途
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种对GIP受体具有激动活性的新型肽化合物的制药用途。
背景技术
2型糖尿病(T2DM)和肥胖的全球流行率在过去30年里持续上升，全世界有2.46亿人患有糖尿病，估计到2025年将有3.8亿人患有糖尿病,持续升高的发病率和死亡率提示了对更有效治疗手段的医学需求。
肠降血糖素(incretin)是人体内的一类肠源性激素，目前已发现的肠降血糖素主要包括2种，即：胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide 1，GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(glucose dependent insulinotropic polypeptide，GIP)，它们均促进胰岛素的分泌，具有葡萄糖依赖性降糖作用。人源GLP-1是含有31个氨基酸的多肽，主要由末端回肠和结肠的L细胞分泌，人源GIP是含有42个氨基酸的多肽，主要由十二指肠和空肠的K细胞产生。在临床试验中，健康受试者在接受GIP与GLP-1联合注射后，达到异糖血症所需的葡萄糖输注量明显高于GLP-1单独给药，同时胰岛β细胞的响应水平高于GLP-1单独给药(Michael,JCE&M，1993,Vol76,No.4)。因此，GIP受体激动剂具有协同增强GLP-1降糖和减重的效果；另一方面，GIP受体激动剂可用作止吐剂或作为伴有呕吐或恶性疾病的预防。因此在GLP-1高剂量给药的条件下会伴随呕吐或恶心的症状，GIP受体激动剂可用于抑制或缓解GLP-1引起的呕吐或恶性等症状，来扩大GLP-1高剂量下的药效。
GIP受体作为糖尿病和肥胖症等代谢疾病的治疗靶标，可以与GLP-1受体激动剂联合使用，或与GLP-1/胰高血糖素受体协同激动剂联合使用。虽然已有专利或产品将GLP-1与GIP序列结合在同一分子上，获得同时具有GLP-1受体与GIP受体的激动活性，但已有分子对GLP-1、GIP受体的激活强度或激活比例对药效的影响还没有明确的结论。而一旦分子结构确定，单一分子对于双靶点的激活水平则无法调节，实现对GLP-1和GIP受体的同水平激活或在同水平激活的条件下施用不同剂量将受到限制。
发明内容
本发明提供一种葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)类似物，在2型糖尿病药物制备中的用途。
在优选技术方案中GIP类似物，包括类GIP多肽片段，所述类GIP多肽类似物片段包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1～18。
本发明还提供一种GIP类似物长效缀合物在2型糖尿病药物制备中的用途。
在优选技术方案中，GIP类似物长效缀合物其选自以下：
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,R30]-hGIP(1-31)；
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,L17,R30]-hGIP(1-31)；
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,E20,R30]-hGIP(1-31)；
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,L17,E20,R30]-hGIP(1-31)；
N{Epsilon-30}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,R16]-hGIP(1-31)。
本发明另外提供一种GIP类似物长效缀合物与GLP-1受体激动剂联合用于2型糖尿病药物和/或减肥药物制备的用途。
优选技术方案中GIP类似物长效缀合物其选自以下：
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,R30]-hGIP(1-31)；
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,L17,R30]-hGIP(1-31)；
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,E20,R30]-hGIP(1-31)；
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,L17,E20,R30]-hGIP(1-31)；
N{Epsilon-30}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,R16]-hGIP(1-31)。
GLP-1受体激动剂为利拉鲁肽、司美格鲁肽、艾塞那肽、杜拉糖肽、利西那肽或阿必鲁肽，优选司美格鲁肽。
GIP类似物长效缀合物与GLP-1受体激动剂摩尔比为1:1～1:9，优选1:3～1:9，优选1:5～1:9，更优选1:9。
本发明对天然的GIP序列进行改造并进行长效缀合物的修饰，产生的GIP类似物及其长效缀合物具有优于天然GIP的对GIP受体提高的激动活性，并实现对GIP受体的选择性激活，可用于糖尿病药物的制备。在体内的腹膜内葡萄糖耐量试验中，GIP类似物长效缀合物导致实验小鼠显著提高的葡萄糖耐受性。在GIP长效缀合物与GLP-1受体激动剂，特别是司美格鲁肽的联用中，加强了体重减轻效果和血糖降低效果，显著好于单药治疗所达到的改善情况。
附图说明
图1实施例8中GIP长效缀合物在IPGTT中血糖相对0时的变化值；
图2实施例8中GIP长效缀合物在IPGTT中血糖变化值曲线下面积；
图3实施例10中GIP长效缀合物与GLP-1类似物联用在IPGTT中血糖变化值曲线下面积；
图4实施例11中GIP长效缀合物与固定量GLP-1类似物联用影响DIO小鼠体重变化；
图5实施例11中固定量GIP长效缀合物与GLP-1类似物联用影响DIO小鼠体重变化；
图6实施例13中GIP长效缀合物与GLP-1类似物联用影响DIO小鼠摄水量变化；
图7实施例13中GIP长效缀合物与GLP-1类似物联用影响DIO小鼠摄水量总体变化。
具体实施方式
除非下文另外定义，本发明所提及的所有技术和科学用语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的意义。
本发明所提供化合物的合成方法是本领域公知的。可通过重组的方法来进行生产，将编码核酸与指导其表达的功能性控制序列连接，在合适的培养基下对宿主细胞进行培养，获得所表达的多肽并进行化学修饰来获得本发明化合物。宿主细胞可选用：大肠杆菌、酿酒酵母以及哺乳动物BHK或CHO细胞系。
本发明的化合物还可通过标准肽合成方法来制造，例如，使用标准固相或液相方法逐步或通过片段组装，以及分离和纯化最终的肽化合物产物来制造，或者通过重组方法和合成方法的任意组合来制造。
实施例1：序列3多肽的制备
将SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列对应的核苷酸序列(E3为起点)GAAGGCACCTTCATCTCCGA TTACTCCATC GCGCTGGACA AAATCCACCA GGAAGATTTC GTAAAATGGC TGCTGGCGCAGAAAGGC进行人工合成(委托南京擎科生物科技有限公司合成)，采用NcoI和XhoI双酶切合成基因和pET28a质粒载体(购自南京擎科生物科技有限公司)，对酶切产物进行胶回收；用T4连接酶连接酶切产物，并将连接产物转化到BL21(DE3)宿主大肠杆菌(购自南京擎科生物科技有限公司)；挑取单菌落接种到装有LB液体培养基的试管中，37℃，250rpm下培养6-10h；提取重组质粒，进行酶切验证，将显示正确插入基因的重组质粒进行测序验证(测序送到南京擎科生物科技有限公司进行)，选出插入基因正确的菌株，即为表达SEQ ID NO:1所示的氨基酸的基因工程菌。
将筛选出的基因工程菌接入含有80mg/L卡那霉素的LB平板37℃培养14-18h；挑取单菌落至含有80mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃、250rpm培养10-15h，形成种子液；将种子液以5％的接种量转接至含有80mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃、250rpm培养至OD600nm为1.5；加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG，在23℃下诱导发酵，诱导5h后，离心收集菌体。用缓冲液重悬，超声破菌，离心收集上清液。上清液经过镍离子鳌合亲和层析柱纯化(购自南京擎科生物科技有限公司)。收集蛋白洗脱峰、SDS-PAGE检测蛋白纯化情况。收集对应组分，超滤脱盐收获融合蛋白。EK酶酶切融合蛋白，得到了对应的多肽。通过化学合成方式将YAib与所获得多肽偶联，即得到序列3多肽：YAibEGTFISDYSIALDKIHQEDFVKWLLAQKG。其余序列多肽制备方法参照序列3多肽的制备过程。
实施例2序列7长效缀合物(peptide7)的制备
实施例2-6中的缩写含义参照下文
Fmoc:9-芴基甲氧羰基、HOBt:1-羟基苯并三唑、DMAP:二甲基氨基吡啶、DIC:二异丙基碳二亚胺、DMF:N,N-二甲基甲酰胺、Boc：叔丁氧羰基、tBu:叔丁基、DCM：二氯甲烷、MeOH:甲醇。
多肽的延长合成中使用以下的氨基酸：Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-L-Aib-OH；Fmoc-LGlu(OtBu)-OH；Fmoc-LGly-OH；Fmoc-L-Thr(tBu)-OH；Fmoc-L-Phe-OH；Fmoc-L-Ile-OH；Fmoc-L-Ser(tBu)-OH；F-moc-L-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-L-Ser(tBu)-OH；Fmoc-L-ILe-OH；Fmoc-ALA-OH；Fmoc-L-Leu-OH；F-moc-L-Asp(OtBu)-OH；F-moc-L-Lys(Mtt)-OH；Fmoc-L-Ile-OH；Fmoc-L-His(Trt)-OH；Fmoc-L-Gln(Trt)-OH；Fmoc-L-Gln(Trt)-OH；F-moc-L-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-L-Phe-OH；Fmoc-L-Val-OH；Fmoc-L-Asn(Trt)-OH；Fmoc-L-Trp(Boc)-OH；Fmoc-L-Leu-OH；Fmoc-L-Leu-OH；Fmoc-ALA-OH；Fmoc-L-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-L-Gly-OH。
Fmoc-L-Tyr(tBu)-王树脂的合成：
称取替代度为0.58mmol/g的王树脂25.86g，加入到固相反应柱中，加入200mL DCM溶胀树脂30分钟后，用DMF洗涤3次，每次200mL。另取13.85g Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH、6.86gHOBt和0.28g DMAP用DMF溶解，5-8℃下加入5.2mL DIC活化5min后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应16小时。Kaiser检测为阴性后，依次进行DMF洗涤2次，MeOH洗涤2次、DCM洗2次和MeOH洗涤2次，每次洗涤溶剂为200mL。收料、常温减压干燥，得到未封端的Fmoc-L-Tyr(tBu)-王树脂28.56g。
上述树脂加入反应柱中，加入200mL DCM溶胀30分钟后，抽干，用DMF洗涤3次，每次200mL。再往反应柱中加入200mL DMF和26mL封闭液(封闭液为V乙酸酐：V吡啶＝1:1)，反应2小时，依次DMF洗涤2次，MeOH洗涤2次、DCM洗2次和MeOH洗涤2次，每次洗涤溶剂为200mL。收料、常温减压干燥得到Fmoc-Tyr(tBu)-王树脂32.02g。
肽树脂的合成：
称取上述封端后的F-moc-L-Tyr(tBu)-王树脂(1.0mmol)，加入反应柱中用20mLDCM溶胀30分钟后，用DMF洗涤3次，每次20mL。洗涤完成后，往反应柱中加入10mL DBLK溶液(20％哌啶/DMF(V/V))，反应5分钟，抽滤，用20mL DMF洗涤一次，再加入10mL DBLK溶液(20％哌啶/DMF(V/V))，反应10分钟，取样中控，直至Kaiser检测为阳性。抽滤，用DMF洗涤3次，每次20mL。另取Fmoc-L-Aib-OH(1.62g，5.0eq)、HOBt(0.81g，6.0eq)加入10mL DMF中溶解，5-8℃下加入DIC(0.69g，5.5eq)活化5min后，加入反应柱中，反应1小时，取样，使用Kaiser检测，显示为阴性，反应完全，用DMF洗涤3次，每次20mL。重复上述去保护和偶联操作，根据多肽序列依次完成其他氨基酸的偶联。在偶联至F-moc-L-Lys(Mtt)-OH时，通过用DCM中70％HFIP+3％TIS洗涤树脂两次，每次0.5h，洗涤树脂，之后用DMF和DCM洗涤，除去Mtt保护基，然后再加入(S)-22-叔丁氧基羰基-43,43-二甲基-10,19,24,41-四氧代-3,6,12,15,42-五氧杂-9,18,23-三氮杂四环庚酸，并继续逐步使用合适的氨基酸基团继续进行，至最后一个氨基酸偶联完成后，按上述方法去保护，去保护完全后依次DMF洗涤2次，MeOH洗涤2次、DCM洗2次和MeOH洗涤2次，每次洗涤溶剂为20mL。收料、常温减压干燥得到目标肽树脂13.06g。
粗肽的切割：
称取上述肽树脂5.01g，20-30℃缓慢加入至50mL裂解液(三氟乙酸：苯甲硫醚：苯甲醚：乙二硫醇＝90:5:3:2)中，加完后反应2小时。待反应完成后，过滤除去树脂，将滤液缓慢倒入事先预冷的甲叔醚(500mL)中，边搅拌边滴加，溶液冰浴沉降2小时。除去上清液，加入预冷的甲级叔丁基醚离心洗涤5次，每次350mL。完成后收料，常温减压干燥得到粗肽2.4g。
肽的纯化：
经多步纯化对粗肽进行精制：第一步：固定相：C18(Kromsil：)，流动相的线性梯度20-60％B(流动相A：0.1％TFA，流动相B：乙腈)，40分钟，紫外线(UV)在214nm检测；第二步：固定相：C18(Kromsil：)，流动相的线性梯度20-60％B(流动相A：0.5％磷酸，流动相B：乙腈)，40分钟，紫外线(UV)在214nm检测。最后冻干得到精肽(97.9％)。MS：m/z 4329.07(M+H)+。
peptide 7的化学名称或者化学结构为
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,R30]-hGIP(1-31)：Seq ID.19。
实施例3序列8长效缀合物(peptide 8)的制备
在实施例2多肽的延长合成中使用以下的氨基酸：Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-L-Aib-OH；Fmoc-LGlu(OtBu)-OH；Fmoc-LGly-OH；Fmoc-L-Thr(tBu)-OH；Fmoc-L-Phe-OH；Fmoc-L-Ile-OH；Fmoc-L-Ser(tBu)-OH；F-moc-L-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-L-Ser(tBu)-OH；Fmoc-L-ILe-OH；Fmoc-ALA-OH；Fmoc-L-Leu-OH；F-moc-L-Asp(OtBu)-OH；F-moc-L-Lys(Mtt)-OH；Fmoc-L-Leu-OH；Fmoc-L-His(Trt)-OH；Fmoc-L-Gln(Trt)-OH；Fmoc-L-Gln(Trt)-OH；F-moc-L-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-L-Phe-OH；Fmoc-L-Val-OH；Fmoc-L-Asn(Trt)-OH；Fmoc-L-Trp(Boc)-OH；Fmoc-L-Leu-OH；Fmoc-L-Leu-OH；Fmoc-ALA-OH；Fmoc-L-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-L-Gly-OH。
合成方法同实施例2，得到的粗肽采用RP-HPLC进行纯化，最后冻干得精肽(98.2％)MS：4329.07(M+H)+。
peptide 8长效缀合物的化学名称或者化学结构为
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,L17,R30]-hGIP(1-31)：Seq ID.20。
实施例4序列9长效缀合物(peptide 9)的制备
在实施例3多肽的延长合成中使用以下的氨基酸：Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-L-Aib-OH；Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH；Fmoc-L-Gly-OH；Fmoc-L-Thr(tBu)-OH；Fmoc-L-Phe-OH；Fmoc-L-Ile-OH；Fmoc-L-Ser(tBu)-OH；F-moc-L-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-L-Ser(tBu)-OH；Fmoc-L-ILe-OH；Fmoc-ALA-OH；Fmoc-L-Leu-OH；F-moc-L-Asp(OtBu)-OH；F-moc-L-Lys(Mtt)-OH；Fmoc-L-Ile-OH；Fmoc-L-His(Trt)-OH；Fmoc-L-Gln(Trt)-OH；Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH；F-moc-L-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-L-Phe-OH；Fmoc-L-Val-OH；Fmoc-L-Asn(Trt)-OH；Fmoc-L-Trp(Boc)-OH；Fmoc-L-Leu-OH；Fmoc-L-Leu-OH；Fmoc-ALA-OH；Fmoc-L-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-L-Gly-OH。
合成方法同实施例2，得到的粗肽采用RP-HPLC进行纯化，最后冻干得精肽(98.2％)MS：4330.05(M+H)+。
peptide 9的化学名称或者化学结构为
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,E20,R30]-hGIP(1-31)：Seq ID.21。
实施例5序列10长效缀合物(peptide 10)的制备
在实施例4多肽的延长合成中使用以下的氨基酸：Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-L-Aib-OH；Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH；Fmoc-L-Gly-OH；Fmoc-L-Thr(tBu)-OH；Fmoc-L-Phe-OH；Fmoc-L-Ile-OH；Fmoc-L-Ser(tBu)-OH；F-moc-L-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-L-Ser(tBu)-OH；Fmoc-L-ILe-OH；Fmoc-ALA-OH；Fmoc-L-Leu-OH；F-moc-L-Asp(OtBu)-OH；F-moc-L-Lys(Mtt)-OH；Fmoc-L-Leu-OH；Fmoc-L-His(Trt)-OH；Fmoc-L-Gln(Trt)-OH；Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH；F-moc-L-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-L-Phe-OH；Fmoc-L-Val-OH；Fmoc-L-Asn(Trt)-OH；Fmoc-L-Trp(Boc)-OH；Fmoc-L-Leu-OH；Fmoc-L-Leu-OH；Fmoc-ALA-OH；Fmoc-L-Gln(Trt)-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-L-Gly-OH。
合成方法同实施例2，得到的粗肽采用RP-HPLC进行纯化，最后冻干得精肽(97.5％)MS：4330.05(M+H)+。
peptide 10的化学名称或者化学结构为
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,L17,E20,R30]-hGIP(1-31)：Seq ID.22。
实施例6序列14长效缀合物(peptide 14)的制备
在实施例5多肽的延长合成中使用以下的氨基酸：Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-L-Aib-OH；Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH；Fmoc-L-Gly-OH；Fmoc-L-Thr(tBu)-OH；Fmoc-L-Phe-OH；Fmoc-L-Ile-OH；Fmoc-L-Ser(tBu)-OH；F-moc-L-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH；Fmoc-L-Ser(tBu)-OH；Fmoc-L-ILe-OH；Fmoc-ALA-OH；Fmoc-L-Leu-OH；F-moc-L-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-Arg(Pbf)-OH；Fmoc-L-Ile-OH；Fmoc-L-His(Trt)-OH；Fmoc-L-Gln(Trt)-OH；Fmoc-L-Gln(Trt)-OH；F-moc-L-Asp(OtBu)-OH；Fmoc-L-Phe-OH；Fmoc-L-Val-OH；Fmoc-L-Asn(Trt)-OH；Fmoc-L-Trp(Boc)-OH；Fmoc-L-Leu-OH；Fmoc-L-Leu-OH；Fmoc-ALA-OH；Fmoc-L-Gln(Trt)-OH；F-moc-L-Lys(Mtt)-OH；Fmoc-L-Gly-OH。
合成方法同实施例2，得到的粗肽采用RP-HPLC进行纯化，最后冻干得精肽(98.5％。)MS：4328.97(M+H)+。
peptide 14的化学名称或者化学结构为
N{Epsilon-30}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,R16]-hGIP(1-31)：Seq ID.23。
其余peptide的合成制备方法参照实施例2～6中所描述技术方案进行。
实施例7：细胞活性检测
GIP受体(glucose-dependent insulinotropic peptide receptor，GIPR)属于G蛋白偶联受体，主要与Gs蛋白偶联，当其激活后，可通过Gs蛋白刺激腺苷酸环化酶(AC)活性，从而升高细胞内cAMP的水平。HTRF cAMP测定方法是一种竞争性的免疫分析法，用于检测细胞内cAMP的变化情况。检测原理为Eu标记的cAMP与ULightTM染料标记的ULightTM-anti-cAMP抗体结合后可发生荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance EnergyTransfer，FRET)，而未标记的cAMP(如细胞产生的cAMP)可与Eu标记的cAMP竞争与Anti-cAMP抗体结合，从而导致FRET信号降低，即信号值与cAMP的浓度呈负相关。本发明利用表达GIPRHEK293稳转细胞系，与不同浓度的测试化合物孵育后，利用HTRF试剂盒，通过测定cAMP含量，评价化合物对GIPR的激动活性。
稳定表达GIPR的HEK细胞系在含有10％胎牛血清的DMEM+100μg/mL Hygromycin B+10％FBS培养基中培养，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。除去旧培养基并用PBS洗一次，然后加入1mLTrypLETMExpress溶液，37℃孵育2min左右。当细胞从皿底脱离，加入约5mL37℃预热的完全培养基。将细胞悬液用吸管轻轻吹打使聚集的细胞分离。将细胞悬液转移至无菌的离心管中，1000rpm离心5min收集细胞，用于实验或传代培养。
化合物对受体激动活性测定使用HTRF试剂盒(试剂盒购自Perkin Elmer)。试剂盒中所有试剂，使用前室温平衡至室温。按照试剂盒说明书配制1×Stimulation Buffer待用；利用DMSO将GCGR受体阳性化合物Glucagon进行梯度稀释，然后用1×StimulationBuffer稀释100倍至10×工作液。利用1％DMSO Buffer将GIPR受体阳性化合物GIP进行梯度稀释至10×。GIPR细胞胰酶消化处理，离心后去除培养基，将细胞重悬于1×StimulationBuffer中，经计数后接种9μL细胞稀释液于384-well板中，均为1000cells/well。取1μL步骤2中稀释好的10×化合物加入至相应实验孔中，其中PC孔(Min值)加入1μL 10×初始浓度阳性化合物，VC孔(Max值)加入1μL 10×DMSO buffer(1％)，离心后放置于37℃孵育30min。用Detection buffer将Eu-cAMP稀释至工作浓度，取5μL/well加入相应实验孔中。将ULight-anti-cAMP用Detection buffer稀释至工作浓度，然后取5μL/well加入相应实验孔中；离心后放置于室温孵育1h。孵育完成后，利用Biotek多功能酶标仪检测665nm和620nm读值。通过Ratio(665/620)与化合物浓度作图，用GraphPad Prism软件非线性回归方法进行曲线拟合及EC50计算。
表1候选序列细胞激动活性
表2候选化合物细胞激动活性
GIP类似物长效缀合物编号 hGIPREC50(pM) hGLP-1REC50(pM)
Peptide 5 26.98 >100
Peptide 6 32.16 >100
Peptide 7 6.66 >100
Peptide 8 4.26 >100
Peptide 9 7.24 >100
Peptide 10 6.82 >100
Peptide 11 3.50 >100
Peptide 12 5.14 >100
Peptide 13 5.61 >100
Peptide 14 3.5 >100
Peptide 15 9.14 >100
Peptide 16 3.77 >100
Peptide 17 25.68 >100
Peptide 18 21.09 >100
Sequence 1-18为GIP类似物裸肽形式。Peptide5-18为GIP类似物的长效缀合物，GIP类似物的氨基酸序列对应Seq ID.5-18。
本发明对天然的GIP序列进行改造并进行长效缀合物的修饰，产生的GIP类似物及其长效缀合物具有优于天然GIP的对GIP受体提高的激动活性，并实现对GIP受体的选择性激活。
实施例8：IPGTT(腹膜内葡萄糖耐量试验)考察施用GIP类似物长效缀合物后对血糖水平的影响
在葡萄糖耐量试验当天，对db/db雄性小鼠(8-9周)注射GIP类似物长效缀合物(经脂肪酸链修饰的)peptide 7、8、9、10、14(制备方法及化学结构详见实施例2、3、4、5、6)，同步进行动物禁食4h。动物可以饮水，但不能食用食物。测量尾部血糖水平，并向小鼠注射(t＝0)2g/kg的腹膜内(i.p.)葡萄糖负荷(200mg/ml葡萄糖溶液，剂量体积10ml/kg)。腹膜内注射葡萄糖负荷后0、15、30、60、120分钟测量尾部血糖水平，各化合物注射后血糖变化值及曲线下面积见附图1和附图2。
从附图可以看出，使用本发明GIP类似物长效缀合物(peptide 7、9、10)导致的血糖耐受性均显著增强，Peptide 7的效果尤其明显。
实施例9：GIP类似物长效缀合物与GLP-1类似物复方在雄性STZ造模二型糖尿病小鼠连续给药7天后进行禁食血糖检测，并评估对血糖的影响
本实施例中使用的GLP-1类似物为司美格鲁肽，其可以如WO2006/097537的实施例4所述制备，并且也被称为N6,26-{18-[N-(17-羧基十七碳酰基)-L-γ-谷氨酰基]-10-氧代-3,6,12,15-四氧杂-9,18-二氮杂十八碳酰基}-[8-(2-氨基-2-丙酸),34-L-精氨酸]人胰高血糖素样肽1(7-37)，参见WHO Drug InformationVol.24,No.1,2010。
本实施例中使用的GIP类似物长效缀合物为peptide 7，制备方法及化学结构详见实施例2。
雄性小鼠在开始治疗前使其适应新环境1周，将小鼠分组(n＝6～8/组)，按照体重、禁食血糖分组，进行筛选并均衡分组，尽量排除过大或者过小的个体。每天一次向动物皮下施用空白缓冲液或测试化合物。体重组每天在给药前测量体重，禁食血糖组在给药7天后禁食4h，测量血糖值。
表3：GIP类似物长效缀合物与GLP-1类似物复方降糖药效
从表3可以看出，使用GLP-1类似物的单药治疗导致血糖值降低，并且呈现明显的剂量依赖性。GLP-1受体激动剂(2.4nmol/kg)与peptide 7(45nmol/kg)的联合治疗加强了血糖值降低的效果，联合治疗显著好于单药治疗所达到的改善情况，其效果好于累加效果。
实施例10：GIP类似物长效缀合物与GLP-1类似物复方后的减重药效
本实施例中使用的GLP-1类似物为司美格鲁肽，同实施例9。
选用C57BL/6J的雄性小鼠，周龄为16W～18W，数量8+只；经过高脂饲料诱导肥胖的DIO雄性小鼠，周龄为16W～18W，数量56+只。所有小鼠进入动物设施后，适应性饲养3天及以上，分组前需要适应3天，检测所有小鼠体重、体脂比及禁食血糖，56只DIO小鼠以体重和禁食血糖为主，体脂比为辅，进行随机分组；8只相近周龄C57BL/6J小鼠作为健康对照一同入组。所有组别的小鼠分组前2-3天单笼饲养，适应环境，期间每天进行适应抓取和空白溶剂给药。分组当天为Day 0，连续给药28天。其中Vehicle组为空白溶剂给药(丙二醇：14.0mg/mL和磷酸氢二钠：1.132mg/mL)，pH 7.4，s.c.(Subcutaneous injection)为皮下注射，给药频率QD为一天一次。具体给药方案见下表.
表4：给药方案-1
药效期根据给药频率每天记录小鼠体重,每3天检测一次餐后血糖，每7天检测一次禁食血糖，终点前检测一次IPGTT(Intraperitoneal glucose tolerance tests，腹腔葡萄糖耐量试验)。从表5体重数据可以看出，GIP类似物单药发挥药效作用有限，复方后GIP类似物可以显著增强GLP-1类似的减重药效，其效果好于累加效果。附图3终点前检测IPGTT中血糖变化值曲线下面积可以看出，GLP-1受体激动剂与GIP类似物，联合治疗加强了血糖值降低的效果(与G2&G3组相比)，其中Peptide 8联合后效果最佳。
表5给药28天后体重变化
实施例11：GIP类似物长效缀合物与GLP-1类似物在不同给药比例下，在雄性DIO小鼠连续给药25天后进行体重检测，并评估对摄食量、肝脏总胆固醇(TC)水平、总三油甘脂(TG)水平的影响
本实施例中使用的GLP-1类似物为司美格鲁肽，同实施例8。
本实施例中使用的GIP长效缀合物为Peptide 8，制备方法及化学结构详见实施例3。
64只高脂饮食诱导肥胖(DIO)小鼠进行称重。当小鼠平均体重约40-45g时，根据小鼠体重随机分配到G2-G11组中，每组8只；正常饮食C57BL/6小鼠8只入组G1组。所有组别的小鼠分组前2-3天单笼饲养，适应环境，期间每天进行适应抓取和空白溶剂给药。分组当天为Day 0。具体给药方案见下表6，其中Vehicle组为空白溶剂给药(丙二醇：14.0mg/mL和磷酸氢二钠：1.132mg/mL)，pH 7.4，s.c.(Subcutaneous injection)为皮下注射，给药频率QD为一天一次，以下实施例相同。
分组(即首次给药前)及分组后每三天称取一次动物体重。实验终点时(Day 25)小鼠禁食4h，G1-G8组全部小鼠收集肝脏并称重，分别取20mg左右的肝脏进行匀浆，取匀浆液进行总胆固醇(TC)和三油甘脂(TG)的检测。
实验结果如表7、8所示，Day 25时，与G1空白溶剂对照比，G2模型组体重显著升高，与G2模型组比，其余给药组小鼠体重均显著降低，下降幅度均超过G2模型组20％以上。在10nmol/kg GLP-1类似物剂量下，与不同Peptide8剂量复方后可发挥的减重药效与GLP-130nmol/kg下相比药效相当或优效。在GIP类似物90nmol/kg剂量下，低剂量GLP-1(5nmol/kg)至中高剂量(10、30nmol/kg)下，复方药效与GLP-130nmol/kg下相比药效相当或优效。通过剂量组合，发现GIP类似物可以增强GLP-1类似物的治疗效果，发挥协同作用。除了减重方面的药效，GIP类似物与GLP-1类似物复方后的还具有增强TG/TC代谢指标改善的作用。
表7固定GLP-1类似物剂量下，与不同剂量的peptide8复方后减重药效
G1空白溶剂对照组，G3-G10给药组与G2模型组各时间点体重，体重变化百分比，进行统计学分析(One-wayANOVA)，*p<0.5，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001
表8固定peptide8剂量下，与不同剂量的GLP-1类似物复方后减重药效
G1空白溶剂对照组，G3-G10给药组与G2模型组各时间点体重，体重变化百分比，进行统计学分析(One-wayANOVA)，*p<0.5，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)
表9受试品对DIO小鼠实验终点TG，TC的影响
G1空白溶剂对照组，G3-G10给药组与G2模型组各时间点体重，Tc/TG变化，进行统计学分析(One-way ANOVA)，*p<0.5，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)
实施例12：GIP类似物长效缀合物药效高剂量探索
本实施例中使用的GLP-1类似物为司美格鲁肽，同实施例8。
本实施例中使用的GIP长效缀合物为Peptide7与Peptide8，制备方法及化学结构详见实施例2与实施例3。
72只DIO小鼠进行称重。(入组筛选)当小鼠平均体重约40-45g时，根据小鼠体重随机分配到G2-G11组中，每组8只；正常饮食C57BL/6小鼠8只入组G1组。所有组别的小鼠分组前2-3天单笼饲养，适应环境，期间每天进行适应抓取和空白溶剂(丙二醇：14.0mg/mL和磷酸氢二钠：1.132mg/mL，pH 7.4)给药。分组当天为Day 0。具体给药方案见下表10。
通过不同调节GLP-1类似物(司美格鲁肽)与GIP类似物长效缀合物(Peptide7与Peptide8)的比例，在GLP-1高剂量(30nmol/kg)下，Peptide7与Peptide8以(1：1、1：3、1：9)的比例进行复方给药，仍可将减重效果进一步扩大，结果见表11。
表10给药方案-3
表11受试品对DIO小鼠D 21(给药后第21天)体重的影响
G1溶媒对照组，G3-G10给药组与G2模型组各时间点体重，体重变化百分比，进行统计学分析(One-way ANOVA)，*p<0.5，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001
实施例13：GIP类似物长效缀合物对摄水量的影响
本实施例中使用的替尔泊肽(Tirzepatide)为GIP和GLP-1共激动剂化合物，其肽序列为：H-Tyr1-Aib2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Tyr10-Ser11-Ile12-Aib13-Leu14-Asp15-Lys16-Il e17-Ala18-Gln19-Lys20(AEEA-AEEA-γ-Glu-eicosanedioicacid)-Ala21-Phe22-Val23-Gln24-Trp25-Leu26-Ile27-Ala28-Gly29-Gly30-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38-Ser39-NH2
其可以如WO2016111971A1的实施例1所述制备。
基于实施例11的实验，对小鼠的累积摄水量也进行了统计，同时与替尔泊肽给药组小鼠的摄水量进行了比较。表12摄水量数据与替尔泊肽比较，可以发现，替尔泊肽给药组小鼠的摄水被显著抑制，但实验组G5-G9中GIP类似物长效缀合物的引入在提高GLP-1类似物药效的同时，并没有增加小鼠额外的不良反应。
表12摄水量统计
G1溶媒对照组，G3-G10给药组与G2模型组各时间点摄水量进行统计学分析(One-wayANOVA)，*p<0.5，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

Claims (9)

1.一种GIP类似物在2型糖尿病药物制备中的用途。
2.如权利要求1所述的制备用途，其特征在于，所述GIP类似物，包括类GIP多肽片段，所述类GIP多肽类似物片段包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1～18。
3.一种GIP类似物长效缀合物在2型糖尿病药物制备中的用途。
4.根据权利要求3所述的制备用途，其特征在于，所述GIP类似物长效缀合物其选自以下：
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,R30]-hGIP(1-31)；
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,L17,R30]-hGIP(1-31)；
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,E20,R30]-hGIP(1-31)；
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,L17,E20,R30]-hGIP(1-31)；
N{Epsilon-30}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,R16]-hGIP(1-31)。
5.一种GIP类似物长效缀合物与GLP-1受体激动剂联合用于2型糖尿病药物和/或减肥药物制备的用途。
6.根据权利要求5所述的制备用途，其特征在于，所述GIP类似物长效缀合物其选自以下：
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,R30]-hGIP(1-31)；
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,L17,R30]-hGIP(1-31)；
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,E20,R30]-hGIP(1-31)；
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,L17,E20,R30]-hGIP(1-31)；
N{Epsilon-30}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,R16]-hGIP(1-31)。
7.根据权利要求5所述的制备用途，其特征在于，所述GLP-1受体激动剂为利拉鲁肽、司美格鲁肽、艾塞那肽、杜拉糖肽、利西那肽或阿必鲁肽等具有GLP-1受体激动活性的化合物，优选司美格鲁肽。
8.根据权利要求5至7任意一项所述的制备用途，其特征在于所述GIP类似物长效缀合物其选自以下：
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,R30]-hGIP(1-31)；
N{Epsilon-16}-18-{[(23R)-23-羧基-2,11,20-三氧亚基-10,19-二氮杂-4,7,13,16-四氧杂二十三烷-23-基]氨基}-18-氧亚基十八烷酸乙酰基-[Aib2,L14,L17,R30]-hGIP(1-31)；
所述GLP-1受体激动剂为司美格鲁肽。
9.根据权利要求8所属的制备用途，所述GIP类似物长效缀合物与GLP-1受体激动剂摩尔比为1:1～1:9，优选1:3～1:9，优选1:5～1:9，更优选1:9。
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