KR20230117367A

KR20230117367A - Bcma-표적화된 키메라 항원 수용체

Info

Publication number: KR20230117367A
Application number: KR1020237020736A
Authority: KR
Inventors: 이홍 야오; 지아치 후앙; 신 야오
Original assignee: 샹하이 셀룰라 바이오파마슈티칼 그룹 엘티디.
Priority date: 2020-12-02
Filing date: 2021-12-01
Publication date: 2023-08-08
Also published as: JP2023553390A; EP4255936A1; WO2022119923A1; CN116997345A; CA3201008A1; AU2021393434A1

Abstract

본 개시내용은 BCMA-표적화된 키메라 항원 수용체 (CAR) 뿐만 아니라 그의 제조 방법 및 적용을 제공한다. 본 개시내용의 CAR은 BCMA-양성 세포를 표적화하고, BCMA-양성 B-세포 림프종, 다발성 골수종 및 형질 세포 백혈병을 치료하는 데 사용될 수 있다.

Description

BCMA-표적화된 키메라 항원 수용체

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 미국 가출원 번호 63/120,692 (2020년 12월 2일 출원), 63/153,666 (2021년 2월 25일 출원), 및 63/212,289 (2021년 6월 18일 출원), 및 미국 출원 번호 17/476,661 (2021년 9월 16일 출원)을 우선권 주장하며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 출원된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2021년 12월 1일에 생성된 상기 ASCII 카피는 11299-008884-WO1_ST25.txt로 명명되고, 41 KB 크기이다.

기술 분야

본 발명은 생의학 분야, 보다 특히 BCMA를 표적화하는 키메라 항원 수용체, 뿐만 아니라 그의 제조 방법 및 적용에 관한 것이다.

배경기술

BCMA는 CD269 또는 TNFRSF17로도 공지된 B 세포 성숙 항원이고, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이다. 그의 리간드는 B 세포 활성화 인자 (BAFF) 및 증식-유도된 리간드 (APRIL)이다.

BCMA의 BAFF 및 APRIL에의 결합은 NF-kB를 활성화시키고, 항아폽토시스 Bcl-2 구성원, 예컨대 Bcl-xL 또는 Bcl-2 및 Mcl-1의 상향조절을 유도한다. BCMA와 그의 리간드 사이의 상호작용은 체액성 면역 뿐만 아니라 상이한 측면으로부터의 B 세포의 성장 및 분화를 조절하여 인간 신체에서 안정하고 균형잡힌 환경을 유지한다.

BCMA의 발현은 B 세포주로 제한된다. 이는 형질 모세포, 형질 세포 및 성숙 B 세포의 일부분 상에서 발현되고, 말단 B 세포의 분화 시에 증가된다. 대부분의 B 세포, 예컨대 나이브 B 세포, 기억 B 세포 및 B 세포 배 중심 및 다른 기관에서, BCMA는 발현되지 않는다. BCMA의 발현이 골수에서 수명이 긴 고정된 형질 세포에 중요한 것으로 보고되었다. 따라서, 골수에서의 형질 세포는 BCMA-결핍 마우스에서 감소되지만, 비장에서의 형질 세포 수준에는 영향을 미치지 않는다. 성숙 B 세포는 BCMA 녹아웃 마우스에서 정상적으로 형질 세포로 분화할 수 있다. BCMA 녹아웃 마우스는 정상으로 보이고 건강해 보였으며 B 세포의 수가 정상이었지만, 형질 세포는 장시간 동안 생존할 수 없었다.

BCMA는 또한 다발성 골수종 및 형질 세포 백혈병과 같은 악성 형질 세포에서 고도로 발현된다. BCMA는 또한 호지킨 림프종을 갖는 환자의 HRS 세포에서도 검출된다. 미국에서, 혈액계의 악성 종양은 모든 악성 종양의 약 10%를 차지하고, 골수종은 모든 악성 혈액 종양의 15%를 차지한다. 문헌에 따르면, BCMA의 발현은 다발성 골수종 질환의 진행과 연관된다. BCMA 유전자는 골수종 샘플에서 고도로 발현되지만, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병 및 급성 T-세포 림프구성 백혈병에서는 낮게 발현된다. B 세포 림프종은 BCMA 리간드인 BAFF 및 APRIL을 과다발현하는 마우스 모델에서 유의하게 증가되었다. BCMA에 결합하는 리간드는 BCMA를 발현하는 다발성 골수종 세포의 성장 및 생존을 조절하는 것으로 밝혀졌다. BCMA와 BAFF 및 APRIL의 조합은 악성 형질 세포를 생존시킬 수 있다. 따라서, BCMA를 발현하는 종양 세포의 손실 및 BCMA 리간드와 수용체 사이의 상호작용의 분포는 다발성 골수종 또는 다른 BCMA 양성 B 세포주 악성 림프종의 치료에서의 결과를 개선시킬 수 있다.

형질세포종 또는 켈러병으로도 공지된 다발성 골수종은 형질 세포의 비정상적 증식을 특징으로 하는 불응성 B 세포주의 악성 종양이다. 형질 세포는 항체의 생산을 담당하는 백혈구의 한 유형이다. 2017년에 국립 암 연구소가 발표한 데이터에 따르면, 골수종은 모든 종양 사례의 1.8%를 차지하며, 사망률은 2.1%이다. 2010-2014년의 통계 결과는 발병률이 연간 100,000명 중 약 6.6명이고 사망률이 약 50%라는 것을 보여준다. 다발성 골수종은 중년 질환이다. 유럽 및 미국에서의 발병 연령 중앙값은 68세이다. 여성보다 남성이 더 많다. 중국에서 발병의 피크 연령은 55-65세이고, 남성 대 여성의 비는 2.35:1이다. 중국에서 다발성 골수종에 대한 확인된 역학적 데이터는 없다. 일반적으로, 발병률은 100,000명 중 약 1명인 주위 동남아시아 및 일본에서의 것과 유사한 것으로 추정된다. 다발성 골수종에 대한 전통적인 치료는 화학요법 및 조혈 줄기 세포 이식을 포함하지만, 이들 방법은 높은 재발률을 갖는다. 보르테조밉 (PS-341)은, 단독으로 또는 기존 의약과 조합하여, 재발성 불응성 다발성 골수종의 치료를 위해 2003년에 FDA에 의해 승인된 최초 프로테아솜 억제제이다. 결과는 만족스러웠다. 이 약물은 또한 2005년 중국에서 시판되었고, 탈리도미드 및 덱사메타손과 함께 다발성 골수종의 치료를 위한 옵션 중 하나가 되었다. 다발성 골수종의 치료는 통상적으로 조합된다. 그러나, 다중 약물이 동시에 사용되는 경우, 비용이 많이 들고 누적되는 부작용의 부정적 영향도 있다. 다발성 골수종의 치료를 위한 새로운 방법을 개발할 임상적 필요성이 여전히 존재한다.

최근에, 면역요법, 특히 입양 T-세포 요법은 혈액계의 악성 종양의 치료를 위한 임상 시험에서 강한 효능 및 밝은 전망을 나타냈다. T 세포는 항원 인식 부분 및 T 세포 활성화 영역을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 모노클로날 항체의 항원 결합 특성을 사용하여, CAR은 비-MHC 제한된 방식으로 T 세포 및 표적의 특이성 및 반응성을 재지시할 수 있다. 이러한 비-MHC 제한된 항원 인식은 CAR-발현 T 세포가 항원 프로세싱 없이 항원을 인식하도록 하여, 종양 회피의 주요 메카니즘을 피한다. 또한, CAR은 내인성 TCR의 알파 쇄 및 베타 쇄를 갖는 이량체를 생산하지 않는다.

현재, CD19를 표적화하는 2종의 키메라 항원 수용체 T 세포 요법 (CAR-T) 생성물이 소아 및 청소년 환자에서의 급성 림프모구성 백혈병의 치료 및 재발성 또는 불응성 대 B-세포 림프종의 성인 2차 또는 다차 시스템 요법에 대해 승인되었다. 그러나, CD19는 다발성 골수종의 악성 형질 세포에서 거의 발현되지 않는다. 다발성 골수종의 치료를 위해 BCMA를 표적화하는 CAR-T 제품 개발이 시급하다.

요약

본 개시내용의 목적은 BCMA를 표적화하는 키메라 항원 수용체 뿐만 아니라 그의 제조 방법 및 적용을 제공하는 것이다.

본 개시내용은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공한다. CAR은 경쇄 가변 영역 (V_L) 및 중쇄 가변 영역 (V_H)을 포함하는 항-BCMA 항원-결합 영역을 포함할 수 있다.

V_L은 3개의 상보성 결정 영역 (CDR), LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있고; V_H는 3개의 CDR, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열식별번호(SEQ ID NO): 17, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열에 대해 약 80% 내지 약 100% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 28에 제시된 아미노산 서열에 대해 약 80% 내지 약 100% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.

특정 실시양태에서, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 35에 제시된 아미노산 서열에 대해 약 80% 내지 약 100% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열식별번호: 38, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 42에 제시된 아미노산 서열에 대해 약 80% 내지 약 100% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.

특정 실시양태에서, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 49에 제시된 아미노산 서열에 대해 약 80% 내지 약 100% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 54, 서열식별번호: 56에 제시된 아미노산 서열에 대해 약 80% 내지 약 100% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.

CAR의 V_L 및 V_H는 각각 (a) 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2; 각각 (a) 서열식별번호: 3 및 서열식별번호: 4; 또는 각각 (a) 서열식별번호: 5 및 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열에 대해 약 80% 내지 약 100% 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다.

특정 실시양태에서, V_L은 V_H의 N-말단에 위치한다.

항-BCMA 항원-결합 영역은 BCMA에 특이적으로 결합하는 단일-쇄 가변 단편 (scFv)일 수 있다.

CAR은 하기 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다: (a) 신호 펩티드, (b) 힌지 영역, (c) 막횡단 도메인, (d) 공동-자극 영역, 및 (e) 세포질 신호전달 도메인.

공동-자극 영역은 4-1BB (CD137), CD28, OX40, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, CD70, CD134, PD1, Dap10, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), NKG2D, GITR, TLR2 또는 그의 조합의 공동-자극 영역을 포함할 수 있다 (또는 그로부터 유래될 수 있다).

세포질 신호전달 도메인은 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인을 포함할 수 있다 (또는 이로부터 유래될 수 있다).

힌지 영역은 CD8, CD28, CD137, Ig4 또는 그의 조합의 힌지 영역을 포함할 수 있다 (또는 그로부터 유래될 수 있다).

막횡단 도메인은 CD8, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 또는 그의 조합의 막횡단 도메인을 포함할 수 있다 (또는 그로부터 유래될 수 있다).

본 개시내용은 본 발명의 CAR을 발현하는 면역 세포를 제공한다. 면역 세포는 T 세포 또는 자연 킬러 (NK) 세포일 수 있다. 면역 세포는 동종 또는 자가일 수 있다.

본 발명의 CAR을 코딩하는 핵산이 또한 본 개시내용에 의해 포괄된다.

본 개시내용은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 추가로 제공한다.

본 개시내용은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 면역 세포를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.

암은 혈액암일 수 있다. 암은 형질-세포 악성종양일 수 있다.

암은 BCMA-양성 악성종양일 수 있다. 암은 다발성 골수종 (MM), 또는 형질 세포 백혈병일 수 있다.

면역 세포는 주입, 주사, 수혈, 인공물이식(implantation) 및/또는 이식(transplantation)에 의해 투여될 수 있다.

면역 세포는 정맥내로, 피하로, 피내로, 결절내로, 종양내로, 골수내로, 근육내로 또는 복강내로 투여될 수 있다.

면역 세포는 정맥내 주입을 통해 투여될 수 있다.

대상체는 인간일 수 있다.

본 개시내용은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 본 발명의 면역 세포를 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.

키메라 항원 수용체 (CAR)는 투여 후 약 28일간 대상체의 혈액에서 약 5.0e+05 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.3e+07 카피/gDNA, 약 5.0e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.0e+07 카피/gDNA, 약 5.0e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.3e+07 카피/gDNA, 또는 약 7.0e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.0e+07 카피/gDNA 범위의 곡선하 면적 (AUC)을 생성할 수 있다.

키메라 항원 수용체 (CAR)는 대상체의 혈액에서 약 5 x 10⁴ 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.3 x 10⁶ 카피/gDNA, 약 5 x 10⁵ 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.3 x 10⁶ 카피/gDNA, 또는 약 7.5 x 10⁵ 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1 x 10⁶ 카피/gDNA 범위의 최대 혈장 농도 (C_max)를 생성할 수 있다.

CAR은 약 12일 내지 약 25일, 약 14일 내지 약 20일, 또는 약 6일 내지 약 22일 범위의 T_max를 가질 수 있다.

특정 실시양태에서, 항-BCMA 항원-결합 영역은 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 3 또는 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 99%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (V_L)을 포함한다.

특정 실시양태에서, 항-BCMA 항원-결합 영역은 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 4 또는 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 99%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (V_H)을 포함한다.

항-BCMA 항원-결합 영역의 경쇄 가변 영역은 BCMA-20 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 1의 위치 24-34, 위치 50-56, 위치 89-97에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3), 또는 BCMA-CA8 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 3의 위치 24-34, 위치 50-56, 위치 89-97에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3), 또는 BCMA-MO6 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 5의 위치 24-34, 위치 50-56, 위치 89-97에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3)과 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 99%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 1, 2 또는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함할 수 있다.

항-BCMA 항원-결합 영역의 중쇄 가변 영역은 BCMA-20 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 2의 위치 31-35, 위치 50-66, 위치 99-110에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3), 또는 BCMA-CA8 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 4의 위치 31-35, 위치 50-66, 위치 99-110에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3), 또는 BCMA-MO6 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 6의 위치 31-35, 위치 50-66, 위치 99-110에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3)과 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 99%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 1, 2 또는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함할 수 있다.

항-BCMA 항원-결합 영역의 경쇄 가변 영역은 BCMA-20 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 21에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3), 또는 BCMA-CA8 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 35에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3), 또는 BCMA-MO6 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 49에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3)과 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 99%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 1, 2 또는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함할 수 있다.

항-BCMA 항원-결합 영역의 중쇄 가변 영역은 BCMA-20 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 28에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3), 또는 BCMA-CA8 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 38, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 42에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3), 또는 BCMA-MO6 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 54, 서열식별번호: 56에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3)과 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 99%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 1, 2 또는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, 항-BCMA 항원-결합 영역의 경쇄 가변 영역은 BCMA-20 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR (서열식별번호: 1의 위치 24-34, 위치 50-56, 위치 89-97에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3)과 동일한 (예를 들어, 80% - 100% 동일한) 3개의 CDR을 포함하고, 항-BCMA 항원-결합 영역의 중쇄 가변 영역은 BCMA-20 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 2의 위치 31-35, 위치 50-66, 위치 99-110에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3)과 동일한 (예를 들어, 80% - 100% 동일한) 3개의 CDR을 포함한다.

특정 실시양태에서, 항-BCMA 항원-결합 영역의 경쇄 가변 영역은 BCMA-20 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 21에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3)과 동일한 (예를 들어, 80% - 100% 동일한) 3개의 CDR을 포함하고, 항-BCMA 항원-결합 영역의 중쇄 가변 영역은 BCMA-20 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 28에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3)과 동일한 (예를 들어, 80% - 100% 동일한) 3개의 CDR을 포함한다.

특정 실시양태에서, 항-BCMA 항원-결합 영역의 경쇄 가변 영역은 BCMA-CA8 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 3의 위치 24-34, 위치 50-56, 위치 89-97에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3)과 동일한 (예를 들어, 80% - 100% 동일한) 3개의 CDR을 포함하고, 항-BCMA 항원-결합 영역의 중쇄 가변 영역은 BCMA-CA8 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 4의 위치 31-35, 위치 50-66, 위치 99-110에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3)과 동일한 (예를 들어, 80% - 100% 동일한) 3개의 CDR을 포함한다.

특정 실시양태에서, 항-BCMA 항원-결합 영역의 경쇄 가변 영역은 BCMA-CA8 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 35에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3)과 동일한 (예를 들어, 80% - 100% 동일한) 3개의 CDR을 포함하고, 항-BCMA 항원-결합 영역의 중쇄 가변 영역은 BCMA-CA8 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 38, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 42에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3)과 동일한 (예를 들어, 80% - 100% 동일한) 3개의 CDR을 포함한다.

특정 실시양태에서, 항-BCMA 항원-결합 영역의 경쇄 가변 영역은 BCMA-MO6 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 5의 위치 24-34, 위치 50-56, 위치 89-97에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3)과 동일한 3개의 CDR을 포함하고, 항-BCMA 항원-결합 영역의 중쇄 가변 영역은 BCMA-MO6 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 6의 위치 31-35, 위치 50-66, 위치 99-110에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3)과 동일한 3개의 CDR을 포함한다.

특정 실시양태에서, 항-BCMA 항원-결합 영역의 경쇄 가변 영역은 BCMA-MO6 항체의 경쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 49에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3)과 동일한 (예를 들어, 80% - 100% 동일한) 3개의 CDR을 포함하고, 항-BCMA 항원-결합 영역의 중쇄 가변 영역은 BCMA-MO6 항체의 중쇄 가변 영역의 CDR (각각 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 54, 서열식별번호: 56에 제시된 바와 같은 CDR1, CDR2 및 CDR3)과 동일한 (예를 들어, 80% - 100% 동일한) 3개의 CDR을 포함한다.

특정 실시양태에서, CAR은 서열식별번호: 59, 서열식별번호: 61 또는 서열식별번호: 63에 제시된 아미노산 서열에 대해 약 80% 내지 약 100%, 약 85% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 95% 내지 약 100%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 99%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, CAR을 코딩하는 핵산은 서열식별번호: 58, 서열식별번호: 60 또는 서열식별번호: 62에 제시된 아미노산 서열에 대해 약 80% 내지 약 100%, 약 85% 내지 약 100%, 약 90% 내지 약 100%, 약 95% 내지 약 100%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 99%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서, CAR은 대상체에게 CAR의 투여 후 약 28일간 대상체의 혈액에서 약 0.5e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 2e+07 카피/gDNA, 약 5.0e+05 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.3e+07 카피/gDNA, 약 5.0e+05 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 2e+07 카피/gDNA, 약 5.0e+05 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.5e+07 카피/gDNA, 약 5.0e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.0e+07 카피/gDNA, 약 5.0e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.3e+07 카피/gDNA, 약 7.0e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.0e+07 카피/gDNA, 약 8.0e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.0e+07 카피/gDNA, 약 0.5e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 4e+06 카피/gDNA, 약 0.5e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 3.5e+06 카피/gDNA, 약 1e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 3.5e+06 카피/gDNA, 약 1.2e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 3.2e+06 카피/gDNA, 약 0.8e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 3.2e+06 카피/gDNA, 약 1.6e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 3.2e+06 카피/gDNA, 약 1e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 2e+06 카피/gDNA, 약 0.6e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.8e+06 카피/gDNA, 약 3e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 3.2e+06 카피/gDNA, 약 0.5e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.7e+06 카피/gDNA, 약 2e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 3.2e+06 카피/gDNA, 약 1.5e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 2e+06 카피/gDNA, 또는 약 1e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 3.2e+06 카피/gDNA 범위의 곡선하 면적 (AUC)을 생성할 수 있다. AUC는 AUC 중앙값일 수 있다.

특정 실시양태에서, CAR은 대상체에게 CAR의 투여 후 대상체의 혈액에서 약 5 x 10⁴ 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.3 x 10⁶ 카피/gDNA, 약 5 x 10⁴ 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.5 x 10⁶ 카피/gDNA, 약 5 x 10⁵ 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.3 x 10⁶ 카피/gDNA, 약 7.5 x 10⁵ 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1 x 10⁶ 카피/gDNA, 약 7 x 10⁵ 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1 x 10⁶ 카피/gDNA, 약 8 x 10⁵ 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1 x 10⁶ 카피/gDNA, 약 7.5 x 10⁵ 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.5 x 10⁶ 카피/gDNA, 약 7 x 10⁵ 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.5 x 10⁶ 카피/gDNA, 약 8 x 10⁵ 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.5 x 10⁶ 카피/gDNA, 약 0.8e+05 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 3.5e+05 카피/gDNA, 약 1e+05 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 3.5e+05 카피/gDNA, 약 1e+05 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.6e+05 카피/gDNA, 약 1e+05 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 3.3e+05 카피/gDNA, 약 0.8e+05 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.5e+05 카피/gDNA, 약 0.8e+05 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 2e+05 카피/gDNA, 약 1e+05 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 2e+05 카피/gDNA, 약 2e+05 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 3e+05 카피/gDNA, 약 2e+05 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 3.5e+05 카피/gDNA, 약 2e+05 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 2.5e+05 카피/gDNA, 또는 약 1e+05 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 3e+05 카피/gDNA 범위의 최대 혈장 농도 (C_max)를 생성한다. C_max는 C_max 중앙값일 수 있다.

특정 실시양태에서, CAR은 약 12일 내지 약 25일, 약 14일 내지 약 20일, 약 6일 내지 약 22일, 약 3일 내지 약 20일, 약 4일 내지 약 18일, 약 5일 내지 약 17일, 약 6일 내지 약 16일, 약 7일 내지 약 15일, 약 9일 내지 약 15일, 약 10일 내지 약 15일, 약 10일 내지 약 14일, 약 8일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 14일, 약 12일 내지 약 14일, 약 8일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 15일, 또는 약 10일 내지 약 14일 범위의 T_max (CAR이 C_max에 도달하는 데 걸리는 시간)를 갖는다. T_max는 T_max 중앙값일 수 있다.

특정 실시양태에서, CAR은 약 30일 내지 약 200일, 약 50일 내지 약 150일, 약 50일 내지 약 100일, 약 60일 내지 약 80일, 약 60일 내지 약 150일, 약 80일 내지 약 150일, 약 50일 내지 약 200일, 약 50일 내지 약 60일, 약 50일 내지 약 80일, 약 50일 내지 약 100일, 약 60일 내지 약 100일, 약 80일 내지 약 100일, 약 60일 내지 약 200일, 약 80일 내지 약 200일, 약 50일 내지 약 140일, 약 60일 내지 약 140일, 또는 약 80일 내지 약 140일 범위의 T_last (최종 정량화가능한 CAR 수준에 상응하는 시간)를 갖는다. T_last는 T_last 중앙값일 수 있다.

구체적으로, BCMA 표적화된 키메라 항원 수용체의 서열 뿐만 아니라 그의 변형된 T 세포 (CART-BCMA)의 제조 방법 및 활성 확인을 제공하는 것이 본 개시내용의 목적이다.

본 개시내용은 BCMA 양성 B 세포 림프종의 치료에 사용하기 위한 키메라 항원 수용체 구조를 제공한다.

제1 측면에서, 이는 키메라 항원 수용체 (CAR) (서열)를 제공하고, 그의 항원 결합 도메인은 BCMA의 세포외 영역을 표적화하는 항체 단일 쇄 가변 영역 서열이다.

또 다른 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 BCMA 서열의 위치 24 내지 41에서의 아미노산 잔기를 표적화하는 항체 단일 쇄 가변 영역 서열이다.

또 다른 실시양태에서, BCMA 서열의 NCBI 수탁 번호는 AY684975.1이다.

또 다른 실시양태에서, 항원 결합 도메인의 구조는 하기와 같은 화학식 I로 제시되며:

V_L-V_H (I)

여기서 V_H는 항체 중쇄 가변 영역이고; V_L은 항체 경쇄 가변 영역이고; "-"는 링커 펩티드 또는 펩티드 결합이고;

그리고, V_L의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1에 제시된 바와 같고, V_H의 아미노산 서열은 서열식별번호: 2에 제시된 바와 같거나;

또는 V_L의 아미노산 서열은 서열식별번호: 3에 제시된 바와 같고, V_H의 아미노산 서열은 서열식별번호: 4에 제시된 바와 같거나;

또는 V_L의 아미노산 서열은 서열식별번호: 5에 제시된 바와 같고, V_H의 아미노산 서열은 서열식별번호: 6에 제시된 바와 같다.

또 다른 실시양태에서, 링커 펩티드의 아미노산 서열은 서열식별번호: 10 또는 서열식별번호: 11에 제시된 바와 같다.

또 다른 실시양태에서, 항체 단일 쇄 가변 영역은 인간, 마우스, 인간-마우스 키메라 항체 단일 쇄 가변 영역을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 키메라 항원 수용체의 구조는 하기와 같은 화학식 II로 제시되며:

S-V_L-V_H-H-TM-C-CD3ζ (II)

여기서

S는 임의적인 신호 펩티드이고;

H는 힌지 영역이고;

TM은 막횡단 도메인이고;

C는 공동-자극 신호전달 분자이고;

CD3ζ는 CD3ζ로부터 유래된 세포질 신호전달 서열이고;

V_H 및 V_L은 상기 기재된 바와 같다.

또 다른 실시양태에서, S는 CD8, CD28, GM-CSF, CD4, CD137 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 신호 펩티드이다.

또 다른 실시양태에서, S는 CD8로부터 유래된 신호 펩티드이다.

또 다른 실시양태에서, S의 아미노산 서열은 서열식별번호: 9에 제시된 바와 같다.

또 다른 실시양태에서, H는 CD8, CD28, CD137 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 힌지 영역이다.

또 다른 실시양태에서, H는 CD8로부터 유래된 힌지 영역이다.

또 다른 실시양태에서, H의 아미노산 서열은 서열식별번호: 12에 제시된 바와 같다.

또 다른 실시양태에서, TM은 CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 영역이다.

또 다른 실시양태에서, TM은 CD8로부터 유래된 막횡단 영역이다.

또 다른 실시양태에서, TM의 서열은 서열식별번호: 13에 제시된 바와 같다.

또 다른 실시양태에서, C는 OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD70, CD134, 4-1BB (CD137), PD1, Dap10, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), NKG2D, GITR, TLR2 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 공동-자극 신호전달 분자이다.

또 다른 실시양태에서, C는 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 신호전달 분자이다.

또 다른 실시양태에서, C의 아미노산 서열은 서열식별번호: 14에 제시된 바와 같다.

또 다른 실시양태에서, CD3ζ의 아미노산 서열은 서열식별번호: 15에 제시된 바와 같다.

제2 측면에서, 이는 제1 측면의 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 핵산 분자는 단리된다.

제3 측면에서, 이는 제2 측면의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 벡터는 DNA, RNA, 플라스미드, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 트랜스포손 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.

제4 측면에서, 이는 제3 측면의 벡터를 포함하거나 또는 염색체 내로 통합된 제2 측면의 외인성 핵산 분자를 갖거나 또는 제1 측면의 CAR을 발현하는 숙주 세포를 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 세포는 단리된 세포이고/거나, 세포는 유전자 조작된 세포이다.

또 다른 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다.

또 다른 실시양태에서, 세포는 T 세포이다.

제5 측면에서, 이는 제1 측면의 CAR을 발현하는 CAR-T 세포를 제조하는 방법을 제공하고, 방법은 제2 측면의 핵산 분자 또는 제3 측면의 벡터를 T 세포 내로 형질도입하여 CAR-T 세포를 수득하는 단계를 포함한다.

제6 측면에서, 이는 제1 측면의 키메라 항원 수용체, 제2 측면의 핵산 분자, 제3 측면의 벡터, 또는 제4 측면의 세포, 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 제제를 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 제제는 액체 제제이다.

또 다른 실시양태에서, 제제의 투여 형태는 주사이다.

또 다른 실시양태에서, 제제 내의 CAR-T 세포의 농도는 1 x 10³ - 1 x 10⁸개 세포/ml, 또는 1 x 10⁴ - 1 x 10⁷개 세포/ml이다.

제7 측면에서, 이는 종양 또는 암을 예방 및/또는 치료하기 위한 의약 또는 제제의 제조를 위한, 제1 측면의 키메라 항원 수용체, 제2 측면의 핵산 분자, 제3 측면의 벡터, 또는 제4 측면의 세포의 용도를 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 종양은 혈액 종양, 고형 종양 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 암은 B 세포 림프종이다.

또 다른 실시양태에서, 혈액 종양은 급성 골수성 백혈병 (AML), 다발성 골수종 (MM), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 미만성 대 B 세포 림프종 (DLBCL) 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 고형 종양은 위암, 위암의 복막 전이, 간암, 백혈병, 신암, 폐암, 소장암, 골암, 전립선암, 결장직장암, 유방암, 대장암, 자궁경부암, 난소암, 림프종, 비인두 암종, 부신 종양, 방광 종양, 비소세포 폐암 (NSCLC), 신경교종, 자궁내막암 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 종양은 BCMA 양성 종양, 예컨대 BCMA 양성 B 세포 림프종, 다발성 골수종 또는 형질 세포 백혈병이다.

제8 측면에서, 이는 제4 측면의 세포의 제조를 위한 키트를 제공하고, 키트는 용기를 포함하고, 제2 측면의 핵산 분자 또는 제3 측면의 벡터는 용기 내에 위치한다.

제9 측면에서, 이는 암 또는 종양의 예방 및/또는 치료를 위한 제4 측면의 세포 또는 제6 측면의 제제의 용도를 제공한다.

제10 측면에서, 이는 적절한 양의 제4 측면의 세포 또는 제6 측면의 제제를 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 질환은 암 또는 종양이다.

상기 언급된 본 개시내용의 다양한 기술적 특색 및 (실시예에서와 같이) 하기에 구체적으로 기재된 다양한 기술적 특색은 본 개시내용의 범주 내에서 서로 조합되어, 공간 제한으로 인해 하나씩 기재될 필요가 없는 새로운 또는 바람직한 기술적 해결책을 구성할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

도 1a, 1b, 및 1c는 CART-BCMA 비교 실시예의 스크리닝 결과를 보여준다. 도 1a는 BCMA를 표적화하는 키메라 항원 수용체를 갖는 조작된 T 세포의 형질감염 효율의 검출을 보여준다. 제6일에 배양된 CAR-BCMA 세포에서 T 세포 막의 표면 상의 CAR 유전자-코딩된 단백질의 발현 수준을 재조합 인간 BCMA 단백질의 Fc 단편 염색 방법에 의해 확인하였다. 제10일에 배양된 1*10⁵개의 CART-BCMA 세포를 각각 BCMA-양성 K562-BCMA-B9 종양 세포주, BCMA를 자연 발현하는 MM.1S 및 RPMI8226 종양 세포주, 및 BCMA-음성 K562 종양 세포주와 함께, 또는 종양 세포 없이, 200 μl GT-551 배지에서 18시간 동안 1:1의 비로 배양하였다. 이어서, T 세포 막의 표면 상의 CD137의 발현 수준 (도 1b) 및 배양물 상청액 중 IFNγ의 분비 수준 (도 1c)을 각각 검출하였다.
도 2는 BCMA를 표적화하는 키메라 항원 수용체의 구조를 보여준다. CAR의 구조는 리더 서열, 항원 인식 서열, 링커 영역, 막횡단 영역, 공동-자극 인자 신호 영역, 및 CD3ζ 신호전달 영역을 포함한다.
도 3a, 3b, 및 3c는 BCMA를 표적화하는 키메라 항원 수용체에 의한 조작된 T 세포의 형질감염 효율의 검출을 보여준다. 제7일 (도 3a), 제21일 (도 3b) 및 제29일 (도 3c)에 배양된 CAR-BCMA 세포에서의 T 세포 막의 표면 상의 CAR 유전자-코딩 단백질의 발현 수준을 재조합 인간 BCMA 단백질의 Fc 단편 염색 방법에 의해 확인하였다.
도 4a 및 4b는 T 세포 막의 표면 상의 CD137의 발현 수준 (도 4a) 및 배양물 상청액에서의 IFNγ의 분비 수준 (도 4b)을 보여준다. 구체적으로, 제7일에 배양된 1 x 10⁵개의 CART-BCMA 세포를 각각 BCMA-양성 K562-BCMA-E7 종양 세포주 및 BCMA-음성 K562 종양 세포주와 함께, 또는 종양 세포 없이, 200 μl GT-551 배지에서 18시간 동안 1:1의 비로 배양하였다. 이어서, T 세포 막의 표면 상의 CD137의 발현 수준 및 배양물 상청액 중 IFNγ의 분비 수준을 각각 검출하였다.
도 5는 CART-BCMA에 의해 유도된 종양 세포의 진행된 아폽토시스 수준의 검출을 보여준다. 구체적으로, 1 x 10⁴개의 CFSE-표지된 BCMA-음성 (NH929) 또는 BCMA-양성 (NH929-BCMA) 종양 세포주를 각각 상응하는 T 세포와 100 μl의 GT-551 배지에서 4시간 동안 도면에 제시된 바와 같은 비로 공동-배양하였다. CFSE-양성 세포에서의 PI-양성 세포의 비율을 100 μl의 25% PI 염료로 15분 동안 염색한 후 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 도면은 상응하는 공동-배양 샘플에서의 PI 양성 세포의 통계적 분석을 보여준다.
도 6a 및 6b는 CART-BCMA에 의해 유도된 종양 세포의 진행된 아폽토시스 수준의 검출을 보여준다. 도 6a는 분석된 샘플에서 CART 양성 세포의 비를 보여주며, 여기서 NT 및 BCMA-MO6은 60%로 계산되었다. 1 x 10⁴개의 CFSE-표지된 BCMA-음성 (NH929) 또는 BCMA-양성 (NH929-BCMA, MM.1S) 종양 세포주를 각각 상응하는 T 세포와 100 μl의 GT-551 배지에서 4시간 동안 도면에 제시된 바와 같은 비로 공동-배양하였다. CFSE-양성 세포에서의 PI-양성 세포의 비율을 100 μl의 25% PI 염료로 15분 동안 염색한 후 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 도 6b는 상응하는 공동-배양 샘플에서의 PI 양성 세포의 통계적 분석을 보여준다.
도 7a 및 7b는 B-NDG 마우스에서 골수종 세포주 RPMI-8226의 생체내 증식에 대한 CART-BCMA의 억제 효과를 보여준다. 대수 성장기의 RPMI-8226 세포를 수집하고, 4.0 x 10⁶개의 종양 세포를 마우스의 우측 등에 피하로 접종하였다. 종양 부피가 약 120 mm³에 도달하였을 때, 동물을 종양 부피에 따라 4개의 군으로 무작위로 나누었다. 이어서, 용매 대조군, 7.5 x 10⁶개의 NT (T 세포 단독) 및 7.5 x 10⁶개의 CART-BCMA 세포를 각각 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 도 7a는 꼬리 정맥을 통한 CART-BCMA-1 및 CART-BCMA-20의 단일 주사가 인간 골수종 RPMI-8226 세포의 성장을 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다. 도 7b는 CART-BCMA-1 및 CART-BCMA-20이 인간 골수종 RPMI-8226 세포를 갖는 종양-보유 마우스의 생존을 유의하게 연장시킬 수 있다는 것을 보여준다.
도 8은 유동 세포측정법에 의한 관련 플라스미드의 형질감염 후의 293T 세포에서의 BCMA, CR2, CXADR, DDR2 및 MAG의 발현 결과를 보여준다.
도 9a, 9b, 및 9c는 시토카인 검출 결과를 보여준다.
도 10은 표적 세포에 대한 각각의 세포의 사멸 능력을 보여준다. 삼각형: BCMA-20 (C-CAR088); 정사각형: 양성 대조군; 원형: NT 대조군 (비-형질감염된 (NT) T 세포).
도 11은 세포 사멸 활성에 대한 가용성 BCMA의 효과를 보여준다.
도 12는 각각의 군에서 마우스의 생존율을 보여준다.
도 13은 I상 임상 연구의 실험 과정을 보여준다.
도 14는 I상 임상 연구의 임상 반응을 보여준다.
도 15는 ID Z0203-00801C008의 환자의 치료 상태를 보여준다.
도 16a 및 16b는 ID Z0203-00701C001의 환자의 치료 상태를 보여준다.
도 17은 C-CAR088의 확장 및 혈액 중 M-단백질/sFLC 수준의 감소를 보여준다.
도 18a-18c는 C-CAR088의 scFv의 결합 특이성을 평가한 결과를 보여준다. 도 18a는 실험 계획을 보여준다. 도 18b는 항-BCMA CAR 및 scFv rabFc의 구조를 보여준다. 도 18c는 실험 결과를 보여준다.
도 19a-19b는 조직 교차 반응성 IHC GLP 연구 및 검증을 보여준다. HAdCC, 인간 1차 부신 피질 세포. HPTEC, 인간 1차 갑상선 상피 세포. A549 BCMA OE, BCMA를 과다발현하는 안정한 균주.
도 20은 CAR (C-CAR088) 제조 과정의 예를 보여준다. 방법은 무혈청 배지의 사용, 폐쇄된, 모듈 통합된, 반자동화 시스템, 및 디지털 모니터링을 포함한다. 별표는 개선된 과정을 나타낸다. 정맥 대 정맥 시간의 중앙값은 약 17일 (범위: 13 내지 83일)이다. 제조 시간의 중앙값은 약 7일 (범위: 5 내지 10일)이다.
도 21은 (재발성 또는 불응성 다발성 골수종의 치료에서의) C-CAR088 I상 임상 연구 설계를 보여준다. I상, 개방-표지, 용량 증량 및 확장 연구를 4개의 의료 센터에서 수행하였다. C-CAR088은 BCMA-20 항체를 기반으로 하는 본 발명의 CAR의 한 실시양태이다.
도 22는 SD, MR, PR, CR, VGPR, MRD 및 PD를 포함한 C-CAR088 임상 반응을 보여준다. SD: 안정 질환; PR: 부분 반응; CR: 완전 반응; PD: 진행성 질환; MR: 최소 반응; VGPR: 매우 우수한 부분 반응; MRD: 최소 잔류 질환.
도 23은 CR/sCR, VGPR 및 PR을 포함한 C-CAR088 임상 반응을 보여준다.
도 24는 중간 및 고용량 군에 대한 무진행 생존 (PFS)의 카플란 마이어 추정을 보여준다.
도 25a는 CAR 투여 후에 환자의 혈액에서의 C-CAR088의 확장을 보여준다. 도 25b는 가장 최근 방문까지 환자의 혈액에서의 C-CAR088의 확장을 보여준다. 도 25c는 CAR 투여 후에 환자의 혈액에서의 C_max 수준을 보여준다. 도 25d는 CAR 투여 후에 환자의 혈액에서의 AUC 수준을 보여준다. 도 25e는 CAR 투여 후에 환자의 혈액에서의 T_max 수준을 보여준다. 도 25f는 CAR 투여 후에 환자의 혈액에서의 T_last 수준을 보여준다.

상세한 설명

본 개시내용은 BCMA를 표적화하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공한다. 특정 실시양태에서, CAR은 4종의 모노클로날 항체: BCMA-1, BCMA-20, BCMA-CA8, 및 BCMA-MO6을 기반으로 한다. 본 개시내용은 또한 1차 T 세포에서의 CAR의 발현 수준, 이들 키메라 항원 수용체의 시험관내 활성화 능력 및 종양 세포 사멸 효능의 분석 및 확인을 제공한다. 연구는 본 개시내용의 키메라 항원 수용체가 BCMA 양성 세포를 표적화하고, BCMA 양성 B 세포 림프종, 다발성 골수종, 형질 세포 백혈병 또는 다른 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다는 것을 제시하였다.

구체적으로, 본 개시내용은 바이러스 감염 후에 세포 막의 표면 상의 상이한 CAR 구조의 발현 시간과 발현 강도 사이의 상관관계를 확인하고, 상이한 CAR 구조 단백질의 발현의 차이를 추가로 확인한다. 이러한 발견은 상이한 CAR 구조가 동일한 감염 조건 하에 막 표면 상의 CAR 단백질의 발현 수준 및 CART 생체내 활성의 지속성에 차이가 존재한다는 것을 시사한다. 광범위한 스크리닝 후에, 본 개시내용의 CAR 구조를 수득하였다. 결과는 본 개시내용의 CAR 구조에 의해 코딩되는 단백질이 완전히 발현되고 막-국재화될 수 있음을 보여준다.

본 개시내용에서, BCMA 항원을 표적화하는 CAR-변형된 T 세포의 제조 방법이 개선된다. 한 실시양태에서, 1% 인간 알부민이 보충된 GT-551 무혈청 배지가 시험관내에서 림프구를 배양하는 데 사용된다.

용어

용어 "약"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정한 값 또는 조성에 대한 허용되는 오차 범위 내의 값 또는 조성을 지칭할 수 있으며, 이는 부분적으로 값 또는 조성이 측정 또는 결정되는 방법에 좌우될 것이다. 수치와 관련하여 용어 "약"은 언급된 수치의 ±10%를 지칭할 수 있다. 즉, 수치는 언급된 값의 90% 내지 언급된 값의 110%의 범위일 수 있다.

용어 "투여하는"은 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 척수 또는 다른 비경구 투여를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 어느 하나를 사용하여, 예컨대 주사 또는 주입에 의해 본 개시내용의 생성물을 대상체 내로 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다.

용어 "항체" (Ab)는 항원에 특이적으로 결합하고 디술피드 결합에 의해 연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 함유하는 이뮤노글로불린, 또는 그의 항원 결합 부분을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 각각의 H 쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 함유한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 함유한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 함유한다. 경쇄 불변 영역은 불변 도메인 CL을 함유한다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있고, 이는 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존적인 영역 내에 산재되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR을 함유하고, 이들은 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 하기 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다.

키메라 항원 수용체 (CAR)

본 개시내용의 키메라 항원 수용체 (CAR)는 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 세포외 도메인은 표적-특이적 결합 요소 (항원 결합 도메인으로도 공지됨)를 포함한다. 세포내 도메인은 공동-자극 신호전달 영역 및 ζ 쇄를 포함한다. 공동-자극 신호전달 영역은 공동-자극 분자를 포함하는 세포내 도메인의 일부를 지칭한다. 공동-자극 분자는 항원 수용체 또는 그의 리간드보다는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 요구되는 세포 표면 분자이다.

링커는 CAR의 세포외 도메인과 막횡단 도메인 사이에, 또는 CAR의 세포질 도메인과 막횡단 도메인 사이에 혼입될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "링커"는 일반적으로 막횡단 도메인을 폴리펩티드 쇄에서 세포외 도메인 또는 세포질 도메인에 연결하는 역할을 하는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 링커는 0-300개의 아미노산, 2-100개의 아미노산, 또는 3-50개의 아미노산을 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, CAR의 세포외 도메인은 BCMA를 표적화하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 본 개시내용의 CAR이 T 세포에서 발현되는 경우에, 항원 인식은 항원 결합 특이성에 기초하여 수행될 수 있다. CAR이 그의 연관된 항원에 결합하는 경우에, 이는 종양 세포에 영향을 미쳐, 종양 세포가 성장하지 못하거나, 사멸하거나 또는 달리 영향을 받게 하여, 환자의 종양 부담이 축소 또는 제거되게 한다. 항원 결합 도메인은 공동-자극 분자 및 ζ 쇄 중 1개 이상으로부터의 세포내 도메인에 융합될 수 있다. 항원 결합 도메인은 4-1BB 신호전달 도메인과 CD3ζ 신호전달 도메인의 조합의 세포내 도메인과 융합될 수 있다.

본원에 사용된 "항원 결합 도메인" 및 "단일-쇄 항체 단편"은 항원-결합 활성을 갖는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, 또는 단일 Fv 단편을 지칭할 수 있다. Fv 항체는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 함유하지만, 불변 영역은 갖지 않는다. Fv 항체는 모든 항원-결합 부위를 갖는 가장 작은 항체 단편을 갖는다. 일반적으로, Fv 항체는 또한 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 포함하고, 항원 결합에 요구되는 구조를 형성할 수 있다. 항원 결합 도메인은 통상적으로 scFv (단일-쇄 가변 단편)이다. scFv의 크기는 전형적으로 완전 항체의 1/6이다. 단일-쇄 항체는 뉴클레오티드 쇄에 의해 코딩되는 아미노산 쇄 서열일 수 있다. 특정 실시양태에서, scFv는 BCMA의 세포외 영역, 예컨대 BCMA 서열의 위치 24 내지 41에서의 아미노산 잔기를 특이적으로 인식하는 항체를 포함할 수 있다. 항체는 단일 쇄 항체일 수 있다.

힌지 영역 및 막횡단 영역 (막횡단 도메인)에 대해, CAR은 CAR의 세포외 도메인에 융합된 막횡단 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 한 실시양태에서, CAR 내의 도메인 중 하나와 자연적으로 회합되는 막횡단 도메인이 사용된다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 이러한 도메인이 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막횡단 도메인에 결합하는 것을 회피하여 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하도록 선택되거나 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다.

CAR 내의 세포내 도메인은 4-1BB의 신호전달 도메인 및 CD3ζ의 신호전달 도메인을 포함한다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 CAR 구조는 신호 펩티드, 항원 인식 서열 (항원-결합 도메인), 링커 영역, 막횡단 영역, 공동-자극 인자 신호 영역, 및 CD3제타 신호전달 영역 (ζ 쇄 부분)을 포함한다. 연결 순서는 하기와 같다:

[CD8 S]-[VL-링커-VH]-[힌지-CD8TM]-[4-1BB]-[CD3제타]

특정 실시양태에서, 본 개시내용에서 선택된 서열은 하기와 같다:

(1) 신호 펩티드는 CD8로부터 유래된 신호 펩티드 서열이다:

(2) BCMA-1 항체로부터 유래된 단일-쇄 가변 영역의 경쇄 (VL) 서열:

(3) BCMA-1 항체로부터 유래된 단일-쇄 가변 영역의 중쇄 (VH) 서열:

이들 중에서, BCMA-1은 공개된 Car-T 서열에 함유된 항체 서열이고, 본 출원에서 대조군으로서 사용된다.

(4) BCMA-20 항체로부터 유래된 단일-쇄 가변 영역의 경쇄 (V_L) 서열:

(5) BCMA-20 항체로부터 유래된 단일-쇄 가변 영역의 중쇄 (VH) 서열:

(6) BCMA-CA8 항체로부터 유래된 단일-쇄 가변 영역의 경쇄 (VL) 서열:

(7) BCMA-CA8 항체로부터 유래된 단일-쇄 가변 영역의 중쇄 (VH) 서열:

(8) BCMA-MO6 항체로부터 유래된 단일-쇄 가변 영역의 경쇄 (VL) 서열:

(9) BCMA-MO6 항체로부터 유래된 단일-쇄 가변 영역의 중쇄 (VH) 서열:

(10) BCMA-1 단일-쇄 가변 영역의 중쇄와 경쇄 사이의 링커 서열은 하기이다:

(11) BCMA-20, BCMA-CA8, 및 BCMA-MO6 단일-쇄 가변 영역의 중쇄와 경쇄 사이의 링커 서열은 하기이다:

(12) 힌지 영역 및 링커 영역의 서열:

(13) 막횡단 영역은 CD8 (CD8TM) 항원의 막횡단 영역 서열이다:

(14) 공동-자극 인자 신호 영역은 4-1BB 세포질 신호전달 모티프의 서열로부터 유래된다:

(15) CD3제타의 신호전달 영역은 TCR 복합체 내의 CD3제타의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)의 서열로부터 유래된다:

특정 실시양태에서, CAR을 코딩하는 핵산 (BCMA-20 항체로부터 유래됨)은 하기 서열 (서열식별번호: 58)을 가질 수 있다:

특정 실시양태에서, CAR (BCMA-20 항체로부터 유래됨)은 하기 아미노산 서열 (서열식별번호: 59)을 가질 수 있다:

특정 실시양태에서, CAR을 코딩하는 핵산 (BCMA-CA8 항체로부터 유래됨)은 하기 서열 (서열식별번호: 60)을 가질 수 있다:

특정 실시양태에서, CAR (BCMA-CA8 항체로부터 유래됨)은 하기 아미노산 서열 (서열식별번호: 61)을 가질 수 있다:

특정 실시양태에서, CAR을 코딩하는 핵산 (BCMA-MO6 항체로부터 유래됨)은 하기 서열 (서열식별번호: 62)을 가질 수 있다:

특정 실시양태에서, CAR (BCMA-BCMA-MO6 항체로부터 유래됨)은 하기 아미노산 서열 (서열식별번호: 63)을 가질 수 있다:

키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR-T 세포)

본원에 사용된 용어 "CAR-T 세포", "CAR-T", 및 "CART"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다.

본 개시내용은 BCMA를 표적화하는 키메라 항원 수용체 구조의 구축물, BCMA를 표적화하는 키메라 항원 수용체 조작된 T 세포의 제조 방법, 및 그의 활성 확인에 관한 것이다.

벡터

목적하는 분자를 코딩하는 핵산 서열은 관련 기술분야에 공지된 재조합 방법을 사용하여, 예컨대, 예를 들어 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 스크리닝함으로써, 그를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 유전자를 유도함으로써, 또는 표준 기술을 사용하여 그를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함으로써 수득될 수 있다. 대안적으로, 관심 유전자는 합성적으로 생산될 수 있다.

본 개시내용은 또한 본 개시내용의 발현 카세트가 삽입된 벡터를 제공한다. 레트로바이러스, 예컨대 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 트랜스진의 장기간의 안정한 통합 및 딸 세포에서의 그의 증식을 가능하게 하기 때문에 장기간 유전자 전달을 달성하는 데 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 간세포와 같은 비-증식성 세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 뮤린 백혈병 바이러스와 같은 종양-레트로바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 이점을 갖는다. 이들은 또한 낮은 면역원성의 이점을 갖는다.

간략하게 요약하면, 발현 카세트 또는 핵산 서열은 전형적으로 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 발현 벡터 내로 혼입된다. 벡터는 진핵생물에서의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열, 및 목적하는 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 함유한다.

본 개시내용의 발현 구축물은 또한 표준 유전자 전달 프로토콜을 사용하여 핵산 면역 및 유전자 요법에 사용될 수 있다. 유전자 전달 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 유전자 요법 벡터를 제공한다.

핵산은 다수의 유형의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드를 포함하나 이에 제한되지는 않는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 특히 관심있는 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 및 서열분석 벡터를 포함한다.

또한, 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)] 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능적인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선택 마커를 함유한다 (예를 들어, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 6,326,193).

포유동물 세포 내로의 유전자 전달을 위해 다수의 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 벡터 내로 삽입되고 레트로바이러스 입자 내에 패키징될 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스는 단리되고, 생체내 또는 생체외에서 대상체의 세포로 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다.

추가의 프로모터 요소, 예를 들어 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 개시 부위의 30-110 bp 상류의 영역에 위치하지만, 다수의 프로모터가 개시 부위의 하류에도 기능적 요소를 함유하는 것으로 최근에 밝혀졌다. 프로모터 요소 사이의 간격은 빈번하게 탄력적이어서, 프로모터 기능은 요소가 역전되거나 서로에 대해 이동되는 경우에 보존된다. 티미딘 키나제 (tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격은 활성이 감소하기 시작하기 전 50 bp 간격까지 증가할 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소는 전사를 활성화시키기 위해 협동적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 보인다.

적합한 프로모터의 한 예는 극초기 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 그에 작동가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 유도할 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 또 다른 예는 신장 성장 인자-1α (EF-1α)이다. 그러나, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바르 바이러스 극초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 뿐만 아니라 인간 유전자 프로모터, 예컨대 비제한적으로 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다. 추가로, 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터가 사용될 수 있다. 유도성 프로모터의 사용은 발현이 요구될 때 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 켜거나, 발현이 요구되지 않을 때 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오네인 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라시클린 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

CAR 폴리펩티드 또는 그의 부분의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입될 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 형질감염 또는 감염시키고자 하는 세포의 집단으로부터 발현 세포의 확인 및 선택을 용이하게 하기 위해 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 다를 함유할 수 있다. 다른 측면에서, 선택 마커는 DNA의 별개의 조각 상에 보유되고 공동-형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선택 마커 및 리포터 유전자 둘 다는 숙주 세포에서의 발현을 가능하게 하는 적절한 조절 서열과 플랭킹될 수 있다. 유용한 선택 마커는 예를 들어 항생제-내성 유전자, 예컨대 neo 등을 포함한다.

잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고 조절 서열의 기능성을 평가하기 위해 리포터 유전자가 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용자 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 그에 의해 발현되지 않고, 그의 발현이 일부 용이하게 검출가능한 특성, 예를 들어 효소적 활성에 의해 나타나는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포 내로 도입된 후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시페라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼리성 포스파타제를 코딩하는 유전자, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82]). 적합한 발현 시스템은 널리 공지되어 있고, 공지된 기술을 사용하여 제조되거나 또는 상업적으로 입수될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 최고 발현 수준을 나타내는 최소 5' 플랭킹 영역을 갖는 구축물이 프로모터로서 확인된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결될 수 있고, 프로모터-구동 전사를 조정하는 능력에 대해 작용제를 평가하는 데 사용될 수 있다.

유전자를 세포 내로 도입하고 발현시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 발현 벡터와 관련하여, 벡터는 관련 기술분야의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포 내로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주사, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)]을 참조한다. 숙주 세포 내로의 폴리뉴클레오티드의 도입 방법은 인산칼슘 형질감염이다.

관심 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물, 예를 들어 인간 세포 내로 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,350,674 및 5,585,362를 참조한다.

폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드성 분산 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로구체, 비드, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함한 지질-기반 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포솜 (예를 들어, 인공 막 소포)이다.

비-바이러스 전달 시스템이 이용되는 경우에, 예시적인 전달 비히클은 리포솜이다. 지질 제제의 사용은 (시험관내, 생체외 또는 생체내에서) 숙주 세포 내로의 핵산의 도입을 위해 고려된다. 또 다른 측면에서, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재되거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오티드 둘 다와 회합된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포솜 내에 포획되거나, 리포솜과 복합체화되거나, 지질을 함유하는 용액 중에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 조합되거나, 지질 중에 현탁액으로서 함유되거나, 미셀과 함께 함유 또는 복합체화되거나, 또는 달리 지질과 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 회합된 조성물은 용액 중 임의의 특정한 구조로 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들은 이중층 구조로, 미셀로서, 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 단순히 용액 중에 산재되어, 가능하게는 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 자연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에서 자연 발생하는 지방 액적 뿐만 아니라 장쇄 지방족 탄화수소 및 그의 유도체, 예컨대 지방산, 알콜, 아민, 아미노 알콜 및 알데히드를 함유하는 화합물의 부류를 포함한다.

한 실시양태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.

조성물

본 개시내용은 면역 세포 (예를 들어, CAR-T 세포), 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 조성물은 액체 조성물이다. 예를 들어, 조성물은 주사가능한 조성물이다. 특정 실시양태에서, 조성물 내의 CAR-T 세포의 농도는 1 x 10³ - 1 x 10⁸개 세포/ml, 또는 1 x 10⁴ - 1 x 10⁷개 세포/ml이다.

한 실시양태에서, 조성물은 완충제, 예컨대 중성 완충 염수, 포스페이트 완충 염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 아주반트 (예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 조성물은 정맥내 투여를 위해 제제화될 수 있다.

치료 용도

본 개시내용은 본 개시내용의 발현 카세트를 코딩하는 렌티바이러스 벡터 (LV)로 형질도입된 세포 (예를 들어, T 세포)를 사용하는 치료 용도를 포함한다. 형질도입된 T 세포는 종양 세포 마커 BCMA를 표적화하고, T 세포를 상승작용적으로 활성화시키고, T 세포 면역 반응을 일으켜, 종양 세포에 대한 사멸 효율을 유의하게 증가시킬 수 있다.

따라서, 본 개시내용은 또한 포유동물에게 본 개시내용의 CAR-T 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 표적 세포 집단 또는 조직에 대한 T 세포-매개 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 자가 환자 (또는 이종 공여자)로부터의 T 세포가 단리되고, 활성화되고, 유전자 변형되어 CAR-T 세포를 생성한 다음, 동일한 환자 내로 주사되는 세포 요법의 한 부류를 포함한다. 이 과정에서 이식편 대 숙주 질환의 확률은 극히 낮고, 항원은 비-MHC-제한된 방식으로 T 세포에 의해 인식된다. 또한, 하나의 CAR-T는 항원을 발현하는 모든 암을 치료할 수 있다. 항체 요법과 달리, CAR-T 세포는 생체내에서 복제되어 장기간 지속을 초래할 수 있고, 이는 지속적인 종양 제어로 이어질 수 있다.

한 실시양태에서, 본 개시내용의 CAR-T 세포는 강건한 생체내 T 세포 확장을 겪을 수 있고, 연장된 양의 시간 동안 지속될 수 있다. 또한, CAR 매개 면역 반응은 CAR-변형된 T 세포가 CAR 내의 항원 결합 모이어티에 특이적인 면역 반응을 유도하는 입양 면역요법 접근법의 일부일 수 있다. 예를 들어, 항-BCMA CAR-T 세포는 BCMA를 발현하는 세포에 대해 특이적인 면역 반응을 도출한다.

본원에 개시된 데이터는 BCMA scFv, 힌지 및 막횡단 도메인, 및 4-1BB 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 구체적으로 개시하지만, 개시내용은 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 구축물의 각각의 성분에 대한 임의의 수의 변이를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

치료될 수 있는 암은 혈관화되지 않거나 대체로 혈관화되지 않은 종양, 및 혈관화된 종양을 포함한다. 암은 비-고형 종양 (예컨대 혈액 종양, 예를 들어 백혈병 및 림프종) 또는 고형 종양을 포함할 수 있다. CAR로 치료될 암의 유형은 암종, 모세포종 및 육종, 및 특정 백혈병 또는 림프성 악성종양, 양성 및 악성 종양, 및 악성종양, 예를 들어 육종, 암종 및 흑색종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 성인 종양/암 및 소아 종양/암이 또한 포함된다.

혈액암은 혈액 또는 골수의 암이다. 혈액 (또는 혈행성) 암의 예는 급성 백혈병 (예컨대 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 골수 백혈병 및 골수모세포, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성 및 적백혈병), 만성 백혈병 (예컨대 만성 골수구성 (과립구성) 백혈병, 만성 골수 백혈병, 및 만성 림프구성 백혈병)을 포함한 백혈병, 진성 다혈구혈증, 림프종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종 (무통성 및 고등급 형태), 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄 질환, 골수이형성 증후군, 모발상 세포 백혈병 및 골수이형성증을 포함한다.

고형 종양은 통상적으로 낭 또는 액체 영역을 함유하지 않는 조직의 비정상적 덩어리이다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 상이한 유형의 고형 종양은 이들을 형성하는 세포의 유형에 따라 명명된다 (예컨대 육종, 암종 및 림프종). 육종 및 암종과 같은 고형 종양의 예는 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 중피종, 악성 림프종, 췌장암 및 난소암을 포함한다.

CAR-변형된 T 세포는 또한 포유동물에서 생체외 면역화 및/또는 생체내 요법을 위한 백신의 한 유형으로서 기능할 수 있다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.

생체외 면역화와 관련하여, 세포를 포유동물 내로 투여하기 전에 하기 중 적어도 하나가 시험관내에서 발생한다: i) 세포를 확장시키는 것, ii) CAR을 코딩하는 핵산을 세포에 도입하는 것, 및/또는 iii) 세포의 동결보존.

생체외 절차는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 하기에 보다 충분히 논의된다. 간략하게, 세포는 포유동물 (예컨대 인간)로부터 단리되고, 본원에 개시된 CAR을 발현하는 벡터로 유전자 변형된다 (즉, 시험관내 형질도입 또는 형질감염된다). CAR-변형된 세포는 포유동물 수용자에게 투여되어 치료 이익을 제공할 수 있다. 포유동물 수용자는 인간일 수 있고, CAR-변형된 세포는 수용자에 대해 자가일 수 있다. 대안적으로, 세포는 수용자에 대해 동종, 동계 또는 이종일 수 있다.

생체외 면역화의 관점에서 세포-기반 백신을 사용하는 것에 추가로, 본 개시내용은 환자에서 항원에 대해 지시된 면역 반응을 도출하기 위한 생체내 면역화를 위한 조성물 및 방법을 또한 제공한다.

본 개시내용은 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 CAR-변형된 T 세포를 투여하는 것을 포함하는, 종양을 치료하는 방법을 제공한다.

본 개시내용의 CAR-변형된 T 세포는 단독으로, 또는 희석제와 및/또는 다른 성분 예컨대 IL-2, IL-17 또는 다른 시토카인 또는 세포 집단과 조합된 제약 조성물로서 투여될 수 있다. 간략하게, 본 개시내용의 제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 표적 세포 집단을 1종 이상의 제약상 또는 생리학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충제, 예컨대 중성 완충 염수, 포스페이트 완충 염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 아주반트 (예를 들어, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조성물은 정맥내 투여를 위해 제제화될 수 있다.

본 개시내용의 제약 조성물은 치료 (또는 예방)될 질환에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있지만, 투여의 양 및 빈도는 환자의 상태, 및 환자의 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이다.

"면역학적 유효량", "항종양 유효량", "종양-억제 유효량", 또는 "치료량"이 나타나있는 경우에, 투여될 본 개시내용의 조성물의 정확한 양은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 환자 (대상체)의 상태에서의 개별 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 본원에 기재된 T 세포를 포함하는 제약 조성물은 10⁴ 내지 10⁹개 세포/kg 체중, 또는 10⁵ 내지 10⁶개 세포/kg 체중 (이들 범위 내의 모든 정수 값 포함)의 투여량으로 투여될 수 있는 것으로 일반적으로 언급될 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이들 투여량으로 다수회 투여될 수 있다. 세포는 면역요법에 통상적으로 공지된 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988] 참조). 특정한 환자에 대한 최적 투여량 및 치료 요법은 질환의 징후에 대해 환자를 모니터링하고 그에 따라 치료를 조정함으로써 의약 기술분야의 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

대상 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 인공물이식 또는 이식에 의한 것을 포함한 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 환자에게 피하로, 피내로, 종양내로, 결절내로, 골수내로, 근육내로, 정맥내 주사에 의해, 또는 복강내로 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 T 세포 조성물은 피내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 T 세포 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. T 세포의 조성물은 종양, 림프절, 또는 감염 부위 내로 직접 주사될 수 있다.

본 개시내용의 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법, 또는 T 세포가 치료 수준으로 확장되는 관련 기술분야에 공지된 다른 방법을 사용하여 활성화 및 확장된 세포는, 항바이러스 요법, 시도포비르 및 인터류킨-2, MS 환자를 위한 시타라빈 (ARA-C로도 공지됨) 또는 나탈리주맙 치료 또는 건선 환자를 위한 에팔리주맙 치료 또는 PML 환자를 위한 다른 치료와 같은 작용제를 사용한 치료를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 수의 관련 치료 양식과 함께 (예를 들어, 그 전에, 동시에 또는 그 후에) 환자에게 투여된다. 추가 실시양태에서, 본 개시내용의 T 세포는 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예컨대 시클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역요법제와 조합되어 사용될 수 있다. 추가 실시양태에서, 본 개시내용의 세포 조성물은 골수 이식, 또는 화학요법제, 예컨대 플루다라빈, 외부-빔 방사선 요법 (XRT), 시클로포스파미드의 사용과 함께 (예를 들어, 그 전에, 그와 동시에 또는 그 후에) 환자에게 투여된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 대상체는 고용량 화학요법에 이어 말초 혈액 줄기 세포 이식으로의 표준 치료를 받을 수 있다. 특정 실시양태에서, 이식 후에, 대상체는 본 개시내용의 확장된 면역 세포의 주입을 받는다. 추가의 실시양태에서, 확장된 세포는 수술 전 또는 후에 투여된다.

환자에게 투여될 상기 치료제의 투여량은 치료될 상태의 정확한 성질 및 치료의 수용자에 따라 달라질 것이다. 환자 투여를 위한 투여량의 스케일링은 관련 기술분야에서 허용되는 실시에 따라 수행될 수 있다. 일반적으로, 1 x 10⁶ 내지 1 x 10¹⁰개의 본 개시내용의 변형된 T 세포 (예를 들어, CAR-T-BCMA 세포)는 예를 들어 각각의 치료 또는 각각의 치료 과정에서 정맥내 주입에 의해 환자에게 적용될 수 있다.

본 개시내용의 주요 이점은 하기를 포함한다:

(a) 본 개시내용의 키메라 항원 수용체에 대해, 세포외 항원 결합 도메인은 특이적 항-BCMA scFv이고; CAR은 낮은 세포독성 및 낮은 부작용으로 종양 세포를 사멸시키는 우수한 능력을 나타냈다.

(b) 본 개시내용에 의해 제공된 키메라 항원 수용체는 T 세포가 CAR 유전자를 보유하는 바이러스 벡터 (예를 들어, 렌티바이러스)에 의해 감염된 후에 CAR 단백질의 안정한 발현 및 막 국재화를 달성할 수 있다.

(c) 본 개시내용의 CAR-변형된 T 세포는 보다 긴 생체내 생존 시간 및 강한 항종양 효과를 갖는다. 본 개시내용에 사용된 scFv는 인간화 또는 인간-유래 항체일 수 있고, 특이적 면역학적 거부를 생성할 가능성이 적다.

본 개시내용은 구체적 실시예를 참조하여 하기에 추가로 예시될 것이다. 이들 실시예는 단지 예시적 목적을 위한 것이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 구체적 조건이 구체적으로 나타나있지 않은 하기 실시예에서의 실험 방법의 경우, 이들은 달리 명시되지 않는 한, 상용 조건, 예를 들어 문헌 [Sambrook. et al., in Molecule Clone: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]에 기재된 조건 하에, 또는 제조업체에 의해 지시된 바와 같이 수행된다. 백분율 및 부(part)는 달리 언급되지 않는 한 중량 기준이다.

실시예 1 렌티바이러스 발현 벡터의 구축

전장 DNA 합성 및 클로닝을 상하이 보이 바이오테크놀로지 캄파니, 리미티드(Shanghai Boyi Biotechnology Co., Ltd)에 의해 위탁하여 코딩 플라스미드의 구축을 달성하였다. pWPT 렌티바이러스 벡터를 클로닝 벡터로서 선택하였고, 클로닝 부위는 BamH I 및 Sal I 부위였다. 구체적인 서열은 상기 기재된 바와 같다.

실시예 2 CAR-T 세포의 제조

(1) 단핵 세포 (PBMC)를 밀도 구배 원심분리에 의해 건강한 사람의 정맥 혈액으로부터 단리하였다.

(2) 제0일에, PBMC를 5 μg/mL의 최종 농도의 CD3 모노클로날 항체 (OKT3) 및 10 μg/mL의 최종 농도의 레트로넥틴 (타카라(TAKARA)로부터 구입함)으로 미리 코팅된 세포 배양 플라스크에 시딩하였다. 배지는 1% 인간 알부민을 함유하는 GT-551 세포 배양 배지였다. 재조합 인간 인터류킨 2 (IL-2)를 1000 U/mL의 최종 농도로 배지에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 5%의 포화 습도로 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

(3) 제1일에, 배양된 PBMC의 상청액을 천천히 흡인하고 폐기하였다. 1% 인간 알부민을 함유하는 새로운 GT-551 세포 배양 배지를 첨가하고, 재조합 인간 인터류킨 2 (IL-2)를 1000 U/mL의 최종 농도로 배지에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 5%의 포화 습도로 CO₂ 인큐베이터에서 연속적으로 배양하였다.

(4) 제3일에, 신선한 배지, 농축 및 정제된 CAR-BCMA 렌티바이러스 용액, 프로타민 술페이트 (12 ug/ml), 및 IL-2 (1000 U/mL의 최종 농도로)를 첨가하였다. 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터에서의 12시간 감염 후, 배양 배지를 폐기하고, 신선한 배지를 첨가하고, 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양을 계속하였다.

(5) 제6일부터 시작하여, CAR-BCMA 세포를 상응하는 활성 검정을 위해 취할 수 있다.

실시예 3 T 세포 게놈 내의 CAR 유전자의 통합 속도 및 막 표면 상의 그의 코딩된 단백질의 발현 수준의 검출

실시예 2에서 제7일 (도 3a), 제21일 (도 3b) 및 제29일 (도 3c)에 배양된 0.5 x 10⁶개의 CART-BCMA 세포 샘플을 각각 취하였다. T 세포 막의 표면 상의 CAR-BCMA 단백질의 발현 수준을 재조합 인간 BCMA 단백질의 Fc 단편 염색 후에 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.

결과는 도 3a, 3b 및 3c에 제시되고, 본 개시내용에서 설계된 4종의 CAR 구조는 그의 상응하는 변형된 T 세포에서 발현되어 세포 막 표면 국재화를 완료할 수 있다.

실시예 4 CAR-BCMA의 시험관내 활성화 능력의 검출

세포 활성화 수준 지표 단백질 CD137 및 IFNγ를 실시예 2에서 제7일에 배양된 CART-BCMA 세포를 사용하여 검출하였다. 제7일에 배양된 1 x 10⁵개의 CART-BCMA 세포를 각각 BCMA-양성 K562-BCMA+E7 종양 세포주 및 BCMA-음성 K562 종양 세포주와 함께, 또는 종양 세포 없이, 200 μl GT-551 배지에서 18시간 동안 1:1의 비로 배양하였다. 이어서, T 세포 막의 표면 상의 CD137의 발현 수준을 유동 세포측정법에 의해 검출하고, 배양물 상청액 중 IFNγ의 분비 수준을 ELISA에 의해 검출하였다.

결과는 도 4a 및 도 4b에 제시되고, 4종의 CART 세포의 표면 상에서 CD137의 발현이 검출되었고, 배양물 상청액에서 IFNγ의 발현이 검출되었다. 이들 중에서, CAR-BCMA-20은 최상의 CD137 활성화 수준 및 IFNγ 방출 수준을 나타낸다. 인간화 MO6 항체 서열을 기반으로 하여 구축된 CART-BCMA-MO6은 마우스 항체 서열을 기반으로 하여 구축된 CART-BCMA-CA8보다 더 약한 수준의 CD137 활성화를 나타내지만, 더 높은 수준의 IFNγ 방출을 나타낸다.

추가적으로, C-CAR088은 BCMA-1, BCMA-CA8 및 BCMA-MO6을 기반으로 한 CAR과 비교하여, BCMA-양성 종양 세포에서 보다 높은 수준의 IFN-γ 방출 (도 4b) 및 CD137 발현 (도 4a)을 유도하였다.

CART-BCMA-20은 CART-BCMA-1 (양성 대조군), CART-BCMA-MO6 및 CART-BCMA-CA8보다 BCMA-양성 종양 세포의 더 큰 아폽토시스를 유도하였다 (도 5).

실시예 5 CART-BCMA 세포에 의해 유도된 종양 세포의 진행된 아폽토시스 활성의 검출

(1) 실시예 2에서 제17일에 배양된 CART-BCMA 세포를 각각 1 x 10⁴개의 CFSE-표지된 BCMA-음성 세포 (NH929) 또는 BCMA-양성 자기-구축된 세포 (NH929-BCMA 과다발현 종양 세포주)와 (도 5에 제시된 바와 같은) 1:1, 2.5:1, 5:1, 10:1, 20:1의 비로 혼합하였다. 혼합된 세포를 100 μl GT-551 배지에서 4시간 동안 공동-배양한 다음, 100 μl 25% PI 염료로 15분 동안 염색하였다. CFSE 양성 세포 중 PI 양성 세포의 비율을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.

(2) 실시예 2에서 제22일에 배양된 CART-BCMA 세포를 각각 1 x 10⁴개의 CFSE-표지된 BCMA-음성 세포 (NH929), BCMA-양성 자기-구축된 세포 (NH929-BCMA 과다발현 종양 세포주) 또는 BCMA를 자연 발현하는 MM.1S 세포주와 (도 6b에 제시된 바와 같은) 1:1, 5:1, 10:1, 10:1, 40:1의 비로 혼합하였다. 혼합된 세포를 100 μl GT-551 배지에서 4시간 동안 공동-배양한 다음, 100 μl 25% PI 염료로 15분 동안 염색하였다. CFSE 양성 세포 중 PI 양성 세포의 비율을 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.

결과는 도 5 및 도 6a 및 6b에 제시되고, 모든 4종의 CART 세포는 BCMA-양성 종양 세포의 아폽토시스를 유도할 수 있다. 이들 중에서, CART-BCMA-20은 CART-BCMA-1보다 더 우수하게 BCMA-양성 종양 세포의 진행성 아폽토시스를 유도할 수 있다. BCMA-양성 종양 세포의 진행성 아폽토시스를 유도하는 CART-BCMA-MO6 및 CART-BCMA-CA8의 능력은 유사하다.

실시예 6 RPMI-8226 골수종 이종이식편 모델 상에서의 CART-BCMA의 억제

대수 성장기의 RPMI-8226 세포를 수집하고, 4.0 x 10⁶개의 종양 세포를 6-8주령 B-NDG 마우스의 우측 등에 피하로 접종하였다. 종양 부피가 약 120 mm³에 도달하였을 때, 동물을 종양 부피에 따라 4개의 군으로 무작위로 나누어, 각각의 군의 종양 부피 차이가 평균 값의 10% 미만이도록 하였다. 이어서, 용매 대조군, 7.5 x 10⁶개의 NT 및 7.5 x 10⁶개의 CART-BCMA 세포를 각각 꼬리 정맥을 통해 주사하였다.

결과는 도 7a 및 7b에 제시되고, 대조군과 비교하여, 꼬리 정맥을 통한 CART-BCMA-1 및 CART-BCMA-20의 단일 주사는 인간 골수종 RPMI-8226 세포의 성장을 효과적으로 억제할 수 있고 (상대 종양 증식률 %T/CRTV≤40%, P<0.05), 인간 골수종-보유 마우스의 생존 시간을 유의하게 연장시킬 수 있다 (대조군의 생존 중앙값은 23일이고, CART-BCMA 치료군의 생존 중앙값은 > 33일임). CART-BCMA-1로 처리된 마우스 및 CART-BCMA-20으로 처리된 마우스 사이에 종양 증식률 및 생존 중앙값에 유의한 차이는 없었다.

생체내 연구를 위해, B-NDG 마우스를 인간 골수종 RPMI-8226 세포로 이종이식하였다. 종양 부피가 약 120 mm³에 도달하였을 때, 용매 대조군, 비-형질감염된 (NT) T 세포 (음성 대조군) 또는 CART-BCMA 세포를 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주사하였다.

대조군과 비교하여, CART-BCMA-1 및 CART-BCMA-20의 단일 주사는 골수종 세포의 성장을 효과적으로 억제하였고, 인간 골수종-보유 마우스의 생존 시간을 유의하게 연장시켰다: CART-BCMA-처리군의 생존 중앙값은 >33일인 반면, 대조군의 생존 중앙값은 23일이었다. CART-BCMA-1로 처리된 마우스 및 CART-BCMA-20으로 처리된 마우스 사이에 종양 증식률 및 생존 중앙값에 유의한 차이는 없었다 (도 7a 및 7b).

결과는 BCMA-20 (C-CAR088)이 높은 생체내 항종양 효능을 갖는다는 것을 시사한다.

비교 실시예

본 출원의 키메라 항원 수용체의 스크리닝 과정에서, 본 발명자들은 다수의 후보 서열을 시험하였으며, 이는 하기 실시예에 예시되어 있다.

스크리닝될 항체는 BCMA-1, BCMA-2, BCMA-69, BCMA-72, BCMA-2A1, BCMA-1E1, BCMA-J22.9, BCMA-20, BCMA-CA8, 및 BCMA-MO6을 포함한다. BCMA를 표적화하는 키메라 항원 수용체의 구조를 상기 항체를 기반으로 하여 구축하였다. 이들 중에서, BCMA-1 및 BCMA-2는 공개된 Car-T 서열이고, 스크리닝을 위한 양성 대조군으로서 사용된다. CAR-T 세포를 실시예 2에서와 동일한 방식으로 제조하고, 실시예 3 및 4에서와 동일한 방식으로 검출하였다.

결과는 도 1a, 1b 및 1c에 제시되고, 이들은 CAR-T 세포의 2개의 배치의 실험 결과이다. Car-T의 발현을 BCMA-Fc 융합 단백질로 검출하였다. 도 1a에 도시된 바와 같이, 1차 T 세포에서 높은 발현이 존재함을 알 수 있다. 도 1b에서, BCMA-1, BCMA-20, BCMA-1E1, BCMA-CA8, BCMA-MO6, 및 BCMA-J22.9가 BCMA 항원에 의해 활성화될 수 있음을 알 수 있다. 도 1c는 활성화된 BCMA-1, BCMA-20, BCMA-1E1, BCMA-CA8, BCMA-MO6, 및 BCMA-J22.9 CAR-T가 보다 높은 수준의 IFN-γ를 생산할 수 있다는 것을 보여준다. 결과는 BCMA-1, BCMA-20, CA8 및 MO6에 의해 수득된 CAR-T 기능이 유사함을 보여주며, 따라서 BCMA-20, CA8 및 MO6 CAR-T를 추가로 분석하고 연구하였다.

실시예 7 막 단백질 어레이 실험

서열식별번호: 1의 경쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 2의 중쇄 가변 영역을 사용하여 단일-쇄 항체 B20-scFv-rabFc를 제조하고, 막 단백질 어레이 실험을 수행하였다.

20 ug/mL의 B20-scFv-rabFc를 각각 5344종의 막 단백질로 일시적으로 형질감염된 HEK293T 세포 어레이에 첨가하였다. 유동 세포측정법은, 이 시험 조건 하에, B20-scFv-rabFc가 TNFRSF17 (Q02223), MAG (P20916), CR2 (P20023), CXADR (P78310) 및 DDR2 (Q16832)와 교차-인식할 수 있으며, 여기서 TNFRSF17, 즉 BCMA는 B20-scFv의 특이적 표적이고, MAG, CR2, CXADR 및 DDR2는 의심되는 비-특이적 표적임을 밝혀내었다.

의심되는 표적이 CAR-T의 활성화를 유발할 수 있는지 여부를 추가로 확인하기 위해, CBM.BCMA CAR-T를 각각 BCMA, CR2, CXADR, DDR2 및 MAG로 형질감염된 293T 세포와 공동-배양하였다. 공동-배양물 상청액 중 IFNγ, TNF, IL-2 및 다른 시토카인을 검출하였다. 공벡터로 형질감염된 293T 세포를 음성 대조군으로서 사용하고, BCMA로 형질감염된 293T 세포를 양성 대조군으로서 사용하였다.

도 8은 유동 세포측정법에 의한 관련 플라스미드의 형질감염 후의 293T 세포에서의 BCMA, CR2, CXADR, DDR2 및 MAG의 발현 결과를 보여준다.

시토카인 검출 결과는 도 9a, 9b 및 9c에 제시된다. 293T 세포 상에서 발현된 BCMA만이 CBM을 유도할 수 있다. BCMA CAR-T 세포는 다량의 IFNγ/TNF/IL-2를 생산하지만, 다른 4종의 비-특이적 표면 마커는 CBM을 활성화시킬 수 없다. BCMA CAR-T 세포.

도 8 및 도 9a-9c는 전체 게놈 막 프로테옴 어레이 및 검증을 보여준다. TNFRSF17, MAG, CR2, CXADR 및 DDR2는 20.0 μg/mL의 농도에서 B-20 scFv rabFc와 중등도로 결합하는 것으로 확인되었다. TNFRSF17 (BCMA)을 발현하는 세포만이 다수의 시토카인 (IFNγ/TNF/IL-2)을 생산하는 BCMA-CAR-T 세포를 유도할 수 있다.

20.0 μg/mL의 농도에서 흉선, 비장, 림프절, 골수 내의 인간 림프구 및 갑상선, 부신 내의 산란된 림프구 상에서 특이적 막 염색이 관찰되었다 (표 1 및 도 19a-19b).

표 1

a) 3명의 공여자에서의 양성 염색의 수.

b) 동일한 유형의 세포에서의 양성 세포의 염색 강도 및 양성 세포의 백분율.

"-" 세포 염색 없음,

"+" 약한 양성 염색, <10% 세포가 염색됨,

"++" 중등도의 양성 염색, 11%-50% 세포가 염색됨.

실시예 8 C-CAR088 세포의 시험관내 항종양 활성

키메라 항원 수용체 BCMA-20 (이하 C-CAR088로 명명됨)을 후속 실험을 위해 선택하였다. C-CAR088 세포, NT 세포 (비-형질감염된 T 세포, 음성 대조군으로서 사용됨) 및 양성 대조군 세포 (블루버드(Bluebird) bb2121)를 BCMA 음성 세포 (NH929) 또는 BCMA 양성 세포 (NH929-BCMA)와 상이한 효과 표적 비로 공동-배양하였다. 표적 세포에 대한 각각의 세포의 사멸 능력을 분석하였다.

결과는 도 10에 제시된다. C-CAR088 세포 및 양성 대조군 세포는 단지 NH929-BCMA 세포에 대한 강한 사멸 효과를 갖지만, 음성 표적 세포 NH929에 대해서는 유의한 사멸 효과를 갖지 않는다. 비-형질감염된 군 (NT)은 또한 표적 세포에 대해 유의한 사멸 효과를 갖지 않는다.

C-CAR088을 갖는 T 세포, 비-형질감염된 (NT) T 세포 (음성 대조군) 및 양성 대조군 세포 (블루버드 bb2121)를 BCMA 음성 세포 (NH929) 또는 BCMA 양성 세포 (NH929-BCMA)와 상이한 효과/표적 비로 공동-배양하였다. 이어서, 세포독성을 검정하였다.

도 10은 C-CAR088 T 세포 및 양성 대조군이 NH929-BCMA 세포 상에서 강한 세포독성을 입증하였지만, NH929 세포 상에서는 그렇지 않았음을 보여준다.

실시예 9 세포 사멸 활성에 대한 가용성 BCMA의 효과

C-CAR088 세포와 BCMA 음성 표적 세포 A549 및 BCMA 양성 표적 세포 A549-BCMA-2E9의 공동-배양 시스템에서, 100 ng/ml 및 500 ng/ml의 가용성 BCMA 단백질을 각각 첨가하여 CD137 발현에 대한 그의 효과를 검출하였다.

결과는 도 11에 제시된다. 가용성 BCMA 단백질은 CD137 발현의 상향조절에 대한 효과가 없으며, 이는 가용성 BCMA가 CAR 및 표적 항원의 특이적 인식을 차단하지 않는다는 것을 나타낸다. 시험관내 세포 사멸 능력 및 IFN-γ 방출의 ELISA의 시험에서, 표적 세포에 대한 C-CAR088 세포의 사멸 효과 및 IFN-γ의 방출은 500 ng/ml의 가용성 BCMA 단백질에 의해 감소되었지만, 유의한 차이는 없었다. 상기 결과는 C-CAR088 세포의 세포 사멸 활성이 기본적으로 가용성 BCMA에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 10 C-CAR088 세포의 용량 의존성 효과

6주령 B-NDG 마우스 (절반 수컷 및 절반 암컷)를 선택하고, 2.5 x 10⁶개의 인간 다발성 골수종 세포 RPMI-8226을 복강내 주사하였다. 유사한 종양 부담을 갖는 마우스를 선택하고, 5개의 군으로 나누고, 각각 2.5 x 10⁶개의 C-CAR088 세포 (저용량 군), 5 x 10⁶개의 C-CAR088 세포 (중간-용량 군), 1 x 10⁷개의 C-CAR088 세포 (고용량 군), T 세포 및 비히클 (비히클로서 동결보호제 (CBMG C-CFMC) 포함)을 주사하였다. 실험은 54일 지속되었다. 실험 동안, 마우스의 종양 부담을 5일마다 평가하였다. 실험 종료 시, 마우스의 생존율을 계산하였다.

결과는 도 12에 제시된다. 5 x 10⁶개 세포/마우스 및 1 x 10⁷개 세포/마우스의 C-CAR088 세포의 용량의 단일 투여는 인간 골수종 RPMI-8226 세포의 B-NDG 마우스 이종이식 종양의 성장을 효과적으로 억제할 수 있다. 상대 종양 증식률은 각각 6.12% 및 0.75%였다 (p <0.05). 실험 종료 시, 중간-용량 군에서 종양-보유 마우스의 생존율은 91.7% (11마리/12마리)였다. 고용량 군의 종양-보유 마우스에서 사망은 발생하지 않았고, 생존율은 100.0% (12마리/12마리)였으며, 비히클 군 (생존율 58.3%)과 비교하여 유의한 차이 (p <0.05)를 가졌다. 상기 결과는 C-CAR088이 용량 의존성 생체내 항종양 활성을 나타낸다는 것을 나타낸다.

실시예 11 C-CAR088의 I상 임상 연구

윤리 위원회의 승인 하에, 총 15명의 지원자가 I상 임상 시험을 수행하였다. 지원자에 대한 주요 적격성 기준은 하기와 같다: 18-75세의 다발성 골수종을 갖는 환자, MM 세포는 BCMA를 발현하고, 측정가능한 MM을 갖고, MM에 대한 2차 선행 요법을 받았고, PI 및 IMiD를 사용한 치료를 받았고, 적절한 간, 신장, 심장 및 조혈 기능을 갖는다.

실험 과정은 도 13에 제시된다.

치료 결과는 도 14 및 표 2에 제시된다. 2명의 환자를 제2주에 평가하였고, 1명은 SD 및 1명은 CR이다. 나머지 13명의 환자를 제4주에 평가하였고, 객관적 반응률 ORR은 100%에 도달하였다. 모든 환자에서, 3명의 CR, 5명의 VGPR (1명의 다라투무맙-내성 환자 포함), 및 6명의 PR이 존재하였다.

표 2 임상 반응

치료-관련 유해 사건은 표 3에 제시된다. 15명의 환자 중 오직 1명의 환자만이 등급 3 시토카인 방출 증후군을 발생시켰다. 용량 증량에서 신경독성 사건 및 용량-제한 독성 (DLT)은 관찰되지 않았다. 혈구감소증은 대부분 Cy/Flu 림프구고갈과 관련된다. 치료 후 특정 정도의 시토카인 방출 증후군의 발생은 또한 측면으로부터 CART 치료의 유효성을 예시한다는 것을 주목해야 한다. 15명의 환자 중 누구도 특히 심각한 시토카인을 갖지 않았고, C-CAR088은 보다 우수한 안전성을 가졌다.

표 3 치료-관련 유해 사건

도 15는 ID Z0203-00801C008의 환자의 치료 상태를 보여준다. 도 16은 ID Z0203-00701C001의 환자의 치료 상태를 보여준다. 1명의 환자에 대한 암 병변의 PET-CT 영상은 골수에서의 비정상적 형질 세포가 C-CAR088 치료 후에 유의하게 감소되었음을 보여준다 (도 15). 도 16a 및 16b는 실험의 시작 시 (기준선) 대다수의 PC가 비정상적이었고 (>90%가 CD45lo/-였음), BCMA+ 및 카파 경쇄에 대해 클론이었음을 보여준다. 도 16b는 BCMA CAR-T 치료의 14 또는 28일 후에, BM에서의 비정상적 PC, 특히 카파 + PC가 유의하게 감소하였고, 이는 85.2%의 기준선 수준으로부터 0%로 감소하였음을 보여준다.

도 17은 혈액 중 C-CAR088의 확장 및 M-단백질/sFLC 수준의 감소를 보여준다. 결과는 C-CAR088 세포가 주사 후에 효과적으로 확장되었고, M-단백질/sFLC 마커의 수준이 계속 감소하였음을 보여주었다. 1명의 환자의 M-마커 수준은 제14일에 0으로 떨어졌다.

C-CAR088에 대한 관찰의 요약은 하기와 같았다.

· 전임상 연구에서, C-CAR088은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 항종양 활성을 보여주었다.

· r/r MM을 갖는 환자에서의 초기 C-CAR088 시험 결과는 전임상 소견을 뒷받침하고, 유망한 효능 및 관리가능한 안전성 프로파일을 보여주었다.

· 낮은 준최적 용량에서의 초기 임상 효능 신호는 고무적이었다.

· KarMMa 데이터와 비교하여, 주입된 환자로부터의 본 발명자들의 현재 용량 수준은 bb2121의 최적 용량보다 훨씬 낮았다. 53% (8/15)가 최근에 투여되었다 (~4주에서).

· PK 프로파일에 기초하여 용량 의존성이 관찰되었다. C-CAR088은 환자에서 잘 허용되었다.

실시예 12 항-BCMA CAR T-세포 요법 (C-CAR088)은 재발성 또는 불응성 다발성 골수종 (r/r MM)을 치료하는 데 있어서 유망한 안전성 및 효능 프로파일을 보여주었다

본 발명자들의 연구는 C-CAR088이 다른 항-BCMA CAR과 비교하여 시험관내 및 생체내 둘 다에서 종양 세포에 대해 상당히 더 세포독성임을 입증하였다.

본 발명자들은 환자에서 재발성/불응성 다발성 골수종 (R/R MM)을 치료하는 데 있어서 항-BCMA CAR (BCMA-20, 또한 "C-CAR088"로 명명됨)의 임상 시험을 수행하였다.

임상 시험은 다수의 상이한 기준에 따라 평가된다. 2가지 주요 척도는 전체 반응률 (ORR) 및 완전 반응률 (CR)이다. 다른 항-BCMA CAR과 비교 시, 청구된 방법의 CAR은 재발성/불응성 다발성 골수종 (R/R MM)을 치료하는 데 있어서 높은 반응률 (95% 전체 반응률 또는 ORR, 및 67% 완전 반응률 또는 CR)에 의해 반영되는 바와 같이, 임상 시험에서 보다 우수한 치료 효능을 제공한다.

심지어 JNJ-4528 (CARTITUDE-1)과 비교한 경우에도, C-CAR088에서의 유해 사건, 예컨대 신경독성의 백분율은 유의하게 더 낮았다. 구체적으로, C-CAR088의 경우에, 단지 4% 환자만이 등급 1 신경독성을 경험하였으며, 이는 자발적으로 해결되었다. 따라서, 청구된 방법의 CAR-T 세포는 유리한 안전성 프로파일을 제공하였다.

C-CAR088은 관리가능한 안전성 프로파일을 입증하였다.

· CRS의 대부분의 사례는 개시까지의 시간의 중앙값이 6일인 등급 1/2이었다.

· 신경독성 (ICANS)은 드물었고, 일반적으로 저등급이었으며, 등급 1은 1건이 있었다.

용량 의존성 반응은 초기에 발생하였고, 심화되었다.

· ORR: 95.7%, CR에 대한 중앙값 시간: 1.6개월 (범위: 0.5-9.5)에서 43.5%의 CR률. 반응까지의 시간의 중앙값: 0.5개월.

· 중앙값 6.2개월 추적에서, 65.1% 환자는 6개월에 무진행이었다.

전임상 연구에서, C-CAR088은 매우 우수한 시험관내 및 생체내 항종양 활성 및 표적 특이성을 보여주었다. r/r MM을 갖는 24명의 환자에서의 임상 시험 결과는 유망한 효능 및 관리가능한 안전성 프로파일과 함께 강한 치료 지수를 보여주었다.

본 발명자들은 환자에서 재발성/불응성 다발성 골수종 (R/R MM)을 치료하는 데 있어서 항-BCMA CAR (BCMA-20, 또한 "C-CAR088"로 명명됨)의 임상 시험을 수행하였다. 본 발명자들의 항-BCMA CAR 치료의 시작 전의 환자의 기준선 인구통계 및 임상 특징을 표 4에 제시한다.

투여된 환자의 연령 중앙값은 60세 (범위: 45-74세)였다. 요법의 선행 차수의 중앙값은 4회 (범위: 선행 요법 2-12회)였다. 모든 환자는 IMiD (면역조절 약물) 및 프로테아솜 억제제를 사용한 선행 치료를 받았다. 25% 환자는 이전에 항-CD38 모노클로날 항체로 치료된 반면, 25% 환자는 자가 조혈 줄기 세포 이식을 받았다.

표 4 환자의 기준선 임상 특징의 요약

* 1q21 게인, del (17p), t (4;14) 및 t (14;16) 포함.

임상 프로토콜, 및 핵심 포함 기준은 도 21에 제시된다. 구체적으로, 검증된 대상체를 등록시키고, 수집된 말초 혈액 백혈구를 사용하여 CAR-T 세포 (C-CAR088)를 생산하였다. 이어서, CAR-T 세포를 동결시키고, 사용시까지 -135℃ 미만에서 저장하였다. CAR-T 치료를 위해, CAR-T 세포를 해동시키고, 투여를 30-45분 내에 완료하였다.

CAR-T 주입 전 -5 및 -3일에, 환자는 플루다라빈 (30 mg/m²/d, 정맥내, 3일 동안 1일 1회), 및 시클로포스파미드 (300 mg/m²/d, 정맥내, 3일 동안 1일 1회)를 포함하는 림프구고갈 예비치료를 받았다.

림프구고갈 대략 72시간 후에, 환자에게 제0일에 1.0-6.0 x 10⁶개 CAR-T 세포/kg을 3 + 3 용량 증량으로서 투여하였다. 주입 후에 제1일에 시작하여 제24개월까지 환자에 대한 추적을 수행하였다.

1차 목적은 안전성: 용량 제한 독성의 등급화; 치료-발현성 유해 사건 (CTCAEV5.0)의 발병률 및 중증도를 포함하였다. 2차 목적은 효능: IMWG 2016 ORR; DOR; PFS; OS를 포함하였다. 탐색적 목적은 CAR-T 확장 및 지속성을 포함하였다.

도 22에 제시된 바와 같이, 본 발명자들의 항-BCMA CAR-T 시험의 전체 반응률 (ORR, CR 및 PR 포함)은 96%이다. 최상의 전체 반응 (BOR)은 12개의 엄격한 완전 반응 (sCR), 2개의 완전 반응 (CR), 8개의 매우 우수한 부분 반응 (VGPR) 및 1개의 부분 반응 (PR)을 포함하였다. 완전 반응 (CR)은 67%였다 (SD: 안정 질환; PR: 부분 반응; CR: 완전 반응; PD: 진행성 질환; MR: 최소 반응; VGPR: 매우 우수한 부분 반응; MRD: 최소 잔류 질환).

전체 및 각각의 용량군에 대한 CR/sCR, VGPR 및 PR은 표 5 및 도 23에 제시된다. 3.0-6.0 x 10⁶개 CAR-T 세포/kg 용량 군에서, 14/21명 (66.7%)의 환자가 CR/sCR을 달성하였고, 모든 (14명/14명) 환자가 10^-4-10^-6에서 유동 세포측정법에 의해 MRD 음성을 달성하였다.

표 5

*1명의 환자는 4.5 x 10⁶/kg을 받았고, 1명은 5.0 x 10⁶/kg을 받았다.

하기 표 6은 C-CAR088 시험을 문헌 [Munshi et al. (KarMMa: Idecabtagene Vicleucel), Mailankody et al. (EVOLVE: Orvacabtagene Autoleucel) 및 Madduri et al. (CARTITUDE-1: JNJ-4528)]의 것과 비교한다.

표 6 다른 BCMA-특이적 CAR과의 C-CAR088 임상 시험의 비교

* +1q21을 포함한다. ⁺ 최저 용량 코호트 (300 x 10⁶개 세포)에서의 PFS. ^# 3-6 x 10⁶개 CAR-T 세포/kg 용량 코호트에서의 결과.

ICANS: 면역 이펙터 세포-연관 신경독성 증후군.

문헌 [Munshi et al., Idecabtagene vicleucel (ide-cel; bb2121), a BCMA-targeted CAR T-cell therapy, in patients with relapsed and refractory multiple myeloma (RRMM): Initial KarMMa results, Journal of Clinical Oncology, 2020, 38(15) suppl., Abstract 8503; Mailankody et al., Orvacabtagene autoleucel (orva-cel), a B-cell maturation antigen (BCMA)-directed CAR T cell therapy for patients (pts) with relapsed/refractory multiple myeloma (RRMM): update of the phase 1/2 EVOLVE study (NCT03430011), Journal of Clinical Oncology, 2020, 38(15) suppl., Abstract 8504; Madduri et al., CARTITUDE-1: Phase 1b/2 Study of Ciltacabtagene Autoleucel, a B-Cell Maturation Antigen-Directed Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy, in Relapsed/Refractory Multiple Myeloma, 62nd ASH Annual Meeting and Exposition, December 5-8, 2020, Abstract 177]을 참조한다.

본 발명자들의 C-CAR088의 임상 시험의 경우, 카플란 마이어 무진행 생존 (PFS) 추정치는 62.1% - 99.7%의 95% 신뢰 구간 (CI)으로, 중간- 및 고-용량 군에 대해 78.7%의 6-개월 PFS를 포함하였다. 반응 지속기간 (DOR) 중앙값에 도달하지 않았다. 표 7 및 도 24를 참조한다.

표 7

환자의 혈액에서의 CAR 카피의 시간 경과를 도 25a 및 25b에 제시한다. 따라서, CAR 수준은 투여 후에 혈액에서 유지되었다.

C-CAR088 치료는 잘 허용되었다. 환자의 유해 반응 (유해 사건, AE)을 기록하였다 (표 8 및 9). 단지 1건 (4.2%)의 ≥3 등급 시토카인 방출 증후군 (CRS)이 존재하였다. 신경독성은 자발적으로 해소된 1명의 환자 (4.2%)에서만 관찰되었으며, ≥3 등급 신경독성은 없었다. 호중구감소증 및 혈소판감소증과 같은 혈구감소증은 플루다라빈/시클로포스파미드 (Cy/Flu) 림프구고갈과 대부분 관련되었다. 용량-제한 독성은 관찰되지 않았고, 모든 유해 사건은 가역적이었다. 이들은 본 발명자들의 항-BCMA CAR이 탁월한 안전성 프로파일을 갖는다는 것을 입증하였다.

표 8

표 9

*문헌 [ASTCT Consensus Grading for Cytokine Release Syndrome and Neurologic Toxicity Associated with Immune Effector Cells 2019].

CRS: 시토카인 방출 증후군

본 발명의 범주는 상기 구체적으로 제시되고 기재된 것에 의해 제한되지 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 물질, 구성, 구축 및 치수의 도시된 예에 대한 적합한 대안이 존재한다는 것을 인식할 것이다. 특허 및 다양한 간행물을 포함한 여러 참고문헌이 본 발명의 설명에서 인용되고 논의된다. 이러한 참고문헌의 인용 및 논의는 단지 본 발명의 설명을 명확하게 하기 위해 제공되며, 임의의 참고문헌이 본원에 기재된 발명에 대한 선행 기술임을 인정하는 것은 아니다. 본 명세서에서 인용되고 논의된 모든 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원에 기재된 것의 변경, 변형 및 다른 구현이 본 발명의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 생각날 것이다. 본 발명의 특정 실시양태가 제시되고 기재되었지만, 본 발명의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 변화 및 변형이 이루어질 수 있음이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 상기 설명 및 첨부 도면에 제시된 내용은 제한으로서가 아니라 단지 예시로서 제공된 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> CELLULAR BIOMEDICINE GROUP HK LIMITED Cellular Biomedicine Group Inc. <120> BCMA-Targeted Chimeric Antigen Receptors <130> 11299/008884-WO1 <150> 17/476,661 <151> 2021-09-16 <150> 63/212,289 <151> 2021-06-18 <150> 63/153,666 <151> 2021-02-25 <150> 63/120,692 <151> 2020-12-02 <160> 63 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA-20 light chain variable region <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gly Gln Thr Ile Ser Ser Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA-20 heavy chain variable region <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe 20 25 30 Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Thr Gly Ala Asp His Ala Ile Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg His Gly Tyr Tyr Asp Gly Tyr His Leu Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA-CA8 light chain variable region <400> 3 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Thr Thr Thr Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Glu Leu Val Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu His Gly Gly Gly Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Gly Tyr Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Ser Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 4 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA-CA8 heavy chain variable region <400> 4 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Ala Ile Tyr Asn Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA-MO6 light chain variable region <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 6 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA-MO6 heavy chain variable region <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA-1 light chain variable region <400> 7 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly 1 5 10 15 Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu 20 25 30 Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg 85 90 95 Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 8 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BCMA-1 heavy chain variable region <400> 8 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 Signal peptide <400> 9 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 10 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 11 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 12 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge <400> 12 Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro 1 5 10 15 Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu 20 25 30 Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg 35 40 45 Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 50 55 <210> 13 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 transmembrane domain <400> 13 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 20 <210> 14 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 4-1BB Costimulatory sequence <400> 14 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 15 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 zeta <400> 15 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 50 55 60 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 65 70 75 80 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 85 90 95 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 100 105 110 Arg <210> 16 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 16 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 17 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 18 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 19 Tyr Thr Ser Asn Leu Gln Ser 1 5 <210> 20 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 20 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 21 Met Gly Gln Thr Ile Ser Ser Tyr Thr 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 22 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 1 5 <210> 23 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 24 Asn Phe Asp Met Ala 1 5 <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 25 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val Ser 1 5 10 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 26 Ser Ile Thr Thr Gly Ala Asp His Ala Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 27 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 27 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg 20 25 30 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 28 His Gly Tyr Tyr Asp Gly Tyr His Leu Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 29 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 30 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 30 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys 20 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 31 Ser Ala Ser Thr Thr Thr Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 32 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Glu Leu Val Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 33 Tyr Thr Ser Asn Leu His Gly 1 5 <210> 34 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 34 Gly Gly Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser 1 5 10 15 Leu Thr Ile Gly Tyr Leu Glu Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 35 Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 36 Phe Gly Gly Gly Ser Lys Leu Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 37 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 37 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 38 Asn Tyr Trp Met His 1 5 <210> 39 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 39 Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 40 Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 41 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 41 Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg 20 25 30 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 42 Gly Ala Ile Tyr Asn Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn 1 5 10 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 43 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 44 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 44 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 45 Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 46 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 46 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 47 Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser 1 5 <210> 48 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 48 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 49 Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp Thr 1 5 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 50 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 51 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 51 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 52 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 52 Asn Tyr Trp Met His 1 5 <210> 53 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 53 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 54 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 54 Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 55 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 55 Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 56 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 56 Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn 1 5 10 <210> 57 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 57 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 58 <211> 1494 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 58 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccggacatcc agatgaccca gtccccctcc tccctgtccg cctccgtggg cgaccgggtg 120 accatcacct gccgggcctc ccagggcatc tccaactacc tgaactggta ccagcagaag 180 cccggcaagg cccccaagcc cctgatctac tacacctcca acctgcagtc cggcgtgccc 240 tcccggttct ccggctccgg ctccggcacc gactacaccc tgaccatctc ctccctgcag 300 cccgaggact tcgccaccta ctactgcatg ggccagacca tctcctccta caccttcggc 360 cagggcacca agctggagat caagggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420 ggcggatctg aggtgcagct ggtggagtcc ggcggcggcc tggtgcagcc cggcggctcc 480 ctgcggctgt cctgcgccgc ctccggcttc accttctcca acttcgacat ggcctgggtg 540 cggcaggccc ccggcaaggg cctggtgtgg gtgtcctcca tcaccaccgg cgccgaccac 600 gccatctacg ccgactccgt gaagggccgg ttcaccatct cccgggacaa cgccaagaac 660 accctgtacc tgcagatgaa ctccctgcgg gccgaggaca ccgccgtgta ctactgcgtg 720 cggcacggct actacgacgg ctaccacctg ttcgactact ggggccaggg caccctggtg 780 accgtgtcct ccttcgtgcc ggtcttcctg ccagcgaagc ccaccacgac gccagcgccg 840 cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg 900 tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc 960 tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc 1020 ctttactgca aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga 1080 ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 1140 ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 1200 ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1260 gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1320 gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1380 atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1440 gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctaa 1494 <210> 59 <211> 497 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 59 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 35 40 45 Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gly Gln 100 105 110 Thr Ile Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 130 135 140 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser 145 150 155 160 Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Asp 165 170 175 Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val Ser 180 185 190 Ser Ile Thr Thr Gly Ala Asp His Ala Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys 195 200 205 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 210 215 220 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val 225 230 235 240 Arg His Gly Tyr Tyr Asp Gly Tyr His Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 245 250 255 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala 260 265 270 Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr 275 280 285 Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala 290 295 300 Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile 305 310 315 320 Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser 325 330 335 Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr 340 345 350 Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu 355 360 365 Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu 370 375 380 Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln 385 390 395 400 Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 405 410 415 Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 420 425 430 Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 435 440 445 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 450 455 460 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 465 470 475 480 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 485 490 495 Arg <210> 60 <211> 1497 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 60 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccggatatcc agctgaccca gaccacaagc agcctgagcg cctccctggg cgacagggtg 120 accattagct gcagcgccag ccaggacatc agcaactacc tgaactggta ccagcagaag 180 cccgacggca ccgtggagct cgtgatctac tacacctcca acctgcacag cggcgtgccc 240 agcaggttct ctggcagcgg cagcggcacc gactacagcc tgaccatcgg ctatctggag 300 cccgaggacg tcgccaccta ctactgccag cagtacagga agctgccctg gaccttcggc 360 ggaggctcta agctggagat taagcgtggt ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcgggt 420 ggcggcggat ctgaggtgca gctgcagcag agcggcgccg tgctggccag gcccggagct 480 agcgtgaaga tgagctgcaa gggcagcggc tacaccttca ccaactactg gatgcactgg 540 gtgaaacaga ggcccggcca gggactggag tggatcggcg ccacctacag gggccacagc 600 gacacctact acaaccagaa gttcaagggc aaggccaagc tgaccgccgt gacctcaacc 660 agcaccgcct acatggaact gagcagcctg accaacgagg acagcgccgt ctattactgc 720 accaggggcg ccatctacaa cggctacgac gtgctggaca attggggcca gggaacacta 780 gtgaccgtgt ccagcttcgt gccggtcttc ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg 840 ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag 900 gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat 960 atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 1020 accctttact gcaaacgggg cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg 1080 agaccagtac aaactactca agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa 1140 gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 1200 cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1260 ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct 1320 caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1380 gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 1440 acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgctaa 1497 <210> 61 <211> 498 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 61 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Leu Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln 35 40 45 Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr 50 55 60 Val Glu Leu Val Ile Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Gly Tyr Leu Glu Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 100 105 110 Arg Lys Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Ser Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala 145 150 155 160 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 165 170 175 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 180 185 190 Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe 195 200 205 Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 210 215 220 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Thr Arg Gly Ala Ile Tyr Asn Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly 245 250 255 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro 260 265 270 Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro 275 280 285 Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro 290 295 300 Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 305 310 315 320 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 325 330 335 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu 340 345 350 Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu 355 360 365 Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys 370 375 380 Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 385 390 395 400 Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 405 410 415 Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 420 425 430 Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu 435 440 445 Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 450 455 460 Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser 465 470 475 480 Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro 485 490 495 Pro Arg <210> 62 <211> 1497 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 62 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccggacatcc agatgaccca gagccctagc tcactgagcg ccagcgtggg cgacagggtg 120 accattacct gctccgccag ccaggacatc agcaactacc tgaactggta ccagcagaag 180 cccggcaagg cccccaagct gctgatctac tacacctcca acctgcactc cggcgtgccc 240 agcaggttca gcggaagcgg cagcggcacc gatttcaccc tgaccatctc cagcctgcag 300 cccgaggact tcgccaccta ctactgccag cagtacagga agctcccctg gactttcggc 360 cagggcacca aactggagat caagcgtggt ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcgggt 420 ggcggcggat ctcaggtgca gctggtccag agcggcgccg aagtgaagaa gcccggcagc 480 tccgtgaaag tgagctgcaa ggccagcggc ggcaccttca gcaactactg gatgcactgg 540 gtgaggcagg cccccggaca gggcctggag tggatgggcg ccacctacag gggccacagc 600 gacacctact acaaccagaa gttcaagggc cgggtgacca tcaccgccga caagagcacc 660 agcaccgcct acatggaact gagcagcctc aggagcgagg acaccgctgt gtattactgc 720 gccaggggcg ccatctacga cggctacgac gtgctggaca actggggcca gggcacacta 780 gtgaccgtgt ccagcttcgt gccggtcttc ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg 840 ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag 900 gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat 960 atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 1020 accctttact gcaaacgggg cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg 1080 agaccagtac aaactactca agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa 1140 gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 1200 cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1260 ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct 1320 caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1380 gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 1440 acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgctaa 1497 <210> 63 <211> 498 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 63 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln 35 40 45 Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 100 105 110 Arg Lys Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 145 150 155 160 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr 165 170 175 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 180 185 190 Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe 195 200 205 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 210 215 220 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Ala Arg Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly 245 250 255 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro 260 265 270 Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro 275 280 285 Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro 290 295 300 Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 305 310 315 320 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 325 330 335 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu 340 345 350 Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu 355 360 365 Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys 370 375 380 Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 385 390 395 400 Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 405 410 415 Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 420 425 430 Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu 435 440 445 Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 450 455 460 Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser 465 470 475 480 Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro 485 490 495 Pro Arg

Claims

경쇄 가변 영역 (V_L) 및 중쇄 가변 영역 (V_H)을 포함하는 항-BCMA 항원-결합 영역을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)로서, V_L은 3개의 상보성 결정 영역 (CDR), LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, V_H는 3개의 CDR, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하며,
(a) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열식별번호(SEQ ID NO): 17, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 21에 제시된 아미노산 서열에 대해 약 80% 내지 약 100% 동일한 아미노산 서열을 갖고, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 28에 제시된 아미노산 서열에 대해 약 80% 내지 약 100% 동일한 아미노산 서열을 갖거나;
(b) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 35에 제시된 아미노산 서열에 대해 약 80% 내지 약 100% 동일한 아미노산 서열을 갖고, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열식별번호: 38, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 42에 제시된 아미노산 서열에 대해 약 80% 내지 약 100% 동일한 아미노산 서열을 갖거나; 또는
(c) LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 49에 제시된 아미노산 서열에 대해 약 80% 내지 약 100% 동일한 아미노산 서열을 갖고, HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 서열식별번호: 52, 서열식별번호: 54, 서열식별번호: 56에 제시된 아미노산 서열에 대해 약 80% 내지 약 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인
키메라 항원 수용체 (CAR).
제1항에 있어서, V_L이 V_H의 N-말단에 위치하는 것인 CAR.
제1항에 있어서, V_L 및 V_H가 (a) 각각 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2; (a) 각각 서열식별번호: 3 및 서열식별번호: 4; 또는 (a) 각각 서열식별번호: 5 및 서열식별번호: 6에 제시된 아미노산 서열에 대해 약 80% 내지 약 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인 CAR.
제1항에 있어서, 항-BCMA 항원-결합 영역이 BCMA에 특이적으로 결합하는 단일-쇄 가변 단편 (scFv)인 CAR.
제1항에 있어서, 하기 중 하나 이상을 추가로 포함하는 CAR:
(a) 신호 펩티드,
(b) 힌지 영역,
(c) 막횡단 도메인,
(d) 공동-자극 영역, 및
(e) 세포질 신호전달 도메인.
제5항에 있어서, 공동-자극 영역이 4-1BB (CD137), CD28, OX40, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, CD70, CD134, PD1, Dap10, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), NKG2D, GITR, TLR2 또는 그의 조합의 공동-자극 영역을 포함하는 것인 CAR.
제5항에 있어서, 세포질 신호전달 도메인이 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 CAR.
제5항에 있어서, 힌지 영역이 CD8, CD28, CD137, Ig4 또는 그의 조합의 힌지 영역을 포함하는 것인 CAR.
제5항에 있어서, 막횡단 도메인이 CD8, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 또는 그의 조합의 막횡단 도메인을 포함하는 것인 CAR.
제1항의 CAR을 발현하는 면역 세포.
제10항에 있어서, T 세포 또는 자연 킬러 (NK) 세포인 면역 세포.
제1항의 CAR을 코딩하는 핵산.
제12항의 핵산을 포함하는 벡터.
제10항의 면역 세포를 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
제14항에 있어서, 암이 혈액암인 방법.
제14항에 있어서, 암이 형질-세포 악성종양인 방법.
제14항에 있어서, 암이 BCMA-양성 악성종양인 방법.
제14항에 있어서, 암이 다발성 골수종 (MM) 또는 형질 세포 백혈병인 방법.
제14항에 있어서, 면역 세포가 주입, 주사, 수혈, 인공물이식(implantation) 및/또는 이식(transplantation)에 의해 투여되는 것인 방법.
제14항에 있어서, 면역 세포가 정맥내로, 피하로, 피내로, 결절내로, 종양내로, 골수내로, 근육내로 또는 복강내로 투여되는 것인 방법.
제14항에 있어서, 면역 세포가 정맥내 주입을 통해 투여되는 것인 방법.
제14항에 있어서, 면역 세포가 동종 또는 자가인 방법.
제14항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
제10항의 면역 세포를 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 키메라 항원 수용체 (CAR)는 투여 후 약 28일간 대상체의 혈액에서 약 5.0e+05 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.3e+07 카피/gDNA 범위의 곡선하 면적 (AUC)을 생성하는 것인, 암을 치료하는 방법.
제24항에 있어서, AUC가 투여 후 약 28일간 대상체의 혈액에서 약 5.0e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.0e+07 카피/gDNA 범위인 방법.
제24항에 있어서, AUC가 투여 후 약 28일간 대상체의 혈액에서 약 5.0e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.3e+07 카피/gDNA 범위인 방법.
제24항에 있어서, AUC가 투여 후 약 28일간 대상체의 혈액에서 약 7.0e+06 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.0e+07 카피/gDNA 범위인 방법.
제10항의 면역 세포를 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 키메라 항원 수용체 (CAR)는 대상체의 혈액에서 약 5 x 10⁴ 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.3 x 10⁶ 카피/gDNA 범위의 최대 혈장 농도 (C_max)를 생성하는 것인, 암을 치료하는 방법.
제28항에 있어서, C_max가 투여 후 약 28일간 대상체의 혈액에서 약 5 x 10⁵ 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1.3 x 10⁶ 카피/gDNA의 범위인 방법.
제28항에 있어서, C_max가 투여 후 약 28일간 대상체의 혈액에서 약 7.5 x 10⁵ 카피/μg 게놈 DNA (카피/gDNA) 내지 약 1 x 10⁶ 카피/gDNA의 범위인 방법.
제28항에 있어서, CAR이 약 12일 내지 약 25일 범위의 T_max를 갖는 것인 방법.
제28항에 있어서, CAR이 약 14일 내지 약 20일 범위의 T_max를 갖는 것인 방법.
제28항에 있어서, CAR이 약 6일 내지 약 22일 범위의 T_max를 갖는 것인 방법.
제1항에 있어서, 서열식별번호: 59, 서열식별번호: 61 또는 서열식별번호: 63에 제시된 아미노산 서열에 대해 약 80% 내지 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CAR.