CN118240932A - 基于分子标志物的扩张型心肌病早期筛查产品及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测血清样本中分子标志物表达水平的试剂在制备扩张型心肌病早期筛查产品中的应用，所述分子标志物为血清中的环状RNA，命名为novel_circ_0021043，其核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示；所述novel_circ_0021043的接头核苷酸序列如SEQ.ID.No.2所示；本发明采用novel_circ_0021043作为扩张型心肌病早期筛查的分子标志物，通过对血清中novel_circ_0021043的检测，从而对扩张型心肌病早期患者进行筛查，有效提高扩张型心肌病早期检测的阳性率，对后期该疾病防治以及治疗具有重要指导意义。
Description
技术领域
本发明具体涉及基于分子标志物的扩张型心肌病早期筛查产品及其应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是一类以左心室或双心室扩大为特征，可导致进行性收缩功能障碍的一类心肌病。扩张型心肌病常伴有心律失常，是心肌病中最常见的类型。扩张型心肌病带来的心力衰竭，严重影响了患者的生活质量，学习能力和劳动能力。
扩张型心肌病早期筛查的完善与普及，有助于提高扩张型心肌病患者的生存率及生活质量。目前扩张型心肌病的临床诊断主要依靠影像学诊断，包括超声心动图检查，核磁共振成像，冠状动脉造影等，这些影像学检查手段往往费用较高，而且使用影像学诊断出扩张型心肌病的患者，往往已发展为晚期扩张型心肌病。因此，需要一种灵敏可靠的检测技术手段以帮助早期筛查和干预。现有技术中公开了关于心肌病诊断的产品大多涉及mRNA，申请号为CN202111668525.9的专利公开了用于早期诊断肥厚型心肌病的包含检测分子标志物SFRP1和IER3的试剂的相关产品；申请号为CN202210919292.3的专利公开了一种用于扩张型心肌病辅助诊断的生物标志物及其应用，公开的标志物为miR-126-3p、miR-126-5p、miR-26a-5p、miR-30c-5p中的至少一种，通过检测人血清中miR-126-3p、miR-126-5p、miR-26a-5p、miR-30c-5p的水平，可有效区分扩张型心肌病患者与健康对照，可用于DCM的辅助诊断。
环状RNA(circRNA)是一种新型的内源性非编码RNA(ncRNA)，具有共价闭合环状结构的内源性RNA分子，主要是由pre-mRNA通过反向剪切加工产生的。环状RNA丰富且稳定表达于生物体各种细胞中，难以被RNA酶或核酸外切酶降解，相较于线性mRNA相比，具有更高的稳定性，并且一些circRNA具有高度的物种间保守性。
circRNA在不同的组织和细胞中通常具有特定的表达谱，并参与到疾病的不同发育过程，多种人类疾病中存在差异性表达的circRNA能够在血液中被检测到，这些circRNA在疾病诊断方面具有巨大的潜力，有望成为新型的临床分子诊断标志物。
发明内容
本发明的目的在于提供基于分子标志物的扩张型心肌病早期筛查产品及其应用，通过对血清中circRNA的检测，从而对扩张型心肌病早期患者进行筛查，有效提高扩张型心肌病早期检测的阳性率。
为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供检测血清样本中分子标志物表达水平的试剂在制备诊断扩张型心肌病的产品中的应用，所述分子标志物为血清中的环状RNA，命名为novel_circ_0021043，其核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示。
进一步地，所述novel_circ_0021043的接头核苷酸序列如SEQ.ID.No.2所示。
进一步地，所述产品通过Northern blotting、qRT-PCR、荧光原位杂交或地高辛标记的寡核苷酸探针方法检测待测个体的血清、血浆或者血浆外泌体中的分子标志物novel_circ_0021043的表达水平。
本发明还提供一种基于分子标志物早期筛查扩张型心肌病的产品，包括检测血清样本中分子标志物表达水平的试剂，所述分子标志物为环状RNA，命名为novel_circ_0021043，其核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示。
进一步地，所述产品还包括核酸探针，核酸探针能与所述分子标志物novel_circ_0021043或其引物相结合。
本发明还提供用于诊断扩张型心肌病早期阶段的体外筛查方法，利用上述产品进行筛查，分析待测个体血清样品，确定分子标志物novel_circ_0021043的表达水平，核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示，其中，分子标志物novel_circ_0021043的表达水平升高且高于健康人群则被视为存在早期阶段的扩张型心肌病患者。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明采用环状RNAnovel_circ_0021043作为分子标志物以及基于novel_circ_0021043表达水平检测的试剂制备的产品用于扩张型心肌病的早期筛查，能够有效提高扩张型心肌病早期检测的阳性率，对后期该疾病防治以及治疗具有重要指导意义；
2、本发明中利用环状RNA novel_circ_0021043作为分子标志物，通过对血清中circRNA的检测，在扩张型心肌病早期血清样本中novel_circ_0021043的表达水平变化，可以快速、特异和灵敏地筛查扩张型心肌病，从而降低扩张型心肌病的死亡率。
附图说明
图1为实施例1中扩张型心肌病模型小鼠心脏总体形态图；
图2为实施例1中扩张型心肌病模型小鼠心脏H&E染色图；
图3为实施例1中扩张型心肌病模型小鼠超声心动图；
图4为实施例1中扩张型心肌病模型小鼠心脏样本中novel_circ_0021043的表达图；
图5为实施例1中扩张型心肌病模型小鼠血清样本中novel_circ_0021043的表达图；
图6为实施例1中环状RNA novel_circ_0021043在小鼠和人上的同源性对比图。
具体实施方式
下面结合较佳实施例和附图对本发明做进一步的说明，在本发明中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值；对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；
下述实施例中小鼠均饲养在实验动物中心SPF级环境中；
实施例1扩张型心肌病模型小鼠的心脏组织和血清样本中的环状RNA novel_circ_0021043的鉴定与检测
(1)建立扩张型心肌病模型小鼠
本实施例中使用心肌特异性敲除Rbm24基因的小鼠作为扩张型心肌病模型小鼠(模型组)，同时使用Rbm24没有敲除的小鼠为对照组，在同样的条件下对模型小鼠和对照组小鼠进行饲养，在出生后第5天，对照组和模型小鼠没有区别，但第23天，模型小鼠心脏扩大(如图1所示)，同时使用H&E染色技术对该小鼠的心脏切片进行形态学观察，发现模型小鼠和对照组在出生后第5天时，心脏没有变化，但在出生后第23天心室壁变薄、心腔变大(如图2所示)，表现出明显的扩张型心肌病的特征，同时使用超声心动图检查出生后第23天的模型小鼠心脏，同样发现模型小鼠心室壁变薄、心腔变大(如图3所示)；
(2)扩张型心肌病模型小鼠早期的circRNA的表达变化检测
分别从对照组与早期模型组(出生后第5天)中采集心脏样本，安乐死处死小鼠，开胸取心脏，剪取的心脏放入无RNA酶的1.5mL离心管中，用提前经过高压蒸汽灭菌的剪刀和镊子将心脏组织剪碎，加入1mL Trizol，加入提前高压灭菌的研磨钢珠，调试研磨仪参数，60Hz，研磨3次，每次20秒，用样品研磨仪开始进行组织研磨；研磨完成后，将组织置于摇床上，室温快摇15分钟，使其充分裂解组织；加入与Trizol体积相比1/5的氯仿(1mL Trizol加200uL氯仿)，剧烈震荡离心管，使其混合物由清亮粉红色变为浑浊粉红色，竖直放置在冰上20分钟，待其静止分层；提前预冷4℃离心机，12000rpm，离心15分钟，使混合物充分分层，最上层为实验需要的上清液，吸取上清液至新的无RNA酶离心管中；提前冷却异丙醇，在上清液中加入与转移的上清液等体积的异丙醇，上下颠倒使混合物充分混匀，-20℃冰箱静置20分钟；取出离心管，4℃，12000rpm，离心10分钟，在离心管底部可见部分白色沉淀物质，丢弃上清液；加入1mL提前配置好冷却的75％乙醇，轻微吹打洗涤白色沉淀物，或上下颠倒几次离心管，再次4℃，12000rpm离心5分钟，小心吸取上清液丢弃，之后放置在通风橱约5分钟，使其多余液体干燥，或放置65℃烘箱中烘烤2分钟；取出离心管，根据白色沉淀物质的大小，加入适当的冷却的DEPC水，充分吹打，使白色沉淀均匀溶解；测定RNA浓度及纯度；将2μg的总RNA加入8U RNase R，并在37℃孵育15min，从而消化线性RNA，最后在80℃中孵育10min使RNase R失活；使用带有gDNA去除的cDNA合成试剂盒(TransGen Biotech)合成cDNA；使用相应引物(以RNA novel_circ_0021043的结构序列为模板，设计引物F：AGATCAGTGGTGGCTTCGG；R：AGCCCTTCACGTTGAGCAT)对circRNA进行表达验证；qPCR反应程序如下：95℃预变性5min、95℃变性30s、58℃退火30s和72℃延伸30s，35-40个循环，72℃5min，4℃终止；配制8％TBE胶(8％TBE胶配方：3.2mL ddH2O、1.6mL 30％丙烯酰胺、1.2mL5X TBE、0.1mL 10％APS、5uL TEMED)，0.5×TBE缓冲液，电压130V，25min，电泳结束后修剪凝胶，浸泡在提前配制好加有溴化乙锭的TBE缓冲液中20min，之后拍照记录并保存。
结果如图4所示，与对照组小鼠相比，模型组小鼠novel_circ_0021043表达明显上调，表明首次发现的novel_circ_0021043有作为扩张型心肌病早期筛查生物标志物的潜力。
同时，取扩张型心肌病模型小鼠血清500μL，加入500μL Trizol试剂，上下颠倒离心管数次，室温静置15min，提取总RNA，进一步利用反转录试剂盒，以随机引物Random 6-mer对RNA进行反转录合成cDNA；利用反向引物(以RNA novel_circ_0021043的结构序列为模板，设计引物F：AGATCAGTGGTGGCTTCGG；R：AGCCCTTCACGTTGAGCAT)进行PCR扩增novel_circ_0021043接头部位的序列；将扩增产物进行8％PAGE胶电泳检测；如图5所示，在扩张型心肌病小鼠血清中检测出了novel_circ_0021043，并且该circRNA在扩张型心肌病模型小鼠血清中高表达，而对照组小鼠(对照组)表达量较少。
针对以上RNA novel_circ_0021043的接头序列进行人(图6hsa)、鼠(图6mmu)同源性比对，进一步发现该circRNA在人与小鼠中，接头序列只有5个位点不同，说明其在人和小鼠中高度保守，充分说明novel_circ_0021043可以作为诊断扩张型心肌病的分子标志物。
实施例2
本实施例提供一种基于分子标志物早期筛查扩张型心脏病的产品，在本实施例中扩张型心肌病早期筛查产品可以为检测试剂、检测芯片和检测试剂盒，产品中还包括能与分子标志物novel_circ_0021043相结合的核酸探针；
其中，分子标志物novel_circ_0021043的核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示，接头核苷酸序列如SEQ.ID.No.2所示；
所述产品通过Northern blotting、qRT-PCR、荧光原位杂交或地高辛标记的寡核苷酸探针方法检测待测个体的血清、血浆或者血浆外泌体中的分子标志物novel_circ_0021043的表达水平；上述novel_circ_0021043的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得环状RNA的体液；
通过研究中发现novel_circ_0021043在扩张型心肌病心脏样本中高表达，并且该circRNA novel_circ_0021043在扩张型心肌病小鼠血清同样高表达，因此，采用novel_circ_0021043可以制备早期扩张型心肌病的筛查产品。
利用所述筛查产品检测受试者样本中novel_circ_0021043的表达水平，与健康人群相比，受试者样本中的novel_circ_0021043表达水平升高，则筛查出受试者为扩张型心肌病患者。
实施例3
本实施提供用于诊断扩张型心肌病早期阶段的体外筛查方法，利用实施例2中记载的产品进行筛查，分析待测个体即患者的血清样品，利用Northern blotting、qRT-PCR、荧光原位杂交或地高辛标记的寡核苷酸探针方法等确定分子标志物novel_circ_0021043(核苷酸序列如SEQ.ID.No.1)的表达水平，分子标志物novel_circ_0021043的表达水平升高且高于健康人群则被视为存在早期阶段的扩张型心肌病患者。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (6)
1.检测血清样本中分子标志物表达水平的试剂在制备扩张型心肌病早期筛查产品中的应用，其特征在于，所述分子标志物为血清中的环状RNA，命名为novel_circ_0021043，其核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述novel_circ_0021043的接头核苷酸序列如SEQ.ID.No.2所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述筛查产品通过Northern blotting、qRT-PCR、荧光原位杂交或地高辛标记的寡核苷酸探针方法检测待测个体的血清、血浆或者血浆外泌体中的分子标志物novel_circ_0021043的表达水平。
4.一种基于分子标志物早期筛查扩张型心肌病的产品，其特征在于，包括检测血清样本中分子标志物表达水平的试剂，所述分子标志物为环状RNA，命名为novel_circ_0021043，其核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示。
5.根据权利要求4所述的基于分子标志物早期筛查扩张型心肌病的产品，其特征在于：还包括核酸探针，核酸探针能与所述分子标志物novel_circ_0021043相结合。
6.用于诊断扩张型心肌病早期阶段的体外筛查方法，其特征在于：利用如权利要求4或5所述的产品进行筛查，分析待测个体血清样品，以半定量或定量的方式确定分子标志物novel_circ_0021043的表达水平，核苷酸序列如SEQ.ID.No.1所示，其中，分子标志物novel_circ_0021043的表达水平升高且高于健康人群则被视为存在早期阶段的扩张型心肌病患者。
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