CN118241482A - 戊二醛交联胶原蛋白纤维及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于填充的交联胶原蛋白纤维，由胶原蛋白纤维以戊二醛为交联剂交联而成，所述交联胶原蛋白纤维的戊二醛残留量小于等于10ppm，交联度在48.3％‑75％之间；Tm值＝69.08℃‑75.72℃。本发明还提供上述交联胶原蛋白纤维的制备方法和应用。本发明提供的交联胶原蛋白纤维具备较好的得率，以及耐胶原酶降解能力。本发明通过在制备方法中控制戊二醛浓度，明显减少了所制备交联胶原蛋白纤维填充剂的交联剂残留。
Description
技术领域
本发明涉及一种戊二醛交联胶原蛋白纤维及其制备和应用。
背景技术
随着年龄的增长，体内的胶原蛋白含量逐渐减少，会出现皮肤松弛、皱纹增多、关节疼痛等问题。因此，如何补充胶原蛋白一直备受美容和健康保健领域的关注。高纯度的动物源性胶原蛋白具有良好生物相容性，可以作为组织填充剂使用。然而由于体内胶原酶的存在，临床使用发现天然胶原蛋白在体内存在维持时间3-6个月。因此，为了增加胶原蛋白在体内的保留时间，研究发现了各种交联技术。最早应用于临床除皱的交联胶原蛋白填充剂产品collagen implants和目前已获批上市的双美科技有限公司的交联胶原蛋白产品“肤丽美”均采用戊二醛作为交联剂，在控制戊二醛残留的基础上，体内维持时间6个月。现有填充剂，都是在中性条件制备的胶原蛋白纤维，再进行化学交联(US 4582640)。虽然戊二醛交联能提高胶原蛋白纤维的熔点，提升耐胶原酶降解能力，但是高浓度的戊二醛交联反应不均匀完全，戊二醛的残留会降低填充剂的生物安全性。有研究通过多步骤(CN101648989)，多种交联剂(CN 102924731)反应提高胶原蛋白纤维熔点和交联度，但是随着增加交联反应步骤，生产过程过程繁琐，交联胶原蛋白纤维得率低，生产成本增加，且其他类型交联剂的生物安全性还有待临床实验进一步验证。
发明内容
为了保证生物安全性的同时，增加交联胶原蛋白纤维的熔点和交联度，以及进一步提高交联胶原蛋白纤维在体内的稳定性和保留时间，本发明提供一种戊二醛交联胶原蛋白纤维，可用于填充剂。
作为本发明的一个方面，涉及一种戊二醛交联胶原蛋白纤维，由胶原蛋白纤维以戊二醛为交联剂交联而成；所述胶原蛋白纤维直径在15-80nm之间；所述戊二醛交联胶原蛋白纤维直径在150-200nm之间；所述戊二醛交联胶原蛋白纤维的戊二醛残留量小于等于10ppm，交联度在48.3％-75％之间，优选73.6％-75％之间；Tm值＝69.08℃-75.72℃，优选73.7℃-75.72℃。也就是说，本发明是用戊二醛将直径在15-80nm之间的胶原蛋白纤维进行交联，得到直径150-200nm之间的戊二醛交联胶原蛋白纤维。
作为本发明的另一个方面，涉及一种交联胶原蛋白填充剂，所述填充剂含有上述戊二醛交联胶原蛋白纤维。所述填充剂还可以含有利多卡因。
作为本发明的又一个方面，涉及制备上述交联胶原蛋白填充剂的方法，其特征在于，所述方法包括：使用生理盐水调节蛋白浓度35mg/mL，利多卡因浓度0.2％，匀浆后无菌灌装于1mL规格的针管中，密封。
作为本发明的又一个方面，涉及制备上述戊二醛交联胶原蛋白的方法，包括：
去除免疫原性和病毒的纯化胶原蛋白分子酸性条件下纤维化后进行戊二醛交联，其中，酸性条件pH值5.0-6.0，戊二醛浓度0.02％-0.06％(v:v)。
由本发明实施例可知，本发明在酸性条件下制备得到直径较小的胶原蛋白纤维，经戊二醛交联后，具有良好的热稳定性和耐胶原酶降解能力，可以维持较长的降解周期。这些性能的综合展示，使得本发明所制备的戊二醛交联胶原蛋白纤维可以作为交联胶原蛋白填充剂的成分，配合利多卡因用于整形外科等领域。本发明所制备戊二醛交联胶原蛋白纤维具有较高的产量和较低的交联剂残留，适合大规模生产并保证产品的生物安全性。
具体实施方式
本申请由北京艾佰瑞生物技术有限公司和北京佰仁医疗科技股份有限公司共同参与研发。
发明人在参照现有技术进行实验的过程发现，公开的技术文献倾向于在中性条件下制备胶原蛋白纤维，然后在中性条件下进行戊二醛交联。通常是选择增加化学交联剂的含量和反应时间达到提高交联度的目的，但是无法大幅度改善热稳定性和耐胶原酶降解能力(CN 117180515 A)；或者使用多种化学交联剂与胶原蛋白纤维表面不同基团反应，能提高交联胶原蛋白纤维的交联度和熔点，提升耐胶原酶降解能力，但是反应步骤繁琐，交联胶原蛋白纤维的得率降低(CN 117180515A)，限制了大规模生产。现有技术普遍认为，用于填充的胶原蛋白纤维的最佳制备条件是中性条件，进一步的交联反应需要根据交联剂的反应条件调节pH值，交联剂的pH值影响胶原蛋白纤维的交联度(CN 117180515)。提高戊二醛浓度和pH值可以加速交联反应，但可能造成交联反应不均一。CN102247299表明，低浓度戊二醛与胶原蛋白纤维在pH＝7.0±0.2的最适条件下反应，得到交联胶原蛋白纤维的交联度低，需要通过多次交联和多种交联剂配合使用提高交联效果。CN117618671在对比例中显示，pH＝6条件下获得胶原蛋白纤维后，经过戊二醛(pH＝7)，1，4丁二醇二缩水甘油醚(pH＝11)，碳化二亚胺(pH＝5)三次交联反应后，得到的交联胶原蛋白纤维虽然交联度有明显提升，但是耐酶解程度低。通常认为，酸性条件下形成的胶原蛋白纤维直径较小，不能满足作为填充剂的要求。但经过进一步实验，发明人惊奇地发现，酸性条件下所制备的胶原蛋白纤维可以均匀地与戊二醛反应，形成稳定的共价键，熔点和交联度明显提升，大幅度改善交联胶原蛋白纤维热稳定性和耐胶原酶降解能力。同时操作步骤简单，戊二醛交联胶原蛋白纤维得率高，戊二醛残留量低，经进一步处理后，可用于填充剂。
本申请所称中性条件是指pH值6.5-7.5，本申请所称酸性条件是指pH值5.0-6.0。
本申请所称的胶原蛋白纤维指的是：胶原蛋白分子经磷酸盐、NaCl纤维化反应后的产物，中性条件下反应以直径80-200nm的胶原蛋白纤维为主要成分，酸性条件下反应以直径15-30nm的胶原蛋白纤维为主要成分。
本申请所称的戊二醛交联胶原蛋白纤维指的是：胶原蛋白纤维经过戊二醛交联反应后离心清洗得到的产物。
本发明对所制备的戊二醛交联胶原蛋白纤维进行熔点测试的方法如下：
定量转移戊二醛交联胶原蛋白纤维至差式扫描量热仪的测试铝坩埚中，然后封置于差示扫描量热仪中，氮气气氛下，10K/min升温温度，在升温范围25℃-100℃条件下进行扫描测定。
本发明对所制备的戊二醛交联胶原蛋白纤维进行交联度测试的方法如下：
定量转移戊二醛交联胶原蛋白纤维至微型离心管，配制0.1MpH 8.5NaHCO3溶液和0.5％(v:v)TNBS溶液，取配制好的两种溶液各1mL先后加入戊二醛交联胶原蛋白纤维中，40℃反应2小时。反应结束后，加入3mL，6M HCl，60℃反应1.5小时，反应结束冷却至室温后，加入5mL去离子水混合均匀。取出5mL混合液加入乙醚，震荡后静置分层并取出乙醚。添加新的乙醚重复3次后，待反应液中乙醚完全挥发，取出200μL反应液并加入400μL去离子水，混匀后使用酶标仪测试345nm吸光度值，减去空白组的吸光度值后得到吸光度值A。取等量未交联的胶原蛋白纤维重复上述步骤得到吸光度值B，利用以下公式计算戊二醛交联胶原蛋白纤维交联度：
本发明对所制备的戊二醛交联胶原蛋白纤维进行戊二醛残留测试的方法如下：
分别添加2mL样品检验液或标准溶液于试管中，与2mL 2,4-二硝基苯肼溶液(称取2,4-二硝基苯肼2.4g，加30％高氯酸溶液，溶解成100mL)混合，在37℃恒温水浴锅中加热20min，反应完成后于漩涡混合器上混匀，取1mL反应液与1mL乙腈混合，后用0.45μm膜过滤至色谱瓶中待测。高效液相色谱使用C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：A为5％乙腈水溶液，B为100％乙腈。流速：1.0mL/min。进样量：10μL，柱温：35℃，紫外检测波长：360nm。
本发明对所制备的戊二醛交联胶原蛋白纤维进行体外胶原酶降解测试的方法如下：
定量转移戊二醛交联胶原蛋白纤维至微型离心管，配制50mM pH 7.4TES胶原酶反应缓冲液，再将戊二醛交联胶原蛋白纤维在TES溶液中配制成2-5mg/ml悬浊液，根据戊二醛交联胶原蛋白纤维总量加入胶原酶溶液，添加比例为1.25U/mg，37℃消化24小时将样品离心收集沉淀和上清液，通过酶标仪测定羟脯氨酸含量计算沉淀和上清液中胶原含量。参照McPherson et al.(1986)Journal of Biomedical Material Research，20:79-92.利用以下公式计算戊二醛交联胶原蛋白纤维的体外胶原酶降解率：
实施例1：中性条件制备戊二醛交联胶原蛋白纤维
(1)动物源性组织预处理(本步骤可以参照现有技术实施)：取新鲜猪皮组织刮去表面脂肪后，将其浸泡在丙酮溶液，室温浸泡16h，将处理后的材料用去离子水清洗3-5次除去多余丙酮，再将材料放入2.0M NaOH溶液中，室温，搅拌，16h，处理结束后用去离子水浸泡，清洗材料至中性，以达到去脂和病毒灭活。
(2)提取(本步骤可以参照现有技术实施)：将清洗后的材料放入0.5M乙酸中进行破碎，匀浆。匀浆后的组织按20：1(组织重量/胃蛋白酶重量)的比例进行胶原蛋白分子提取，控制温度18℃，搅拌提取72小时。将提取液离心收集上清，并搅拌均匀后进行澄清过滤，控制浊度小于30，得到胶原蛋白分子粗提液。
(3)纯化(本步骤可以参照现有技术实施)：利用切向流系统进行超滤胶原蛋白分子粗提液，浓缩至3mg/ml后，开始进行20mM乙酸溶液透析，透析20倍体积后得到胶原蛋白分子。
(4)胶原蛋白分子纤维化：取一定体积的纯化后胶原蛋白分子，加入1/10体积的磷酸盐缓冲液(0.2M Na2HPO4：0.2M NaH2PO4＝7:3，v:v)。混匀调pH为7.0，30℃放置6小时得到胶原蛋白纤维。90％胶原蛋白纤维直径在80-200nm之间。
(5)胶原蛋白纤维交联：胶原蛋白纤维中加入戊二醛溶液至终浓度0.005％(v:v)，混匀，30℃继续搅拌过夜。离心收集沉淀，pH7.0磷酸盐缓冲液清洗3次即得戊二醛交联胶原蛋白纤维。70％戊二醛交联胶原蛋白纤维直径在150-200nm之间，并形成网状结构。
(6)灌装：取戊二醛交联胶原蛋白纤维，进行8000rpm，30min离心，得到的沉淀加入生理盐水匀浆后将浓度调节为35mg/ml，再将调节好浓度的戊二醛交联胶原蛋白纤维无菌灌装于1mL规格的针管中，密封，得到戊二醛交联胶原蛋白纤维填充剂。
本实施例获得的戊二醛交联胶原蛋白纤维利用差式扫描量热仪，酶标仪和高效液相色谱检测，Tm值＝67.13℃，交联度33.5％，得率75.6％。体外胶原酶处理后降解率79％，戊二醛残留量1.9ppm。将无菌灌装得到的戊二醛交联胶原蛋白纤维填充剂通过27G针头打入新西兰大白兔背部两侧的皮下，6个月降解完全。
实施例2中性条件制备戊二醛交联胶原蛋白纤维
步骤(1)-(3)同实施例1。
(4)胶原蛋白分子纤维化：取一定体积的纯化后胶原蛋白分子，加入1/10体积的磷酸盐缓冲液(0.2M Na2HPO4：0.2M NaH2PO4＝7:3，v:v)。混匀调pH为7.0。30℃放置6小时得到胶原蛋白纤维。90％胶原蛋白纤维直径在80-200nm之间。
(5)胶原蛋白纤维交联：胶原蛋白纤维中加入戊二醛溶液至终浓度0.01％(v:v)，混匀后30℃继续搅拌过夜。离心收集沉淀，pH7.0磷酸盐缓冲液清洗3次即得戊二醛交联胶原蛋白纤维。80％戊二醛交联胶原蛋白纤维直径在150-200nm之间，并形成网状结构。
步骤(6)同实施例1。
本实施例获得的戊二醛交联胶原蛋白纤维利用差式扫描量热仪，酶标仪和高效液相色谱检测，Tm值＝67.79℃，交联度40.8％，得率80.2％。体外胶原酶处理后降解率68％。戊二醛残留量2.6ppm。将无菌灌装得到的戊二醛交联胶原蛋白纤维填充剂通过27G针头打入新西兰大白兔背部两侧的皮下，6个月降解完全。
实施例3中性条件制备戊二醛交联胶原蛋白纤维
步骤(1)-(3)同实施例1。
(4)胶原蛋白分子纤维化：取一定体积的纯化后胶原蛋白分子，加入1/10体积的磷酸盐缓冲液(0.2M Na2HPO4：0.2M NaH2PO4＝7:3，v:v)。混匀调pH为7.0。30℃放置6小时得到胶原蛋白纤维。90％胶原蛋白纤维直径在80-200nm之间。
(5)胶原蛋白纤维交联：胶原蛋白纤维中加入戊二醛溶液至终浓度0.02％(v:v)，混匀后30℃继续搅拌过夜。离心收集沉淀，pH7.0磷酸盐缓冲液清洗3次即得戊二醛交联胶原蛋白纤维。90％戊二醛交联胶原蛋白纤维直径在150-200nm之间，并形成网状结构。
步骤(6)同实施例1。
本实施例获得的戊二醛交联胶原蛋白纤维利用差式扫描量热仪，酶标仪和高效液相色谱检测，Tm值＝68.15℃，交联度41.2％，得率82.1％。体外胶原酶处理后降解率63％。戊二醛残留量5.8ppm。将无菌灌装得到的戊二醛交联胶原蛋白纤维填充剂通过27G针头打入新西兰大白兔背部两侧的皮下，6个月降解完全。
实施例4中性条件制备戊二醛交联胶原蛋白纤维
步骤(1)-(3)同实施例1。
(4)胶原蛋白分子纤维化：取一定体积的纯化后胶原蛋白分子，加入1/10体积的磷酸盐缓冲液(0.2M Na2HPO4：0.2M NaH2PO4＝7:3，v:v)。混匀调pH为7.0。30℃放置6小时得到胶原蛋白纤维。90％胶原蛋白纤维直径在80-200nm之间。
(5)胶原蛋白纤维交联：胶原蛋白纤维中加入戊二醛溶液至终浓度0.04％(v:v)，混匀后30℃继续搅拌过夜。离心收集沉淀，pH7.0磷酸盐缓冲液清洗3次即得戊二醛交联胶原蛋白纤维。90％戊二醛交联胶原蛋白纤维直径在150-200nm之间，并形成网状结构。
步骤(6)同实施例1。
本实施例获得的戊二醛交联胶原蛋白纤维利用差式扫描量热仪，酶标仪和高效液相色谱检测，Tm值＝68.23℃，交联度42.0％，得率82.9％。体外胶原酶处理后降解率60％。戊二醛残留量12.8ppm。将无菌灌装得到的戊二醛交联胶原蛋白纤维填充剂通过27G针头打入新西兰大白兔背部两侧的皮下，6个月降解完全。
实施例5酸性条件制备戊二醛交联胶原蛋白纤维
步骤(1)-(3)同实施例1。
(4)胶原蛋白分子纤维化：取一定体积的纯化后胶原蛋白分子，加入1/10体积的磷酸盐缓冲液(0.2M Na2HPO4：0.2M NaH2PO4＝7:3，v:v)。混匀调pH为6.0。30℃放置6小时得到胶原蛋白纤维。70％胶原蛋白纤维直径50-80nm。
(5)胶原蛋白纤维交联：胶原蛋白纤维中加入戊二醛溶液至终浓度0.02％(v:v)，混匀后30℃继续搅拌过夜。离心收集沉淀，pH7.0磷酸盐缓冲液清洗3次即得戊二醛交联胶原蛋白纤维。80％戊二醛交联胶原蛋白纤维直径在150-200nm之间，并形成网状结构。
步骤(6)同实施例1。
本实施例获得的戊二醛交联胶原蛋白纤维利用差式扫描量热仪，酶标仪和高效液相色谱检测，Tm值＝69.08℃，交联度48.3％，得率83.5％。体外胶原酶处理后降解率52％。戊二醛残留量5.2ppm。将无菌灌装得到的戊二醛交联胶原蛋白纤维填充剂通过27G针头打入新西兰大白兔背部两侧的皮下，6个月降解完全。
实施例6酸性条件制备戊二醛交联胶原蛋白纤维
步骤(1)-(3)同实施例1。
(4)胶原蛋白分子纤维化：取一定体积的纯化后胶原蛋白分子，加入1/10体积的磷酸盐缓冲液(0.2M Na2HPO4：0.2M NaH2PO4＝7:3，v:v)。混匀调pH为5.0。30℃放置6小时得到胶原蛋白纤维。70％胶原蛋白纤维直径为15-30nm。
(5)胶原蛋白纤维交联：胶原蛋白纤维中加入戊二醛溶液至终浓度0.02％(v:v)，混匀后30℃继续搅拌过夜。离心收集沉淀，pH7.0磷酸盐缓冲液清洗3次即得戊二醛交联胶原蛋白纤维。80％戊二醛交联胶原蛋白纤维直径在150-200nm之间，并形成网状结构。
步骤(6)同实施例1。
本实施例获得的戊二醛交联胶原蛋白纤维利用差式扫描量热仪，酶标仪和高效液相色谱检测，Tm值＝69.20℃，交联度49.2％，得率83.8％。体外胶原酶处理后降解率49％。戊二醛残留量5.1ppm。将无菌灌装得到的戊二醛交联胶原蛋白纤维填充剂通过27G针头打入新西兰大白兔背部两侧的皮下，6个月降解完全。
实施例7酸性条件制备戊二醛交联胶原蛋白纤维
步骤(1)-(3)同实施例1。
(4)胶原蛋白分子纤维化：取一定体积的纯化后胶原蛋白分子，加入1/10体积的磷酸盐缓冲液(0.2M Na2HPO4：0.2M NaH2PO4＝7:3，v:v)。再加入0.15MNaCl，混匀调pH为5.0。30℃放置6小时得到胶原蛋白纤维。90％胶原蛋白纤维直径为15-30nm。
(5)胶原蛋白纤维交联：胶原蛋白纤维中加入戊二醛溶液至终浓度0.02％(v:v)，混匀后30℃继续搅拌过夜。离心收集沉淀，pH7.0磷酸盐缓冲液清洗3次即得戊二醛交联胶原蛋白纤维。90％戊二醛交联胶原蛋白纤维直径在150-200nm之间，并形成网状结构。
步骤(6)同实施例1。
本实施例获得的戊二醛交联胶原蛋白纤维利用差式扫描量热仪，酶标仪和高效液相色谱检测，Tm值＝69.26℃，交联度49.50％，得率89.3％。体外胶原酶处理后降解率48％。戊二醛残留量4.6ppm。将无菌灌装得到的戊二醛交联胶原蛋白纤维填充剂通过27G针头打入新西兰大白兔背部两侧的皮下，6个月降解完全。
实施例8酸性条件制备戊二醛交联胶原蛋白纤维
步骤(1)-(3)同实施例1。
(4)胶原蛋白分子纤维化：取一定体积的纯化后胶原蛋白分子，加入1/10体积的磷酸盐缓冲液(0.2M Na2HPO4：0.2M NaH2PO4＝7:3，v:v)。再加入0.15MNaCl，混匀调pH为5.0。25℃放置6小时得到胶原蛋白纤维。90％胶原蛋白纤维直径为15-30nm。
(5)胶原蛋白纤维交联：胶原蛋白纤维中加入戊二醛溶液至终浓度0.04％(v:v)，混匀后30℃继续搅拌过夜。离心收集沉淀，pH7.0磷酸盐缓冲液清洗3次即得戊二醛交联胶原蛋白纤维。90％戊二醛交联胶原蛋白纤维直径在150-200nm之间，并形成网状结构。
步骤(6)同实施例1。
本实施例获得的戊二醛交联胶原蛋白纤维利用差式扫描量热仪，酶标仪和高效液相色谱检测，Tm值＝73.7℃，交联度73.6％，得率90.2％。体外胶原酶处理后降解率23％。戊二醛残留量6.8ppm。将无菌灌装得到的戊二醛交联胶原蛋白纤维填充剂通过27G针头打入新西兰大白兔背部两侧的皮下，8个月未降解完全。
实施例9酸性条件制备戊二醛交联胶原蛋白纤维
步骤(1)-(3)同实施例1。
(4)胶原蛋白分子纤维化：取一定体积的纯化后胶原蛋白分子，加入1/10体积的磷酸盐缓冲液(0.2M Na2HPO4：0.2M NaH2PO4＝7:3，v:v)。再加入0.15MNaCl，混匀调pH为5.0。25℃放置6小时得到胶原蛋白纤维。90％胶原蛋白纤维直径为15-30nm。
(5)胶原蛋白纤维交联：胶原蛋白纤维中加入戊二醛溶液至终浓度0.06％(v:v)，混匀后30℃继续搅拌过夜。离心收集沉淀，pH7.0磷酸盐缓冲液清洗3次即得戊二醛交联胶原蛋白纤维。90％戊二醛交联胶原蛋白纤维直径在150-200nm之间，并形成网状结构。
步骤(6)同实施例1。
本实施例获得的戊二醛交联胶原蛋白纤维利用差式扫描量热仪，酶标仪和高效液相色谱检测，Tm值＝75.72℃，交联度75.0％，得率90.9％。体外胶原酶处理后降解率17％。戊二醛残留量9.8ppm。将无菌灌装得到的戊二醛交联胶原蛋白纤维填充剂通过27G针头打入新西兰大白兔背部两侧的皮下，8个月未降解完全。
实施例10酸性条件制备戊二醛交联胶原蛋白纤维
步骤(1)-(3)同实施例1。
(4)胶原蛋白分子纤维化：取一定体积的纯化后胶原蛋白分子，加入1/10体积的磷酸盐缓冲液(0.2M Na2HPO4：0.2M NaH2PO4＝7:3，v:v)。再加入0.15MNaCl，混匀调pH为5.0。30℃放置6小时得到胶原蛋白纤维。90％胶原蛋白纤维直径为15-30nm。
(5)胶原蛋白纤维交联：胶原蛋白纤维中加入戊二醛溶液至终浓度0.08％(v:v)，混匀后30℃继续搅拌过夜。离心收集沉淀，pH7.0磷酸盐缓冲液清洗3次即得戊二醛交联胶原蛋白纤维。90％戊二醛交联胶原蛋白纤维直径在150-200nm之间，并形成网状结构。
步骤(6)同实施例1。
本实施例获得的戊二醛交联胶原蛋白纤维利用差式扫描量热仪，酶标仪和高效液相色谱检测，Tm值＝77.26℃，交联度78.5％，得率92.1％。体外胶原酶处理后降解率13％。戊二醛残留量11.7ppm。将无菌灌装得到的戊二醛交联胶原蛋白纤维填充剂通过27G针头打入新西兰大白兔背部两侧的皮下，8个月未降解完全。
以上实施例中，步骤(1)-(3)均相同，主要是对材料进行去脂和灭病毒处理并进行胶原蛋白分子提取及纯化，均可参照现有技术来实现。步骤(4)是对纯化得到的胶原蛋白分子进行纤维化处理，步骤(5)是对胶原蛋白纤维进行戊二醛交联处理步骤，(6)是对戊二醛交联胶原蛋白纤维进行灌装处理。实施例1、2、3和4是在中性条件pH7.0进行纤维化处理，之后分别采用0.005％、0.01％、0.02％或0.04％的戊二醛溶液进行交联处理。实施例5和6分别采用的是酸性条件pH6.0和pH5.0进行纤维化处理，之后采用0.02％戊二醛溶液进行交联处理。实施例7、8、9和10采用的是酸性条件pH5.0进行纤维化处理并在纤维化反应溶液：Na2HPO4和NaH2PO4溶液基础上增加了NaCl，之后分别采用0.02％、0.04％、0.06％和0.08％戊二醛溶液进行交联处理。
所有实施例所得的戊二醛交联胶原蛋白纤维都进行了熔点，交联度，得率，降解率和交联剂残留测量。实施例1所得的戊二醛交联胶原蛋白纤维中，中性条件纤维化处理后进行戊二醛交联的胶原蛋白纤维相比未交联的胶原蛋白纤维，虽然热稳定性提高，但得率和耐胶原酶降解能力低。实施例2-4表明，随着交联剂的浓度增加，交联胶原蛋白纤维的交联度提升，胶原酶降解率降低。但是，实施例4表明，随着交联剂浓度提升到0.04％，戊二醛的残留量会超过药典对体内植入产品的规定限度(10ppm)，且仍然无法制备得到体内维持时间更长的戊二醛交联胶原蛋白纤维。实施例3、5、6显示，随着纤维化反应的pH值降低，戊二醛交联胶原蛋白纤维的交联度和Tm值提升，耐胶原酶降解能力提高。酸性条件下所得胶原蛋白纤维相比于中性条件所得胶原蛋白纤维，纤维直径较小，在15-80nm之间。实施例6和7表明，酸性条件下，在纤维化反应溶液：Na2HPO4和NaH2PO4溶液基础上增加了NaCl，通过调节盐离子，提高了胶原蛋白纤维得率。实施例8-10表明，酸性条件纤维化处理后，提高交联剂浓度至0.04％-0.08％，有利于增加戊二醛交联胶原蛋白纤维交联度，Tm值升高，耐胶原酶降解能力提高。尤其是实施例9，在pH5.0进行纤维化处理并在纤维化反应溶液：Na2HPO4和NaH2PO4溶液基础上增加了NaCl，之后采用0.06％戊二醛溶液进行交联处理效果最好。在保证戊二醛残留量低于中国药典对体内植入产品的规定限度(<10ppm)的同时，Tm值＝75.72℃，热稳定性良好且交联度75％，耐胶原酶降解能力明显提高，可在体内维持8个月以上。对比CN 116444826 A中用PBS缓冲液和氢氧化钠溶液调节胶原蛋白分子的pH值为6.0-9.0，得到胶原蛋白水凝胶后于EDC/NHS交联液中发生化学交联反应，本发明用磷酸盐缓冲液和NaCl溶液调节胶原蛋白分子的pH值为5.0-6.0，得到胶原蛋白纤维后进行戊二醛交联反应，提高交联度的同时，反应均匀，戊二醛交联胶原蛋白纤维得率高。
中性条件制备的胶原蛋白纤维由于直径较大，在80-200nm之间，制备的戊二醛交联胶原蛋白纤维，交联度在33.5％-41.2％之间，Tm值＝67.13℃-68.23℃。虽然一定程度上提高了胶原蛋白纤维作为填充剂的维持时间，但耐胶原酶降能力仍无法达到预期。为了增加交联剂与氨基酸的作用位点，本发明在酸性条件下制备得到直径较小的胶原蛋白纤维，在15-80nm之间，可以充分均匀地与交联剂发生反应，从而提高交联度和熔点。本发明制备的戊二醛交联胶原蛋白纤维，交联度在48.3％-75％之间，优选73.6％-75％，提高了耐胶原酶降解能力；熔点Tm值＝69.08℃-75.72℃，优选73.7℃-75.72℃，具有良好的热稳定性，可以对应到较长的降解周期。这些性能的综合展示，使得本发明所制备的戊二醛交联胶原蛋白纤维可以作为填充剂配合利多卡因用于整形外科等领域，而且具有较高的产量和较低的交联剂残留，适合大规模生产并保证产品的生物安全性。
Claims (10)
1.一种戊二醛交联胶原蛋白纤维，由胶原蛋白纤维以戊二醛为交联剂交联而成，其特征在于，所述胶原蛋白纤维直径在15-80nm之间；所述戊二醛交联胶原蛋白纤维直径在150-200nm之间；所述戊二醛交联胶原蛋白纤维的戊二醛残留量小于等于10ppm，交联度在48.3％-75％之间；Tm值＝69.08℃-75.72℃。
2.权利要求1所述戊二醛交联胶原蛋白纤维，其特征在于，所述交联胶原蛋白纤维的戊二醛残留量小于等于10ppm，交联度在73.6％-75％之间；Tm值＝73.7℃-75.72℃。
3.权利要求2所述戊二醛交联胶原蛋白纤维，其特征在于，所述交联胶原蛋白纤维的戊二醛残留量小于等于10ppm，交联度75％；Tm值＝75.72℃。
4.制备权利要求1-3任一所述戊二醛交联胶原蛋白纤维的方法，其特征在于，包括：猪皮组织经预处理、提取、纯化，得到的去除免疫原性和病毒的胶原蛋白分子在酸性条件下纤维化后，进行戊二醛交联。
5.权利要求4所述方法，其特征在于，所述酸性条件pH值5.0-6.0。
6.权利要求4所述方法，其特征在于，所述胶原蛋白纤维中加入戊二醛溶液至终浓度为0.02％-0.06％。
7.权利要求4所述方法，其特征在于，所述酸性条件为磷酸盐缓冲液，所述胶原蛋白分子为动物源胶原蛋白分子。
8.一种交联胶原蛋白填充剂，其特征在于，所述填充剂包含权利要求1-3任一所述戊二醛交联胶原蛋白纤维。
9.权利要求8所述交联胶原蛋白填充剂，其特征在于，所述填充剂还含有利多卡因。
10.制备权利要求9所述交联胶原蛋白填充剂的方法，其特征在于，所述方法包括：使用生理盐水调节蛋白浓度35mg/mL，利多卡因浓度0.2％，匀浆后无菌灌装于1mL规格的针管中，密封。
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