CN118252123A - 一种小鼠胃癌模型及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种小鼠胃癌模型及其构建方法和应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种小鼠胃癌模型及其构建方法和应用。
背景技术
胃癌是全球第五大最常见的癌症,其致死率位居第四。胃癌在某些亚洲中南部国家居肿瘤致死原因首位,东亚和东欧发病率高,在北美和北欧发病率低。大多数胃癌或胃食管结合部(GEJ)癌患者确认时已为晚期,并且预后差。转移性胃癌的5年生存率约为5.5%。根据全国恶性肿瘤登记资料分析,中国约30%的胃癌患者初次诊断即为伴有远处转移的晚期胃癌,该类患者行姑息手术及化疗治疗的5年生存率不足10%;而侵犯邻近脏器的局部进展期胃癌患者的5年生存率为13%~34%。
长期以来,晚期胃/胃食管结合部腺癌的治疗原则仍是以全身化疗为主的综合治疗。目前美国临床肿瘤学NCCN指南推荐含氟嘧啶(卡培他滨或氟尿嘧啶)和铂类(奥沙利铂或顺铂)等细胞毒药物的双药联合化疗为一线治疗方案,其中卡培他滨和奥沙利铂的联合方案(CAPOX)是主要推荐方案之一。晚期胃癌患者一线化疗的中位生存期往往仅1年左右。
Checkmate 649研究对比了抗PD-1抗体纳武利尤单抗联合化疗和单用化疗一线治疗HER2阴性或未知的胃癌和胃食管结合部腺癌的疗效,结果显示在PD-L1 CPS≥5的人群中,纳武利尤单抗联合化疗显著提高OS(14.4月vs.11.1月;HR=0.71;p<0.0001);但在PD-L1 CPS<5的人群中,纳武利尤单抗联合化疗相对于单用化疗并未给患者带来OS或PFS获益(OS12.4月vs.12.3月,HR=0.94;PFS 7.5月vs 8.2月,HR=0.93)。因此,尽管该联合方案已通过FDA和中国国家药监局审批,批准用于一线联合铂类和氟尿嘧啶类化疗治疗晚期胃癌、胃食管结合部癌和食管腺癌的治疗(无论PD-L1表达情况),但EMEA仅批准在PD-L1 CPS≥5的人群使用该联合方案,且NCCN指南以及CSCO指南1级证据仅推荐纳武利尤单抗联合化疗用于PD-L1 CPS≥5的晚期转移性胃癌患者,对于PD-L1 CPS<5的人群,仍推荐化疗为主。
细胞表面抗原Claudin-18的剪切变体2(cell surface antigen claudin-18splice variant 2(CLDN 18.2))作为一个高度特异性的细胞表面蛋白,在正常的组织中仅在分化的胃粘膜上表皮细胞上表达且在胃干细胞上不表达,但能在多种肿瘤组织中持续、稳定地高表达。研究已经表明,CLDN 18.2在多种原发恶性肿瘤中异常激活和过度表达,尤其好发于消化系统恶性肿瘤,包括胃癌(包括原发性胃癌及其转移后癌症类型),胰腺癌,食管癌,胆管癌和胆囊癌等,在卵巢癌和肺癌中也能检测到显著表达。由于CLDN18.2在除胃特定细胞以外的正常组织中几乎不表达而在肿瘤组织中显著表达,靶向CLDN18.2对正常组织的影响很小,这使CLDN18.2成为一个理想的肿瘤治疗性候选靶点。安斯泰来、创胜集团一二期的临床结果显示其抗CLDN18.2单抗联合一线化疗治疗晚期胃癌都取得了积极的结果。
由于抗CLDN18.2单抗主要是基于NK细胞的ADCC(还有一部分CDC)的作用来杀伤肿瘤细胞,因此临床前的动物模型需要小鼠自体或者异体移植的NK细胞参与,但建立该肿瘤模型比较复杂和困难。常见的依据人外周血单个核细胞(PBMC)或者造血干细胞(HSC)重建的人源化小鼠模型,尽管其T细胞和B细胞重建的效果较好,但NK细胞基本不能存活;而在人源化IL-15小鼠上重建,虽然NK细胞能够一定程度的重建,但过程比较复杂,其重建的NK细胞也不一定具有生物学功能。因此亟需提供一种适合评价靶向人CLDN18.2药物(例如抗CLDN18.2抗体,靶向CLDN18.2的ADC等)的药效的小鼠胃癌模型及其构建方法和应用。
发明概述
本发明人利用免疫系统正常的特定小鼠品系,基于特定的小鼠胃癌细胞系,构建了小鼠胃癌模型。本发明的小鼠胃癌模型稳健,十分适合靶向人CLDN18.2药物及其治疗联合的药效评价。
在第一方面,本发明提供了一种小鼠胃癌模型,其包含植入的胃癌MFC细胞肿瘤,其中所述MFC细胞包含并稳定表达编码人CLDN18.2的核酸,且其中所述小鼠具有615系小鼠遗传背景。在一个优选实施方案中,所述小鼠为6-7周龄雌性615系小鼠。
在一些实施方案中,所述植入胃癌MFC细胞选自:皮下植入,原位植入,或系统注射植入(例如,腹腔或静脉注射)。
在一些实施方案中,所述人CLDN18.2包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列,或与其具有至少95%同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述MFC细胞是通过使用包含人CLDN18.2编码核酸的慢病毒载体转染而构建的单克隆细胞系。在再一实施方案中,所述慢病毒载体还包含哺乳动物细胞筛选抗性基因,例如嘌呤霉素抗性基因。
在一些实施方案中,所述编码人CLDN18.2的核酸在组成型启动子控制下表达,优选地所述启动子为CMV启动子。
在第二方面,本发明提供了一种构建本发明的小鼠胃癌模型的方法,包括步骤:
(a)构建稳定表达编码人CLDN18.2的核酸的单克隆MFC细胞系;
(b)将步骤(a)获得的单克隆MFC细胞株的细胞,植入615系小鼠皮下。
在一些实施方案中,所述植入选自皮下,原位,或系统注射(例如,腹腔或静脉注射),优选皮下植入所述单克隆MFC细胞系。
在一些实施方案中,步骤(b)中,皮下植入大约1x105个细胞至大约1x107个所述MFC细胞,优选所述MFC细胞为对数生长期细胞。
在一些实施方案中,如通过流式细胞术所测定的,相比于对照MFC细胞,步骤(a)获得的单克隆MFC细胞系具有高至少5倍,优选高至少10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍人CLDN18.2表达量。
在第三方面,本发明提供一种用于靶向人CLDN18.2药物或包含所述药物的治疗联合的药效评价的方法,包括:
(i)根据本发明第二方面的方法构建小鼠胃癌模型;
(ii)向小鼠模型施用待测药物或治疗联合;以及
(iii)评价待测药物或治疗联合的药效。
在第四方面,本发明提供了一种用于筛选靶向人CLDN18.2的候选药物或包含所述药物的候选治疗联合的方法,
(i)根据本发明第二方面的方法构建小鼠胃癌模型;
(ii)向小鼠模型施用待测候选药物或治疗联合;以及
(iii)评价待测候选药物或治疗联合的药效。
在根据本发明第三或第四方面的一些实施方案中,所述靶向人CLDN18.2药物为包含抗人CLDN18.2抗体或其抗原结合片段的药物。在一些实施方案中,所述抗人CLDN18.2抗体或其抗原结合片段包含根据Kabat定义的SEQ ID NO:2的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列,和根据Kabat定义的SEQ ID NO:3的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的抗体;优选地,包含SEQ ID NO:2的重链可变区和SEQ ID NO:3的轻链可变区的抗体。
在根据本发明第三或第四方面的一些实施方案中,所述靶向人CLDN18.2药物选自:Zolbetuximab;AB011;TST001;MIL93;M108;LM-102;LM-302;NBL-015;ASKB589;BNT141–01;LS-CLDN18.2001;ZL-1211;FL-301;Q-1802;AMG-910;CT041;LCARC18S;LY011;CMG901;SYSA1801;和RC118。
在一些实施方案中,所述待评价或筛选的治疗联合包括:所述靶向人CLDN18.2药物与选自以下的一种或多种治疗的联合:
-化疗剂,例如,含氟嘧啶(例如卡培他滨或氟尿嘧啶)、铂类(例如奥沙利铂或顺铂)、紫衫醇、多西他赛、伊利替康或其组合;和
-免疫检查点抑制剂,例如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
在一些实施方案中,所述待评价或筛选的治疗联合包括所述靶向人CLDN18.2药物与以下之一或两者的组合:
-抗PD-1抗体;和
-奥沙利铂/氟尿嘧啶。
在一些实施方案中,所述抗PD-1抗体选自:Nivolumab,Dostarlimab,Pembrolizumab,MEDI0680,MEDI4736,BI 754091,Pidilizumab,Cemiplimab,Spartalizumab,Cetrelimab,Toripalimab,PF-06801591,Tislelizumab,AMP-224,ABBV-181,Lambrolizumab,Camrelizumab,Sintilimab,Penpulimab,Zimberelimab,Retifanlimab,Serplulimab,Balstilimab,Geptanolimab,Prolgolimab,Ezabenlimab,Sasanlimab,Pimivalimab,Budigalimab,Nofazinlimab,Sindelizumab,MGA404,Sym021,BAT1306,和HX008。
在一些实施方案中,所述抗PD-L1抗体选自:Atezolizumab,BMS-936559,Avelumab,lodapolimab,Durvalumab,CX-072,FAZ053,Envafolimab,MDX-1105,STI-1040,CS1001,Adebrelimab,SHR-1701,TOB2450,Bintrafusp,LP002,STI-3031,Cosibelimab,Pacmilimab,NM01,LDP,AMP-224,Garivulimab,A167,SCD-135,Opucolimab,和GR1405。
在一些实施方案中,在向所述小鼠模型施用所述药物或治疗联合后,监测肿瘤生长,优选地监测肿瘤生长至少15天、至少20天、至少30天或至少40天。
在一些实施方案中,所述人CLDN18.2靶向药物或治疗联合以单剂或多剂施用于小鼠模型,且优选地其中首剂施用在所述单克隆MFC细胞株植入之前或植入之后第0天至第15天进行;或在MFC肿瘤体积达到至少50mm3,90mm3,100mm3,110mm3,120mm3,130mm3,140mm3,150mm3,200mm3,250mm3,或300mm3时进行。
在一些实施方案中,在向小鼠植入所述MFC细胞后至少5天、至少10天、至少20天、至少30天、至少40天,进行所述评价,且优选地,所述评价持续至少10天、至少20天、至少30天或至少40天。
在一些实施方案中,在所述评价前,所述药物或治疗联合持续施用至少1周、至少2周、至少3周、至少4周,且优选地,以选自以下的时间间隔施用:每日一次、每周两次、每周一次、每两周给药一次、每三周一次或每月一次。
在一些实施方案中,所述药物或治疗联合采用选自以下的施用途径施用:腹腔给药、静脉给药、口服给药、瘤内给药。
在一些实施方案中,所述评价包括监测选自以下之一项或多项参数:小鼠体重、肿瘤体积、肿瘤生长速度、小鼠存活率、小鼠代谢参数、免疫效应细胞分析、肿瘤组织学、肿瘤微环境改变、肿瘤转移。
在一些优选的实施方案中,所述靶向人CLDN18.2药物为抗人CLDN18.2抗体,且所述抗体包含Fc区。在一些更优选的实施方案中,所述抗人CLDN18.2抗体基于NK细胞的ADCC和/或CDC作用来杀伤肿瘤细胞。优选地,所述抗人CLDN18.2抗体或其抗原结合片段包含根据Kabat定义的SEQ ID NO:2的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列,和根据Kabat定义的SEQ ID NO:3的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的抗体;优选地,包含SEQ ID NO:2的重链可变区和SEQ ID NO:3的轻链可变区。
在第五方面,本发明提供了用于筛选或评价靶向人CLDN18.2的候选药物或包含所述药物的候选治疗联合的产品,其中所述产品包含根据本发明的小鼠胃癌模型,和任选地用于所述药物或治疗联合的药效评价的工具。
附图简述
图1显示,用于构建本发明细胞系命名为MFC/CLDN18.2的慢病毒表达载体的质粒图谱。
图2显示,通过流式细胞术检测,不同人CLDN18.2转基因MFC细胞克隆的人CLDN18.2表达水平。
图3显示,MFC/CLDN18.2小鼠肿瘤模型的生长曲线。
图4显示,抗CLDN18.2抗体联合抗PD-1抗体与化疗抑制小鼠胃癌MFC/CLDN18.2肿瘤的生长。
图5显示:不同品系小鼠中MFC-hCLDN18.2肿瘤的生长曲线(表示为平均值±标准误,n=5)。
发明详述
除非另外限定,否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外,本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。
定义
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5%的下限和比指定数字数值大5%的上限的范围内的数字数值。
在本文中,术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤,但是不排除任意其他要素、整数或步骤。例如,在述及包含一个氨基酸序列的多肽时,也涵盖了由该氨基酸序列组成的多肽。
在本文中,术语“人CLDN18.2”是指人来源的细胞表面抗原Claudin-18的剪切变体2。Claudin18.2属于4次跨膜蛋白,包含2个胞外环和1个胞内环,其序列与同家族蛋白Claudin18.1非常相近,仅在第一个胞外环上存在氨基酸差别。优选地,所述CLDN18.2具有Uniprot ID:P56856-2下记载的氨基酸序列,或具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列:
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LGLPAMLQAVRALMIVGIVLGAIGLLVSIFALKCIRIGSMEDSAKANMTLTSGIMFIVSGLCAIAGVSVFA
NMLVTNFWMSTANMYTGMGGMVQTVQTRYTFGAALFVGWVAGGLTLIGGVMMCIACRGLAPEETNYKAVSYHASGHSVAYKPGGFKASTGFGSNTKNKKIYDGGARTEDEVQSYPSKHDYV(SEQ ID NO:1)。
在本文中,表述“人CLDN18.2”也涵盖来自人的各种功能性变体,包括天然变体和人工变体,优选地所述变体与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在本文中,表述“人CLDN18.2”也涵盖,包含能够与靶向CLDN18.2药物(例如CLDN18.2抗体)特异性结合的人CLDN18.2胞外区的人工膜结合蛋白。
在本文中,在提及蛋白或核酸序列时,使用的术语“来源”或“来自”可互换使用,表示所述蛋白或核酸序列来自所述及的来源细胞或物种,由此具有与所述来源中所包含的该类蛋白或核酸基本相同(至少95%或优选地99%)的氨基酸序列或核苷酸序列,且具有相同的期望生物学活性,例如与相同结合配偶体(例如抗体)的结合活性。
在本文中,术语小鼠的“遗传背景”是指,属于特定小鼠品系的小鼠的基因组。在本文中,“遗传背景”可以是近交系小鼠,但不限于此。例如,不同的第一和第二小鼠品系杂交,产生的F1后代将具有混合了两个品系的基因组。如果该F1小鼠与其中一个亲本小鼠品系回交至少10代,所得小鼠的遗传背景将是用于回交的该亲本小鼠品系的遗传背景。因此,在本文中,“遗传背景”也涵盖由此杂交和回交来源的小鼠遗传背景。在本文中,“遗传背景”也涵盖,在所述品系的小鼠成员的基因组中,通过例如转基因方式,已经引入了少数外源核酸序列的情况。
在本文中,“人CLDN18.2靶向药物”是指,能够特异性靶向并结合人CLDN18.2的人CLDN18.2靶向药物。这样的药物可以是包含能够与人CLDN18.2结合的抗体或其抗原结合部分的分子,例如蛋白质或多肽,或其偶联物或缀合物,或细胞表面表达所述结合分子的细胞,例如免疫效应细胞。
在本文中,关于氨基酸序列(或核酸序列)的“序列同一性百分比(%)”定义为在比对序列并且(如有必要)引入缺口以实现最大对应性后,候选序列中与参考序列中氨基酸(或核酸)残基相同的氨基酸(或核酸)残基的百分比。例如,可以使用公开可获得的工具如BLASTN、BLASTp(可在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的网站上获得,也参见AltschulS.F.等人,J.Mol.Biol.,215:403–410(1990);Stephen F.等人,Nucleic Acids Res.,25:3389–3402(1997)),ClustalW2(可在欧洲生物信息学研究所的网站上获得,也参见HigginsD.G.等人,Methods in Enzymology,266:383-402(1996);Larkin M.A.等人,Bioinformatics(Oxford,England),23(21):2947-8(2007))和ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件,来实现用于确定氨基酸(或核酸)序列同一性百分比的比对。本领域技术人员可以使用工具提供的默认参数,或者可以例如通过选择合适的算法来自定义适合比对的参数。在某些实施方式中,不完全相同的残基位置可以通过保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是指其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如,电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基取代。通常,保守的氨基酸取代基本上不会改变蛋白质的功能特性。如果两个或更多个氨基酸序列之间由于保守取代而彼此不同,可以向上调整相似性的百分比或程度以校正取代的保守性。进行这种调整的手段是本领域技术人员公知的(参见,例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331),其通过引用并入本文。
本发明胃癌小鼠模型及其构建
建立疾病的小鼠动物模型是药效评价的基础和重要手段。在肿瘤药物评价中,小鼠疾病模型的质量,包括与待测药物的作用机理的适应性、模拟肿瘤微环境的程度、建成模型的概率(即,成模率),均直接关系到药效评价的成本,关系到药效评价的成功与失败。
CLDN18.2靶点已被证明是胃癌治疗很有潜力的靶点,CLDN18.2靶向抗体联合化疗治疗晚期胃癌的三期临床的成功,正在改变现有胃癌治疗的格局。因此,有必要构建适用于此类药物评价的动物模型。
在充分考虑CLDN18.2靶向药物及其治疗联合的作用机理的情况下,本发明人通过深入研究,构建了本发明的胃癌移植物小鼠模型。本发明的胃癌小鼠模型,采用特定遗传背景的免疫系统正常的小鼠构建,由于免疫系统完整,受体小鼠具有完全的免疫活性,不仅与CLDN18.2靶向药物的作用机理相适应,且该免疫系统与同种移植肿瘤细胞相容,从而具有稳定、能最大化模拟肿瘤微环境等优点。
如实施例所证实,相比于常规BALB/c和C57BL/6小鼠,以615系小鼠作为遗传背景,能够显著提高人CLDN18.2转基因MFC胃癌细胞在小鼠中建立肿瘤的成功率,成模率达到100%
如实施例所证实,在本发明的小鼠肿瘤模型中,肿瘤在具有完全免疫功能的615系小鼠中保持持续且稳定的增长趋势,直至40天之后,未出现因小鼠自身免疫机制导致的携带异种来源CLDN18.2的MFC肿瘤的自发消退,由此为持续较长时间的肿瘤药物药效评价提供了条件。
如实施例所证实,本发明的动物模型不仅展示出对CLDN18.2靶向药物的应答,且展示出对免疫治疗和化疗的应答,并能良好地区分单药和治疗联合的药效。这说明,本发明模型不仅适用于靶向CLDN18.2的单药(例如抗CLDN18.2单抗、双抗和ADC)在胃癌治疗中的药效评价;也为其他药物留下作用空间,适用于治疗联合(包括但不限于,化疗和免疫治疗,例如免疫检查点抑制剂、血管生成抑制剂治疗)在胃癌治疗中的药效评价。
因此,在第一方面,本发明提供了一种建立在615系小鼠遗传背景上的胃癌模型,所述小鼠模型包含皮下移植的稳定表达人CLDN18.2的胃癌MFC肿瘤。
MFC/hCLDN18.2细胞系
MFC细胞是小鼠前胃癌细胞系。该细胞系可商购获得,例如自中国医学科学院血液学研究所或中国科学院典型培养物保藏中心购买获得。为适用于人CLDN18.2靶向药物的药效评价,将编码人CLDN18.2的核酸序列引入此胃癌细胞系中,产生细胞表面稳定表达人CLDN18.2的细胞。在本文中,所述稳定表达人CLDN18.2的胃癌MFC细胞及其后代细胞,也称作“MFC/hCLDN18.2细胞”或“MFC/hCLDN18.2细胞系”。
为获得MFC/hCLDN18.2细胞,可使用的人CLDN18.2编码核酸并无特别限制,只要其可以编码并表达来源于人的功能性CLDN18.2蛋白即可。在一个实施方案中,所述人CLDN18.2编码核酸包含编码来源人的CLDN18.2胞外区(即,相应于SEQ ID NO:1的aa1至aa196)的多核苷酸序列。在另一实施方案中,所述人CLDN18.2编码核酸包含编码来源于人的全长CLDN18.2(即,相应于SEQ ID NO:1的aa1至aa261)的多核苷酸序列。在一个实施方案中,所述人CLDN18.2编码核酸包含编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列,或其天然等位基因变体、或与其具有至少95%、96%、97%、98%、99%或99.5%同一性的氨基酸序列的多核苷酸序列。
可以通过本领域已知的核酸转移方法,将人CLDN18.2编码核酸转移至MFC细胞中,产生根据本发明的“MFC/hCLDN18.2细胞”。这样的核酸转移方法包括但不限于,显微注射、粒子攻击、病毒转染等。
已经开发了众多基于病毒或非病毒的载体和系统用于转移基因至哺乳动物细胞中。非病毒载体和系统包含质粒、游离型载体和人工染色体,一般含有用于表达蛋白质或RNA的表达盒(参见,例如,Harrington等人,Nat Genet 15:345,1997)。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒的载体,基于SV40、乳头瘤病毒、HBP EB病毒、痘苗病毒载体和Semliki Forest病毒(SFV)的载体。参见,Smith,Annu.Rev.Microbiol.49:807,1995;和Rosenfeld等人,Cell 68:143,1992。
在一个优选的实施方案中,采用逆转录病毒载体,用于人CLDN18.2核酸转移目的。衍生自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具,因为它们允许转基因的长期、稳定整合和其在子代细胞中增殖。在一个更优选的实施方案中,使用慢病毒载体系统来形成本发明的MFC/hCLDN18.2细胞。
本领域已知多种慢病毒载体系统。在这些系统中,慢病毒基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列)与编码反式作用蛋白的序列分离。由此,载体系统包括包装成分和载体成分。包装成分由病毒基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建,能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白;而载体成分与包装成分互补,含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列,同时具有异源启动子控制下的多克隆位点以及在此位点插入的目的基因。
用于本发明的慢病毒载体系统可以包含慢病毒表达载体和包装辅助病毒成分,其中慢病毒表达载体在细胞中不能复制。可以将包含人CLDN18.2编码核酸的表达盒插入慢病毒表达载体。然后,慢病毒表达载体在包装辅助病毒成分存在下共转染哺乳动物细胞。使用此慢病毒表达系统,可以将所述表达盒整合到哺乳动物细胞核基因组中。
为实现目的基因向MFC细胞转移,与本发明慢病毒表达载体,可以组合使用三质粒包装系统,该包装系统由分别表达gag/pol,Rev,VSV-G(水泡性口炎病毒G蛋白)的三种包装质粒组成。此外,也可以使用其他的慢病毒包装系统,例如五质粒系统(分别提供gag-pro,vpr-pol,VSV-G,Tet-off,tat-IRES-rev表达元件的质粒)。这些慢病毒包装质粒系统可以例如从Invitrogen,Clontech,Didier Trono等处商业购买获得。
在本发明中,在一些实施方案中,表达人CLDN18.2的慢病毒表达载体包含病毒包装、转染、稳定整合所需的遗传信息。在该慢病毒表达载体载体中,人CLDN18.2多肽编码核酸插入两个LTR(长末端重复序列)之间,LTR序列可以促使该编码核酸整合到哺乳动物宿主细胞的基因组中。在一个实施方案中,表达质粒的3’LTR缺失了部分序列,使得整合后的病毒基因组失去自我复制能力。在一些实施方案中,所述慢病毒病毒载体还包含插入两个LTR之间的选择标记基因,例如,抗生素抗性基因,如嘌呤霉素抗性基因。
可以使用如上述的慢病毒载体系统共转染哺乳动物细胞,组装产生具有感染性的假病毒颗粒。收获的感染性病毒颗粒,任选地在浓缩和/或检测病毒滴度后,感染哺乳动物细胞,并筛选细胞表面表达人CLDN18.2的MFC细胞。
一般,为了实现人CLDN18.2在MFC细胞中的表达,在用于向本发明MFC转移人CLDN18.2的载体(包括前述实施方案中的慢病毒表达载体)中,编码人CLDN18.2的核酸包含在表达盒中并与启动子有效连接。在本说明书中,“有效连接”指两个或更多个多核苷酸(例如,DNA)区段之间的功能性关系。一般地,“有效连接”指转录调节序列与被转录序列的功能性关系。例如,如果启动子序列在适宜的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录,则该启动子序列与编码序列有效连接。
能够在哺乳动物细胞中表达转基因的启动子均适用于本发明的目的。在一个实施方案中,所述启动子是组成型启动子。可在哺乳动物细胞中使用的组成型启动子是本领域已知的,包括但不限于,CMV启动子和EF1a启动子。CMV启动子,即立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子,是能够驱动与之有效连接的任何多核苷酸序列高水平表达的组成型强启动子序列。EF1a启动子是哺乳动物细胞中天然存在的启动子,其驱动延伸因子-1复合体的α亚基表达。已经在哺乳动物表达质粒中广泛使用了EF1a启动子并且已经显示有效驱动从克隆至慢病毒载体中的转基因表达目的蛋白。此外,也可以使用其他组成型启动子序列,所述其他组成型启动子序列包括但不限于,猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、埃巴病毒立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子,以及人基因启动子,如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1α启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。另外,本发明并不局限于组成型启动子的使用。也可以考虑使用诱导型启动子。
除启动子之外,包含人CLDN18.2编码核酸的表达盒也可以,根据需要,包含其他调节元件,以利于人CLDN18.2在MFC细胞中的有效表达。此类元件通常包括ATG起始密码子和邻近核糖体结合位点或其他序列。此外,可以通过纳入适用于所用细胞系统的增强子,增强表达的效率。例如,SV40增强子或CMV增强子可用于提高哺乳动物宿主细胞中的表达。表达载体还可以提供分泌信号序列,或使用人CLDN18.2的天然信号序列,以保证含有CLDN18.2的多肽在MFC细胞表面的呈现。
载体还可以包含哺乳动物细胞筛选抗性基因,例如赋予G418、潮霉素、嘌呤霉素等抗性的选择标记基因。由此,在外源人CLDN18.2编码核酸导入宿主MFC细胞后,利用选择标记基因,选择稳定转染的细胞系。在一些实施方案中,表达载体包含哺乳动物细胞筛选抗性基因,例如嘌呤霉素抗性基因。
在MFC细胞系中引入CLDN18.2转基因后,进行MFC/hCLDN18.2单克隆细胞系的选择。为此,可以按照本领域已知的方式,进行有限稀释和克隆筛选。本领域已知的多种方式,可用于检测所获单克隆细胞系中CLDN18.2转基因的基因组组合和稳定表达,例如,基因组测序、PCR扩增分析和流式细胞术检测。在一些优选的实施方案中,MFC/hCLDN18.2单克隆细胞系具有与未转基因的MFC细胞系相同的增殖能力。在一些优选的实施方案中,如基于流式细胞术检测所示,相对于MFC细胞,MFC/hCLDN18.2单克隆细胞系具有高至少5倍、6倍、7倍、8倍、9倍,优选地至少10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、或甚至至少50倍的人CLDN18.2表达量。在再一优选实施方案中,MFC/hCLDN18.2单克隆细胞系经多次传代(例如至少3代、4代、5代)保持稳定的CLDN18.2表达量。
615系小鼠
615小鼠为国际通用的近交系标准实验动物小鼠。在本文中,615系小鼠是指具有615小鼠的遗传背景的小鼠。遗传背景对肿瘤细胞的生长具有影响。在不同遗传背景的小鼠中,即使接种相同的肿瘤细胞,也可能导致十分不同的建模效率和肿瘤生长情况以及不同的药物反应性。在本发明的实施方案中,本发明的胃癌模型建立在615系小鼠遗传背景上。在一个实施方案中,所述615系小鼠为近交系615小鼠。在另一实施方案中,所述615系小鼠在基因组中可以包含或不包含基因修饰。在一些实施方案中,所述基因修饰是引入并整合在基因组中的异源转基因。在一些优选的实施方案中,用于建立模型的小鼠为大约5-8周龄,优选6-7周龄。在一些优选的实施方案中,用于建立模型的小鼠为大约6-7周龄雌性小鼠。
为构建根据本发明的胃癌小鼠模型,将经确认稳定表达人CLDN18.2的MFC/hCLDN18.2单克隆细胞系,植入615系小鼠。所述植入可以选自皮下植入,原位植入,或系统注射植入。在一些实施方案中,皮下植入MFC/hCLDN18.2,并任选地观察肿瘤的生长情况。在一些实施方案中,原位植入MFC/hCLDN18.2,以模拟肿瘤生长的源环境。在另一些实施方案中,通过腹腔或静脉注射,植入MFC/hCLDN18.2,并任选地监测肿瘤的扩散情况。优选地,通过皮下植入,以建立MFC肿瘤。
在一些实施方案中,用于植入的MFC/hCLDN18.2单克隆细胞系为对数生长期细胞。可以根据植入方式,选择合适的植入细胞量,例如,至少1x105至1x107个细胞/只小鼠,如大约1-5x106个细胞/只小鼠。
在一些实施方案中,MFC/hCLDN18.2单克隆细胞植入小鼠后持续稳定生长,建立胃癌MFC肿瘤。在一些实施方案中,通过流式细胞术检测,建立的胃癌MFC肿瘤具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的人CLDN18.2阳性率。
本发明胃癌小鼠模型的应用
本发明的胃癌小鼠模型可用于靶向人CLDN18.2的药物及其联合治疗的药效评价和相关候选药物的筛选。
因此,在一些实施方案中,本发明提供了一种用于靶向人CLDN18.2的药物或包含所述药物的治疗联合的药效评价的方法,包括:
(i)根据本发明的方法构建小鼠胃癌模型;
(ii)向小鼠模型施用待测药物或治疗联合;以及
(iii)评价待测药物或治疗联合的药效。
在另一些实施方案中,本发明提供了一种用于筛选靶向人CLDN18.2的候选药物或包含所述药物的候选治疗联合的方法,
(i)根据本发明方法构建小鼠胃癌模型;
(ii)向小鼠模型施用待测候选药物或治疗联合;以及
(iii)评价待测候选药物或治疗联合的药效。
在本文中,“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将包含治疗剂(例如,根据本发明的)的药物组合物物理引入受试者(例如,根据本发明的小鼠模型)。本文公开的制剂的给药途径包括静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、脊髓或其他肠胃外给药途径,例如通过注射或输注。本文所用的短语“肠胃外给药”是指除肠内和局部给药以外的给药方式,通常通过注射,包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注,以及体内电穿孔。在一些实施例中,该制剂通过非肠胃外途径施用,在一些实施例中,通过口服施用。其他非肠胃外途径包括局部、表皮或粘膜给药途径,例如鼻内、阴道、直肠、舌下或局部。也可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时期内进行施用。
根据本发明,可以提及的人CLDN18.2靶向药物的实例包括,但不限于,具有特异性结合人CLDN18.2胞外区的抗体部分的药物分子,例如,CLDN18.2单特异性抗体、多特异性抗体(例如,双特异性抗体)、抗体-药物偶联物(ADC)、靶向CLDN18.2的嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体(TCR)。
在一个实施方案中,所述人CLDN18.2靶向药物是抗人CLDN18.2抗体或其抗原结合片段。在本文中,术语“抗体”以最广意义使用,指至少包含轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽,其中,所述免疫球蛋白可变区特异性识别并结合目的抗原。因此,使用本发明胃癌小鼠模型进行检测的抗CLDN18.2抗体可以是各种的抗体结构,包括、但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体或多链抗体、单特异性或多特异性抗体(例如双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、重链抗体、骆驼科抗体、全长抗体和抗体片段,只要它们呈现期望的抗原CLDN18.2结合活性即可。而且,抗体可以是任何类(例如,IgG,IgE,IgM,IgD和IgA)、型(例如,IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2)或亚型。
在本文中,“全抗体”(在本文中可与“全长抗体”、“完全抗体”和“完整抗体”互换使用)是指,包含至少两条重链(H)和两条轻链(L)的免疫球蛋白分子。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。可变区是抗体的重链或轻链中参与抗体与其抗原结合的结构域。一般,重链可变区和轻链可变区分别包含负责抗原结合的三个“互补决定区”(在本文中,也缩写“CDR区”或“CDR”),其中从N-端开始顺序编号,位于抗体重链可变结构域内的CDR被称作HCDR1、HCDR2和HCDR3,而位于抗体轻链可变结构域内的CDR被称作LCDR1、LCDR2和LCDR3。本领域公知多种用于在一个给定的VH或VL氨基酸序列中确定其CDR序列的方案。例如,Kabat互补决定区(CDR)是基于序列变异性确定的并且是最常用的(Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1991))。抗体的恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是显示出多种效应子功能。抗体的轻链可以基于其恒定区的氨基酸序列归入两种类型(称为kappa(κ)和lambda(λ))中的一种。抗体的重链可以基于其恒定区的氨基酸序列而划分为主要5种不同的类型:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且这些类型中的几种可以进一步划分成亚类,如,IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1以及IgA2。
在本文中,术语抗体的“抗体片段”和“抗原结合片段”可互换使用,是指并非完整抗体的分子,其包含完整抗体中用于结合该完整抗体所结合的抗原的部分。如本领域技术人员理解的,为实现抗原结合目的,抗体片段通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。可以通过重组DNA技术、或通过酶或化学切割完整的抗体制备抗体片段。抗原结合片段包括但不限于Fab、scFab、Fab’、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、单链Fv、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)、微抗体(minibody)、单结构域抗体(sdAb);以及从抗体片段形成的多特异性抗体。Fab片段是一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段,例如,通过木瓜蛋白酶消化完全抗体能够获得Fab片段。可以借接头将Fab的轻链(L链)和重链(H链)融合构建成单一多肽链,即单链Fab(scFab)(参见例如US20070274985A1)。此外,通过胃蛋白酶在铰链区的二硫键下面消化完全抗体可以产生F(ab′)2,其为Fab’的二聚体,是二价的抗体片段。F(ab′)2可以在中性条件下通过破坏铰链区中的二硫键而被还原,从F(ab′)2二聚体转化为Fab′单体。Fab′单体基本上是具有铰链区的Fab片段。Fv片段由抗体单臂的VL和VH结构域组成。另外,可以使用重组方法,将独立编码Fv片段的两个结构域VL和VH的基因,通过编码连接肽(接头)的核酸序列连接在一起,重组表达形成单链Fv,在该单条蛋白链中VH区和VL区配对提供抗原结合位点。双链抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段,该片段在同一多肽链中包含通过短接头连接的VL和VH。在双链抗体中,由于接头过短,同一链上的VH和VL两个结构域之间无法配对,而被迫与另一链上的互补结构域配对并且产生两个抗原结合位点。双链抗体可以是二价的或双特异性的。双链抗体的更详细描述可以参见例如,EP 404,097;WO 1993/01161;Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003);以及Hollinger等人,PNAS USA 90:6444-6448(1993)。三链抗体和四链抗体和微抗体也描述于Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003),和邵荣光等人(编辑),抗体药物研究与应用,人民卫生出版社(2013)。单结构域抗体(sdAb)通常指这样的抗体,其中单个可变结构域(例如,重链可变结构域(VH)或轻链可变结构域(VL)、衍生自骆驼科重链抗体的重链可变结构域、衍生自鱼类IgNAR的VH样单结构域(v-NAR))即可赋予抗原结合,而不需要与另一可变结构域相互作用以识别靶抗原。(关于抗体片段的更详细的描述,也可以参见:基础免疫学(Fundamental Immunology),W.E.Paul编辑,Raven Press,N.Y.(1993)。
在一些实施方案中,所述人CLDN18.2靶向药物是抗人CLDN18.2抗体,所述抗体除包含负责抗原结合的可变区外,还至少包含免疫球蛋白Fc区。抗体的Fc恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是显示出多种效应子功能。在本文中,术语“效应子功能”指随免疫球蛋白同种型变动的归因于抗体恒定Fc区的那些生物学活性。效应子功能的例子包括:基于补体系统的效应子功能,例如C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC);基于免疫效应细胞,例如,T细胞、B细胞、NK细胞和巨噬细胞的效应子功能,例如,Fc受体结合作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌;以及由免疫复合物介导的效应子功能,例如,抗原呈递细胞的抗原摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)和B细胞活化的下调。
“ADCC”是指抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。ADCC在人体中主要由自然杀伤细胞(NK细胞)介导。在ADCC中,抗体与靶细胞表面上展示的抗原结合,NK细胞表面的FcγRIIIA识别抗体的Fc区,从而NK细胞被激活,释放穿孔素和颗粒溶解酶,导致靶细胞的裂解和凋亡。
评价目标分子的ADCC活性的体外测定试验的非限制性实例描述于US5,500,362(也可以参见,例如Hellstrom,I.等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063;和Hellstrom,I.等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA82(1985)1499-1502);US 5,821,337(也可以参见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)。或者,可采用非放射性测定方法(例如,用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.MountainView,CA)和非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI))。适用于这些测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地,可以在体内评价目标分子的ADCC活性,例如,在如Clynes,R.等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 95(1998)652-656中公开的动物模型中评价。
“CDC”是指补体依赖性细胞毒性。在CDC中,抗体的Fc区与补体分子C1q结合,继而形成膜攻击复合物,导致靶细胞的清除。参见,例如Liszewski和Atkinson,ch.26,Fundamental immunology,第3版,Paul编,Raven Press,New York,1993,pp917-940。
“ADCP”是指抗体依赖性细胞介导的吞噬作用。在Fc受体介导的该过程中,与抗体结合的靶细胞被吞噬细胞例如巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和树突细胞所吞噬。多种Fc受体可以参与该过程。Richards等,Mol.Cancer Ther.7(8):2517-2527(2008)描述了用于ADCP的体外试验。
在一些实施方案中,所述人CLDN18.2靶向药物是全长抗人CLDN18.2抗体。在另一些实施方案中,所述人CLDN18.2靶向药物是抗人CLDN18.2抗体片段,例如选自Fab、scFab、Fab’、F(ab’)2、Fab’-SH、Fv、单链Fv、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)、和微抗体(minibody)。
在一些实施方案中,所述人CLDN18.2靶向药物包含或是单特异性抗体。在另一实施方案中,所述人CLDN18.2靶向药物包含或是多特异性抗体。在本文中,术语“多特异性”抗体指具有至少两个抗原结合位点的抗体,所述至少两个抗原结合位点中的每一个抗原结合位点与不同抗原表位结合。在一些实施方案中,所述人CLDN18.2靶向药物包含或是双特异性抗体,其中所述抗体能够与CLDN18.2上不同的第一和第二表位特异性结合。在一些实施方案中,所述人CLDN18.2靶向药物包含或是双特异性抗体,其中所述抗体能够与CLDN18.2上的第一表位特异性结合,且能够与不同于CLDN18.2的第二个抗原上的第二表位特异性结合。在某些实施方式中,所述第二抗原是免疫相关靶标,其可选地选自下组:PD-L1、PD-L2、PD-1、CLTA-4、TIM-3、LAG3、CD160、2B4、TGFβ、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、ICAM-1、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、LFA-1、ICOS、4-1BB、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、IL-2、IL-15、CD3、CD16和CD83。在某些实施方式中,所述第二抗原包含肿瘤抗原。在某些实施方式中,所述肿瘤抗原存在于表达CLDN18.2的细胞中。在某些实施方式中,所述肿瘤抗原包含CA-125、神经节苷脂G(D2)、G(M2)和G(D3)、CD20、CD52、CD33、Ep-CAM、CEA、蛙皮素样肽(bombesin-like peptides)、PSA、HER2/neu、表皮生长因子受体(EGFR)、erbB2、erbB3/HER3、erbB4、CD44v6、Ki-67、癌相关粘蛋白、VEGF、VEGFR(例如VEGFR3)、雌激素受体、Lewis-Y抗原、TGFβ1、IGF-1受体、EGFα、c-Kit受体、运铁蛋白受体、IL-2R或CO17-1A。在某些实施方式中,第二抗原是T细胞表面抗原。T细胞表面抗原的实例包括但不限于选自下组的抗原:CD3、CD2、CD4、CD5、CD6、CD8、CD28、CD40L和/或CD44,优选为CD3。在某些实施方式中,所述第二抗原是CD3的ε链。在某些实施方式中,所述双特异性抗体与T细胞上的CD3结合导致了所述T细胞的增殖和/或活化,这诱导细胞毒性因子(例如,穿孔素和颗粒酶)的释放以及靶细胞的细胞溶解和凋亡。在某些实施方式中,所述第二抗原是NK细胞表面抗原,例如CD16(FcγRIII)或CD56。在某些实施方式中,双特异性抗体与NK细胞上的CD16结合导致了NK细胞脱粒和靶细胞的穿孔素依赖性靶细胞裂解(ADCC)。
在再一些实施方案中,所述人CLDN18.2靶向药物是,细胞表面表达人CLDN18.2的免疫效应细胞,例如,嵌合抗原受体(CAR)细胞。在本文中,嵌合抗原受体(CAR)是指包含抗原结合结构域、跨膜结构域、(任选地共刺激信号传导区)和TCR信号传导结构域的多肽,其中所述抗原结合结构域与CLDN18.2特异性结合。在一些实施方案中,所述CAR包含本文所述的抗人CLDN18.2的抗原结合片段,例如Fab或scFv。
在再一些实施方案中,所述人CLDN18.2靶向药物是包含靶向人CLDN18.2的抗体部分的抗体-药物偶联物(ADC)。在本文中,术语“抗体-药物偶联物”是指,抗体或其抗原结合片段与另一种活性剂(例如化疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针等)的连接。连接可以是共价键,也可以是非共价相互作用(例如通过静电力)。为了形成抗体药物偶联物,可以使用本领域已知的各种接头。另外,在药物是多肽的情况下,抗体药物偶联物可以以融合蛋白的形式提供,所述融合蛋白可以从编码所述偶联物的多核苷酸表达而来。在一些实施方案中,抗体-药物偶联物(ADC)中与抗体缀合或偶联的药物部分包含清除修饰剂(clearance-modifying agent)、化疗剂、细胞毒性剂、放射性同位素、镧系元素、DNA烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白结合剂或其他抗癌药物。在某些实施方式中,用于ADC中连接抗体与药物的接头在特定的生理环境下是可裂解的,从而促进药物在细胞中的释放。例如,接头可以是酸不稳定的接头、对肽酶敏感的接头、光不稳定的接头、二甲基接头或含二硫键的接头、硫醚接头和酯酶不稳定的接头(Chari等人,Cancer Research52:127-131(1992)、美国专利号5,208,020)。在一些实施方式中,接头可包含天然或非天然氨基酸残基,例如二肽、三肽、四肽或五肽。此类接头的实例包括:缬氨酸-瓜氨酸(ve或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)、甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-yal-cit)、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)、缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基氧酰基(“vc-PAB”)。
在一些实施方案中,所述人CLDN18.2靶向药物包含特异性结合人CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段作为其部分,或由特异性结合人CLDN18.2的抗体或其抗原结合片段组成。在一些实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含根据Kabat定义的SEQ ID NO:2的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列,和根据Kabat定义的SEQ ID NO:3的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列,在一个实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段包含SEQ IDNO:2或与其具有至少90%、95%或96%、97%、98%或99%同一性的VH氨基酸序列和SEQ IDNO:3或与其具有至少90%、95%或96%、97%、98%或99%同一性的VL氨基酸序列。在一个实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段是IgG1型抗体。在一个实施方案中,所述抗体或其抗原结合片段还包含SEQ ID NO:4或与其具有至少90%、95%或96%、97%、98%或99%同一性的重链恒定区序列;和/或SEQ ID NO:5或与其至少90%、95%或96%、97%、98%或99%同一性的轻链恒定区序列。
在一些实施方案中,所述人CLDN18.2靶向药物选自,例如,但不限于:
单克隆抗体类药物:例如,Zolbetuximab(IMAB362,Astellas Pharma);AB011(CARsgen Therapeutics);TST001(Mabspace Biosciences);MIL93(Mabworks Biotech);M108(FutureGen Biopharm);LM-102(LaNova Medicines);LM-302(LaNova Medicines);NBL-015(NovaRock Biotherapeutics);ASKB589(Jiangsu Aosaikang Pharmaceutical);BNT141–01(BioNTech SE);LS-CLDN18.2001(Mabspace Biosciences);ZL-1211(ZaiBiopharmaceutical);FL-301(Nanjing Kaedi Biotech,Flame Biosciences);
双特异性抗体类药物:例如,Q-1802(Qurebio);AMG-910(Amgen);
CAR-T细胞类药物:例如,CT041(CARsgen Therapeutics);LCARC18S(NanjingLegend Biotech Co.);LY011(Shanghai Longyao Biotechnology);
ADC类药物:例如,ASKB589(Jiangsu Aosaikang);CMG901(Keymed Biosciences);SYSA1801(CSPC Pharma);和RC118(RemeGen)。
可使用本发明胃癌小鼠模型进行评价的联合治疗包括人CLDN18.2靶向药物与选自以下的治疗的联合:化疗剂、抗癌药、放射治疗、免疫治疗剂、抗血管生成剂、靶向治疗剂、细胞治疗剂、基因治疗剂、激素治疗剂或细胞因子。
在一些实施方案中,联用的药物包括,但不限于,免疫治疗药物(例如,免疫监测点抑制剂,例如抗PD-1抗体,抗PD-L1抗体,抗TIGIT拮抗剂抗体)、抗血管生成剂(例如,VEGF拮抗剂)、化疗剂(例如,铂类化疗剂(例如,卡铂或顺铂,和/或一种或多种非铂类化疗剂,例如,烷化剂(例如,环磷酰胺)、紫杉烷(例如,紫杉醇,例如,nab-紫杉醇),和/或拓扑异构酶II抑制剂(例如,多柔比星))),或药物组合(例如,包含免疫检查点抑制剂(如抗PD-1抗体)、化疗剂(例如,铂类化疗剂(例如,卡铂或顺铂)和/或一种或多种非铂类化疗剂(例如,烷化剂(例如,环磷酰胺)、紫杉烷(例如,紫杉醇)和/或拓扑异构酶II抑制剂(例如,多柔比星))的药物组合)。
在一些实施方案中,所述联合治疗包括所述人CLDN18.2靶向药物与选自以下的一种或多种治疗的联合:
-化疗剂;和
-免疫检查点抑制剂。
可以提及联用的化疗剂包括,但不限于,烷化剂,例如,环磷酰胺,马利兰,氮芥等;抗代谢类化疗药,例如,氟尿嘧啶,卡培他滨,阿糖胞苷等;抗肿瘤抗生素类化疗药,例如,丝裂霉素,表阿霉素、表柔比星等;植物类化疗药物,例如,长春新碱,长春地辛,紫杉醇,多西他赛,伊利替康等;铂类化疗药,例如顺铂,卡铂,奥沙利铂;激素类化疗药,例如,甲地孕酮,泼尼松,阿那曲唑等。
在一些实施方案中,所述化疗剂选自:含氟嘧啶(例如卡培他滨或氟尿嘧啶)、铂类(例如奥沙利铂或顺铂)、紫衫醇、多西他赛、伊利替康或其组合。
在一些实施方案中,所述化疗剂选自:丝裂霉素C、阿霉素、表柔比星、顺铂、BCNU、5-氟尿嘧啶、依托泊苷、羟基脲、UFT、卡培他滨、S-1、紫杉醇、多西他赛、CPT-11,伊立替康,及其组合。
在一些实施方案中,所述化疗剂选自:FLOT(氟尿嘧啶、亚叶酸、奥沙利铂和多西他赛);ECX(表柔比星、顺铂和卡培他滨);ECF(表柔比星、顺铂和氟尿嘧啶);EOX(表柔比星、奥沙利铂和卡培他滨);EOF(表柔比星、奥沙利铂和氟尿嘧啶);FOLFOX(奥沙利铂、氟尿嘧啶和亚叶酸)。
在本文中,术语“免疫检查点抑制剂”具有本领域的一般含义,并且是指抑制免疫抑制性检查点蛋白的功能的任何化合物。如本文所用,术语“免疫检查点蛋白”在本领域中具有其一般含义,并且是指由T细胞表达的分子,其通过升高信号(刺激性检验点分子)或降低信号(抑制性检验点分子)来表达。抑制性检查点分子的实例包括A2AR,B7-H3,B7-H4,BTLA,CTLA-4,CD277,IDO,KIR,PD-1,LAG-3,TIM-3和VISTA。抑制包括功能降低和完全阻断。优选的免疫检查点抑制剂是特异性识别免疫检查点蛋白的抗体。已知许多免疫检查点抑制剂。免疫检查点抑制剂包括肽,抗体,核酸分子和小分子。免疫检查点抑制剂的实例包括PD-1拮抗剂,PD-L1拮抗剂,PD-L2拮抗剂,CTLA-4拮抗剂,VISTA拮抗剂,TIM-3拮抗剂,LAG-3拮抗剂,IDO拮抗剂,KIR2D拮抗剂,A2AR拮抗剂,B7-H3拮抗剂,B7-H4拮抗剂和BTLA拮抗剂。
在一些实施方案中,免疫检查点抑制剂选自:PD-1拮抗剂(例如抗PD-1抗体),PD-L1(程序性死亡配体-1)拮抗剂(例如抗PD-L1抗体)和PD-L2(程序性死亡配体2)拮抗剂(例如抗PD-L2抗体)。
在一些实施方案中,免疫检查点抑制剂选自以下的抗PD-1抗体:Nivolumab(OPDIVO;BMS-936558),Dostarlimab(TSR-042),Pembrolizumab(KEYTRUDA;MK-3475),MEDI0680(AMP-514),MEDI4736,BI754091,Pidilizumab(CT-011),Cemiplimab(LIBTAYO,REGN2810),Spartalizumab(PDR001),Cetrelimab(JNJ63723283),Toripalimab(JS001),PF-06801591,Tislelizumab(BGB-A317),AMP-224(GSK-2661380),ABBV-181,Lambrolizumab,Camrelizumab(SHR-1210),Sintilimab(Tyvyt,IBI308),Penpulimab(AK105),Zimberelimab,Retifanlimab,Serplulimab,Balstilimab,Geptanolimab,Prolgolimab,Ezabenlimab,Sasanlimab,Pimivalimab,Budigalimab,Nofazinlimab,Sindelizumab,MGA404,Sym021,BAT1306,和HX008。
在一些实施方案中,免疫检查点抑制剂选自以下的抗PD-L1抗体:Atezolizumab(TECENTRIQ;R05541267;MPDL3280A;RG7446),BMS-936559,Avelumab(bavencio),lodapolimab(LY3300054),Durvalumab(MEDI4736),CX-072(Proclaim-CX-072),FAZ053,Envafolimab(KN035),MDX-1105,STI-1040,CS1001,Adebrelimab(SHR-1316),SHR-1701,TOB2450,Bintrafusp,LP002,STI-3031,Cosibelimab,Pacmilimab,NM01,LDP,AMP-224,Garivulimab(BGB-A333),A167,SCD-135,Opucolimab,和GR1405。
在一些实施方案中,抗PD-1抗体选自MDX-1106(也称为纳武利尤单抗(Nivolumab),MDX-1106-04,ONO-4538,和BMS-936558),Merck 3475(也称为Pembrolizumab,MK-3475,Lambrolizumab),和SCH-900475)和CT-011(也称为Pidilizumab,hBAT和hBAT-1)。在一些实施方案中,PD-1结合拮抗剂是AMP-224(也称为B7-DCIg)。在一些实施方案中,抗PD-L1抗体选自YW243.55.S70,MPDL3280A,MDX-1105和MEDI4736。MDX-1105,也称为BMS-936559,是WO2007/005874中描述的抗PD-L1抗体。抗体YW243.55.S70是WO2010/077634 A1中描述的抗PD-L1。MEDI4736是WO2011/066389和US2013/034559中描述的抗PD-L1抗体。MDX-1106,也称为MDX-1106-04,ONO-4538或BMS-936558,是美国专利号8,008,449和WO2006/121168中描述的抗PD-L1抗体。Merck 3745,也称为MK-3475或SCH-900475,是美国专利号8,345,509和WO2009/114335中描述的抗PD-L1抗体。CT-011(Pidizilumab),也称为hBAT或hBAT-1,是WO2009/101611中描述的抗PD-1抗体。AMP-224,也称为B7-DCIg,是WO2010/027827和WO2011/066342中描述的PD-L2-Fc融合可溶性受体。阿替佐木单抗(Atezolimumab)是美国专利No.8,217,149中描述的抗PD-L1抗体。阿韦拉单抗(Avelumab)是US20140341917中描述的抗PD-L1抗体。CA-170是WO2015033301和WO2015033299中描述的PD-1拮抗剂。其他抗PD-1抗体公开于美国专利号8,609,089,US2010028330和/或US20120114649。在一些实施方案中,PD-1抑制剂是选自纳武利尤单抗,帕博利珠单抗或Pidilizumab的抗PD-1抗体。在一些实施方案中,PD-L1拮抗剂选自包括阿韦拉单抗,BMS-936559,CA-170,杜鲁麦单抗(Durvalumab),MCLA-145,SP142,STI-A1011,STIA1012,STI-A1010,STI-A1014,A110,KY1003和阿替佐木单抗的组,优选的是阿韦拉单抗,杜鲁麦单抗或阿替佐木单抗。
在一些优选的实施方案中,其中所述治疗联合包括所述靶向人CLDN18.2药物与以下之一或两者的组合:抗PD-1抗体;和奥沙利铂/氟尿嘧啶。
在筛选和药效评价过程中,所述人CLDN18.2靶向药物或治疗联合可以采用任何适宜的剂量、频率、施用模式、持续时间,施用于根据本发明的小鼠模型。在一些实施方案中,所述人CLDN18.2靶向药物或治疗联合以单剂或多剂施用于小鼠模型。在一些实施方案中,所述人CLDN18.2靶向药物或治疗联合,在所述单克隆MFC/hCLDN18.2细胞植入之前或植入之后,开始首剂施用,例如,在MFC/hCLDN18.2细胞植入之后第0天至第15天,开始首剂施用。在一些实施方案中,所述人CLDN18.2靶向药物或治疗联合,在小鼠模型的MFC/hCLDN18.2细胞肿瘤体积达到至少50mm3、90mm3、120mm3、150mm3、200mm3时,开始首剂施用。
在筛选和药效评价过程中,可以根据所检测的人CLDN18.2靶向药物或治疗联合,确定适宜的药效评价方法。例如,可以在植入所述MFC细胞后至少5天、至少10天、至少20天、至少30天、至少40天,开始进行评价;并持续至少10天、至少20天、至少30天、或至少40天。在一些实施方案中,在所述评价前,所述药物或治疗联合已经持续施用至少1周、至少2周、至少3周或至少4周,任选地,以选自以下的时间间隔施用:每日一次、每周两次、每周一次、每两周给药一次、每三周一次或每月一次。在一些实施方案中,所述人CLDN18.2靶向药物或治疗联合采用选自以下的施用途径施用:腹腔给药、静脉给药、口服给药、或肿瘤内给药。
在根据本发明的筛选和药效评价方法中,在向根据本发明的小鼠模型施用人CLDN18.2靶向药物或治疗联合后,可以根据所用药物或治疗联合的作用机制,监测小鼠模型的各种生理相关参数和/或肿瘤相关参数,并任选地与对照(未施用药物或施用了已知药效的药物)施用进行比较。可以提及的评价参数包括,但不限于,小鼠体重、肿瘤体积、肿瘤生长速度、小鼠存活率、小鼠代谢参数分析、免疫效应细胞分析、肿瘤组织学、肿瘤细胞的增殖和凋亡、外周血淋巴细胞数量(例如,CD3+,CD4+/-,CD8+/-T淋巴细胞)、肿瘤转移、肿瘤微环境改变。
在一些实施方案中,所述评价包括监测肿瘤生长,优选地监测肿瘤生长至少15天、至少20天、至少30天或至少40天。
在一些实施方案中,所述评价包括测量肿瘤细胞的增殖和/或凋亡速率。可以通过5-BrdU摄入测量肿瘤细胞增殖;和/或通过TUNEL测试试验测量肿瘤细胞的凋亡,以监测肿瘤体积的改变与肿瘤细胞凋亡和/或肿瘤细胞增殖的关系。
在一些实施方案中,所述评价包括监测肿瘤微环境的变化,例如,通过显微镜检,观察免疫细胞的浸润和微血管的密度和数量变化。
在一些实施方案中,所述评价包括监测选自以下之一或多项:(i)癌细胞数量减少;(ii)肿瘤大小减小;(iii)在一定程度上抑制、延缓、减缓并可能阻止癌细胞向外周器官的浸润;(iv)抑制(即,在一定程度上减慢并可能阻止)肿瘤转移;(v)抑制肿瘤生长;(vi)预防或延缓肿瘤的发生和/或复发;和/或(vii)在一定程度上减轻一种或更多与癌症相关的症状。
本发明再一方面,也提供了用于本发明上述方法的产品,其中所述产品包含根据本发明的小鼠模型和任选地用于施用和/或评价根据本发明的靶向人CLDN18.5的候选药物或治疗联合的工具。
以下列举实施例,用来更加具体地说明本发明,但本发明不会因此而受到任何的限制。
实施例
实施例1:稳定高表达人CLDN18.2的小鼠胃癌MFC细胞系的构建
实验试剂和细胞株
MFC细胞:来自南京科百生物科技有限公司;
胰酶EDTA溶液:购于上海源培,货号S310KJ
PBS:购于上海源培,货号B320KJ
转染试剂Lipo293TM:购于碧云天,货号C0521
PEG慢病毒纯化试剂:购于英茂盛业,货号P1201
ChamQ SYBR qPCR Master Mix:购于诺唯赞,货号Q311
嘌呤霉素盐酸盐:购于生工,货号A610593-0025
2×Taq Master Mix:购于诺唯赞,货号P112-03
Goat Anti-Human IgG H&L(FITC):购于abcam,货号ab6854
构建稳定表达人CLDN18.2的MFC细胞系
使用慢病毒表达载体pLV4ltr-Puro-CMV质粒(质粒来源于南京永屹生物科技有限公司,质粒图谱见图1),将人CLDN18.2基因(公开序列来自Uniprot ID:P568562)构建至质粒中,置于CMV启动子控制下。根据Lipo293TM(碧云天:C0521)转染试剂的要求,将表达人CLDN18.2基因的穿梭质粒与辅助质粒混匀,再与转染试剂混合并孵育,将孵育混合物加入293T细胞的培养器皿中,进行293T的转染。使用PEG慢病毒纯化试剂(英茂盛业:P1201),进行慢病毒的浓缩与纯化。最后用PBS溶解慢病毒沉淀,以50uL/管进行分装,并保存在-80℃。
侵染前一天取1x105个MFC细胞铺板于24孔板,取适量病毒侵染细胞,24小时后换液。使用6μg/mL终浓度的嘌呤霉素(生工,货号A610593-0025)药杀2天后,换无嘌呤霉素的培养基继续培养。细胞池计数后,通过有限稀释,使细胞浓度控制在1-1.5个细胞每100μL。把该细胞悬液接种到96孔板中;培养一周左右,显微镜下观察96孔板中生长的单克隆,并标记单克隆所在的孔。用胰酶-EDTA溶液将贴壁生长的单克隆细胞消化下来,并终止消化后,转移到新的培养板中,行细胞传代。
待细胞增殖到106个细胞以上时,取约5x105细胞,使用抗人CLDN18.2抗体(18B10-HaLa)和Goat Anti-Human IgG H&L(FITC)(abcam,货号ab6854)进行流式检测。从图2可以看出:构建的不同克隆细胞株(A7-2,A7-1和A13-1)呈现出人CLDN18.2不同程度的细胞表面表达,故细胞系构建成功,将构建好的细胞系命名为MFC/CLDN18.2。
实施例2:胃癌MFC/CLDN18.2小鼠肿瘤模型的构建
试验试剂和实验材料:
DMEM培养基:购于Gibco,货号11965-092
FBS:购于Gibco,货号10099-141
胰酶EDTA溶液:购于Gibco,货号SV30010
PBS:购于Hyclone,货号Cat:SH30256.01
实验小鼠
品系为SPF级615小鼠,购于中国医学科学院血液学研究所(生产许可证号:SCXK(津)2020-0001);6-7周龄雌性小鼠,体重范围约18-20g;动物合格证号:0012240;使用单位动物设施为创胜诊断科技(苏州)有限公司(使用许可证号:SYXK(苏)2019-0016)。
动物模型构建
在37℃,含5%的CO2的条件下,将实施例1构建好的MFC/CLDN18.2细胞(A13-1克隆)加入到含10%FBS的DMEM完全培养基进行体外培养扩增。细胞每隔一天,使用胰酶溶液进行消化并传代处理。当细胞处于对数生长期时,收集细胞进行接种。
选用6-7周龄雌性615小鼠,在每只小鼠右腋窝处皮下注射0.1mL(2*10^6cells/只)MFC/CLDN18.2细胞悬液。约一周后对肿瘤进行测量,并记录肿瘤生长情况。肿瘤体积计算公式:V=0.5a*b^2(a代表肿瘤长径、b代表肿瘤短径)。由图3可以看出,稳定表达人CLDN18.2的MFC肿瘤能够在615小鼠上持续稳定的生长。
实施例3:抗人CLND18.2抗体联合奥沙利铂/氟尿嘧啶和抗PD-1抗体对小鼠胃癌MFC/CLDN18.2肿瘤的抑制作用
试验试剂和实验材料:
DMEM培养基:购于Gibco,货号11965-092
FBS:购于Gibco,货号10099-141
胰酶EDTA溶液:购于Gibco,货号SV30010
PBS:购于Hyclone,货号Cat:SH30256.01
受试物
抗人CLDN18.2抗体18B10-HaLa,制备方法参见WO2021032157A1,来自苏州创胜医药集团有限公司,使用时用PBS稀释至所需浓度;
18B10-HaLa抗体VH序列(SEQ ID NO:2)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYNMNWVRQAPGQGLEWMGNIDPYYGGTSYNQKFKGRVTMTIDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARMYHGNAFDYWGQGTTVTVSS
18B10-HaLa抗体VL序列(SEQ ID NO:3)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNLKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPLTFGGGTKVEIK
18B10-HaLa抗体重链恒定区序列(SEQ ID NO:4)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
18B10-HaLa抗体重链恒定区序列(SEQ ID NO:5)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
奥沙利铂,批号201126AM,来自江苏恒瑞医药股份有限公司;
氟尿嘧啶,批号2001121,来自天津金耀药业有限公司;
抗小鼠PD-1抗体RMP1-14,批号800121A1ZB,来自BioXCell。
实验小鼠:
品系为SPF级615小鼠,购于中国医学科学院血液学研究所(生产许可证号:SCXK(津)2020-0001);6-7周龄雄性小鼠,体重范围约17-20g;动物合格证号:0012310;使用单位动物设施为创胜诊断科技(苏州)有限公司(使用许可证号:SYXK(苏)2019-0016)。
在小鼠胃癌MFC/CLDN18.2肿瘤模型上的药物药效评价
在37℃,含5%的CO2的条件下,将MFC/CLDN18.2细胞使用含10%FBS的DMEM完全培养基进行体外培养扩增。细胞每隔一天,使用胰酶溶液进行消化并传代处理。当细胞处于对数生长期时,收集细胞进行接种。
选用6-7周龄雌性615小鼠,在每只小鼠右腋窝处皮下注射0.1mL(2*10^6cells/只)MFC/CLDN18.2细胞悬液。接种约5天后对肿瘤进行测量,肿瘤体积约90mm^3时,根据肿瘤体积分成4组,每组9只荷瘤鼠。一至四组分别给与(1)PBS、(2)10mg/kg 18B10-HaLa、(3)1mg/kg RMP1-14和1mg/kg奥沙利铂/5mg/kg氟尿嘧啶以及(4)10mg/kg 18B10-HaLa与1mg/kgRMP1-14和1mg/kg奥沙利铂/5mg/kg氟尿嘧啶的联合使用。18B10-HaLa和RMP1-14为腹腔给药,每周给药两次,共三周;奥沙利铂/氟尿嘧啶为静脉给药,每周给药一次,共三周。每周两次对肿瘤进行测量,肿瘤体积计算公式:V=0.5a*b^2(a代表肿瘤长径、b代表肿瘤短径)。据肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线,比较各组间肿瘤生长曲线的差异。使用Prism GraphPad作图软件进行作图分析(平均值±标准误),组间使用T检验进行统计分析。p<0.05,认为有显著差异;p<0.01,认为有极显著差异。
实验结果显示(图3):实验第19天,(1)PBS组、(2)18B10-HaLa组、(3)RMP1-14和奥沙利铂/氟尿嘧啶组、以及(4)18B10-HaLa与RMP1-14和奥沙利铂/氟尿嘧啶的联合使用组的荷瘤鼠,肿瘤的平均体积分别为:4215.07±302.18mm^3、2821.81±245.98mm^3、1600.84±182.01mm^3和1170.83±147.11mm^3。因此,治疗组(2)-(4)第19天的肿瘤生长抑制率分别为33.05%、62.02%和72.22%。在MFC/CLDN18.2小鼠胃癌肿瘤模型中,18B10-HaLa和RMP1-14与奥沙利铂/氟尿嘧啶单独或者联合使用均能够极显著地抑制肿瘤生长(与对照相比,p<0.01),这说明本发明构建的表达人CLDN18.2的小鼠胃癌模型可以很好地用于验证针对靶向人CLDN18.2药物的药效试验。
实施例4:在不同品系小鼠上构建MFC/hCLDN18.2肿瘤模型
除了615系小鼠品系外,在本实施例中还选择了常见的BALB/c和C57BL/6J小鼠品系作为对照,构建MFC/hCLDN18.2小鼠肿瘤模型。每个品系各5只小鼠。收集处于对数生长期的MFC/hCLDN18.2细胞,配制成细胞浓度为2×107/mL的细胞悬液,将细胞悬液与基质胶按照1:1比例进行混合备用。对每只小鼠前肢的右腋下接种0.1mL的细胞悬液。每周两次使用游标卡尺对小鼠的肿瘤生长进行检测,肿瘤体积的计算公式:V=0.5a*b^2,其中a代表肿瘤的长径,b代表肿瘤的短径。使用Prism GraphPad作图分析。实验终点,使用CO2吸入麻醉对动物进行安乐死。如图5所示,MFC/hCLDN18.2只特异性地在615小鼠中成瘤,而BALB/c和C57BL/6J小鼠中不能成瘤。
Claims (22)
1.一种小鼠胃癌模型,其包含植入的胃癌MFC细胞肿瘤,其中所述MFC细胞包含并稳定表达编码人CLDN18.2的核酸,且其中所述小鼠具有615系小鼠遗传背景,优选地,所述小鼠为6-7周龄雌性615系小鼠。
2.权利要求1的小鼠胃癌模型,其中所述植入选自皮下植入,原位植入,或系统注射植入(例如,腹腔或静脉注射)。
3.权利要求1-2的小鼠胃癌模型,其中所述人CLDN18.2包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
4.权利要求1-3的小鼠胃癌模型,其中所述MFC细胞是通过使用包含人CLDN18.2编码核酸的慢病毒载体转染而构建的单克隆细胞系,
任选地,所述慢病毒载体还包含哺乳动物细胞筛选抗性基因,例如嘌呤霉素抗性基因。
5.权利要求1-4的小鼠胃癌模型,其中所述编码人CLDN18.2的核酸在组成型启动子控制下表达,优选地所述启动子为CMV启动子。
6.一种构建权利要求1-5任一项的小鼠胃癌模型的方法,包括步骤:
(a)构建稳定表达编码人CLDN18.2的核酸的单克隆MFC细胞株;
(b)将步骤(a)获得的单克隆MFC细胞株的细胞,植入615系小鼠皮下。
7.权利要求6的方法,其中,所述植入选自皮下,原位,或系统注射(例如,腹腔或静脉注射)。
8.权利要求6-7的方法,其中,步骤(b)中,皮下植入大约1x105个细胞至大约1x107个所述MFC细胞,优选所述MFC细胞为对数生长期细胞。
9.权利要求6-8的方法,其中,如通过流式细胞术所测定的,相比于对照MFC细胞,步骤(a)获得的单克隆MFC细胞系具有高至少5倍,优选高至少10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍人CLDN18.2表达量。
10.一种用于靶向人CLDN18.2药物或包含所述药物的治疗联合的药效评价的方法,包括:
(i)根据权利要求6-9的方法构建小鼠胃癌模型;
(ii)向小鼠模型施用待测药物或治疗联合;以及
(iii)评价待测药物或治疗联合的药效。
11.一种用于筛选靶向人CLDN18.2的候选药物或包含所述药物的候选治疗联合的方法,
(i)根据权利要求6-9的方法构建小鼠胃癌模型;
(ii)向小鼠模型施用待测候选药物或治疗联合;以及
(iii)评价待测候选药物或治疗联合的药效。
12.权利要求10-11的方法,其中所述靶向人CLDN18.2药物为包含抗人CLDN18.2抗体或其抗原结合片段的药物,
优选地,所述抗人CLDN18.2抗体或其抗原结合片段包含根据Kabat定义的SEQ ID NO:2的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列,和根据Kabat定义的SEQ ID NO:3的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列,
优选地,所述抗人CLDN18.2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:2的重链可变区和SEQ ID NO:3的轻链可变区。
13.权利要求10-11的方法,其中靶向人CLDN18.2药物选自:Zolbetuximab;AB011;TST001;MIL93;M108;LM-102;LM-302;NBL-015;ASKB589;BNT141–01;LS-CLDN18.2001;ZL-1211;FL-301;Q-1802;AMG-910;CT041;LCARC18S;LY011;CMG901;SYSA1801;和RC118。
14.权利要求10-13的方法,其中所述治疗联合包括所述靶向人CLDN18.2药物与选自以下的一种或多种治疗的联合:
-化疗剂,例如,含氟嘧啶(例如卡培他滨或氟尿嘧啶)、铂类(例如奥沙利铂或顺铂)、紫衫醇、多西他赛、伊利替康或其组合;和
-免疫检查点抑制剂,例如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
15.权利要求10-14的方法,其中所述治疗联合包括所述靶向人CLDN18.2药物与以下之一或两者的组合:
-抗PD-1抗体;和
-奥沙利铂/氟尿嘧啶。
16.权利要求14-15的方法,其中所述抗PD-1抗体选自:Nivolumab,Dostarlimab,Pembrolizumab,MEDI0680,MEDI4736,BI 754091,Pidilizumab,Cemiplimab,Spartalizumab,Cetrelimab,Toripalimab,PF-06801591,Tislelizumab,AMP-224,ABBV-181,Lambrolizumab,Camrelizumab,Sintilimab,Penpulimab,Zimberelimab,Retifanlimab,Serplulimab,Balstilimab,Geptanolimab,Prolgolimab,Ezabenlimab,Sasanlimab,Pimivalimab,Budigalimab,Nofazinlimab,Sindelizumab,MGA404,Sym021,BAT1306,和HX008。
17.权利要求14-15的方法,其中所述抗PD-L1抗体选自:Atezolizumab,BMS-936559,Avelumab,lodapolimab,Durvalumab,CX-072,FAZ053,Envafolimab,MDX-1105,STI-1040,CS1001,Adebrelimab,SHR-1701,TOB2450,Bintrafusp,LP002,STI-3031,Cosibelimab,Pacmilimab,NM01,LDP,AMP-224,Garivulimab,A167,SCD-135,Opucolimab,和GR1405。
18.权利要求10-17的方法,其中,所述药物或治疗联合采用选自以下的施用途径施用:腹腔给药、静脉给药、口服给药、瘤内给药。
19.权利要求10-18的方法,其中,所述评价包括监测选自以下之一项或多项参数:小鼠体重、肿瘤体积、肿瘤生长速度、小鼠存活率、小鼠代谢参数、免疫效应细胞分析、肿瘤组织学、肿瘤微环境改变、肿瘤转移。
20.权利要求10-19的方法,其中在向所述小鼠模型施用所述药物或治疗联合后,监测肿瘤生长,优选地监测肿瘤生长至少15天、至少20天、至少30天或至少40天。
21.权利要求10-20的方法,其中所述靶向人CLDN18.2药物为抗人CLDN18.2抗体,且所述抗体基于NK细胞的ADCC和/或CDC作用来杀伤肿瘤细胞,
优选地,所述抗人CLDN18.2抗体包含根据Kabat定义的SEQ ID NO:2的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列,和根据Kabat定义的SEQ ID NO:3的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3序列,更优选地,所述抗人CLDN18.2抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:2的重链可变区和SEQ ID NO:3的轻链可变区。
22.用于筛选或评价靶向人CLDN18.2的候选药物或包含所述药物的候选治疗联合的产品,其中所述产品包含根据权利要求1-5的小鼠胃癌模型,和任选地用于所述药物或治疗联合的药效评价的工具。
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