CN118207265A - 一种制备d-泛酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种制备D‑泛酸的方法，所述方法包含以下步骤：在发酵培养重组细胞来制备D‑泛酸的过程中，当发酵罐的底糖耗尽时，添加补料培养基到发酵罐中，至检测到的OUR值为80‑100mmol/L/h。该以OUR结合RQ反馈控制补料的方法可以最大限度地获得更高的产物浓度和转化率(产物对于葡萄糖转化率)，并有效控制副产物如乙酸、乳酸的产生。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种制备D-泛酸的方法。
背景技术
D-泛酸，又称维生素B5，为水溶性B族维生素。D-泛酸参与碳水化合物、蛋白质和脂肪的代谢作用，广泛应用于饲料添加剂、食品添加剂、化妆品和医药保健品。化学合成法合成D-泛酸时需要以DL-泛酰内酯为原料，DL-泛酰内酯在化学合成过程中需要使用氢氰酸，会产生对环境有严重污染的含氰废水。而且化学合成法步骤多，涉及多个中间体和拆分工艺。
实际上，D-泛酸在原核生物、真核生物如大肠杆菌、酵母菌甚至是植物细胞中都能够通过自身的酶促反应合成。因此，可以通过合成生物学手段改造微生物菌种生产D-泛酸。但是在微生物发酵生产D-泛酸的过程中，产物合成主代谢途径仅会产生二氧化碳(CO2)，并不会消耗氧气，所以发酵过程呼吸商(RQ)越高，转化率越高。而只有葡萄糖流向旁支途径如三羧酸循环(TCA循环)才会消耗氧气。因此如果过程中通过控制补料速率来将摄氧率(Oxygen Uptake Rate，OUR)控制在合理范围内，则可以使得更多的糖流向产物合成，从而显著提高发酵过程D-泛酸的产率和转化率，同时能够降低某些副产物如乙酸、乳酸的形成。目前现有技术中还缺乏高效便捷生成D-泛酸的发酵方法。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种制备D-泛酸的方法，具体为通过控制OUR提高D-泛酸发酵过程产率和转化率(对糖)的方法。
本发明的技术方案为，一种制备D-泛酸的方法，所述方法包括：
在发酵培养重组细胞来制备D-泛酸的过程中，当发酵罐的底糖耗尽时，添加补料培养基到发酵罐中，至检测到的OUR值为80-100mmol/L/h。
在一些较佳的实施例中，所述补料培养基包含40-60％质量浓度的葡萄糖和0.5-5％质量浓度的有机氮源。
优选地，所述有机氮源的质量浓度为0.5-1％，和/或，所述有机氮源为酵母浸粉或者蛋白胨。
更优选地，所述补料培养基包括：55％质量浓度的葡萄糖，0.5％质量浓度的酵母浸粉。
在一些具体的实施例中，在发酵培养过程中当检测的OUR值低于预设值时，向发酵罐中添加补料培养基直至检测的OUR值达到或大于预设值，此时停止补料。待OUR再次降至预设值以下时，再开始补料。过程中同时实时检测RQ值。所述OUR预设值的范围为80-100mmol/L/h，所述补料培养基包含40-60％质量浓度的葡萄糖和0.5-5％质量浓度的有机氮源。
在一些具体的实施例中，通过在发酵培养过程中当检测出的OUR值低于预设值时，向发酵罐中添加包含40-60％质量浓度的葡萄糖和0.5-1％的有机氮源，直至检测出的OUR值高于设定值。此发酵方法能够较好地避免发酵过程中补糖过多导致供氧不足糖积累而使得厌氧副产物乙酸和乳酸的产生，厌氧副产物的产生不仅会影响菌体生长，还会影响产物D-泛酸的正常生产。因此，通过该方法，能够提高D-泛酸的生产效率，并提高过程的转化率。
在另一些较佳的实施例中，所述发酵培养使用的培养基包括：葡萄糖0.1-1％，蛋白胨0.5-1％，酵母浸粉0.5-1％，磷酸二氢钾0.2-0.5％，氯化铵0.5-1％，七水硫酸镁0.05-0.1％，四水氯化锰0.005-0.01％，无水氯化铁0.005-0.01％。
优选地，所述培养基包括：葡萄糖0.5％，蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.5％，磷酸二氢钾0.3％，氯化铵0.6％，七水硫酸镁0.07％，四水氯化锰0.006％，无水氯化铁0.01％。
在另一些较佳的实施例中，所述发酵培养的条件选自以下一种或多种：
(i)温度30-37℃；
(ii)pH 6.5-7.0；
(iii)通风比0.8-1.2VVM；
(iv)底糖消耗完前将DO控制在30％；底糖消耗完通过OUR来控制补糖时，将DO控制在0％以上。
优选地，所述发酵培养的条件选自以下一种或多种：
(i)温度35℃，
(ii)pH 6.8，
(iii)通风比1.0VVM；
(iv)所述DO通过调整转速来控制。
在另一些较佳的实施例中，所述重组细胞在进行发酵培养前还包括种子培养的步骤，所述种子培养的培养基为LB培养基。
优选地，所述种子培养后，将种子培养基接入发酵罐的接种比例为5-10。
更优选地，所述种子培养的条件选自以下一种或多种：
培养温度为30-35℃；
震荡培养优选在摇床中200-250ppm例如220rpm；
培养时间为3-5h。
在一些具体的实施例中，所述OUR值为90mmol/L/h。
在一些具体的实施例中，D-泛酸发酵所用菌株为重组大肠杆菌，所述重组菌为自主构建的W3110型大肠杆菌，命名为PB17菌株，菌株基因型为:ΔtdcDE::Ptrc-BsalsS/ΔpoxB::Ptrc-BsalsS/ilvC::Ptrc-milvC/ΔadhE::Ptrc-milvC/ΔpflB::Ptrc-ilvD/ilvE::milvE/ΔavtA::Ptrc-glyA/ΔldhA::Ptrc-panE/coaA::mcoaA
R106A/ΔlacI::Ptrc-lpd:/ΔackA::T7-CgpanB-CgpanC/ΔyfbQ::phag-eT7R/ΔycgH::pbolA-eT7R/ΔydeU::Ptrc-bamA。
在一些具体的实施例中，所述发酵培养方法为将产D-泛酸的基因工程菌(PB17)摇瓶种子接入发酵培养基，在合适的培养条件下进行培养，过程中通过质谱仪实时检测发酵尾气中氧气含量，并计算实时的OUR值。培养至底料中的葡萄糖消耗完成后，溶解氧浓度(DO)反弹后开始进行连续补糖操作。首先，随着补糖的进行和菌体浓度的增加，OUR会随着发酵过程的增加而增加，当检测到的OUR值大于设定值时则停止补料。随后进入OUR控制补料状态，补料方式为当发酵培养过程中检测出的OUR值低于预设值时，向发酵罐中添加包含40-60％质量浓度的葡萄糖和0.5-1％的有机氮源，直至检测出的OUR值高于设定值。并同时实时检测发酵过程中的RQ值。
进一步地，所述摇瓶种子培养方法为：LB培养基，培养温度为30-35℃，在摇床中220rpm下培养3-5h后接入发酵培养基。
进一步地，所述摇瓶种子接入发酵罐的接种比例为5-10％。
进一步地，所述发酵培养基组分及其含量为：葡萄糖0.1-1％，蛋白胨0.5-1％，酵母浸粉0.5-1％，磷酸二氢钾0.2-0.5％，氯化铵0.5-1％，七水硫酸镁0.05-0.1％，四水氯化锰0.005-0.01％，无水氯化铁0.005-0.01％，氨水调pH至7.0,121℃灭菌30min。
进一步地，所述发酵合适培养条件为温度35-37℃，pH用氨水控制在6.5-7.0，通风比0.8-1.0VVM，底糖消耗完前即DO没有反弹前过程DO通过转速控制在30％。在DO反弹后即根据OUR来控制补糖时，通过转速将DO控制在0％以上。
进一步地，所述补料培养基成分及其含量为：葡萄糖40-60％(g/g)，酵母浸粉或者蛋白胨0.5-1.0％，121℃灭菌30min。
进一步地，所述OUR的预设值范围为80-100mmol/L/h。
进一步地，所述OUR、RQ实时检测与计算方法如下：
发酵过程中尾气各组分含量由Extrel质谱仪测定。OUR、CER以及RQ值根据如下公式(1-1)、(1-2)以及(1-3)计算：
RQ＝CER/OUR (1-3)
其中Fin是通气速率，V是发酵液体积；Cinertin、和/>分别是进气中氮气、氧气和二氧化碳的比例；/>和/>分别为发酵罐出气中氧气和二氧化碳的比例，Pin是进气的压力，tin是进气的温度，h是进气的湿度。
进一步地，发酵产物D-泛酸，主要副产物乙酸和乳酸的检测方法为高效液相色谱法：
设备与分析柱型号
设备：岛津LC-20AD
色谱柱：ODS-35um 4.6*250mm(UP)
流动相
流动相A：0.006M/L磷酸氢二钾(用磷酸调pH至3，而后用0.45μm水系滤膜抽滤后超声20min脱气后再使用)
流动相B：甲醇(色谱级，超声20min脱气后再使用)
检测条件
HPLC检测条件如下：
检测时间：35min
检测波长：210nm
柱温箱温度：35℃
泵模式：低压等度梯度，总流速为1.2ml/min，流动相A：流动相B为9:1
进样量：20μL
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明提供的方法在降低副产物乙酸和乳酸的积累的情况下，可以有效提高D-泛酸发酵中的产物浓度和转化率，产物浓度至少可达到66g/kg，最高可达到71g/kg。
附图说明
图1为OUR控制90mmol/L/h时的发酵结果液相检测图(乳酸4.6min，乙酸5.2min以及D-泛酸14.8min)。
图2为OUR控制120mmol/L/h时的发酵结果液相检测图(乳酸4.6min，乙酸5.2min以及D-泛酸14.8min)。
图3为OUR不控制时的发酵结果液相检测图(乳酸4.6min，乙酸5.2min以及D-泛酸14.8min)。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
制备实施例1重组大肠杆菌的制备
步骤1、增强乙酰乳酸合成酶基因BsalsS,同时敲除tdcDE操纵子
以Escherichia coli W3110为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术如图1(Yu Jiang et al.2015Multigene Editing in the Escherichia coli Genome viathe CRISPR-Cas9System.Applied Environmental Microbiology.81:2506-2514)，将来源于pTrc99A的Ptrc启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)，和来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168(来自ATCC，编号23857)的乙酰乳酸合成酶基因alsS(核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示)，融合成新的表达元件，并插入染色体上丙酸激酶编码基因tdcD和甲酸乙酰转移酶编码基因tdcE位点，具体步骤如下：
(1)构建pTarget-tdcE质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-tdcE-sF/pTarget-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-tdcE质粒。
(2)构建donor DNA片段：以E.coli W3110基因组为模版，tdcD-UF与tdcD-ptrc-UR为引物扩增获得donor DNA的上游部分(tdcD-U)，BsalsS-tdcE-DF与tdcD-DR为引物扩增获得
donor DNA的下游部分(tdcE-D)，根据蛋白序列合成BsalsS并插入到pTrc99A质粒的NcoI/EcoRI酶切位点，以pTrc99A-BsalsS为模板使用引物ptrc-F和BsalsS-R扩增获得ptrc-BsalsS片段，胶回收纯化PCR片段得到tdcD-U、ptrc-BsalsS和tdcE-D；使用融合PCR的方法将三片段连接在一起，通过测序验证得到donor DNA片段。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入E.coli W3110中，转接单克隆到含0.05mg/L卡那霉素的LB试管中，30℃过夜培养；再以体积浓度1％的接种量接种到含50mLLB培养基的250mL摇瓶中，并加入500μl 1mol/L的L-阿拉伯糖，150rpm、30℃培养至OD6000.4～0.6；4000rpm，4℃离心10min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见(Molecular Cloning:ALaboratory Manual，3ed Edition，99-102)的描述。
(4)取200ngpTarget-panC质粒和1ug donor DNA片段与100μl电击感受态细胞混合，转入预冷的2mm电击杯中，冰浴1min左右，用电穿孔仪(MicroPluserTM,BIO-RAD)进行电击转化，电击完成后立即加入1mL LB培养基并立即轻柔吸出，转移到1.5mL离心管中，30℃复苏2-3h后涂布含0.05mg/L卡那霉素和0.05mg/L壮观霉素的LB平板，37℃倒置培养12-16h，以引物对tdcD-UUF/BsalsS-R和ptrc-F/tdcE-DDR分别进行菌落PCR验证，若能分别成功克隆出一段3000bp和3000bp左右的片段，则证明是W3110，ΔtdcDE::Ptrc-BsalsS阳性菌落，命名为PB1。
(5)质粒消除：挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L卡那霉素的LB试管，30℃培养过夜，次日菌液划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L壮观霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L壮观霉素的LB平板的单菌落其pTarget-tdcE质粒成功消除，挑取pTarget-tdcE质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划线于LB平板，37℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L卡那霉素的LB平板，不能在含0.05mg/L卡那霉素的LB平板的单菌落其pCas质粒成功消除，最终得到无质粒PB1菌株，选取多个转化子并甘油保种。
步骤2、增强乙酰乳酸合成酶基因BsalsS，同时敲除丙酮酸氧化酶基因poxB
以步骤1获得的菌株PB1作为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(同步骤1)，将来源于pTrc99A的ptrc启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)，和来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168(来自ATCC，编号23857)的乙酰乳酸合成酶基因alsS(核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示)，融合成新的表达元件，并插入染色体上丙酮酸氧化酶基因poxB位点，具体步骤如下：
(1)构建pTarget-poxB质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-poxB-sF/pTarget-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-poxB质粒。
(2)构建donor DNA片段：以E.coli W3110基因组为模版，poxB-UF、poxB-ptrc-UR、BsalsS-poxB-DF与poxB-DR为引物，以pTrc99A-BsalsS为模板使用引物ptrc-F和BsalsS-R扩增获得ptrc-BsalsS片段、构建步骤同步骤1(2)，融合poxB-U、ptrc-BsalsS和poxB-D三片段，通过测序验证得到donor DNA片段。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入步骤1获得的PB1感受态中，PB1感受态制备方法同步骤1(3)。
(4)构建得到PB1,ΔpoxB::Ptrc-BsalsS阳性菌落，构建方法同步骤1(4)，以引物对poxB-UUF/BsalsS-R和ptrc-F/poxB-DDR分别进行菌落PCR验证，若能分别成功克隆出一段3000bp和3000bp左右的片段，则证明是PB1,ΔpoxB::Ptrc-BsalsS阳性菌落，命名为PB2。
(5)质粒消除：实施方法同步骤1(5)，获得无质粒PB2菌株,选取多个转化子并甘油保种。
步骤3、乙酰羟基酸还原异构酶基因ilvC的突变及增强
以步骤2获得的菌株作为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(同步骤1)，将来源于pTrc99A的Ptrc启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)，和来自Escherichia coli W3110的乙酰羟基酸还原异构酶基因ilvC(核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示)，融合成新的表达元件并引入突变位点，原位表达，具体步骤如下：
(1)构建pTarget-milvC质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-milvC-sF/pTarget-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-milvC质粒。
(2)构建donor DNA片段：以E.coli W3110基因组为模版，ilvC-UF、ilvC-UR、ilvC-DF、ilvC-MR、ilvC-MF与ilvC-DR为引物，以pTrc99A为模板使用引物ptrc-F和ptrc-R扩增获得ptrc片段、构建步骤同步骤1(2)，融合ilvC-U、ptrc、ilvC-D1和ilvC-D2四片段，通过测序验证得到donor DNA片段。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入步骤2获得的PB2感受态中，PB2感受态制备方法同步骤1(3)。
(4)构建得到PB2,Ptrc-milvC阳性菌落，构建方法同步骤1(4)，以引物对ilvC-UUF/ptrc-R和milvC-yzF/ilvC-DDR分别进行菌落PCR验证，若能分别成功克隆出一段1200bp和800bp左右的片段，则证明是PB2,Ptrc-milvC阳性菌落，命名为PB3。
(5)质粒消除：实施方法同步骤1(5)，获得无质粒PB3菌株，选取多个转化子并甘油保种。
步骤4、增强突变型乙酰羟基酸还原异构酶基因milvC，同时敲除醇脱氢酶基因adhE
以步骤3获得的菌株作为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(同步骤1)，将来源于pTrc99A的Ptrc启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)，和来自PB3的突变型乙酰羟基酸还原异构酶基因milvC(核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示)，融合成新的表达元件，并插入染色体上醇脱氢酶基因adhE位点，具体步骤如下：
(1)构建pTarget-adhE质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-adhE-sF/pTarget-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-adhE质粒。
(2)构建donor DNA片段：以E.coli W3110基因组为模版，adhE-UF、adhE-ptrc-UR、ilvC-adhE-DF与adhE-DR为引物，以PB3为模板使用引物ptrc-F和ilvC-R扩增获得ptrc-milvC片段、构建步骤同步骤1(2)，融合adhE-U、ptrc-milvC和adhE-D三片段，通过测序验证得到donor DNA片段。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入步骤3获得的PB3感受态中，PB3感受态制备方法同步骤1(3)。
(4)构建得到PB3,ΔadhE::Ptrc-milvC阳性菌落，构建方法同步骤1(4)，以引物对adhE-UUF/ilvC-R和ptrc-F/adhE-DDR分别进行菌落PCR验证，若能分别成功克隆出一段2600bp和2700左右的片段，则证明是PB3,ΔadhE::Ptrc-milvC阳性菌落，命名为PB4。
(5)质粒消除：实施方法同步骤1(5)，获得无质粒PB4菌株，选取多个转化子并甘油保种。
步骤5、增强二羟酸脱水酶基因ilvD，同时敲除丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB
以步骤4获得的菌株作为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(同步骤1)，将来源于pTrc99A的Ptrc启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)，和来自Escherichia coli W3110的二羟酸脱水酶基因ilvD(核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示)，融合成新的表达元件，并插入染色体上丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB位点，具体步骤如下：
(1)构建pTarget-pflB质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-pflB-sF/pTarget-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-pflB质粒。
(2)构建donor DNA片段：以E.coli W3110基因组为模版，pflB-UF、pflB-ptrc-UR、ilvD-F、ilvD-R、ilvD-pflB-DF与pflB-DR为引物，以pTrc99A为模板使用引物ptrc-F和ptrc-R扩增获得ptrc片段、构建步骤同步骤1(2)，融合pflB-U、ptrc、ilvD和pflB-D四片段，通过测序验证得到donor DNA片段。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入步骤4获得的PB4感受态中，PB4感受态制备方法同步骤1(3)。
(4)构建得到PB4,ΔpflB::Ptrc-ilvD阳性菌落，构建方法同步骤1(4)，以引物对pflB-UUF/ilvD-R和ptrc-F/pflB-DDR分别进行菌落PCR验证，若能分别成功克隆出一段3000bp和3100bp左右的片段，则证明是PB4,ΔpflB::Ptrc-ilvD阳性菌落，命名为PB5。
(5)质粒消除：实施方法同步骤1(5)，获得无质粒PB5菌株，选取多个转化子并甘油保种。
步骤6、弱化支链氨基酸氨基转移酶基因ilvE
以步骤5获得的菌株作为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(同步骤1)，通过将ilvE基因的ATG突变为GTG实现表达弱化，来自Escherichia coli W3110的支链氨基酸氨基转移酶基因ilvE(核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示)，突变后的milvE的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示，具体步骤如下：
(1)构建pTarget-milvE质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-milvE-sF/pTarget-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-milvE质粒。
(2)构建donor DNA片段：以E.coli W3110基因组为模版，ilvE-UF、ilvE-mUR、ilvE-mDF与ilvE-DR为引物，扩增获得ilvE-mU和ilvE-mD片段、构建步骤同步骤1(2)，融合ilvE-mU和ilvE-mD二片段，通过测序验证得到donor DNA片段。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入步骤5获得的PB5感受态中，PB5感受态制备方法同步骤1(3)。
(4)构建得到PB5,milvE阳性菌落，构建方法同步骤1(4)，以引物对ilvE-myzF/ilvE-DDR进行菌落PCR验证，若能成功克隆出一段1000bp左右的片段，则证明是PB5,milvE阳性菌落，命名为PB6。
(5)质粒消除：实施方法同步骤1(5)，获得无质粒PB6菌株，选取多个转化子并甘油保种。
步骤7、增强甘氨酸羟甲基转移酶基因glyA，同时敲除缬氨酸-丙酮酸转氨酶基因avtA
以步骤6获得的菌株作为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(同步骤1)，将来源于pTrc99A的Ptrc启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)，和来自Escherichia coli W3110的甘氨酸羟甲基转移酶基因glyA(核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示)，融合成新的表达元件，并插入染色体上缬氨酸-丙酮酸转氨酶基因avtA位点，具体步骤如下：
(1)构建pTarget-avtA质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-avtA-sF/pTarget-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-avtA质粒。
(2)构建donor DNA片段：以E.coli W3110基因组为模版，avtA-UF、avtA-ptrc-UR、glyA-F、glyA-R、glyA-avtA-DF与avtA-DR为引物，以pTrc99A为模板使用引物ptrc-F和ptrc-R扩增获得ptrc片段、构建步骤同步骤1(2)，融合avtA-U、ptrc、glyA和avtA-D四片段，通过测序验证得到donor DNA片段。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入步骤6获得的PB6感受态中，PB6感受态制备方法同步骤1(3)。
(4)构建得到PB6,ΔavtA::Ptrc-glyA阳性菌落，构建方法同步骤1(4)，以引物对avtA-UUF/glyA-R和ptrc-F/avtA-DDR分别进行菌落PCR验证，若能分别成功克隆出一段2500bp和2500bp左右的片段，则证明是PB6,ΔavtA::Ptrc-glyA阳性菌落，命名为PB7。
(5)质粒消除：实施方法同步骤1(5)，获得无质粒PB7菌株，选取多个转化子并甘油保种。
步骤8增强2-脱氢泛酸酯-2-还原酶基因panE，同时敲除乳酸脱氢酶基因ldhA
以步骤7获得的菌株作为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(同步骤1)，将来源于pTrc99A的Ptrc启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)，和来自Escherichia coli W3110的2-脱氢泛酸酯-2-还原酶基因panE(核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示)，融合成新的表达元件，并插入染色体上乳酸脱氢酶基因ldhA位点，具体步骤如下：
(1)构建pTarget-ldhA质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-ldhA-sF/pTarget-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-ldhA质粒。
(2)构建donor DNA片段：以E.coli W3110基因组为模版，ldhA-UF、ldhA-ptrc-UR、panE-F、panE-R、panE-ldhA-DF与ldhA-DR为引物，以pTrc99A为模板使用引物ptrc-F和ptrc-R扩增获得ptrc片段、构建步骤同步骤1(2)，融合ldhA-U、ptrc、panE和ldhA-D四片段，通过测序验证得到donor DNA片段。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入步骤7获得的PB7感受态中，PB7感受态制备方法同步骤1(3)。
(4)构建得到PB7,ΔldhA::Ptrc-panE阳性菌落，构建方法同步骤1(4)，以引物对ldhA-UUF/panE-R和ptrc-F/ldhA-DDR分别进行菌落PCR验证，若能分别成功克隆出一段2200bp和2200bp左右的片段，则证明是PB7,ΔldhA::Ptrc-panE阳性菌落，命名为PB8。(5)质粒消除：实施方法同步骤1(5)，获得无质粒PB8菌株，选取多个转化子并甘油保种。
步骤9弱化泛酸激酶基因coaA
以步骤8获得的菌株作为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(同步骤1)，通过将coaA基因的106位氨基酸R突变为A实现表达弱化，来自Escherichia coliW3110的泛酸激酶基因coaA(核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示)，突变后mcoaA的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示，具体步骤如下：
(1)构建pTarget-mcoaA质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-mcoaA-sF/pTarget-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-mcoaA质粒。(2)构建donor DNA片段：以E.coli W3110基因组为模版，coaA-UF、coaA-mUR、coaA-mDF与coaA-DR为引物，扩增获得coaA-mU和coaA-mD片段、构建步骤同步骤1(2)，融合coaA-mU和coaA-mD二片段，通过测序验证得到donor DNA片段。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入步骤8获得的PB8感受态中，PB8感受态制备方法同步骤1(3)。
(4)构建得到PB8,mcoaA R106A阳性菌落，构建方法同步骤1(4)，以引物对McoaA-yzF/coaA-DDR进行菌落PCR验证，若能成功克隆出一段1000bp左右的片段，则证明是PB8,mcoaAR106A阳性菌落，命名为PB9。
(5)质粒消除：实施方法同步骤1(5)，获得无质粒PB9菌株，选取多个转化子并甘油保种。
步骤10增强硫辛酰胺脱氢酶基因lpd，同时敲除阻遏蛋白编码基因lacI
以步骤9获得的菌株作为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(同步骤1)，将来源于pTrc99A的Ptrc启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)，和来自Escherichia coli W3110的硫辛酰胺脱氢酶基因lpd(核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示)，融合成新的表达元件，并插入染色体上阻遏蛋白编码基因lacI位点，具体步骤如下：
(1)构建pTarget-lacI质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-lacI-sF/pTarget-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-lacI质粒。
(2)构建donor DNA片段：以E.coli W3110基因组为模版，lacI-UF、lacI-ptrc-UR、lpd-F、lpd-R、lpd-lacI-DF与lacI-DR为引物，以pTrc99A为模板使用引物ptrc-F和ptrc-R扩增获得ptrc片段、构建步骤同步骤1(2)，融合lacI-U、ptrc、lpd和lacI-D四片段，通过测序验证得到donor DNA片段。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入步骤9获得的PB9感受态中，PB9感受态制备方法同步骤1(3)。
(4)构建得到PB9,ΔlacI::Ptrc-lpd阳性菌落，构建方法同步骤1(4)，以引物对lacI-UUF/lpd-R和ptrc-F/lacI-DDR分别进行菌落PCR验证，若能分别成功克隆出一段2700bp和2700bp左右的片段，则证明是PB9,ΔlacI::Ptrc-lpd阳性菌落，命名为PB10。
(5)质粒消除：实施方法同步骤1(5)，获得无质粒PB10菌株，选取多个转化子并甘油保种。
步骤11增强基因CgpanB和CgpanC，同时敲除乙酸激酶基因ackA
以步骤10获得的菌株作为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(同步骤1)，将来源于pTrc99A的Ptrc启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)或来源于pET30A的T7启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)，和来自谷氨酸棒状杆菌的α-酮异戊酸羟甲基转移酶基因CgpanB(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)及泛酸合成酶基因CgpanC(核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)，融合成新的表达元件ptrc-CgpanB-CgpanC和T7-CgpanB-CgpanC，使用不同的启动子串联表达CgpanB和CgpanC，并插入染色体上乙酸激酶基因ackA位点，具体步骤如下：
(1)构建pTarget-ackA质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-ackA-sF/pTarget-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-ackA质粒。
(2)构建donor DNA(ptrc)片段：以E.coli W3110基因组为模版，ackA-UF、ackA-ptrc-UR、CgpanC-ackA-DF与ackA-DR为引物，以pTrc99A-CgpanB-CgpanC为模板使用引物ptrc-F和CgpanC-R扩增获得ptrc-CgpanB-CgpanC片段、构建步骤同步骤1(2)，融合ackA-U、ptrc-CgpanB-CgpanC、和ackA-D三片段，通过测序验证得到donor DNA(ptrc)片段。(3)构建donor DNA(T7)片段：以E.coli W3110基因组为模版，ackA-UF、ackA-T7-UR、CgpanC-ackA-DF与ackA-DR为引物，以pTrc99A-CgpanB-CgpanC为模板使用引物T7-F和CgpanC-R扩增获得T7-CgpanB-CgpanC片段、构建步骤同步骤1(2)，融合ackA-U、T7-CgpanB-CgpanC、和ackA-D三片段，通过测序验证得到donor DNA(T7)片段。
(4)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入步骤10获得的PB10感受态中，PB10感受态制备方法同步骤1(3)。
(5)构建得到PB10,ΔackA::Ptrc-CgpanB-CgpanC阳性菌落，构建方法同步骤1(4)，以引物对ackA-UUF/CgpanC-R和ptrc-F/ackA-DDR分别进行菌落PCR验证，若能分别成功克隆出一段2900bp和2900bp左右的片段，则证明是PB10,ΔackA::Ptrc-CgpanB-CgpanC阳性菌落，命名为PB11。
(6)构建得到PB10,ΔackA::T7-CgpanB-CgpanC阳性菌落，构建方法同步骤1(4)，以引物对ackA-UUF/CgpanC-R和T7-CgpanB-F/ackA-DDR分别进行菌落PCR验证，若能分别成功克隆出一段2600bp和2600bp左右的片段，则证明是PB10,ΔackA::T7-CgpanB-CgpanC阳性菌落，命名为PB12。
(7)质粒消除：实施方法同步骤1(5)，获得无质粒PB11和PB12菌株，选取多个转化子并甘油保种。
步骤12表达T7 RNA聚合酶基因，同时敲除谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶基因yfbQ
以大肠杆菌BL21(DE3)的基因组为模板，引物对eT7-F/R，通过PCR扩增获得T7 RNA聚合酶基因片段eT7R(SEQ ID NO:4)；以E.coli W3110基因组为模版，EcoRI-yfbQ-UF与yfbQ-eT7-UR为引物扩增获得donor DNA的上游部分(EcoRI-yfbQ-U)，eT7-yfbQ-DF与EcoRI-yfbQ-DR为引物扩增获得donor DNA的下游部分(EcoRI-yfbQ-D)，将所扩增的EcoRI-yfbQ-U、T7 RNA聚合酶基因片段、EcoRI-yfbQ-D和EcoRI单酶切后的pkk223-3载体进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将其三者进行重组连接。重组连接后的混合物转化至E.coli DH5α(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，获得多个单菌落。通过菌落PCR和测序验证正确后，抽提质粒即得到pkk223-3-yfbQ-U-eT7-D质粒，该质粒包含了T7 RNA聚合酶序列编辑yfbQ所需的上下游同源臂序列。
以E.coli W3110基因组为模版，pbolA-F与pbolA-R为引物扩增获得PbolA启动子，phag-F与phag-R为引物扩增获得Phag启动子(SEQ ID NO:1)，以pTrc99A为模板使用引物ptrc-F2和ptrc-R2扩增获得ptrc2片段，胶回收纯化PCR片段后；使用多片段一步法克隆试剂盒将其与XbaI单酶切后的pkk223-3-yfbQ-U-eT7-D载体进行重组连接。重组连接后的混合物转化至E.coli DH5α(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，获得多个单菌落。通过菌落PCR和测序验证正确后，抽提质粒即得到pkk223-3-yfbQ-U-ptrc-eT7-D、pkk223-3-yfbQ-U-pbolA-eT7-D和pkk223-3-yfbQ-U-phag-eT7-D。
以步骤11获得的菌株作为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(同步骤1)，使用上述3种不同启动子表达eT7R，并插入染色体上谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶基因yfbQ位点，具体步骤如下：
(1)构建pTarget-yfbQ质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-yfbQ-sF/pTarget-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-yfbQ质粒。
(2)构建donor DNA片段：以pkk223-3-yfbQ-U-ptrc-eT7-D、pkk223-3-yfbQ-U-pbolA-eT7-D和pkk223-3-yfbQ-U-phag-eT7-D为模版，使用引物yfbQ-UF和yfbQ-DR为引物，扩增获得yfbQ-U-ptrc-eT7-D、yfbQ-U-pbolA-eT7-D和pkk223-3-yfbQ-U-phag-eT7-D片段，通过测序验证得到三种donor DNA片段。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入步骤11获得的PB12感受态中，PB12感受态制备方法同步骤1(3)。
(4)构建得到PB12,ΔyfbQ::Ptrc-eT7R阳性菌落，构建方法同步骤1(4)，以引物对yfbQ-UUF/eT7R-R和ptrc-F/yfbQ-DDR分别进行菌落PCR验证，若能分别成功克隆出一段3900bp和3900bp左右的片段，则证明是PB12,ΔyfbQ::Ptrc-eT7R阳性菌落，命名为PB13。
(5)构建得到PB12,ΔyfbQ::PbolA-eT7R阳性菌落，构建方法同步骤1(4)，以引物对yfbQ-UUF/eT7R-R和pbolA-F/yfbQ-DDR分别进行菌落PCR验证，若能分别成功克隆出一段3900bp和3900bp左右的片段，则证明是PB12,ΔyfbQ::PbolA-eT7R阳性菌落，命名为PB14。
(6)构建得到PB12,ΔyfbQ::Phag-eT7R阳性菌落，构建方法同步骤1(4)，以引物对yfbQ-UUF/eT7R-R和phag-F/yfbQ-DDR分别进行菌落PCR验证，若能分别成功克隆出一段3900bp和3900bp左右的片段，则证明是PB12,ΔyfbQ::Phag-eT7R阳性菌落，命名为PB15。
(7)质粒消除：实施方法同步骤1(5)，获得无质粒PB13、PB14和PB15菌株，选取多个转化子并甘油保种。
步骤13表达T7 RNA聚合酶基因，同时敲除假基因ycgH
以步骤12获得的菌株PB15作为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(同步骤1)，使用上述PbolA启动子(SEQ ID NO:2)表达eT7R，并插入染色体上假基因ycgH位点，具体步骤如下：
(1)构建pTarget-ycgH质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-ycgH-sF/pTarget-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-ycgH质粒。
(2)构建donor DNA片段：以步骤12中获得的质粒pkk223-3-yfbQ-U-pbolA-eT7-D为模板，引物对pbolA-F2/eT7-R，通过PCR扩增获得pbolA-eT7R片段；以E.coli W3110基因组为模版，ycgH-UF与ycgH-pbolA-UR为引物扩增获得donor DNA的上游部分(ycgH-U)，eT7-ycgH-DF与ycgH-DR为引物扩增获得donor DNA的下游部分(ycgH-D)，将所扩增的ycgH-U、pbolA-eT7R片段和ycgH-D进行融合，使用引物ycgH-UF和ycgH-DR为引物，扩增获得ycgH-U-pbolA-eT7-D片段，通过测序验证得到正确donor DNA片段。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入步骤12获得的PB15感受态中，PB15感受态制备方法同步骤1(3)。
(4)构建得到PB15,ΔycgH::PbolA-eT7R阳性菌落，构建方法同步骤1(4)，以引物对ycgH-UUF/eT7R-R和pbolA-F/ycgH-DDR分别进行菌落PCR验证，若能分别成功克隆出一段3800bp和3900bp左右的片段，则证明是PB15,ΔycgH::PbolA-eT7R阳性菌落，命名为PB16。
(5)质粒消除：实施方法同步骤1(5)，获得无质粒PB16菌株，选取多个转化子并甘油保种。
步骤14检测菌株D-泛酸产量
选择出发株W3110作为对照菌株、重组株PB11、PB13、PB14、PB15和PB16，分别涂布不含抗生素的种子培养基(含有1wt％葡萄糖,0.1wt％KH2PO4,0.1wt％MgSO4,1.6wt％(NH4)2SO4,0.001wt％FeSO4,0.001wt％MnSO4,0.2％酵母提取物)，于37℃培养过夜。然后分别各挑取3个单克隆，利用5ml种子培养基(含有1wt％葡萄糖,0.1wt％KH2PO4,0.1wt％MgSO4,1.6wt％(NH4)2SO4,0.001wt％FeSO4,0.001wt％MnSO4,0.2wt％酵母提取物)进行培养，37℃、225rpm过夜。然后将每个菌株再分别转接至50ml新鲜的发酵培养基10g/L葡萄糖,0.7％Ca(HCO3)2，0.1％KH2PO4，0.1％MgSO4,1.6％(NH4)2SO4,0.001％FeSO4,0.001％MnSO4,0.2％酵母提取物,并添加0.3％β-丙氨酸)中于37℃、170rpm继续培养24h，取样测定每个菌株的OD600，并利用液相检测并计算各培养基中的D-泛酸的含量(结果参见表3)。
如表3所示，与对照菌株W3110相比，不同重组菌株的OD600，差异不明显，使用对数期或稳定期特异性启动子的菌株D-泛酸产量显著高于诱导型启动子的菌株，其中PB16菌株D-泛酸产量最高，最后积累了3.68g/kg以上的D-泛酸。
步骤15构建表达bamA、bamB、acrB或mdtF，并敲除ydeU的菌株
以步骤13获得的菌株作为出发菌株，使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术(同步骤1)，将来源于pTrc99A的Ptrc启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)及T1T2终止子(核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示)，和来自Escherichia coli W3110的外膜相关蛋白基因bamA(核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示)、bamB(核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示)或透性酶基因acrB(核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示)、mdtF(核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示)，融合成新的表达元件，并插入染色体上假基因ydeU位点，具体步骤如下：
以E.coli MG1655基因组为模版，bamA-F和bamA-R为引物扩增获得bamA基因片段，bamB-F和bamB-R为引物扩增获得bamB基因片段，acrB-F和acrB-R为引物扩增获得acrB基因片段，mdtF-F和mdtF-R为引物扩增获得mdtF基因片段，胶回收纯化PCR片段后；使用多片段一步法克隆试剂盒将其与NcoI和EcoRI双酶切后的pTrc99A载体进行重组连接。重组连接后的混合物转化至E.coli DH5α(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，获得多个单菌落。通过菌落PCR和测序验证正确后，抽提质粒即得到pTrc99A-bamA、pTrc99A-bamB、pTrc99A-acrB和pTrc99A-mdtF。
(1)构建pTarget-ycgH质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-ycgH-sF/pTarget-R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α，壮观酶素平板筛选，测序验证获得正确的pTarget-ycgH质粒。
(2)构建donor DNA片段：以上述质粒为模板，引物对ptrc-F和T1T2-R扩增获得相应的表达元件；以E.coli W3110基因组为模版，ydeU-UF与ydeU-ptrc-UR为引物扩增获得donor DNA的上游部分(ydeU-U)，T1T2-ydeU-DF与ydeU-DR为引物扩增获得donor DNA的下游部分(ydeU-D)，将所扩增的ydeU-U、不同基因表达元件片段、ydeU-D三片段融合，使用引物ydeU-UF和ydeU-DR为引物，扩增获得ydeU-U-ptrc-bamA–D、ydeU-U-ptrc-bamB-D、ydeU-U-ptrc-acrB-D和ydeU-U-ptrc-mdtF-D片段，通过测序验证得到正确donor DNA片段。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入步骤13获得的PB16感受态中，PB16感受态制备方法同步骤1(3)。
(4)构建得到PB16,ΔydeU::Ptrc-bamA阳性菌落，构建方法同步骤1(4)，以引物对ydeU-UUF/ptrc-R和bamA-F/ydeU-DDR分别进行菌落PCR验证，若能分别成功克隆出一段2300bp和2000bp左右的片段，则证明是PB16,ΔydeU::Ptrc-bamA阳性菌落，命名为PB17。
(5)构建得到PB16,ΔydeU::Ptrc-bamB阳性菌落，构建方法同步骤1(4)，以引物对ydeU-UUF/ptrc-R和bamB-F/ydeU-DDR分别进行菌落PCR验证，若能分别成功克隆出一段2400bp和2100bp左右的片段，则证明是PB16,ΔydeU::Ptrc-bamB阳性菌落，命名为PB18。
(6)构建得到PB16,ΔydeU::Ptrc-acrB阳性菌落，构建方法同步骤1(4)，以引物对ydeU-UUF/ptrc-R和acrB-F/ydeU-DDR分别进行菌落PCR验证，若能分别成功克隆出一段2700bp和2400bp左右的片段，则证明是PB16,ΔydeU::Ptrc-acrB阳性菌落，PB19。
(7)构建得到PB16,ΔydeU::Ptrc-mdtF阳性菌落，构建方法同步骤1(4)，以引物对ydeU-UUF/ptrc-R和mdtF-F/ydeU-DDR分别进行菌落PCR验证，若能分别成功克隆出一段2700bp和2400bp左右的片段，则证明是PB16,ΔydeU::Ptrc-mdtF阳性菌落，命名为PB20。
(8)质粒消除：实施方法同步骤1(5)，获得无质粒PB17、PB18、PB19、PB20菌株，选取多个转化子并甘油保种。
步骤16检测菌株D-泛酸产量
选择出发株W3110和PB16作为对照菌株、新的重组株PB17、PB18、PB19和PB20，分别涂布不含抗生素的种子培养基(含有1wt％葡萄糖,0.1wt％KH2PO4,0.1wt％MgSO4,1.6wt％(NH4)2SO4,0.001wt％FeSO4,0.001wt％MnSO4,0.2wt％酵母提取物)，于37℃培养过夜。然后分别各挑取3个单克隆，利用5ml种子培养基(含有1wt％葡萄糖,0.1wt％KH2PO4,0.1wt％MgSO4,1.6wt％(NH4)2SO4,0.001wt％FeSO4,0.001wt％MnSO4,0.2％酵母提取物)进行培养，37℃、225rpm过夜。然后将每个菌株再分别转接至50ml新鲜的发酵培养基(10g/L葡萄糖,0.7wt％Ca(HCO3)2，0.1wt％KH2PO4，0.1wt％MgSO4,1.6wt％(NH4)2SO4,0.001wt％FeSO4,0.001wt％MnSO4,0.2wt％酵母提取物的培养基，另添加0.3％β-丙氨酸)中于37℃、170rpm继续培养24h，利用液相检测并计算各培养基中的D-泛酸的含量(结果参见表4)。
如表4所示，表达促进D-泛酸排出蛋白的菌株PB17、PB18、PB19和PB20重组菌株与对照菌株PB16相比，生成的D-泛酸的产量有进一步的提高，其中PB17菌株D-泛酸产量最高，最后积累了4.37g/kg以上的D-泛酸。
表1本发明使用的菌株和质粒
/>
表2基因工程菌D-泛酸产量比较1
| D-泛酸(g/kg) | OD600 | |
| W3110 | 0 | 8.63±0.05 |
| PB11 | 2.03±0.05 | 8.56±0.08 |
| PB13 | 2.42±0.07 | 8.33±0.05 |
| PB14 | 2.73±0.06 | 8.25±0.04 |
| PB15 | 2.95±0.03 | 8.04±0.06 |
| PB16 | 3.68±0.02 | 7.93±0.01 |
表3基因工程菌D-泛酸产量比较2
| D-泛酸(g/L) | OD600 | |
| W3110 | 0 | 8.63±0.05 |
| PB16 | 3.68±0.08 | 7.96±0.09 |
| PB17 | 4.52±0.05 | 7.59±0.01 |
| PB18 | 4.21±0.06 | 7.76±0.03 |
| PB19 | 4.12±0.02 | 7.88±0.02 |
| PB20 | 3.99±0.07 | 8.01±0.05 |
实施例1
将含有LB培养基的摇瓶中接入含有产D-泛酸的重组大肠杆菌(即PB17，:ΔtdcDE::Ptrc-BsalsS/ΔpoxB::Ptrc-BsalsS/ilvC::Ptrc-milvC/ΔadhE::Ptrc-milvC/ΔpflB::Ptrc-ilvD/ilvE::milvE/ΔavtA::Ptrc-glyA/ΔldhA::Ptrc-panE/coaA::mcoaAR106A/ΔlacI::Ptrc-lpd:/ΔackA::T7-CgpanB-CgpanC/ΔyfbQ::phag-eT7R/ΔycgH::pbolA-eT7R/ΔydeU::Ptrc-bamA)，在摇床中30℃培养5h后以10％接种比接入发酵罐。发酵罐中的发酵培养基组分及其含量为：葡萄糖0.5％，蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.5％，磷酸二氢钾0.3％，氯化铵0.6％，七水硫酸镁0.07％，四水氯化锰0.006％，无水氯化铁0.01％。发酵罐中的发酵培养条件为温度35℃，pH用氨水控制在6.8，通风比1.0VVM。在发酵过程中实时检测尾气中各组分含量并计算OUR和RQ值。将OUR的预设值设置为80mmol/L/h。当发酵培养基中的底糖耗尽，DO反弹时开始连续补料，将OUR控制在80mmol/L/h左右。补料培养基成分及其含量为：葡萄糖55％(g/g)，酵母浸粉0.5％。在发酵48h后取样检测发酵液中D-泛酸、乙酸和乳酸含量，结果如表4所示。
所述OUR、RQ实时检测与计算方法如下：
发酵过程中尾气各组分含量由Extrel质谱仪测定。OUR、CER以及RQ值根据如下公式(1-1)、(1-2)以及(1-3)计算：
RQ＝CER/OUR (1-3)
其中Fin是通气速率，V是发酵液体积；Cinertin、和/>分别是进气中氮气、氧气和二氧化碳的比例；/>和/>分别为发酵罐出气中氧气和二氧化碳的比例，Pin是进气的压力，tin是进气的温度，h是进气的湿度。
实施例2
本实施例与实施例1不同点在于将OUR的预设值设置为90mmol/L/h，其余的发酵方法与实施例1相同。即在发酵培养基中的底糖耗尽，DO反弹时开始连续补料，将OUR控制在90mmol/L/h左右。同样地，在发酵48h后取样检测发酵液中D-泛酸、乙酸和乳酸含量，结果如表4和图1所示。
实施例3
本实施例与实施例1不同点在于将OUR的预设值设置为100mmol/L/h，其余的发酵方法与实施例1以相同。即在发酵培养基中的底糖耗尽，DO反弹时开始连续补料，OUR控制在100mmol/L/h左右。同样地，在发酵48h后取样检测发酵液中D-泛酸、乙酸和乳酸含量，结果如表4所示。
对比例1
本实施例与实施例1不同点在于将OUR的预设值设置为60mmol/L/h，其余的发酵方法与实施例1相同。即在发酵培养基中的底糖耗尽，DO反弹时开始连续补料，将OUR控制在60mmol/L/h左右。同样地，在发酵48h后取样检测发酵液中D-泛酸、乙酸和乳酸含量，结果如表4所示。
对比例2
本实施例与实施例1不同点在于将OUR的预设值设置为120mmol/L/h，其余的发酵方法与实施例1相同。即在发酵培养基中的底糖耗尽，DO反弹时开始连续补料，将OUR值控制在120mmol/L/h左右。同样地，在发酵48h后取样检测发酵液中D-泛酸、乙酸和乳酸含量，结果如表4和图2所示。
对比例3
本实施例与实施例1不同点在于将OUR的预设值设置为150mmol/L/h，其余的发酵方法与实施例1相同。即在发酵培养基中的底糖耗尽，DO反弹时开始连续补料，将OUR控制在150mmol/L/h左右。同样地，在发酵48h后取样检测发酵液中D-泛酸、乙酸和乳酸含量，结果如表1所示。
对比例4
本实施例与实施例1不同点在于发酵培养基中的底糖耗尽，其余的发酵方法与实施例1相同，DO反弹时开始连续补料，不通过控制OUR值的方式控制补糖。而是在连续补糖开始后不间断补糖，使得发酵液中的糖浓度控制在1-3g/L。在发酵48h后取样检测发酵液中D-泛酸、乙酸和乳酸含量，结果如表4和图3所示。同时，通过实施检测发酵过程OUR值，发现此工艺时最高OUR可达250mmol/L/h以上。
表4
序列:
SEQ ID NO:1:Phag启动子序列，不包含rbs区域
GCGATTTCCTTTTATCTTTCGACACGTAAAACGAATACCGGGGTTATCGGTCTGAATTGCGCAAAGTTTACGTTTAATTGTTTTTTTTAATAGCGGGAATAAGGGGCAGAGAAAAGAGTATTTCGGCGACTAACAAAAAATGGCTGTTTTTGAAAAAAATTCTAAAGGTTGTTTTACGACAGACGATAACAGGGTTGACGGCGATTGAGCCGACGGGTGGAAACCCAATACGTAATCAACGACTT
SEQ ID NO:2:PbolA启动子序列，不包含rbs区域
TGTTTGGTAAAAATTCCCGCCATCATAACATTGCCAACGGCGAGGGGAAGTGGGTAAGGCATGTAAATTCATCATGTTGACGAAATAATCGCCCCTGGTAAAAGAAACACTGATGCGAGGCCTGTGTTTCAATCTTTAAATCAGTAAACTTCATACGCTTGACGGAAAAACCAGGACGAAACCTAAATATTTGTTGTTAAGCTGCAATGGAAACGGTAAAAGCGGCTAGTATTTAAAG
SEQ ID NO:3:用于表达T7RNA聚合酶基因的rbs序列
CGCCTTGAAGAAAGGAGGTATAATCCGAGCTC
SEQ ID NO:4:T7RNA聚合酶基因序列
ATGAACACGATTAACATCGCTAAGAACGACTTCTCTGACATCGAACTGGCTGCTATCCCGTTCAACACTCTGGCTGACCATTACGGTGAGCGTTTAGCTCGCGAACAGTTGGCCCTTGAGCATGAGTCTTACGAGATGGGTGAAGCACGCTTCCGCAAGATGTTTGAGCGTCAACTTAAAGCTGGTGAGGTTGCGGATAACGCTGCCGCCAAGCCTCTCATCACTACCCTACTCCCTAAGATGATTGCACGCATCAACGACTGGTTTGAGGAAGTGAAAGCTAAGCGCGGCAAGCGCCCGACAGCCTTCCAGTTCCTGCAAGAAATCAAGCCGGAAGCCGTAGCGTACATCACCATTAAGACCACTCTGGCTTGCCTAACCAGTGCTGACAATACAACCGTTCAGGCTGTAGCAAGCGCAATCGGTCGGGCCATTGAGGACGAGGCTCGCTTCGGTCGTATCCGTGACCTTGAAGCTAAGCACTTCAAGAAAAACGTTGAGGAACAACTCAACAAGCGCGTAGGGCACGTCTACAAGAAAGCATTTATGCAAGTTGTCGAGGCTGACATGCTCTCTAAGGGTCTACTCGGTGGCGAGGCGTGGTCTTCGTGGCATAAGGAAGACTCTATTCATGTAGGAGTACGCTGCATCGAGATGCTCATTGAGTCAACCGGAATGGTTAGCTTACACCGCCAAAATGCTGGCGTAGTAGGTCAAGACTCTGAGACTATCGAACTCGCACCTGAATACGCTGAGGCTATCGCAACCCGTGCAGGTGCGCTGGCTGGCATCTCTCCGATGTTCCAACCTTGCGTAGTTCCTCCTAAGCCGTGGACTGGCATTACTGGTGGTGGCTATTGGGCTAACGGTCGTCGTCCTCTGGCGCTGGTGCGTACTCACAGTAAGAAAGCACTGATGCGCTACGAAGACGTTTACATGCCTGAGGTGTACAAAGCGATTAACATTGCGCAAAACACCGCATGGAAAATCAACAAGAAAGTCCTAGCGGTCGCCAACGTAATCACCAAGTGGAAGCATTGTCCGGTCGAGGACATCCCTGCGATTGAGCGTGAAGAACTCCCGATGAAACCGGAAGACATCGACATGAATCCTGAGGCTCTCACCGCGTGGAAACGTGCTGCCGCTGCTGTGTACCGCAAGGACAAGGCTCGCAAGTCTCGCCGTATCAGCCTTGAGTTCATGCTTGAGCAAGCCAATAAGTTTGCTAACCATAAGGCCATCTGGTTCCCTTACAACATGGACTGGCGCGGTCGTGTTTACGCTGTGTCAATGTTCAACCCGCAAGGTAACGATATGACCAAAGGACTGCTTACGCTGGCGAAAGGTAAACCAATCGGTAAGGAAGGTTACTACTGGCTGAAAATCCACGGTGCAAACTGTGCGGGTGTCGATAAGGTTCCGTTCCCTGAGCGCATCAAGTTCATTGAGGAAAACCACGAGAACATCATGGCTTGCGCTAAGTCTCCACTGGAGAACACTTGGTGGGCTGAGCAAGATTCTCCGTTCTGCTTCCTTGCGTTCTGCTTTGAGTACGCTGGGGTACAGCACCACGGCCTGAGCTATAACTGCTCCCTTCCGCTGGCGTTTGACGGGTCTTGCTCTGGCATCCAGCACTTCTCCGCGATGCTCCGAGATGAGGTAGGTGGTCGCGCGGTTAACTTGCTTCCTAGTGAAACCGTTCAGGACATCTACGGGATTGTTGCTAAGAAAGTCAACGAGATTCTACAAGCAGACGCAATCAATGGGACCGATAACGAAGTAGTTACCGTGACCGATGAGAACACTGGTGAAATCTCTGAGAAAGTCAAGCTGGGCACTAAGGCACTGGCTGGTCAATGGCTGGCTTACGGTGTTACTCGCAGTGTGACTAAGCGTTCAGTCATGACGCTGGCTTACGGGTCCAAAGAGTTCGGCTTCCGTCAACAAGTGCTGGAAGATACCATTCAGCCAGCTATTGATTCCGGCAAGGGTCTGATGTTCACTCAGCCGAATCAGGCTGCTGGATACATGGCTAAGCTGATTTGGGAATCTGTGAGCGTGACGGTGGTAGCTGCGGTTGAAGCAATGAACTGGCTTAAGTCTGCTGCTAAGCTGCTGGCTGCTGAGGTCAAAGATAAGAAGACTGGAGAGATTCTTCGCAAGCGTTGCGCTGTGCATTGGGTAACTCCTGATGGTTTCCCTGTGTGGCAGGAATACAAGAAGCCTATTCAGACGCGCTTGAACCTGATGTTCCTCGGTCAGTTCCGCTTACAGCCTACCATTAACACCAACAAAGATAGCGAGATTGATGCACACAAACAGGAGTCTGGTATCGCTCCTAACTTTGTACACAGCCAAGACGGTAGCCACCTTCGTAAGACTGTAGTGTGGGCACACGAGAAGTACGGAATCGAATCTTTTGCACTGATTCACGACTCCTTCGGTACCATTCCGGCTGACGCTGCGAACCTGTTCAAAGCAGTGCGCGAAACTATGGTTGACACATATGAGTCTTGTGATGTACTGGCTGATTTCTACGACCAGTTCGCTGACCAGTTGCACGAGTCTCAATTGGACAAAATGCCAGCACTTCCGGCTAAAGGTAACTTGAACCTCCGTGACATCTTAGAGTCGGACTTCGCGTTCGCGTAACGCCAAATCAATACGACTCCGGATCCCCTTCGAAGGAAAGACCTGATGCTTTTCGTGCGCGCAGAATTCAGTCGGCTTTTTTTTGAGTAA
SEQ ID NO:5：CgpanB基因的序列，来自谷氨酸棒状杆菌，根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化
ATGCCGATGAGCGGCATTGATGCGAAAAAAATTCGCACCCGCCATTTTCGCGAAGCGAAAGTGAACGGTCAGAAAGTGAGCGTGCTGACGAGCTATGATGCGCTGAGCGCGCGCATTTTTGATGAAGCGGGCGTGGATATGCTGCTGGTGGGCGATAGCGCGGCGAACGTGGTGCTGGGCCGCGATACCACCTTAAGTATCACCCTGGATGAAATGATTGTGCTGGCGAAAGCGGTGACCATTGCGACCAAACGCGCGCTGGTGGTTGTGGATCTGCCGTTTGGCACCTATGAAGTGAGCCCGAACCAAGCGGTGGAAAGCGCGATTCGCGTGATGCGCGAAACCGGCGCGGCCGCGGTGAAAATTGAAGGCGGCGTGGAAATTGCGCAGACCATTCGCCGCATTGTGGATGCGGGCATTCCGGTGGTGGGCCATATTGGCTATACCCCGCAGAGCGAACATAGCCTGGGCGGCCATGTGGTGCAAGGCCGCGGCGCGAGCAGCGGCAAACTGATTGCGGATGCGCGCGCGCTGGAACAAGCGGGCGCGTTTGCGGTGGTGCTGGAAATGGTGCCGGCGGAAGCGGCGCGCGAAGTGACCGAAGATCTGAGCATTACCACCATTGGCATTGGCGCGGGCAACGGCACCGATGGCCAAGTGCTGGTGTGGCAAGATGCGTTTGGCCTGAACCGCGGCAAAAAACCGCGCTTTGTGCGCGAATATGCGACCCTGGGCGATAGCCTGCATGATGCGGCGCAAGCGTATATTGCGGATATTCATGCGGGCACCTTTCCGGGCGAAGCGGAAAGCTTTTAA
SEQ ID NO:6：CgpanC基因的序列，来自谷氨酸棒状杆菌，根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化
ATGCAAGTGGCGACCACCAAACAAGCGCTGATTGATGCGCTGCTGCATCATAAAAGCGTGGGCCTGGTGCCGACGATGGGCGCGCTGCATAGCGGCCATGCGAGCCTGGTGAAAGCGGCGCGCGCGGAAAACGATACGGTGGTGGCGAGCATTTTTGTGAACCCGCTGCAGTTTGAAGCGCTGGGCGATTGCGATGATTATCGCAACTATCCGCGTCAGCTGGATGCGGATCTGGCGCTGCTGGAAGAAGCGGGCGTGGATATTGTGTTTGCGCCGGATGTGGAAGAAATGTATCCGGGCGGCCTGCCGCTGGTGTGGGCGCGCACCGGCAGCATTGGCACCAAACTGGAAGGCGCGAGCCGTCCGGGCCATTTTGATGGCGTGGCGACCGTGGTGGCGAAACTGTTTAACCTGGTGCGCCCGGATCGCGCGTATTTTGGTCAGAAAGATGCGCAGCAAGTGGCGGTGATTCGCCGCCTGGTGGCGGATCTGGATATTCCGGTGGAAATTCGCCCGGTGCCGATTATTCGCGGCGCGGATGGCCTGGCGGAAAGTAGCCGCAACCAACGCTTAAGCGCCGATCAGCGTGCCCAAGCGCTGGTGCTGCCGCAAGTGCTGAGTGGTCTGCAGCGCCGCAAAGCGGCGGGCGAAGCGCTGGATATTCAAGGCGCGCGCGATACCCTGGCGAGCGCGGATGGCGTGCGCCTGGATCATCTGGAAATTGTTGATCCGGCGACCCTGGAACCGCTGGAAATTGATGGCCTGCTGACGCAGCCGGCGCTGGTGGTGGGCGCGATTTTTGTGGGCCCGGTGCGCCTGATTGATAACATTGAACTGTAA
SEQ ID NO:7：T7启动子序列，来自pET30a质粒
TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAAT
SEQ ID NO:8：bamA的基因序列
ATGGCGATGAAAAAGTTGCTCATAGCGTCGCTGCTGTTTAGCAGCGCCACCGTATACGGTGCTGAAGGGTTCGTAGTGAAAGATATTCATTTCGAAGGCCTTCAGCGTGTCGCCGTTGGTGCGGCCCTCCTCAGTATGCCGGTGCGCACAGGCGACACGGTTAATGATGAAGATATCAGTAATACCATTCGCGCTCTGTTTGCTACCGGCAACTTTGAGGATGTTCGCGTCCTTCGTGATGGTGATACCCTTCTGGTTCAGGTAAAAGAACGTCCGACCATTGCCAGCATTACTTTCTCCGGTAACAAATCGGTGAAAGATGACATGCTGAAGCAAAACCTCGAGGCTTCTGGTGTGCGTGTGGGCGAATCCCTCGATCGCACCACCATTGCCGATATCGAGAAAGGTCTGGAAGACTTCTACTACAGCGTCGGTAAATATAGCGCCAGCGTAAAAGCTGTCGTGACCCCGCTGCCGCGCAACCGTGTTGACCTAAAACTGGTGTTCCAGGAAGGTGTGTCAGCTGAAATCCAGCAAATTAACATTGTTGGTAACCATGCTTTCACCACCGACGAACTGATCTCTCATTTCCAACTGCGTGACGAAGTGCCGTGGTGGAACGTGGTAGGCGATCGTAAATACCAGAAACAGAAACTGGCGGGCGACCTTGAAACCCTGCGCAGCTACTATCTGGATCGCGGTTATGCCCGTTTCAACATCGACTCTACCCAGGTCAGTCTGACGCCAGATAAAAAAGGTATTTACGTCACGGTGAACATCACCGAAGGCGATCAGTACAAGCTTTCTGGCGTTGAAGTGAGCGGCAACCTTGCCGGGCACTCCGCTGAAATTGAGCAGCTGACTAAGATCGAGCCGGGTGAGCTGTATAACGGCACCAAAGTGACCAAGATGGAAGATGACATCAAAAAGCTTCTCGGTCGCTATGGTTATGCCTATCCGCGCGTACAGTCGATGCCCGAAATTAACGATGCCGACAAAACCGTTAAATTACGTGTGAACGTTGATGCGGGTAACCGTTTCTACGTGCGTAAGATCCGTTTTGAAGGTAACGATACCTCGAAAGATGCCGTCCTGCGTCGCGAAATGCGTCAGATGGAAGGTGCATGGCTGGGGAGCGATCTGGTCGATCAGGGTAAGGAGCGTCTGAATCGTCTGGGCTTCTTTGAAACTGTCGATACCGATACCCAACGTGTTCCGGGTAGCCCGGACCAGGTTGATGTCGTCTACAAGGTAAAAGAGCGCAACACCGGTAGCTTCAACTTTGGTATTGGTTACGGTACTGAAAGTGGCGTGAGCTTCCAGGCTGGTGTGCAGCAGGATAACTGGTTAGGTACAGGTTATGCTGTTGGTATCAACGGGACCAAAAACGATTACCAGACCTATGCTGAACTGTCGGTAACCAACCCGTACTTCACCGTAGATGGCGTAAGCCTCGGTGGTCGTCTCTTCTATAATGACTTCCAGGCAGATGACGCCGACCTGTCCGACTATACCAACAAGAGTTATGGTACAGACGTGACGTTGGGCTTCCCGATTAACGAATATAACTCGCTGCGTGCAGGTCTGGGTTATGTACATAACTCCCTGTCCAACATGCAGCCTCAGGTTGCGATGTGGCGTTATCTGTACTCTATGGGTGAACATCCGAGCACCTCTGATCAGGATAACAGCTTCAAAACGGACGACTTCACGTTCAACTATGGTTGGACCTATAACAAGCTTGACCGTGGTTACTTCCCGACAGATGGTTCACGTGTCAACCTGACCGGTAAAGTGACCATTCCTGGATCGGATAACGAATACTACAAAGTGACGTTAGACACGGCGACTTATGTGCCGATCGATGACGATCACAAATGGGTTGTTCTGGGGCGTACCCGCTGGGGTTATGGTGATGGTTTAGGCGGCAAAGAGATGCCGTTCTACGAGAACTTCTATGCCGGTGGTTCCAGCACCGTGCGTGGCTTCCAGTCCAATACCATTGGTCCGAAAGCAGTTTACTTCCCGCATCAGGCCAGTAATTATGATCCGGACTATGATTACGAATGTGCGACTCAGGACGGCGCGAAAGACCTGTGTAAATCGGATGATGCTGTAGGCGGTAACGCCATGGCGGTTGCCAGCCTCGAGTTCATCACCCCGACGCCGTTTATTAGCGATAAGTATGCTAACTCGGTTCGTACTTCCTTCTTCTGGGATATGGGTACCGTTTGGGATACAAACTGGGATTCCAGCCAATATTCTGGATATCCGGACTATAGTGATCCAAGCAATATCCGTATGTCTGCGGGTATCGCATTACAATGGATGTCCCCATTGGGGCCGTTGGTGTTCTCCTACGCCCAGCCGTTCAAAAAGTACGATGGAGACAAGGCAGAACAGTTCCAGTTTAACATCGGTAAAACCTGGTAA
SEQ ID NO:9：bamB的基因序列
ATGCAATTGCGTAAATTACTGCTGCCAGGACTGCTTTCCGTTACCCTTTTAAGCGGCTGTTCGCTGTTTAACAGCGAAGAAGATGTGGTAAAGATGTCCCCATTGCCAACCGTTGAAAACCAGTTTACGCCGACCACGGCGTGGAGCACTTCCGTTGGTAGCGGCATTGGCAACTTCTATTCCAATCTTCATCCGGCACTGGCGGACAACGTTGTCTATGCAGCGGACCGCGCTGGTTTAGTAAAAGCGCTGAATGCGGATGATGGCAAAGAAATCTGGTCTGTCAGCCTGGCCGAGAAAGATGGCTGGTTCTCTAAAGAGCCTGCATTACTTTCTGGCGGTGTGACCGTGTCTGGTGGGCATGTCTACATTGGCAGCGAAAAGGCGCAGGTTTACGCGCTGAATACCAGCGATGGTACTGTGGCATGGCAAACTAAAGTCGCGGGTGAAGCACTTTCGCGCCCGGTGGTCAGCGACGGTCTGGTGTTAATCCACACCAGTAACGGTCAGTTACAAGCGCTGAACGAAGCTGACGGCGCTGTCAAATGGACAGTTAACCTCGATATGCCTTCGCTCTCTTTGCGTGGCGAGTCTGCGCCGACAACGGCTTTTGGTGCGGCCGTCGTGGGGGGCGATAATGGTCGCGTCAGCGCAGTGCTGATGGAACAGGGCCAGATGATTTGGCAGCAGCGTATTTCCCAGGCGACCGGTTCTACCGAAATTGACCGTCTGAGCGATGTTGACACGACTCCCGTCGTTGTTAACGGCGTTGTTTTCGCGCTGGCCTATAATGGTAACCTGACGGCGCTTGATCTGCGCAGTGGTCAGATTATGTGGAAACGCGAACTGGGTTCGGTGAATGATTTCATCGTCGACGGCAATCGCATCTATCTGGTCGATCAAAATGACCGGGTGATGGCGTTGACCATTGATGGCGGCGTTACGCTGTGGACACAAAGCGATCTGCTGCATCGCCTGCTGACTTCTCCGGTGCTGTATAATGGCAACCTGGTGGTCGGTGACAGTGAAGGTTATCTGCACTGGATTAACGTCGAAGATGGTCGTTTCGTTGCCCAGCAAAAAGTTGATAGTTCCGGTTTCCAGACTGAACCGGTTGCCGCTGACGGCAAACTGCTGATCCAGGCAAAAGACGGAACCGTGTACTCTATTACACGTTAA
SEQ ID NO:10：T1T2终止子序列，来自于pTrc99A质粒
GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTT
SEQ ID NO:11：acrB的基因序列，来自大肠杆菌
ATGCCTAATTTCTTTATCGATCGCCCGATTTTTGCGTGGGTGATCGCCATTATCATCATGTTGGCAGGGGGGCTGGCGATCCTCAAACTGCCGGTGGCGCAATATCCTACGATTGCACCGCCGGCAGTAACGATCTCCGCCTCCTACCCCGGCGCTGATGCGAAAACAGTGCAGGACACGGTGACACAGGTTATCGAACAGAATATGAACGGTATCGATAACCTGATGTACATGTCCTCTAACAGTGACTCCACGGGTACCGTGCAGATCACCCTGACCTTTGAGTCTGGTACTGATGCGGATATCGCGCAGGTTCAGGTGCAGAACAAACTGCAGCTGGCGATGCCGTTGCTGCCGCAAGAAGTTCAGCAGCAAGGGGTGAGCGTTGAGAAATCATCCAGCAGCTTCCTGATGGTTGTCGGCGTTATCAACACCGATGGCACCATGACGCAGGAGGATATCTCCGACTACGTGGCGGCGAATATGAAAGATGCCATCAGCCGTACGTCGGGCGTGGGTGATGTTCAGTTGTTCGGTTCACAGTACGCGATGCGTATCTGGATGAACCCGAATGAGCTGAACAAATTCCAGCTAACGCCGGTTGATGTCATTACCGCCATCAAAGCGCAGAACGCCCAGGTTGCGGCGGGTCAGCTCGGTGGTACGCCGCCGGTGAAAGGCCAACAGCTTAACGCCTCTATTATTGCTCAGACGCGTCTGACCTCTACTGAAGAGTTCGGCAAAATCCTGCTGAAAGTGAATCAGGATGGTTCCCGCGTGCTGCTGCGTGACGTCGCGAAGATTGAGCTGGGTGGTGAGAACTACGACATCATCGCAGAGTTTAACGGCCAACCGGCTTCCGGTCTGGGGATCAAGCTGGCGACCGGTGCAAACGCGCTGGATACCGCTGCGGCAATCCGTGCTGAACTGGCGAAGATGGAACCGTTCTTCCCGTCGGGTCTGAAAATTGTTTACCCATACGACACCACGCCGTTCGTGAAAATCTCTATTCACGAAGTGGTTAAAACGCTGGTCGAAGCGATCATCCTCGTGTTCCTGGTTATGTATCTGTTCCTGCAGAACTTCCGCGCGACGTTGATTCCGACCATTGCCGTACCGGTGGTATTGCTCGGGACCTTTGCCGTCCTTGCCGCCTTTGGCTTCTCGATAAACACGCTAACAATGTTCGGGATGGTGCTCGCCATCGGCCTGTTGGTGGATGACGCCATCGTTGTGGTAGAAAACGTTGAGCGTGTTATGGCGGAAGAAGGTTTGCCGCCAAAAGAAGCTACCCGTAAGTCGATGGGGCAGATTCAGGGCGCTCTGGTCGGTATCGCGATGGTACTGTCGGCGGTATTCGTACCGATGGCCTTCTTTGGCGGTTCTACTGGTGCTATCTATCGTCAGTTCTCTATTACCATTGTTTCAGCAATGGCGCTGTCGGTACTGGTGGCGTTGATCCTGACTCCAGCTCTTTGTGCCACCATGCTGAAACCGATTGCCAAAGGCGATCACGGGGAAGGTAAAAAAGGCTTCTTCGGCTGGTTTAACCGCATGTTCGAGAAGAGCACGCACCACTACACCGACAGCGTAGGCGGTATTCTGCGCAGTACGGGGCGTTACCTGGTGCTGTATCTGATCATCGTGGTCGGCATGGCCTATCTGTTCGTGCGTCTGCCAAGCTCCTTCTTGCCAGATGAGGACCAGGGCGTGTTTATGACCATGGTTCAGCTGCCAGCAGGTGCAACGCAGGAACGTACACAGAAAGTGCTCAATGAGGTAACGCATTACTATCTGACCAAAGAAAAGAACAACGTTGAGTCGGTGTTCGCCGTTAACGGCTTCGGCTTTGCGGGACGTGGTCAGAATACCGGTATTGCGTTCGTTTCCTTGAAGGACTGGGCCGATCGTCCGGGCGAAGAAAACAAAGTTGAAGCGATTACCATGCGTGCAACACGCGCTTTCTCGCAAATCAAAGATGCGATGGTTTTCGCCTTTAACCTGCCCGCAATCGTGGAACTGGGTACTGCAACCGGCTTTGACTTTGAGCTGATTGACCAGGCTGGCCTTGGTCACGAAAAACTGACTCAGGCGCGTAACCAGTTGCTTGCAGAAGCAGCGAAGCACCCTGATATGTTGACCAGCGTACGTCCAAACGGTCTGGAAGATACCCCGCAGTTTAAGATTGATATCGACCAGGAAAAAGCGCAGGCGCTGGGTGTTTCTATCAACGACATTAACACCACTCTGGGCGCTGCATGGGGCGGCAGCTATGTGAACGACTTTATCGACCGCGGTCGTGTGAAGAAAGTTTATGTCATGTCAGAAGCGAAATACCGTATGCTGCCGGATGATATCGGCGACTGGTATGTTCGTGCTGCTGATGGTCAGATGGTGCCATTCTCGGCGTTCTCCTCTTCTCGTTGGGAGTACGGTTCGCCGCGTCTGGAACGTTACAACGGCCTGCCATCCATGGAAATCTTAGGCCAGGCGGCACCGGGTAAAAGTACCGGTGAAGCAATGGAGCTGATGGAACAACTGGCGAGCAAACTGCCTACCGGTGTTGGCTATGACTGGACGGGGATGTCCTATCAGGAACGTCTCTCCGGCAACCAGGCACCTTCACTGTACGCGATTTCGTTGATTGTCGTGTTCCTGTGTCTGGCGGCGCTGTACGAGAGCTGGTCGATTCCGTTCTCCGTTATGCTGGTCGTTCCGCTGGGGGTTATCGGTGCGTTGCTGGCTGCCACCTTCCGTGGCCTGACCAATGACGTTTACTTCCAGGTAGGCCTGCTCACAACCATTGGGTTGTCGGCGAAGAACGCGATCCTTATCGTCGAATTCGCCAAAGACTTGATGGATAAAGAAGGTAAAGGTCTGATTGAAGCGACGCTTGATGCGGTGCGGATGCGTTTACGTCCGATCCTGATGACCTCGCTGGCGTTTATCCTCGGCGTTATGCCGCTGGTTATCAGTACTGGTGCTGGTTCCGGCGCGCAGAACGCAGTAGGTACCGGTGTAATGGGCGGGATGGTGACCGCAACGGTACTGGCAATCTTCTTCGTTCCGGTATTCTTTGTGGTGGTTCGCCGCCGCTTTAGCCGCAAGAATGAAGATATCGAGCACAGCCATACTGTCGATCATCATTGA
SEQ ID NO:12：mdtF的基因序列，来自大肠杆菌
ATGGCTAACTATTTTATTGATCGCCCGGTTTTTGCCTGGGTACTTGCCATTATTATGATGCTTGCAGGTGGTCTGGCGATCATGAACTTACCGGTTGCGCAGTATCCGCAGATTGCGCCACCGACCATTACCGTCAGCGCTACCTATCCAGGTGCCGATGCGCAAACGGTAGAAGACTCGGTCACTCAGGTGATTGAGCAAAATATGAATGGGCTTGATGGCCTGATGTACATGTCTTCAACCAGTGATGCGGCGGGCAATGCCTCTATCACTCTGACCTTCGAGACTGGGACATCTCCTGATATCGCACAGGTTCAAGTGCAAAATAAACTGCAACTCGCTATGCCTTCATTACCTGAAGCAGTGCAGCAGCAGGGGATTAGCGTCGATAAGTCGAGCAGTAATATCCTGATGGTAGCGGCGTTTATTTCTGATAACGGCAGCCTCAACCAGTACGATATCGCGGACTATGTAGCGTCTAATATCAAAGACCCGCTAAGCCGTACCGCGGGCGTTGGTAGCGTACAACTCTTTGGTTCCGAGTATGCCATGCGTATCTGGCTGGACCCGCAAAAACTCAATAAATATAACCTGGTACCTTCCGATGTTATTTCCCAGATTAAGGTGCAAAACAACCAGATTTCCGGTGGTCAACTGGGTGGCATGCCACAGGCGGCAGACCAGCAGCTAAACGCCTCGATCATTGTGCAGACGCGTCTGCAAACGCCGGAAGAATTTGGCAAAATCCTGTTGAAAGTTCAGCAAGATGGTTCGCAAGTGCTGCTGCGTGATGTCGCTCGCGTCGAACTTGGGGCGGAAGATTATTCCACCGTGGCACGCTATAACGGCAAACCTGCTGCCGGGATCGCCATCAAACTGGCTGCCGGAGCAAACGCCCTGGATACCTCGCGGGCAGTCAAAGAGGAACTGAACCGCTTATCAGCCTATTTCCCGGCAAGTCTGAAGACGGTTTATCCTTACGACACCACGCCGTTTATCGAAATTTCTATTCAGGAAGTTTTCAAAACACTGGTTGAGGCTATCATCCTAGTCTTCCTGGTCATGTATCTGTTTTTGCAGAATTTCCGTGCCACAATCATCCCGACGATTGCCGTACCGGTGGTTATTCTCGGGACGTTTGCGATCTTGTCGGCGGTCGGTTTCACCATCAACACGTTGACTATGTTCGGGATGGTGCTGGCGATAGGGTTACTGGTGGATGACGCCATCGTGGTGGTGGAGAACGTCGAGCGTGTCATTGCGGAAGATAAGCTACCGCCGAAGGAAGCGACGCATAAATCGATGGGGCAGATCCAACGTGCGCTGGTCGGTATTGCCGTTGTTCTTTCCGCAGTGTTTATGCCGATGGCCTTTATGAGCGGTGCAACCGGGGAGATCTACCGCCAGTTCTCCATCACGCTGATCTCCTCCATGCTGCTTTCAGTATTTGTGGCAATGAGCCTGACCCCTGCCCTGTGCGCCACCATTCTGAAAGCCGCGCCGGAAGGCGGTCACAAACCTAACGCCCTGTTCGCACGCTTCAACACGCTGTTTGAAAAATCAACTCAACACTATACCGATAGCACCCGCTCGCTGTTGCGTTGTACCGGTCGCTACATGGTGGTCTACCTGCTGATTTGCGCCGGGATGGCGGTGCTGTTCCTGCGCACGCCGACCTCTTTCTTACCAGAAGAGGATCAGGGGGTATTTATGACCACCGCGCAGTTACCTTCCGGTGCCACCATGGTTAACACCACGAAAGTGCTGCAACAGGTGACGGATTATTATCTGACTAAAGAGAAAGATAATGTCCAGTCGGTGTTTACCGTTGGCGGCTTTGGCTTCAGCGGTCAGGGGCAAAACAACGGCCTGGCGTTTATCAGTCTCAAGCCGTGGTCTGAACGTGTCGGTGAGGAAAACTCGGTTACCGCGATCATTCAGCGGGCAATGATTGCGTTAAGCAGTATCAATAAAGCCGTCGTCTTCCCGTTCAACTTACCCGCGGTGGCTGAACTGGGTACCGCGTCAGGTTTTGATATGGAACTGCTGGACAACGGTAACCTGGGGCACGAAAAACTAACCCAGGCGCGAAACGAGCTGTTATCACTGGCAGCGCAATCACCGAATCAGGTCACCGGGGTACGCCCGAACGGCCTGGAAGATACGCCGATGTTCAAAGTGAACGTCAACGCTGCGAAAGCTGAAGCGATGGGCGTGGCGCTGTCTGATATCAACCAGACAATTTCCACCGCCTTCGGCAGCAGCTACGTGAACGACTTCCTCAACCAGGGGCGGGTGAAAAAAGTGTATGTCCAGGCAGGCACGCCGTTCCGTATGTTGCCGGATAACATCAACCAATGGTATGTACGCAACGCCTCTGGCACGATGGCACCGCTTTCTGCCTACTCGTCTACCGAATGGACCTATGGTTCACCGCGACTGGAACGCTACAACGGCATCCCGTCAATGGAGATTTTAGGTGAAGCGGCGGCCGGGAAAAGTACCGGTGACGCCATGAAATTTATGGCAGACCTGGTCGCTAAACTTCCGGCAGGCGTCGGCTACTCATGGACCGGACTATCGTATCAGGAAGCGTTATCCTCAAATCAGGCTCCTGCGCTGTATGCGATTTCACTGGTCGTGGTGTTCCTCGCCCTCGCCGCACTCTATGAGAGCTGGTCAATTCCGTTCTCGGTGATGTTGGTTGTTCCGTTAGGCGTCGTTGGCGCATTACTGGCCACCGATCTGCGCGGCTTAAGTAATGACGTCTACTTCCAGGTTGGTTTGCTGACCACCATCGGGCTTTCCGCCAAAAACGCCATCCTGATTGTCGAATTTGCCGTTGAGATGATGCAGAAAGAAGGGAAAACGCCGATAGAGGCAATCATCGAAGCGGCGCGGATGCGTTTACGCCCAATCCTGATGACCTCTCTGGCCTTTATTCTCGGCGTGCTGCCGCTGGTTATCAGTCATGGTGCCGGTTCTGGCGCGCAAAACGCGGTAGGTACCGGCGTGATGGGCGGGATGTTTGCCGCAACAGTGCTGGCAATTTACTTCGTTCCGGTCTTTTTCGTTGTAGTGGAACATCTCTTTGCCCGCTTTAAAAAAGCGTAA
SEQ ID NO:13：Ptrc启动子序列，来自pTrc99A质粒
GTTTGACAGCTTATCATCGACTGCACGGTGCACCAATGCTTCTGGCGTCAGGCAGCCATCGGAAGCTGTGGTATGGCTGTGCAGGTCGTAAATCACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAGGCGCACTCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACC
SEQ ID NO:14：乙酰乳酸合成酶BsalsS基因序列，来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168，根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化
ATGCTGACCAAAGCGACCAAAGAACAGAAAAGTCTGGTGAAAAACCGCGGCGCGGAACTGGTGGTGGATTGCCTGGTGGAACAAGGCGTGACCCATGTGTTTGGCATTCCGGGCGCGAAAATTGATGCGGTGTTTGATGCGCTGCAAGATAAAGGCCCGGAAATTATTGTGGCGCGCCATGAACAGAACGCCGCCTTTATGGCGCAAGCGGTTGGTCGCCTGACCGGCAAACCGGGCGTGGTGTTAGTGACGAGCGGCCCGGGTGCGAGCAACCTGGCGACGGGCCTGCTGACCGCGAACACCGAAGGCGATCCGGTGGTGGCGCTGGCGGGCAACGTGATTCGCGCGGATCGCCTGAAACGCACCCATCAGAGCCTGGATAACGCGGCGCTGTTTCAGCCGATTACCAAATATAGCGTGGAAGTGCAAGATGTGAAAAACATTCCGGAAGCGGTGACCAACGCGTTTCGCATTGCGAGCGCGGGCCAAGCGGGCGCGGCGTTTGTGAGCTTTCCGCAAGATGTGGTGAACGAAGTGACCAACACCAAAAACGTGCGCGCGGTGGCGGCGCCGAAACTGGGCCCGGCGGCGGATGATGCGATTAGCGCGGCGATTGCGAAAATTCAGACCGCGAAACTGCCGGTGGTTTTAGTGGGTATGAAAGGCGGCCGCCCGGAAGCGATTAAAGCGGTGCGCAAACTGCTGAAAAAAGTGCAGCTGCCGTTTGTGGAAACCTATCAAGCGGCGGGCACCCTGAGCCGCGATCTGGAAGATCAGTATTTTGGCCGCATTGGCCTGTTTCGCAATCAGCCGGGCGATCTGTTACTGGAACAAGCGGATGTGGTGCTGACCATTGGCTATGATCCGATTGAATATGATCCGAAATTTTGGAACATTAACGGCGATCGCACCATTATTCATCTGGATGAAATTATTGCGGATATTGATCATGCGTATCAGCCGGATCTGGAACTGATTGGCGATATTCCGAGCACCATTAACCATATTGAACATGATGCGGTGAAAGTGGAATTTGCGGAACGCGAACAGAAAATTCTGAGCGATCTGAAACAGTATATGCATGAAGGCGAACAAGTGCCGGCGGATTGGAAAAGCGATCGCGCGCATCCGCTGGAAATTGTGAAAGAACTGCGCAACGCGGTGGATGATCATGTGACCGTGACCTGCGATATTGGCAGCCATGCGATTTGGATGAGCCGCTATTTTCGCAGCTATGAACCGCTGACCCTGATGATTAGCAACGGCATGCAGACCCTGGGCGTGGCGCTGCCGTGGGCGATTGGCGCGAGCCTGGTGAAACCGGGCGAAAAAGTGGTGAGCGTGAGCGGCGATGGCGGCTTTCTGTTTAGCGCGATGGAACTGGAAACCGCGGTGCGCCTGAAAGCGCCGATTGTGCATATTGTGTGGAACGATAGCACCTATGATATGGTGGCGTTTCAGCAGCTGAAAAAATATAACCGCACGAGCGCGGTGGATTTTGGCAACATTGATATTGTGAAATATGCGGAAAGCTTTGGCGCGACCGGCCTGCGCGTGGAAAGCCCGGATCAGCTGGCGGATGTGCTGCGCCAAGGCATGAACGCGGAAGGCCCGGTGATTATTGATGTGCCGGTGGATTATAGCGATAACATTAACCTGGCGAGCGATAAACTGCCGAAAGAATTTGGCGAACTGATGAAAACCAAAGCGCTGTAA
SEQ ID NO:15：乙酰羟基酸还原异构酶基因ilvC序列，来自大肠杆菌
ATGGCTAACTACTTCAATACACTGAATCTGCGCCAGCAGCTGGCACAGCTGGGCAAATGTCGCTTTATGGGCCGCGATGAATTCGCCGATGGCGCGAGCTACCTTCAGGGTAAAAAAGTAGTCATCGTCGGCTGTGGCGCACAGGGTCTGAACCAGGGCCTGAACATGCGTGATTCTGGTCTCGATATCTCCTACGCTCTGCGTAAAGAAGCGAttgccgagaagcgcgcgtccTGGCGTAAAGCGACCGAAAATGGTTTTAAAGTGGGTACTTACGAAGAACTGATCCCACAGGCGGATCTGGTGATTAACCTGACGCCGGACAAGCAGCACTCTGATGTAGTGCGCACCGTACAGCCACTGATGAAAGACGGCGCGGCGCTGGGCTACTCGCACGGTTTCAACATCGTCGAAGTGGGCGAGCAGATCCGTAAAGATATCACCGTAGTGATGGTTGCGCCGAAATGCCCAGGCACCGAAGTGCGTGAAGAGTACAAACGTGGGTTCGGCGTACCGACGCTGATTGCCGTTCACCCGGAAAACGATCCGAAAGGCGAAGGCATGGCGATTGCCAAAGCCTGGGCGGCTGCAACCGGTGGTCACCGTGCGGGTGTGCTGGAATCGTCCTTCGTTGCGGAAGTGAAATCTGACCTGATGGGCGAGCAAACCATCCTGTGCGGTATGTTGCAGGCTGGCTCTCTGCTGTGCTTCGACAAGCTGGTGGAAGAAGGTACCGATCCAGCATACGCAGAAAAACTGATTCAGTTCGGTTGGGAAACCATCACCGAAGCACTGAAACAGGGCGGCATCACCCTGATGATGGACCGTCTCTCTAACCCGGCGAAACTGCGTGCTTATGCGCTTTCTGAACAGCTGAAAGAGATCATGGCACCCCTGTTCCAGAAACATATGGACGACATCATCTCCGGCGAATTCTCTTCCGGTATGATGGCGGACTGGGCCAACGATGATAAGAAACTGCTGACCTGGCGTGAAGAGACCGGCAAAACCGCGTTTGAAACCGCGCCGCAGTATGAAGGCAAAATCGGCGAGCAGGAGTACTTCGATAAAGGCGTACTGATGATTGCGATGGTGAAAGCGGGCGTTGAACTGGCGTTCGAAACCATGGTCGATTCCGGCATCATTGAAGAGTCTGCATATTATGAATCACTGCACGAGCTGCCGCTGATTGCCAACACCATCGCCCGTAAGCGTCTGTACGAAATGAACGTGGTTATCTCTGATACCGCTGAGTACGGTAACTATCTGTTCTCTTACGCTTGTGTGCCGTTGCTGAAACCGTTTATGGCAGAGCTGCAACCGGGCGACCTGGGTAAAGCTATTCCGGAAGGCGCGGTAGATAACGGGCAACTGCGTGATGTGAACGAAGCGATTCGCAGCCATGCGATTGAGCAGGTAGGTAAGAAACTGCGCGGCTATATGACAGATATGAAACGTATTGCTGTTGCGGGTTAA
SEQ ID NO:16：milvC，突变的乙酰羟基酸还原异构酶基因ilvC序列
ATGGCTAACTACTTCAATACACTGAATCTGCGCCAGCAGCTGGCACAGCTGGGCAAATGTCGCTTTATGGGCCGCGATGAATTCGCCGATGGCGCGAGCTACCTTCAGGGTAAAAAAGTAGTCATCGTCGGCTGTGGCGCACAGGGTCTGAACCAGGGCCTGAACATGCGTGATTCTGGTCTCGATATCTCCTACGCTgaattcAAAGAAGCGAttgcAgaAGagcgTgcAAGtTGGCGTAAAGCGACCGAAAATGGTTTTAAAGTGGGTACTTACGAAGAACTGATCCCACAGGCGGATCTGGTGATTAACCTGACGCCGGACAAGCAGCACTCTGATGTAGTGCGCACCGTACAGCCACTGATGAAAGACGGCGCGGCGCTGGGCTACTCGCACGGTTTCAACATCGTCGAAGTGGGCGAGCAGATCCGTAAAGATATCACCGTAGTGATGGTTGCGCCGAAATGCCCAGGCACCGAAGTGCGTGAAGAGTACAAACGTGGGTTCGGCGTACCGACGCTGATTGCCGTTCACCCGGAAAACGATCCGAAAGGCGAAGGCATGGCGATTGCCAAAGCCTGGGCGGCTGCAACCGGTGGTCACCGTGCGGGTGTGCTGGAATCGTCCTTCGTTGCGGAAGTGAAATCTGACCTGATGGGCGAGCAAACCATCCTGTGCGGTATGTTGCAGGCTGGCTCTCTGCTGTGCTTCGACAAGCTGGTGGAAGAAGGTACCGATCCAGCATACGCAGAAAAACTGATTCAGTTCGGTTGGGAAACCATCACCGAAGCACTGAAACAGGGCGGCATCACCCTGATGATGGACCGTCTCTCTAACCCGGCGAAACTGCGTGCTTATGCGCTTTCTGAACAGCTGAAAGAGATCATGGCACCCCTGTTCCAGAAACATATGGACGACATCATCTCCGGCGAATTCTCTTCCGGTATGATGGCGGACTGGGCCAACGATGATAAGAAACTGCTGACCTGGCGTGAAGAGACCGGCAAAACCGCGTTTGAAACCGCGCCGCAGTATGAAGGCAAAATCGGCGAGCAGGAGTACTTCGATAAAGGCGTACTGATGATTGCGATGGTGAAAGCGGGCGTTGAACTGGCGTTCGAAACCATGGTCGATTCCGGCATCATTGAAGAGTCTGCATATTATGAATCACTGCACGAGCTGCCGCTGATTGCCAACACCATCGCCCGTAAGCGTCTGTACGAAATGAACGTGGTTATCTCTGATACCGCTGAGTACGGTAACTATCTGTTCTCTTACGCTTGTGTGCCGTTGCTGAAACCGTTTATGGCAGAGCTGCAACCGGGCGACCTGGGTAAAGCTATTCCGGAAGGCGCGGTAGATAACGGGCAACTGCGTGATGTGAACGAAGCGATTCGCAGCCATGCGATTGAGCAGGTAGGTAAGAAACTGCGCGGCTATATGACAGATATGAAACGTATTGCTGTTGCGGGTTAA
SEQ ID NO:17：二羟酸脱水酶基因ilvD序列，来自大肠杆菌
ATGCCTAAGTACCGTTCCGCCACCACCACTCATGGTCGTAATATGGCGGGTGCTCGTGCGCTGTGGCGCGCCACCGGAATGACCGACGCCGATTTCGGTAAGCCGATTATCGCGGTTGTGAACTCGTTCACCCAATTTGTACCGGGTCACGTCCATCTGCGCGATCTCGGTAAACTGGTCGCCGAACAAATTGAAGCGGCTGGCGGCGTTGCCAAAGAGTTCAACACCATTGCGGTGGATGATGGGATTGCCATGGGCCACGGGGGGATGCTTTATTCACTGCCATCTCGCGAACTGATCGCTGATTCCGTTGAGTATATGGTCAACGCCCACTGCGCCGACGCCATGGTCTGCATCTCTAACTGCGACAAAATCACCCCGGGGATGCTGATGGCTTCCCTGCGCCTGAATATTCCGGTGATCTTTGTTTCCGGCGGCCCGATGGAGGCCGGGAAAACCAAACTTTCCGATCAGATCATCAAGCTCGATCTGGTTGATGCGATGATCCAGGGCGCAGACCCGAAAGTATCTGACTCCCAGAGCGATCAGGTTGAACGTTCCGCGTGTCCGACCTGCGGTTCCTGCTCCGGGATGTTTACCGCTAACTCAATGAACTGCCTGACCGAAGCGCTGGGCCTGTCGCAGCCGGGCAACGGCTCGCTGCTGGCAACCCACGCCGACCGTAAGCAGCTGTTCCTTAATGCTGGTAAACGCATTGTTGAATTGACCAAACGTTATTACGAGCAAAACGACGAAAGTGCACTGCCGCGTAATATCGCCAGTAAGGCGGCGTTTGAAAACGCCATGACGCTGGATATCGCGATGGGTGGATCGACTAACACCGTACTTCACCTGCTGGCGGCGGCGCAGGAAGCGGAAATCGACTTCACCATGAGTGATATCGATAAGCTTTCCCGCAAGGTTCCACAGCTGTGTAAAGTTGCGCCGAGCACCCAGAAATACCATATGGAAGATGTTCACCGTGCTGGTGGTGTTATCGGTATTCTCGGCGAACTGGATCGCGCGGGGTTACTGAACCGTGATGTGAAAAACGTACTTGGCCTGACGTTGCCGCAAACGCTGGAACAATACGACGTTATGCTGACCCAGGATGACGCGGTAAAAAATATGTTCCGCGCAGGTCCTGCAGGCATTCGTACCACACAGGCATTCTCGCAAGATTGCCGTTGGGATACGCTGGACGACGATCGCGCCAATGGCTGTATCCGCTCGCTGGAACACGCCTACAGCAAAGACGGCGGCCTGGCGGTGCTCTACGGTAACTTTGCGGAAAACGGCTGCATCGTGAAAACGGCAGGCGTCGATGACAGCATCCTCAAATTCACCGGCCCGGCGAAAGTGTACGAAAGCCAGGACGATGCGGTAGAAGCGATTCTCGGCGGTAAAGTTGTCGCCGGAGATGTGGTAGTAATTCGCTATGAAGGCCCGAAAGGCGGTCCGGGGATGCAGGAAATGCTCTACCCAACCAGCTTCCTGAAATCAATGGGTCTCGGCAAAGCCTGTGCGCTGATCACCGACGGTCGTTTCTCTGGTGGCACCTCTGGTCTTTCCATCGGCCACGTCTCACCGGAAGCGGCAAGCGGCGGCAGCATTGGCCTGATTGAAGATGGTGACCTGATCGCTATCGACATCCCGAACCGTGGCATTCAGTTACAGGTAAGCGATGCCGAACTGGCGGCGCGTCGTGAAGCGCAGGACGCTCGAGGTGACAAAGCCTGGACGCCGAAAAATCGTGAACGTCAGGTCTCCTTTGCCCTGCGTGCTTATGCCAGCCTGGCAACCAGCGCCGACAAAGGCGCGGTGCGCGATAAATCGAAACTGGGGGGTTAA
SEQ ID NO:18：支链氨基酸氨基转移酶基因ilvE序列，来自大肠杆菌
ATGACCACGAAGAAAGCTGATTACATTTGGTTCAATGGGGAGATGGTTCGCTGGGAAGACGCGAAGGTGCATGTGATGTCGCACGCGCTGCACTATGGCACTTCGGTTTTTGAAGGCATCCGTTGCTACGACTCGCACAAAGGACCGGTTGTATTCCGCCATCGTGAGCATATGCAGCGTCTGCATGACTCCGCCAAAATCTATCGCTTCCCGGTTTCGCAGAGCATTGATGAGCTGATGGAAGCTTGTCGTGACGTGATCCGCAAAAACAATCTCACCAGCGCCTATATCCGTCCGCTGATCTTCGTCGGTGATGTTGGCATGGGAGTAAACCCGCCAGCGGGATACTCAACCGACGTGATTATCGCTGCTTTCCCGTGGGGAGCGTATCTGGGCGCAGAAGCGCTGGAGCAGGGGATCGATGCGATGGTTTCCTCCTGGAACCGCGCAGCACCAAACACCATCCCGACGGCGGCAAAAGCCGGTGGTAACTACCTCTCTTCCCTGCTGGTGGGTAGCGAAGCGCGCCGCCACGGTTATCAGGAAGGTATCGCGCTGGATGTGAACGGTTATATCTCTGAAGGCGCAGGCGAAAACCTGTTTGAAGTGAAAGATGGTGTGCTGTTCACCCCACCGTTCACCTCCTCCGCGCTGCCGGGTATTACCCGTGATGCCATCATCAAACTGGCGAAAGAGCTGGGAATTGAAGTACGTGAGCAGGTGCTGTCGCGCGAATCCCTGTACCTGGCGGATGAAGTGTTTATGTCCGGTACGGCGGCAGAAATCACGCCAGTGCGCAGCGTAGACGGTATTCAGGTTGGCGAAGGCCGTTGTGGCCCGGTTACCAAACGCATTCAGCAAGCCTTCTTCGGCCTCTTCACTGGCGAAACCGAAGATAAATGGGGCTGGTTAGATCAAGTTAATCAATAA
SEQ ID NO:19：突变的支链氨基酸氨基转移酶基因milvE序列，来自大肠杆菌
GTGACCACCAAAAAGGCAGACTATATCTGGTTCAATGGGGAGATGGTTCGCTGGGAAGACGCGAAGGTGCATGTGATGTCGCACGCGCTGCACTATGGCACTTCGGTTTTTGAAGGCATCCGTTGCTACGACTCGCACAAAGGACCGGTTGTATTCCGCCATCGTGAGCATATGCAGCGTCTGCATGACTCCGCCAAAATCTATCGCTTCCCGGTTTCGCAGAGCATTGATGAGCTGATGGAAGCTTGTCGTGACGTGATCCGCAAAAACAATCTCACCAGCGCCTATATCCGTCCGCTGATCTTCGTCGGTGATGTTGGCATGGGAGTAAACCCGCCAGCGGGATACTCAACCGACGTGATTATCGCTGCTTTCCCGTGGGGAGCGTATCTGGGCGCAGAAGCGCTGGAGCAGGGGATCGATGCGATGGTTTCCTCCTGGAACCGCGCAGCACCAAACACCATCCCGACGGCGGCAAAAGCCGGTGGTAACTACCTCTCTTCCCTGCTGGTGGGTAGCGAAGCGCGCCGCCACGGTTATCAGGAAGGTATCGCGCTGGATGTGAACGGTTATATCTCTGAAGGCGCAGGCGAAAACCTGTTTGAAGTGAAAGATGGTGTGCTGTTCACCCCACCGTTCACCTCCTCCGCGCTGCCGGGTATTACCCGTGATGCCATCATCAAACTGGCGAAAGAGCTGGGAATTGAAGTACGTGAGCAGGTGCTGTCGCGCGAATCCCTGTACCTGGCGGATGAAGTGTTTATGTCCGGTACGGCGGCAGAAATCACGCCAGTGCGCAGCGTAGACGGTATTCAGGTTGGCGAAGGCCGTTGTGGCCCGGTTACCAAACGCATTCAGCAAGCCTTCTTCGGCCTCTTCACTGGCGAAACCGAAGATAAATGGGGCTGGTTAGATCAAGTTAATCAATAA
SEQ ID NO:20：甘氨酸羟甲基转移酶基因glyA序列，来自大肠杆菌
ATGTTAAAGCGTGAAATGAACATTGCCGATTATGATGCCGAACTGTGGCAGGCTATGGAGCAGGAAAAAGTACGTCAGGAAGAGCACATCGAACTGATCGCCTCCGAAAACTACACCAGCCCGCGCGTAATGCAGGCGCAGGGTTCTCAGCTGACCAACAAATATGCTGAAGGTTATCCGGGCAAACGCTACTACGGCGGTTGCGAGTATGTTGATATCGTTGAACAACTGGCGATCGATCGTGCGAAAGAACTGTTCGGCGCTGACTACGCTAACGTCCAGCCGCACTCCGGCTCCCAGGCTAACTTTGCGGTCTACACCGCGCTGCTGGAACCAGGTGATACCGTTCTGGGTATGAACCTGGCGCATGGCGGTCACCTGACTCACGGTTCTCCGGTTAACTTCTCCGGTAAACTGTACAACATCGTTCCTTACGGTATCGATGCTACCGGTCATATCGACTACGCCGATCTGGAAAAACAAGCCAAAGAACACAAGCCGAAAATGATTATCGGTGGTTTCTCTGCATATTCCGGCGTGGTGGACTGGGCGAAAATGCGTGAAATCGCTGACAGCATCGGTGCTTACCTGTTCGTTGATATGGCGCACGTTGCGGGCCTGGTTGCTGCTGGCGTCTACCCGAACCCGGTTCCTCATGCTCACGTTGTTACTACCACCACTCACAAAACCCTGGCGGGTCCGCGCGGCGGCCTGATCCTGGCGAAAGGTGGTAGCGAAGAGCTGTACAAAAAACTGAACTCTGCCGTTTTCCCTGGTGGTCAGGGCGGTCCGTTGATGCACGTAATCGCCGGTAAAGCGGTTGCTCTGAAAGAAGCGATGGAGCCTGAGTTCAAAACTTACCAGCAGCAGGTCGCTAAAAACGCTAAAGCGATGGTAGAAGTGTTCCTCGAGCGCGGCTACAAAGTGGTTTCCGGCGGCACTGATAACCACCTGTTCCTGGTTGATCTGGTTGATAAAAACCTGACCGGTAAAGAAGCAGACGCCGCTCTGGGCCGTGCTAACATCACCGTCAACAAAAACAGCGTACCGAACGATCCGAAGAGCCCGTTTGTGACCTCCGGTATTCGTGTAGGTACTCCGGCGATTACCCGTCGCGGCTTTAAAGAAGCCGAAGCGAAAGAACTGGCTGGCTGGATGTGTGACGTGCTGGACAGCATCAATGATGAAGCCGTTATCGAGCGCATCAAAGGTAAAGTTCTCGACATCTGCGCACGTTACCCGGTTTACGCATAA
SEQ ID NO:21：2脱氢泛酸酯2还原酶基因panE序列，来自大肠杆菌
ATGAAAATTACCGTATTGGGATGCGGTGCCTTAGGGCAATTATGGCTTACAGCACTTTGCAAACAGGGTCATGAAGTTCAGGGCTGGCTGCGCGTACCGCAACCTTATTGTAGCGTGAATCTGGTTGAGACAGATGGTTCGATATTTAACGAATCGCTGACCGCCAACGATCCCGATTTTCTCGCCACCAGCGATCTGCTCCTGGTGACGCTGAAAGCATGGCAGGTTTCCGATGCCGTCAAAAGCCTCGCGTCCACACTGCCTGTAACTACGCCAATACTGTTAATTCACAACGGCATGGGCACCATCGAAGAGTTGCAAAACATTCAGCAGCCATTACTGATGGGCACCACCACCCATGCAGCCCGCCGCGACGGCAATGTCATTATTCATGTGGCAAACGGTATCACGCATATTGGCCCGGCACGGCAACAGGACGGGGATTACAGTTATCTGGCGGATATTTTGCAAACCGTGTTGCCTGACGTTGCCTGGCATAACAATATTCGCGCCGAGCTGTGGCGCAAGCTGGCAGTCAACTGCGTGATTAATCCACTGACTGCCATCTGGAATTGCCCGAACGGTGAATTACGTCATCATCCGCAAGAAATTATGCAGATATGCGAAGAAGTCGCGGCGGTGATCGAACGCGAAGGGCATCATACTTCAGCAGAAGATTTGCGTGATTACGTGATGCAGGTGATTGATGCCACAGCGGAAAATATCTCGTCGATGTTGCAGGATATCCGCGCGCTGCGCCACACTGAAATCGACTATATCAATGGTTTTCTCTTACGCCGCGCCCGCGCGCATGGGATTGCCGTACCGGAAAACACCCGCCTGTTTGAAATGGTAAAAAGAAAGGAGAGTGAATATGAGCGCATCGGCACTGGTTTGCCTCGCCCCTGGTAG
SEQ ID NO:22：泛酸激酶基因coaA序列，来自大肠杆菌
ATGAGTATAAAAGAGCAAACGTTAATGACGCCTTACCTACAGTTTGACCGCAACCAGTGGGCAGCTCTGCGTGATTCCGTACCTATGACGTTATCGGAAGATGAGATCGCCCGTCTCAAAGGTATTAATGAAGATCTCTCGTTAGAAGAAGTTGCCGAGATCTATTTACCTTTGTCACGTTTGCTGAACTTCTATATAAGCTCGAATCTGCGCCGTCAGGCAGTTCTGGAACAGTTTCTTGGTACCAACGGGCAACGCATTCCTTACATTATCAGTATTGCTGGCAGTGTCGCGGTGGGGAAAAGTACAACCGCCCGTGTATTGCAGGCGCTATTAAGCCGTTGGCCGGAACATCGTCGTGTTGAACTGATCACTACAGATGGCTTCCTTCACCCTAATCAGGTTCTGAAAGAACGTGGTCTGATGAAGAAGAAAGGCTTCCCGGAATCGTATGATATGCATCGCCTGGTGAAGTTTGTTTCCGATCTCAAATCCGGCGTGCCAAACGTTACAGCACCTGTTTACTCACATCTTATTTATGATGTGATCCCGGATGGAGATAAAACGGTTGTTCAGCCTGATATTTTAATTCTTGAAGGGTTAAATGTCTTACAGAGCGGGATGGATTATCCACACGATCCACATCATGTATTTGTTTCTGATTTTGTCGATTTTTCGATATATGTTGATGCACCGGAAGACTTACTTCAGACATGGTATATCAACCGTTTTCTGAAATTCCGCGAAGGGGCTTTTACCGACCCGGATTCCTATTTTCATAACTACGCGAAATTAACTAAAGAAGAAGCGATTAAGACTGCCATGACATTGTGGAAAGAGATCAACTGGCTGAACTTAAAGCAAAATATTCTACCTACTCGTGAGCGCGCCAGTTTAATCCTGACGAAAAGTGCTAATCATGCGGTAGAAGAGGTCAGACTACGCAAATAA
SEQ ID NO:23：突变的泛酸激酶基因mcoaA序列，来自大肠杆菌
ATGAGTATAAAAGAGCAAACGTTAATGACGCCTTACCTACAGTTTGACCGCAACCAGTGGGCAGCTCTGCGTGATTCCGTACCTATGACGTTATCGGAAGATGAGATCGCCCGTCTCAAAGGTATTAATGAAGATCTCTCGTTAGAAGAAGTTGCCGAGATCTATTTACCTTTGTCACGTTTGCTGAACTTCTATATAAGCTCGAATCTGCGCCGTCAGGCAGTTCTGGAACAGTTTCTTGGTACCAACGGGCAACGCATTCCTTACATTATCAGTATTGCTGGCAGTGTCGCGGTGGGGAAAAGTACAACCGCCgctgtccttcaagccttgctgAGCCGTTGGCCGGAACATCGTCGTGTTGAACTGATCACTACAGATGGCTTCCTTCACCCTAATCAGGTTCTGAAAGAACGTGGTCTGATGAAGAAGAAAGGCTTCCCGGAATCGTATGATATGCATCGCCTGGTGAAGTTTGTTTCCGATCTCAAATCCGGCGTGCCAAACGTTACAGCACCTGTTTACTCACATCTTATTTATGATGTGATCCCGGATGGAGATAAAACGGTTGTTCAGCCTGATATTTTAATTCTTGAAGGGTTAAATGTCTTACAGAGCGGGATGGATTATCCACACGATCCACATCATGTATTTGTTTCTGATTTTGTCGATTTTTCGATATATGTTGATGCACCGGAAGACTTACTTCAGACATGGTATATCAACCGTTTTCTGAAATTCCGCGAAGGGGCTTTTACCGACCCGGATTCCTATTTTCATAACTACGCGAAATTAACTAAAGAAGAAGCGATTAAGACTGCCATGACATTGTGGAAAGAGATCAACTGGCTGAACTTAAAGCAAAATATTCTACCTACTCGTGAGCGCGCCAGTTTAATCCTGACGAAAAGTGCTAATCATGCGGTAGAAGAGGTCAGACTACGCAAATAA
SEQ ID NO:24：硫辛酰胺脱氢酶基因lpd序列，来自大肠杆菌
ATGAGTACTGAAATCAAAACTCAGGTCGTGGTACTTGGGGCAGGCCCCGCAGGTTACTCCGCTGCCTTCCGTTGCGCTGATTTAGGTCTGGAAACCGTAATCGTAGAACGTTACAACACCCTTGGCGGTGTTTGCCTGAACGTCGGCTGTATCCCTTCTAAAGCACTGCTGCACGTAGCAAAAGTTATCGAAGAAGCCAAAGCGCTGGCTGAACACGGTATCGTCTTCGGCGAACCGAAAACCGATATCGACAAGATTCGTACCTGGAAAGAGAAAGTGATCAATCAGCTGACCGGTGGTCTGGCTGGTATGGCGAAAGGCCGCAAAGTCAAAGTGGTCAACGGTCTGGGTAAATTCACCGGGGCTAACACCCTGGAAGTTGAAGGTGAGAACGGCAAAACCGTGATCAACTTCGACAACGCGATCATTGCAGCGGGTTCTCGCCCGATCCAACTGCCGTTTATTCCGCATGAAGATCCGCGTATCTGGGACTCCACTGACGCGCTGGAACTGAAAGAAGTACCAGAACGCCTGCTGGTAATGGGTGGCGGTATCATCGGTCTGGAAATGGGCACCGTTTACCACGCGCTGGGTTCACAGATTGACGTGGTTGAAATGTTCGACCAGGTTATCCCGGCAGCTGACAAAGACATCGTTAAAGTCTTCACCAAGCGTATCAGCAAGAAATTCAACCTGATGCTGGAAACCAAAGTTACCGCCGTTGAAGCGAAAGAAGACGGCATTTATGTGACGATGGAAGGCAAAAAAGCACCCGCTGAACCGCAGCGTTACGACGCCGTGCTGGTAGCGATTGGTCGTGTGCCGAACGGTAAAAACCTCGACGCAGGCAAAGCAGGCGTGGAAGTTGACGACCGTGGTTTCATCCGCGTTGACAAACAGCTGCGTACCAACGTACCGCACATCTTTGCTATCGGCGATATCGTCGGTCAACCGATGCTGGCACACAAAGGTGTTCACGAAGGTCACGTTGCCGCTGAAGTTATCGCCGGTAAGAAACACTACTTCGATCCGAAAGTTATCCCGTCCATCGCCTATACCGAACCAGAAGTTGCATGGGTGGGTCTGACTGAGAAAGAAGCGAAAGAGAAAGGCATCAGCTATGAAACCGCCACCTTCCCGTGGGCTGCTTCTGGTCGTGCTATCGCTTCCGACTGCGCAGACGGTATGACCAAGCTGATTTTCGACAAAGAATCTCACCGTGTGATCGGTGGTGCGATTGTCGGTACTAACGGCGGCGAGCTGCTGGGTGAAATCGGCCTGGCAATCGAAATGGGTTGTGATGCTGAAGACATCGCACTGACCATCCACGCGCACCCGACTCTGCACGAGTCTGTGGGCCTGGCGGCAGAAGTGTTCGAAGGTAGCATTACCGACCTGCCGAACCCGAAAGCGAAGAAGAAGTAA
表5本发明所使用的引物序列
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从实施例和对比例的实验结果看，本发明通过OUR反馈控制补料的方法可以有效提高D-泛酸发酵过程的产物浓度和转化率，并可以有效降低副产物乙酸和乳酸的积累。
以上所述实施例的各个技术特征可以任意的组合，为了描述简洁，未对上述实施例中的各项技术所有可能的组合都进行描述。然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当作为本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种制备D-泛酸的方法，其特征在于，所述方法包括：
在发酵培养重组细胞来制备D-泛酸的过程中，当发酵罐的底糖耗尽时，添加补料培养基到发酵罐中，至检测到的OUR值为80-100mmol/L/h。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述补料培养基包含40-60％质量浓度的葡萄糖和0.5-5％质量浓度的有机氮源；
优选地，所述有机氮源的质量浓度为0.5-1％，和/或，所述有机氮源为酵母浸粉或者蛋白胨；
更优选地，所述补料培养基包括：55％质量浓度的葡萄糖，0.5％质量浓度的酵母浸粉。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养使用的培养基包括：葡萄糖0.1-1％，蛋白胨0.5-1％，酵母浸粉0.5-1％，磷酸二氢钾0.2-0.5％，氯化铵0.5-1％，七水硫酸镁0.05-0.1％，四水氯化锰0.005-0.01％，无水氯化铁0.005-0.01％；
优选地，所述培养基包括：葡萄糖0.5％，蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.5％，磷酸二氢钾0.3％，氯化铵0.6％，七水硫酸镁0.07％，四水氯化锰0.006％，无水氯化铁0.01％。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件选自以下一种或多种：
(i)温度30-37℃；
(ii)pH 6.5-7.0；
(iii)通风比0.8-1.2VVM；
(iv)底糖消耗完前将DO控制在30％；底糖消耗完通过OUR来控制补糖时，将DO控制在0％以上。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件选自以下一种或多种：
(i)温度35℃，
(ii)pH 6.8，
(iii)通风比1.0VVM；
(iv)所述DO通过调整转速来控制。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组细胞在进行发酵培养前还包括种子培养的步骤，所述种子培养的培养基为LB培养基。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述种子培养后，将种子培养基接入发酵罐的接种比例为5-10。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述种子培养的条件选自以下一种或多种：
培养温度为30-35℃；
震荡培养优选在摇床中200-250ppm例如220rpm；
培养时间为3-5h。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述OUR值为90mmol/L/h。
10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述重组细胞为重组大肠杆菌，优选所述重组大肠杆菌的基因型为:ΔtdcDE::Ptrc-BsalsS/ΔpoxB::Ptrc-BsalsS/ilvC::Ptrc-milvC/ΔadhE::Ptrc-milvC/ΔpflB::Ptrc-ilvD/ilvE::milvE/ΔavtA::Ptrc-glyA/ΔldhA::Ptrc-panE/coaA::mcoaA R106A/ΔlacI::Ptrc-lpd:/ΔackA::T7-CgpanB-CgpanC/ΔyfbQ::phag-eT7R/ΔycgH::pbolA-eT7R/ΔydeU::Ptrc-bamA。
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| CN202410455400.5A CN118207265A (zh) | 2024-04-16 | 2024-04-16 | 一种制备d-泛酸的方法 |
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