CN118202948A - 一种长筒石蒜再生的基础培养基、组培培养基和再生组培方法 - Google Patents
一种长筒石蒜再生的基础培养基、组培培养基和再生组培方法 Download PDFInfo
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Classifications
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Landscapes
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Abstract
本发明属于植物繁殖栽培技术领域，具体涉及一种长筒石蒜再生的基础培养基、组培培养基和再生组培方法。本发明提供了一种长筒石蒜再生的组培培养基，所述组培培养基包括诱导培养基、增殖培养基、分化培养基、壮芽培养基与壮苗和生根培养基；在本发明提供的组培培养基中，以改良的MS培养基和改良B5培养基为基础培养基，在2,4‑D、6‑BA、IBA、NAA、碳纳米管和酪蛋白水解物共同作用下利于诱导长筒石蒜愈伤组织形成、增殖、分化和生根，再结合蔗糖这种能源物质，共同提高长筒石蒜的繁殖系数，获得大量的长筒石蒜组培苗。
Description
技术领域
本发明属于植物繁殖栽培技术领域，具体涉及一种长筒石蒜再生的基础培养基、组培培养基和再生组培方法。
背景技术
长筒石蒜(Lycoris longitubaY.Hsu&G.J.Fan)是石蒜科石蒜属的多年生草本，叶带状基生，顶端渐狭、圆头，绿色，中间淡色带明显；伞形花序有花5～7朵；蕾浅紫色，花白色，花被裂片腹面稍有淡红色条纹，长椭圆形，顶端略微反卷，边缘不皱缩，花冠筒长4～6cm；雄蕊略短于花被。长筒石蒜的花期为7～8月，有蒴果，种子呈黑色。长筒石蒜喜在阳光、潮湿的环境下生长，如阴湿山坡、岩石及石崖下，但也能耐半阴和干旱环境，稍耐寒，生命力颇强，对土壤无严格要求。长筒石蒜为狭域分布的种类，仅分布在江苏省内的阴湿的山坡，种群数量较小。
长筒石蒜的鳞茎中含石蒜碱、加兰他敏、力可拉敏等生物碱，可作为用于制药的原料；其中加兰他敏和石蒜胺碱含量较高，有解毒散结、治疗咽喉肿痛、皮肤疮疖痈肿、瘰疬等功效。通常在春季、秋季采挖2～3年生的鳞茎，洗净晒干，或切片晒干；外用时，将晒干的磷茎捣烂敷患处即可。
在园林中，长筒石蒜可做林下地被花卉，花境丛植或山石间自然式栽植。长筒石蒜花葶健壮，花茎高，也是理想的鲜切花材料。长筒石蒜通常以种子繁殖和分球繁殖的方式进行繁殖，但由于其独特的生物学特性，种子产量不高、种子萌发所需的时间长、营养生长期短(如长筒石蒜长叶子的时间为1月上中旬到4月中下旬)，从播种到开花需要5～6年时间，种球生产的周期长，成本高；对于分球繁殖，一个开花球每年仅能自然产生1～2个仔球，繁殖系数很低。
近年来，陆续建立了以鳞茎盘为外植体的长筒石蒜的组培快繁技术体系，但普遍存在繁殖系数低的问题。因此，急需对长筒石蒜的再生组培培养基进行改进。
发明内容
本发明的目的是提供一种长筒石蒜再生的基础培养基、组培培养基和再生组培方法，应用本发明提供的基础培养基和组培培养基以长筒石蒜的种胚为外植体进行长筒石蒜愈伤组织再生组培快繁提高长筒石蒜的繁殖系数。
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种长筒石蒜再生组培的基础培养基，所述基础培养基为改良B5培养基和/或改良MS培养基；所述改良B5培养基的组成包括：硫酸铵134mg/L，硼酸3mg/L，二水合氯化钙880mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，五水合硫酸铜0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，七水合硫酸亚铁27.8mg/L，七水合硫酸镁500mg/L，一水合硫酸锰10mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，碘化钾0.75mg/L，硝酸钾2500mg/L，磷酸二氢钠150mg/L，七水合硫酸锌2mg/L；肌醇100mg/L，1mg/L维生素B6，10mg/L维生素B1和烟酸5.0mg/L；
所述改良MS培养基包括：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、七水合硫酸镁370mg/L、二水合氯化钙880mg/L、四水合硫酸锰22.3mg/L、七水合硫酸锌8.6mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、二水合钼酸钠0.25mg/L、六水合氯化钴0.025mg/L、五水合硫酸铜0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水合硫酸亚铁27.8mg/L、烟酸5.0mg/L、维生素B110.0mg/L、维生素B61.0 mg/L、甘氨酸2mg/L和肌醇100mg/L。
本发明提供了一种长筒石蒜再生的组培培养基，所述组培培养基包括诱导培养基、增殖培养基、分化培养基、壮芽培养基与壮苗和生根培养基；
所述诱导培养基以上述技术方案所述的改良B5培养基为基本培养基，还包括：1.0～2.0mg/L6-BA、6.0～10.0mg/L2,4-D、酪蛋白水解物0.5～1.0g/L、蔗糖30g/L和琼脂6.5～7.0g/L；
所述增殖培养基以上述技术方案所述的改良B5培养基为基本培养基，还包括：1.0～2.0mg/L6-BA、3.0～5.0mg/L2,4-D、酪蛋白水解物0.5～1.0g/L、碳纳米管1.0～2.0mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6.5～7.0g/L；
所述分化培养基以上述技术方案所述的改良MS培养基为基本培养基，还包括：2.0～4.0mg/L6-BA、1.0～2.0mg/LNAA、酪蛋白水解物0.5～1.0g/L、碳纳米管1.0～2.0mg/L、30g/L蔗糖和6.5～7.0g/L琼脂；
所述壮芽培养基以上述技术方案所述的改良MS培养基为基本培养基，还包括：1.5～3.0mg/LNAA、2.0～4.0mg/L6-BA、碳纳米管1.0～2.0mg/L、40～60g/L蔗糖和6.5～7.0g/L琼脂；
所述壮苗和生根培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：1.5～2.0mg/L6-BA、0.5～1.0mg/LNAA、2.0～2.5mg/L IBA、碳纳米管1.0～2.0mg/L、40～60g/L蔗糖和6.5～7.0g/L琼脂。
本发明提供了一种长筒石蒜愈伤组织的再生组培方法，所述再生组培方法采用上述技术方案所述的组培培养基，包括以下步骤：
将长筒石蒜的种胚接种在诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，得到已产生愈伤组织的胚；
将所述已产生愈伤组织的胚转接于增殖培养基中进行愈伤组织增殖培养，得到愈伤组织团块；
将所述愈伤组织团块转接于分化培养基中进行愈伤组织分化培养，得到丛生芽；
将所述丛生芽转接于壮芽培养基中进行壮芽培养，得到无根苗；
将所述无根苗转接到壮苗和生根培养基上进行壮苗生根培养，得到组培苗。
优选的，在愈伤组织诱导培养前，还包括：将种胚进行清洗和消毒；所述清洗和消毒包括：先用无菌水清洗2～3次，然后采用有效氯含量0.1％～0.3％的次氯酸钠溶液消毒1～2min，无菌水清洗4～5次。
优选的，所述种胚通过如下方式获得：去除长筒石蒜蒴果果皮，沿种子纵径切开，得到种胚。
优选的，所述愈伤组织诱导培养和愈伤组织增殖培养均为暗培养；所述愈伤组织分化培养、壮芽培养和壮苗生根培养均为光暗交替培养，光照的时间为12～16h/d，所述光照的强度800～1200Lx。
优选的，所述愈伤组织团块的直径为1.5～2.5cm；所述丛生芽的长度为1.0～1.5cm。
优选的，所述愈伤组织诱导培养的时间为28～45d；所述愈伤组织增殖培养的时间为30～40d；所述愈伤组织分化培养的时间为30～40d；所述壮芽培养的时间为60～80d；所述壮苗生根培养的时间为30～40d。
优选的，在所述壮芽培养过程中，还包括将壮芽培养30～40d的培养产物转接至新的壮芽培养基上进行继代培养，得到无根苗。
优选的，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养、愈伤组织增殖培养、愈伤组织分化培养、壮芽培养和壮苗生根培养的温度均为25±1℃。
本发明的有益效果：本发明提供了一种长筒石蒜再生组培的基础培养基，所述基础培养基为改良B5培养基和/或改良MS培养基；所述改良B5培养基的组成包括：硫酸铵134mg/L，硼酸3mg/L，二水合氯化钙880mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，五水合硫酸铜0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，七水合硫酸亚铁27.8mg/L，七水合硫酸镁500mg/L，一水合硫酸锰10mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，碘化钾0.75mg/L，硝酸钾2500mg/L，磷酸二氢钠150mg/L，七水合硫酸锌2mg/L；肌醇100mg/L，1mg/L维生素B6，10mg/L维生素B1和烟酸5.0mg/L；
所述改良MS培养基包括：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、七水合硫酸镁370mg/L、二水合氯化钙880mg/L、四水合硫酸锰22.3mg/L、七水合硫酸锌8.6mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、二水合钼酸钠0.25mg/L、六水合氯化钴0.025mg/L、五水合硫酸铜0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水合硫酸亚铁27.8mg/L、烟酸5.0mg/L、10.0mg/L维生素B1、1.0mg/L维生素B6、甘氨酸2mg/L和肌醇100mg/L。
在本发明提供的再生组培的基础培养基中，改良的MS培养基中提高CaCl2·2H2O用量，提高钙元素用量可以促进对培养基中硝态氮的吸收，从而有利于愈伤组织的诱导及植株的形态建成；维生素B1、维生素B6和烟酸等有机质用量增加可以提高细胞膜的透性从而促进养分的吸收；改良B5培养基中添加钙元素、增加有机物烟酸是为了促进养分吸收；利用本发明的基础培养基可以显著提高长筒石蒜愈伤组织诱导率和分化率，最终提高繁殖系数。
本发明还提供了一种长筒石蒜再生的组培培养基，所述组培培养基包括诱导培养基、增殖培养基、分化培养基、壮芽培养基与壮苗和生根培养基；
所述诱导培养基以改良B5培养基为基本培养基，还包括：1.0～2.0mg/L 6-BA、6.0～10.0mg/L 2,4-D、酪蛋白水解物0.5～1.0g/L、蔗糖30g/L和琼脂6.5～7.0g/L；
所述增殖培养基以改良B5培养基为基本培养基，还包括：1.0～2.0mg/L 6-BA、3.0～5.0mg/L 2,4-D、酪蛋白水解物0.5～1.0g/L、碳纳米管1.0～2.0mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6.5～7.0g/L；
所述分化培养基以改良MS培养基为基本培养基，还包括：2.0～4.0mg/L 6-BA、1.0～2.0mg/LNAA、酪蛋白水解物0.5～1.0g/L、碳纳米管1.0～2.0mg/L、30g/L蔗糖和6.5～7.0g/L琼脂；
所述壮芽培养基以改良MS培养基为基本培养基，还包括：1.5～3.0mg/LNAA、2.0～4.0mg/L6-BA、碳纳米管1.0～2.0mg/L、40～60g/L蔗糖和6.5～7.0g/L琼脂；
所述壮苗和生根培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：1.5～2.0mg/L6-BA、0.5～1.0mg/LNAA、2.0～2.5mg/L IBA、碳纳米管1.0～2.0mg/L、40～60g/L蔗糖和6.5～7.0g/L琼脂。
在组培培养基中，添加的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)促进长筒石蒜愈伤组织的形成；6-BA(6-苄氨基嘌呤)刺激细胞分裂促进长筒石蒜生长和发育，促进愈伤组织的形成；NAA(α-萘乙酸)促进长筒石蒜发芽、生长和生根；IBA的作用为生根，酪蛋白水解物促进长筒石蒜种胚和丛生芽的分化；碳纳米管可以促进长筒石蒜愈伤组织的生长、芽的生长和生根；在2,4-D、6-BA、IBA、NAA、碳纳米管和酪蛋白水解物共同作用下利于诱导长筒石蒜愈伤组织形成、增殖、分化和生根，再结合蔗糖这种能源物质，共同提高长筒石蒜的愈伤组织诱导率和分化率，最终提高繁殖系数，获得大量的长筒石蒜组培苗。实施例结果表明：利用本发明的组培培养基可以获得大量的长筒石蒜组培苗，提高长筒石蒜的繁殖系数。可见本发明通过所述诱导培养基、增殖培养基、分化培养基、壮芽培养基与壮苗和生根培养基的各个组分之间相互协同作用，在适宜的组分浓度控制下提高长筒石蒜的繁殖系数，缩短组培周期。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1长筒石蒜种胚愈伤组织的诱导第12d的情况；
图2为实施例1长筒石蒜种胚愈伤组织的诱导第30d情况；
图3为实施例1长筒石蒜愈伤组织的分化第28d情况；
图4为实施例1长筒石蒜无根苗的壮苗和生根培养第25d情况。
具体实施方式
本发明提供一种长筒石蒜再生组培的基础培养基，所述基础培养基为改良B5培养基和/或改良MS培养基。
本发明所述改良B5培养基的组成包括：硫酸铵134mg/L，硼酸3mg/L，二水合氯化钙880mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，五水合硫酸铜0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，七水合硫酸亚铁27.8mg/L，七水合硫酸镁500mg/L，一水合硫酸锰10mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，碘化钾0.75mg/L，硝酸钾2500mg/L，磷酸二氢钠150mg/L，七水合硫酸锌2mg/L；肌醇100mg/L，1mg/L维生素B6，10mg/L维生素B1和烟酸5.0mg/L；更优选为所述改良B5培养基仅含有：硫酸铵134mg/L，硼酸3mg/L，二水合氯化钙880mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，五水合硫酸铜0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，七水合硫酸亚铁27.8mg/L，七水合硫酸镁500mg/L，一水合硫酸锰10mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，碘化钾0.75mg/L，硝酸钾2500mg/L，磷酸二氢钠150mg/L，七水合硫酸锌2mg/L；肌醇100mg/L，1mg/L维生素B6，10mg/L维生素B1和烟酸5.0mg/L。所述改良B5培养基的为添加880mg/L CaCl2·2H2O和有机物烟酸5mg/L。
在本发明提供的再生组培的基础培养基中，改良B5培养基中添加CaCl2·2H2O和有机物烟酸是为了促进外植体对养分尤其是硝态氮的吸收。
本发明所述改良MS培养基包括：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、七水合硫酸镁370mg/L、二水合氯化钙880mg/L、四水合硫酸锰22.3mg/L、七水合硫酸锌8.6mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、二水合钼酸钠0.25mg/L、六水合氯化钴0.025mg/L、五水合硫酸铜0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水合硫酸亚铁27.8mg/L、烟酸5.0mg/L、10.0mg/L维生素B1、1.0mg/L维生素B6、甘氨酸2mg/L和肌醇100mg/L；更优选为所述改良MS培养基仅含有：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、七水合硫酸镁370mg/L、二水合氯化钙880mg/L、四水合硫酸锰22.3mg/L、七水合硫酸锌8.6mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、二水合钼酸钠0.25mg/L、六水合氯化钴0.025mg/L、五水合硫酸铜0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水合硫酸亚铁27.8mg/L、烟酸5.0mg/L、10.0mg/L维生素B1、1.0mg/L维生素B6、甘氨酸2mg/L和肌醇100mg/L。
在本发明提供的再生组培的基础培养基中，改良的MS培养基中添加CaCl2·2H2O和提高其用量的可以促进对培养基中硝态氮的吸收，从而有利于愈伤组织的诱导及植株的形态建成，维生素B1和烟酸用量提高可以提高细胞膜的透性从而促进养分的吸收。
本发明提供了一种长筒石蒜再生的组培培养基，所述组培培养基包括诱导培养基、增殖培养基、分化培养基、壮芽培养基与壮苗和生根培养基。
本发明所述诱导培养基以上述技术方案所述改良B5培养基为基本培养基，还包括：1.0～2.0mg/L 6-BA、6.0～10.0mg/L2,4-D、酪蛋白水解物0.5～1.0g/L、蔗糖30g/L和琼脂6.5～7.0g/L；优选为以改良B5培养基为基本培养基，还仅含有：1.0～2.0mg/L6-BA、6.0～10.0mg/L2,4-D、酪蛋白水解物0.5～1.0g/L、蔗糖30g/L和琼脂6.5～7.0g/L。
本发明的诱导培养基中6-BA的浓度为1.0～2.0mg/L，优选为1.2～1.8mg/L，更优选为1.5mg/L。所述诱导培养基中2,4-D的浓度为6.0～10.0mg/L，优选为7.0～9.0mg/L，更优选为8mg/L。所述诱导培养基中酪蛋白水解物的浓度为0.5～1.0g/L，优选为0.7～0.9g/L，更优选为0.8g/L。所述诱导培养基中琼脂的浓度为6.5～7.0g/L，更优选6.7g/L。本发明添加的2,4-D、6-BA和酪蛋白水解物能够促进愈伤组织的形成。对所述酪蛋白水解物的来源没有特殊限定，采用常规的市售产品即可。在本发明实施例中，应用的酪蛋白水解物购买自高教研(北京)科技有限公司。
在本发明中，所述诱导培养基的pH值优选为5.75～5.85，更优优选为5.80。
本发明所述增殖培养基以上述技术方案所述改良B5培养基为基本培养基，还包括：1.0～2.0mg/L6-BA、3.0～5.0mg/L2,4-D、酪蛋白水解物0.5～1.0g/L、碳纳米管1.0～2.0mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6.5～7.0g/L；优选为以改良B5培养基为基本培养基，还仅含有：1.0～2.0mg/L6-BA、3.0～5.0mg/L2,4-D、酪蛋白水解物0.5～1.0g/L、碳纳米管1.0～2.0mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6.5～7.0g/L。本发明的增殖培养基中6-BA的浓度为1.0～2.0mg/L，优选为1.3～1.7mg/L，更优选为1.5mg/L。所述增殖培养基中2,4-D的浓度为3.0～5.0mg/L，优选为3.5～4.5mg/L，更优选为4.0mg/L。所述增殖培养基中酪蛋白水解物的浓度为0.5～1.0g/L，优选为0.7～0.9g/L，更优选为0.8g/L。所述增殖培养基中碳纳米管的浓度为1.0～2.0mg/L，优选为1.2～1.7mg/L，更优选为1.5mg/L。本发明所述碳纳米管优选为多壁碳纳米管。所述增殖培养基中琼脂的浓度为6.5～7.0g/L，更优选6.7g/L。本发明中6-BA、2,4-D、酪蛋白水解物和碳纳米管在适当浓度配比下能够共同促进长筒石蒜的愈伤组织的增殖。
在本发明中，所述增殖培养基的pH值优选为5.75～5.85，更优优选为5.80。
本发明所述分化培养基以上述技术方案所述改良MS培养基为基本培养基，还包括：2.0～4.0mg/L 6-BA、1.0～2.0mg/LNAA、酪蛋白水解物0.5～1.0g/L、碳纳米管1.0～2.0mg/L、30g/L蔗糖和6.5～7.0g/L琼脂；优选为以改良MS培养基为基本培养基，还仅含有：2.0～4.0mg/L 6-BA、1.0～2.0mg/LNAA、酪蛋白水解物0.5～1.0g/L、碳纳米管1.0～2.0mg/L、30g/L蔗糖和6.5～7.0g/L琼脂。
本发明的分化培养基中6-BA的浓度为2.0～4.0mg/L，优选为2.3～3.3mg/L，更优选为3.0mg/L。所述分化培养基中NAA的浓度为1.0～2.0mg/L，优选为1.2～1.8mg/L，更优选为1.4mg/L。所述分化培养基中酪蛋白水解物的浓度为0.5～1.0g/L，优选为0.6～0.8g/L，更优选为0.7g/L。所述分化培养基中碳纳米管的浓度为1.0～2.0mg/L，优选为1.1～1.6mg/L，更优选为1.4mg/L。本发明所述碳纳米管优选为多壁碳纳米管。目前商品化的碳纳米管有3种：单壁碳纳米管、多壁碳纳米管和羧化多壁碳纳米管；经过前期的实验，3种碳纳米管的效果差不多，多壁碳纳米管价格最便宜，因此选用多壁碳纳米管。所述分化培养基中琼脂的浓度为6.5～7.0g/L，更优选6.7g/L。本发明在2,4-D、6-BA、NAA、酪蛋白水解物和碳纳米管的适当组分的特定作用下促进愈伤组织分化成大量丛生芽。
在本发明中，所述分化培养基的pH值优选为5.75～5.85，更优优选为5.80。
本发明所述壮芽培养基以上述技术方案所述改良MS培养基为基本培养基，还包括：1.5～3.0mg/LNAA、2.0～4.0mg/L6-BA、碳纳米管1.0～2.0mg/L、40～60g/L蔗糖和6.5～7.0g/L琼脂；优选为以改良MS培养基为基本培养基，还仅含有：1.5～3.0mg/LNAA、2.0～4.0mg/L 6-BA、碳纳米管1.0～2.0mg/L、40～60g/L蔗糖和6.5～7.0g/L琼脂。本发明的壮芽培养基中6-BA的浓度为2.0～4.0mg/L，优选为2.5～3.6mg/L，更优选为2.0～3.0mg/L。所述壮芽培养基中NAA的浓度为1.5～3.0mg/L，优选为1.8～2.5mg/L，更优选为2.0mg/L。所述壮芽培养基中碳纳米管的浓度为1.0～2.0mg/L，优选为1.3～1.8mg/L，更优选为1.5mg/L。本发明所述碳纳米管优选为多壁碳纳米管。目前商品化的碳纳米管有3种：单壁碳纳米管、多壁碳纳米管和羧化多壁碳纳米管；经过前期的实验，3种碳纳米管的效果差不多，多壁碳纳米管价格最便宜，因此选择多壁碳纳米管。所述壮芽培养基中琼脂的浓度为6.5～7.0g/L，更优选6.7g/L。本发明在改良MS培养基、NAA、6-BA和碳纳米管的作用下促进丛生芽的生长，从而得到无根苗。
在本发明中，所述壮芽培养基的pH值优选为5.75～5.85，更优优选为5.80。
本发明所述壮苗和生根培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：1.5～2.0mg/L6-BA、0.5～1.0mg/LNAA、2.0～2.5mg/L IBA、碳纳米管1.0～2.0mg/L、40～60g/L蔗糖和6.5～7.0g/L琼脂；优选为所述壮苗和生根培养基以MS培养基为基本培养基，还仅含有：1.5～2.0mg/L 6-BA、0.5～1.0mg/LNAA、2.0～2.5mg/L IBA、碳纳米管1.0～2.0mg/L、40～60g/L蔗糖和6.5～7.0g/L琼脂。
本发明的壮苗和生根培养基中6-BA的浓度为1.5～2.0mg/L，优选为1.6～1.9mg/L，更优选为1.8mg/L。所述壮苗和生根培养基中NAA的浓度为0.5～1.0mg/L，优选为0.7～0.9mg/L，更优选为0.8mg/L。所述壮苗和生根培养基中IBA的浓度为2.0～2.5mg/L，优选为2.1～2.4mg/L，更优选为2.3mg/L。所述壮苗和生根培养基中碳纳米管的浓度为1.0～2.0mg/L，优选为1.1～1.7mg/L，更优选为1.6mg/L。本发明所述碳纳米管优选为多壁碳纳米管。目前商品化的碳纳米管有3种：单壁碳纳米管、多壁碳纳米管和羧化多壁碳纳米管；经过前期的实验，3种碳纳米管的效果差不多，多壁碳纳米管最便宜，因此选择多壁碳纳米管。所述壮苗和生根培养基中琼脂的浓度为6.5～7.0g/L，更优选6.7g/L。本发明的NAA、6-BA、IBA和碳纳米管可以促进长筒石蒜的无根苗生根和生长，得到组培苗。
在本发明中，所述壮苗和生根培养的pH值优选为5.75～5.85，更优优选为5.80。
本发明提供的诱导培养基、增殖培养基、分化培养基、壮芽培养基与壮苗和生根培养基中均含有蔗糖，蔗糖可以植物生长所需的碳源，促进愈伤组织的发生和丛生芽的萌发、生长；本发明在2,4-D、6-BA、NAA、IBA、碳纳米管、酪蛋白水解物和蔗糖的共同作用下促进长筒石蒜的芽的生长和分化、无根苗的生根。本发明提供的组培培养基应用效果好，可以同时获得大量的组培苗，缩短了长筒石蒜育苗的时间和降低了育苗的成本，提高愈伤组织诱导率和分化率，最终提高了繁殖系数，缩短组培周期。
本发明对所述B5培养基、MS培养基、2,4-D、6-BA、NAA、IBA、碳纳米管、酪蛋白水解物、蔗糖和琼脂的来源没有特殊的限定，采用常规的市售产品即可。
本发明还提供了一种长筒石蒜愈伤组织的再生组培方法，所述再生组培方法采用上述技术方案所述的组培培养基，包括以下步骤：
将长筒石蒜的种胚接种在诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，得到已产生愈伤组织的胚；
将所述已产生愈伤组织的胚转接于增殖培养基中进行愈伤组织增殖培养，得到愈伤组织团块；
将所述愈伤组织团块转接于分化培养基中进行愈伤组织分化培养，得到丛生芽；
将所述丛生芽转接于壮芽培养基中进行壮芽培养，得到无根苗；
将所述无根苗转接到壮苗和生根培养基上进行壮苗生根培养，得到组培苗。
本发明长筒石蒜的种胚接种在诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，得到已产生愈伤组织的胚。本发明优选以长筒石蒜的种胚作为外植体进行育苗。在本发明中，所述长筒石蒜的种胚优选通过如下方式获得：去除长筒石蒜蒴果果皮，沿种子纵径切开，得到种胚。本发明所述种胚优选为完整的成熟种胚。
本发明所述长筒石蒜蒴果的采集时间优选为长筒石蒜蒴果的果皮变黄，种皮变黑时9～10月份进行采集。本发明所述蒴果采集时间的选择是为了提高种胚愈伤组织的诱导率。
在本发明中，在愈伤组织诱导培养前，优选还包括：将种胚进行清洗和消毒。本发明所述清洗优选利用无菌水完成。本发明对所述清洗方式没有特殊限定，保证清洗干净即可。本发明优选先用无菌水清洗2～3次，然后采用有效氯含量0.1％～0.3％的次氯酸钠溶液消毒1～2min，再用无菌水清洗4～5次。本发明优选先用无菌水清洗2～3次，更优选为3次；所述采用有效氯质量含量0.1％～0.3％的次氯酸钠溶液消毒，更优选为利用有效氯含量0.1％～0.2％的次氯酸钠溶液消毒，本发明所述消毒的时间优选为1～2min，更优选为1min；最后再优选用无菌水清洗4～5次，更优选为清洗4次。
现有技术中长筒石蒜组培快繁的方式大多以鳞茎盘为外植体，诱导产生从生芽，进而壮芽、诱导生根，从而建立其快繁技术体系。此技术最大的缺点是繁殖系数低，愈伤组织诱导率低。本发明以种胚作为外植体进行组织培养快繁育苗，解决了现有技术中利用鳞茎盘为外植体进行组培育苗时的繁殖系数低，愈伤组织诱导率低的技术问题，可以获得大量的一致性好、健壮的长筒石蒜植株，并同时缩短组培周期。
种胚清洗和消毒后，本发明优选将长筒石蒜的种胚接种在诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，得到已产生愈伤组织的胚。本发明每个诱导培养基中优选接种一个种胚。本发明所述种胚的接种方式优选为水平放置于诱导培养基上。在本发明中，所述愈伤组织诱导培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃。本发明所述愈伤组织诱导培养优选为暗培养；所述愈伤组织诱导培养的时间优选为28～45d，进一步优选为30～43d，更优选为32～40d。本发明所述诱导培养的时间从种胚接种于诱导培养基开始计算至得到出现淡黄色的愈伤组织的胚为止。
出现淡黄色的愈伤组织的胚后；本发明将所述将所述已产生愈伤组织的胚转接于增殖培养基中进行愈伤组织增殖培养，得到愈伤组织团块；
在本发明中，所述增殖培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃。在本发明中，所述增殖培养优选为暗培养。所述增殖培养的时间优选为30～40d，更优选为35～40d。本发明所述增殖培养的时间从已产生愈伤组织的胚转接于增殖培养基开始计算至得到愈伤组织团块直径为1.5～2.5cm为止。
增殖培养得到直径为1.5～2.5cm的愈伤组织团块后；本发明将所述愈伤组织团块转接于分化培养基中进行愈伤组织分化培养，得到丛生芽。
本发明优选将直径为1.5～2.5cm的愈伤组织团块转接于分化培养基中进行愈伤组织分化培养，更优选为将直径为1.8～2.0cm的愈伤组织团块转接于分化培养基中进行愈伤组织分化培养。本发明分化培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃。在本发明中，所述分化培养优选为光暗交替培养；光培养的光照的时间优选为12～16h/d，进一步优选为14～16h/d，更优选为16h/d；所述光照的强度优选为800～1200Lx，更优选为1000Lx。本发明所述分化培养的培养时间优选为30～40d，更优选为35～40d。
分化培养得到高度为1.0～1.5cm的丛生芽后；本发明优选将丛生芽从愈伤组织上分离出来转接于壮芽培养基中进行壮芽培养，得到无根苗。
本发明壮芽培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃。在本发明中，所述壮芽培养优选为光暗交替培养；光培养的光照的时间优选为12～16h/d，进一步优选为14～16h/d，更优选为16h/d；所述光照的强度优选为800～1200Lx，更优选为1000Lx。本发明所述壮芽培养的培养时间优选为60～80d，更优选为70～80d。
本发明在所述壮芽培养过程中，优选还包括将壮芽培养30～40d的培养产物转接至新的壮芽培养基中进行继代培养，得到无根苗；更优选为壮芽培养35～40d的培养产物转接至新的壮芽培养基中进行继代培养，得到无根苗。本发明所述继代培养优选为更换培养基，继代培养的培养基同壮芽培养基。本发明所述壮芽培养的时间从转接于壮芽培养基开始计算至得到叶片3～4片和鳞茎周径0.8～1.5cm的无根苗为止。
壮芽培养得到叶片3～4片或鳞茎周径0.8～1.5cm的无根苗后；本发明将所述将所述无根苗转接到壮苗和生根培养基上进行壮苗生根培养，得到组培苗。
在本发明中，所述壮苗生根培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃。在本发明中，所述壮苗生根培养优选在光暗交替培养条件下进行的，本发明光照的时间优选为12～16h/d，进一步优选为14～16h/d，更优选为16h/d；所述光照的强度优选为800～1200Lx，更优选为1000Lx。本发明所述壮苗生根培养的培养时间优选为30～40d，进一步优选为35～40d，更优选为40d。
在本发明中，所述愈伤组织诱导培养、愈伤组织增殖培养、愈伤组织分化培养、壮芽培养和壮苗生根培养优选在组培瓶中进行，对所述组培瓶的规格没有特殊限定，采用常规的产品即可。本发明所述愈伤组织诱导培养基、诱导培养基、分化培养基、壮芽培养基、壮苗和生根培养基灭菌后倒入组培瓶中，本发明对所述灭菌的方式没有特殊限定，采用常规的方式即可。
本发明壮苗生根培养后优选得到鳞茎周径1.5～2.0cm、根3～5条和重1.5～2.0g的长筒石蒜试管苗。本发明所述试管苗的鳞茎周径优选为1.5～2.0cm，更优选为1.6～1.8cm，本发明所述试管苗的根系优选为3～5条，更优选为4条。本发明所述试管苗的重量优选为1.5～2.0g，更优选为1.6～1.8g。
本发明所述壮苗生根培养后得到试管苗，所述试管苗同时满足鳞茎直径0.3～0.5cm、根系3～5条和重1.5～2.0g三个条件后进行炼苗移栽和移栽培养，以提高试管苗的成活率。
得到试管苗后，本发明优选对所述试管苗进行炼苗和移栽。在本发明中，所述炼苗优选在室内完成，所述炼苗的温度优选为长筒石蒜生长的温度，所述炼苗的时间优选为4～6d，更优选为6d。本发明优选炼苗时将壮苗生根培养组培瓶松盖后，先置于组培室缓冲间放置2～3d，再置于自然散射光下放置2～3d。
在本发明中，所述移栽时优选将炼苗后的试管苗洗净根部后移栽至基质中培养，所述移栽培养用基质优选包括以下体积份的组分：泥炭土0.5～1.5份、珍珠岩0.5～1.5份和田园土0.5～1.5份。本发明所述泥炭土、珍珠岩和田园土的体积比优选为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)，进一步优选为(0.8～1.3)：(0.8～1.3)：(0.8～1.3)，更优选为1：1：1；所述移栽的温度优选为15～28℃，进一步优选为20～28℃，更优选为25℃。移栽前，本发明优选对所述基质进行消毒，本发明对所述消毒的方式没有特殊限定，本发明优选应用800倍～1000倍广谱杀菌剂对基质进行消毒处理，更优选为800倍。本发明所述广谱杀菌剂优选为百菌清。
本发明对所述移栽培养时应用的穴盘的来源和规格没有特殊限定，采用常规产品即可。本发明中所述应用的穴盘规格优选为10行×10列。本发明优选每个穴盘中栽1～2株试管苗。本发明所述移栽之后浇足够的定根水，之后进行正常的水肥管理即可。
现有技术中的长筒石蒜采用鳞茎盘为外植体，愈伤组织诱导率低，繁殖系数低。本发明的创新点是在于采用种胚为外植体，采用特定生长调节剂组合，进行愈伤组织的诱导，提高愈伤组织诱导率和分化率，最终提高繁殖系数。
本技术以长筒石蒜种胚为外植体，诱导产生愈伤组织，经过增殖培养后，诱导其分化出丛生芽，在经过壮芽培养、壮苗生根培养等步骤，获得一致性好、健壮的长筒石蒜植株，本发明建立药赏两用植物长筒石蒜基于愈伤组织的再生技术体系，为长筒石蒜的种球扩繁和遗传转化体系的建立提供技术支撑，也为其在观赏和药用方面的产业化应用奠定基础。本发明组培获得的长筒石蒜植株种质不退化可以确保观赏效果和药材的质量，将为其规模化栽培提供技术支撑，也为长筒石蒜农杆菌介导的遗传转化体系的建立奠定技术基础。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
改良B5培养基和改良MS培养基用于下述实施例和对比例，具体组成如下：
改良B5培养基的方法为在B5培养基的配方中添加880mg/L二水合氯化钙，并将有机物烟酸用量增至5mg/L；改良B5培养基的组成为：硫酸铵134mg/L，硼酸3mg/L，二水合氯化钙880mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，五水合硫酸铜0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，七水合硫酸亚铁27.8mg/L，七水合硫酸镁500mg/L，一水合硫酸锰10mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，碘化钾0.75mg/L，硝酸钾2500mg/L，磷酸二氢钠150mg/L，七水合硫酸锌2mg/L；肌醇100mg/L，烟酸5mg/L，1mg/L维生素B6，10mg/L维生素B1。
改良MS培养基的方法为在MS培养基中添加二水合氯化钙，使其用量增至原本组成中用量增加至880mg/L，并将MS培养基中的有机成分维生素B1和烟酸用量提高至原来的10倍，维生素B6增至原来的2倍，分别为10.0mg/LVB1、1.0mg/L VB6和烟酸5.0mg/L；改良MS培养基的组成为硝酸铵(NH4NO3)1650mg/L、硝酸钾(KNO3)1900mg/L、磷酸二氢钾(KH2PO4)170mg/L、七水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)370mg/L、二水合氯化钙(CaCl2·2H2O)880mg/L、四水合硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.3mg/L、七水合硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6mg/L、碘化钾(KI)0.83mg/L、硼酸(H3BO3)6.2mg/L、二水合钼酸钠(NaMoO4·2H2O)0.25mg/L、六水合氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025mg/L、五水合硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA)37.3mg/L、七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8mg/L、烟酸(VB5)5.0mg/L、盐酸硫胺素(VB1)10.0mg/L、盐酸吡哆醇(维生素B6)1.0mg/L、甘氨酸2mg/L、肌醇100mg/L。
实施例1
1外植体的获取：于2022年9月底，在长筒石蒜果皮变黄，种皮变黑时，将蒴果采下，带回实验室，将果皮去除，沿种子纵径将其切开，获得长筒石蒜完整的种胚。
2外植体的消毒：于超净台上用无菌水将步骤1所得种胚清洗3次，之后用有效氯含量为0.1％的次氯酸钠溶液消毒1.0min，无菌水清洗4次，备用。
3愈伤组织的诱导：将步骤2消毒后的种胚水平接种到愈伤组织诱导培养基上，诱导培养基组成为：以改良B5培养基为基础培养基，还仅添加1.0mg/L 6-BA，6.0mg/L 2,4-D，1.0g/L酪蛋白水解物、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂，pH值为5.8。诱导培养为黑暗培养，种胚水平接种到愈伤组织诱导培养基的第1d即为诱导培养的第1d，诱导培养12d后，胚即开始萌动，诱导培养28d后，胚表面出现淡黄色的愈伤组织。
4愈伤组织的增殖：步骤3诱导培养培养32d后，将已产生愈伤组织的胚转接到愈伤组织增殖培养基上，进行增殖培养。愈伤组织增殖培养基组成为：以改良B5培养基为基本培养基，还仅添加6-BA 1.0mg/L、5.0mg/L 2,4-D、酪蛋白水解物1.0g/L、碳纳米管1.0mg/L、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂；pH值为5.8，增殖培养为黑暗培养。经过35d的增殖培养后，愈伤组织增殖为直径2.0cm的团块。
5愈伤组织的分化：将步骤3直径为2.0cm的团块转接到愈伤组织分化培养基上进行分化培养。分化培养基组成为：以改良MS为基本培养基，还仅添加6-BA2.0 mg/L、NAA1.0mg/L、酪蛋白水解物1.0g/L、碳纳米管1.0mg/L、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂；pH值为5.8，增殖培养为光暗交替培养。光暗交替培养的光照培养的时间为16h/d，黑暗培养时间为8h/d，光照培养的光照强度为800～1200lx；经过35d的培养，可观察到淡黄的愈伤组织分化出白色的芽点，进而分化出大量丛生芽。
6壮芽培养：将步骤5的高度为1.0～1.5cm的丛生芽从愈伤组织上分离出来，转接到壮芽培养基上进行壮芽培养。壮芽培养基组成为：以改良MS为基本培养基，还仅添加6-BA2.0 mg/L、NAA 1.5mg/L、碳纳米管1.0mg/L、蔗糖50g/L和6.5g/L琼脂；pH值为5.8。
经过35d的培养，同样的壮芽培养基配方继续继代培养一次。再经过35d的培养，丛生芽长成叶片3～4片、鳞茎周径0.8～1.5cm的无根试管苗。
7壮苗和生根培养：壮苗和生根培养可一步完成。具体方法是将步骤6壮芽培养后获得的无根试管苗转接到壮芽和生根培养基上进行壮芽和生根共培养。壮芽和生根培养基的组分为：以MS为基本培养基，还仅添加1.5mg/L 6-BA，0.5mg/LNAA、2.0mg/L IBA、1.0mg/L碳纳米管、蔗糖40g/L和琼脂6.5g/L。壮芽和生根共培养的温度为25±1℃，光照强度为800～1200lx，光照时间为16h/d。培养40d后，即可获得鳞茎周径1.5～2.0cm、根3～5条，试管苗鲜重0.5～1.0g的试管苗。
8炼苗和移栽：炼苗在室内进行，具体为：将组培瓶松盖后，置于组培室缓冲间，放置3d，之后移入室内，置于自然散射光下，再放置3d。炼苗完成后，用镊子将试管苗取出，洗去根部的培养基，移栽到10×10的穴盘中，浇足定根水(浇足定根水的判断标准为有水从穴盘底漏出即可)。栽培基质为泥炭土、珍珠岩和田园土，泥炭土、珍珠岩和田园土的体积比为1:1:1。栽培基质须经800倍百菌清消毒处理后再移栽试管苗。之后进行正常的水肥管理。
实施例2
1外植体的获取：于2022年10月上旬，将已采收并在冰箱中储存约半月长筒石蒜果实剥去果皮，获得其成熟的种子，用解剖刀沿纵径将其切开，获得长筒石蒜完整的种胚。
2外植体的消毒：于超净台上用无菌水将步骤1所得种胚清洗3次，之后用有效氯含量为0.3％的次氯酸钠溶液消毒1.0min，无菌水清洗4次，备用。
3愈伤组织的诱导：将步骤2消毒后的种胚水平接种到愈伤组织诱导培养基上，诱导培养基组成为：以改良B5培养基为基础培养基，还仅添加2.0mg/L 6-BA，8.0mg/L 2,4-D，1.0g/L酪蛋白水解物、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂，pH值为5.8。诱导培养为黑暗培养，种胚水平接种到愈伤组织诱导培养基的第1d即为诱导培养的第1d，诱导培养15d后，胚即开始萌动，诱导培养30d后，胚表面出现淡黄色的愈伤组织。
4愈伤组织的增殖：诱导培养40d后，将已产生愈伤组织的胚转接到愈伤组织增殖培养基上进行增殖培养。
愈伤组织增殖培养基组成为：以改良B5培养基为基本培养基，还仅添加2.0mg/L6-BA、4.0mg/L 2,4-D、0.5g/L酪蛋白水解物、2.0mg/L多壁碳纳米管、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂；pH值为5.8，增殖培养为黑暗培养。经过40d的增殖培养后，愈伤组织增殖为直径约1.8cm的团块。
5愈伤组织的分化：将步骤3直径约1.8cm的团块转接到愈伤组织分化培养基上进行分化培养。分化培养基的组分为：以改良MS为基本培养基，还仅添加3.0mg/L 6-BA、2.0mg/LNAA、0.5g/L酪蛋白水解物、1.5mg/L多壁碳纳米管、蔗糖30g/L和7.0g/L琼脂；pH值为5.8，增殖培养为光暗交替培养。光暗交替培养的光照培养的时间为16h/d，黑暗培养时间为8h/d，光照培养的光照强度为800～1200lx；经过40d的培养，可观察到淡黄的愈伤组织分化出白色的芽点，进而分化出大量丛生芽。
6壮芽培养：将步骤5所得的高度为1.0～1.5cm丛生芽从愈伤组织上分离出来，转接到壮芽培养基上进行壮芽培养。壮芽培养基组成为：以改良MS为基本培养基，还仅添加6-BA4.0 mg/L、NAA2.0mg/L、多壁碳纳米管2.0mg/L、蔗糖60g/L和7.0g/L琼脂；pH值为5.8。
经过40d的培养，同样的壮芽培养基配方继续继代培养一次。再经过40d的培养，丛生芽长成叶片3～4片、鳞茎周径0.8～1.5cm的无根试管苗。
7壮苗和生根培养：壮苗和生根培养可一步完成。具体方法是将步骤6壮芽培养后获得的无根试管苗转接到壮芽和生根培养基上进行壮苗和生根培养。壮苗和生根培养基的组分为：以MS为基本培养基，还仅添加2.0mg/L 6-BA，1.0mg/LNAA，2.5mg/L IBA，2.0mg/L碳纳米管、40g/L蔗糖和7.0g/L琼脂，pH值为5.8。壮苗和生根培养的培养温度为25±1℃，光照强度800～1200lx，光照时间16h/d。培养40d后，即可获得鳞茎周径1.5～2.0cm、根3～5条，重1.5～2.0g的试管苗。
8炼苗和移栽：炼苗在室内进行，具体为：将组培瓶松盖后，置于组培室缓冲间，放置3d，之后移入室内，置于自然散射光下，再放置3d。炼苗完成后，用镊子将试管苗取出，洗去根部的培养基，移栽到规格为10×10的穴盘中，浇足定根水。栽培基质为泥炭土、珍珠岩和田园土，泥炭土、珍珠岩和田园土的体积比为1:1:1；栽培基质须先经800倍广谱杀菌剂消毒处理后再移栽，移栽之后进行正常的水肥管理。
对比例1
同实施例1中的步骤1～3，唯一的区别在于外植体为长筒石蒜鳞茎盘。
愈伤组织诱导率(％)＝诱导出愈伤组织的种胚数*100/接种种胚数
愈伤组织芽分化率(％)＝分化的愈伤组织块数*100/接种愈伤组织块数
表1不同外植体对愈伤组织诱导和分化的影响
实施例3
同实施例1中的步骤1～5，唯一的区别在于分化培养基的组成为：以改良MS为基本培养基，还仅添加6-BA2.0mg/L、NAA 1.0mg/L、酪蛋白水解物0.75g/L、碳纳米管1.0mg/L、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂。
对比例2
同实施例1中的步骤1～5，唯一的区别在于分化培养基的组成为：以改良MS为基本培养基，还仅添加6-BA2.0mg/L、NAA 1.0mg/L、碳纳米管1.0mg/L、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂。
对比例3
同实施例1中的步骤1～5，唯一的区别在于分化培养基的组成为：以改良MS为基本培养基，还仅添加6-BA2.0 mg/L、NAA 1.0mg/L、碳纳米管1.0mg/L、酪蛋白水解物1.25g/L、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂。
分化系数＝每块愈伤组织可分化出的芽数
表2酪蛋白水解物浓度(氮源)对愈伤组织芽分化的影响
对比例4
同实施例1中的步骤1～3，唯一的区别在于诱导培养基的基本培养基为MS培养基；诱导培养基组成为：以MS为基本培养基，还仅添加1.0mg/L 6-BA，6.0mg/L 2,4-D，1.0g/L酪蛋白水解物、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂。
对比例5
同实施例1中的步骤1～3，唯一的区别在于诱导培养基的基本培养基为1/2MS培养基；诱导培养基组成为：以1/2MS为基本培养基，还仅添加1.0mg/L6-BA，6.0mg/L 2,4-D，1.0g/L酪蛋白水解物、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂。
对比例6
同实施例1中的步骤1～3，唯一的区别在于诱导培养基的基本培养基为B5培养基；诱导培养基组成为：以B5为基本培养基，还仅添加1.0mg/L 6-BA，6.0mg/L 2,4-D，1.0g/L酪蛋白水解物、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂。
对比例7
同实施例1中的步骤1～3，唯一的区别在于诱导培养基的基本培养基为DKW培养基；诱导培养基组成为：以DKW为基本培养基，还仅添加1.0mg/L6-BA，6.0mg/L 2,4-D，1.0g/L酪蛋白水解物、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂。
对比例8
同实施例1中的步骤1～3，唯一的区别在于诱导培养基的基本培养基为N6培养基；诱导培养基组成为：以N6为基本培养基，还仅添加1.0mg/L 6-BA，6.0mg/L 2,4-D，1.0g/L酪蛋白水解物、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂。
愈伤组织诱导率(％)的计算公式同上，结果见表5，可知，实施例1以改良B5为基础培养基的愈伤组织诱导率最高为66.67％。
表3不同基本培养基对长筒石蒜种胚愈伤组织诱导率的影响
| 编号 | 基本培养基 | 接种种胚数 | 愈伤组织诱导率(％) |
| 对比例4 | MS | 30 | 40.00 |
| 对比例5 | 1/2MS | 30 | 36.33 |
| 实施例1 | 改良B5 | 30 | 66.67 |
| 对比例6 | B5 | 30 | 36.67 |
| 对比例7 | DKW | 30 | 33.33 |
| 对比例8 | N6 | 30 | 30.00 |
实施例4～7和对比例9～17只进行了愈伤组织的诱导培养，即只进行了实施例1中的步骤1～3。
实施例4
同实施例1中的步骤1～3，唯一的区别在于步骤3中的诱导培养基的2,4-D浓度改变，培养基为：以改良B5培养基为基础培养基，还仅添加6-BA，2,4-D，1.0g/L酪蛋白水解物、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂；6-BA和2,4-D的添加量见表4。
实施例5
同实施例1中的步骤1～3，唯一的区别在于步骤3中的诱导培养基的2,4-D浓度改变，培养基为：以改良B5培养基为基础培养基，还仅添加6-BA，2,4-D，1.0g/L酪蛋白水解物、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂；6-BA和2,4-D的添加量见表4。
实施例6
同实施例1中的步骤1～3，唯一的区别在于步骤3中的诱导培养基的6-BA和2,4-D浓度改变，培养基为：以改良B5培养基为基础培养基，还仅添加6-BA，2,4-D，1.0g/L酪蛋白水解物、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂；6-BA和2,4-D的添加量见表4。
实施例7
同实施例1中的步骤1～3，唯一的区别在于步骤3中的诱导培养基的6-BA和2,4-D浓度改变，培养基为：以改良B5培养基为基础培养基，还仅添加6-BA，2,4-D，1.0g/L酪蛋白水解物、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂；6-BA和2,4-D的添加量见表4。
对比例9
同实施例1中的步骤1～3，唯一的区别在于步骤3中的诱导培养基的2,4-D浓度改变，培养基为：以改良B5培养基为基础培养基，还仅添加6-BA，2,4-D，1.0g/L酪蛋白水解物、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂；6-BA和2,4-D的添加量见表4。
对比例10
同实施例1中的步骤1～3，唯一的区别在于步骤3中的诱导培养基的2,4-D浓度改变，培养基为：以改良B5培养基为基础培养基，还仅添加6-BA，2,4-D，1.0g/L酪蛋白水解物、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂；6-BA和2,4-D的添加量见表4。
对比例11
同实施例1中的步骤1～3，唯一的区别在于步骤3中的诱导培养基的6-BA和2,4-D浓度改变，培养基为：以改良B5培养基为基础培养基，还仅添加6-BA，2,4-D，1.0g/L酪蛋白水解物、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂；6-BA和2,4-D的添加量见表4。
对比例12
同实施例1中的步骤1～3，唯一的区别在于步骤3中的诱导培养基的6-BA和2,4-D浓度改变，培养基为：以改良B5培养基为基础培养基，还仅添加6-BA，2,4-D，1.0g/L酪蛋白水解物、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂；6-BA和2,4-D的添加量见表4。
对比例13
同实施例1中的步骤1～3，唯一的区别在于步骤3中的诱导培养基的6-BA和2,4-D浓度改变，培养基为：以改良B5培养基为基础培养基，还仅添加6-BA，2,4-D，1.0g/L酪蛋白水解物、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂；6-BA和2,4-D的添加量见表4。
对比例14
同实施例1中的步骤1～3，唯一的区别在于步骤3中的诱导培养基的6-BA浓度改变，培养基为：以改良B5培养基为基础培养基，还仅添加6-BA，2,4-D，1.0g/L酪蛋白水解物、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂；6-BA和2,4-D的添加量见表4。
对比例15
同实施例1中的步骤1～3，唯一的区别在于步骤3中的诱导培养基的6-BA和2,4-D浓度改变，培养基为：以改良B5培养基为基础培养基，还仅添加6-BA，2,4-D，1.0g/L酪蛋白水解物、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂；6-BA和2,4-D的添加量见表4。
对比例16
同实施例1中的步骤1～3，唯一的区别在于步骤3中的诱导培养基的6-BA和2,4-D浓度改变，培养基为：以改良B5培养基为基础培养基，还仅添加6-BA，2,4-D，1.0g/L酪蛋白水解物、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂；6-BA和2,4-D的添加量见表4。
对比例17
同实施例1中的步骤1～3，唯一的区别在于步骤3中的诱导培养基的6-BA和2,4-D浓度改变，培养基为：以改良B5培养基为基础培养基，还仅添加6-BA，2,4-D，1.0g/L酪蛋白水解物、蔗糖30g/L和6.5g/L琼脂；6-BA和2,4-D的添加量见表4。
实施例1～2和实施例4～7和对比例9～17的愈伤组织诱导率(％)的计算公式同上，结果见表4。
表46-BA和2,4-D浓度对长筒石蒜种胚愈伤组织诱导率的影响
综上所述，利用本发明的技术方案可以提高长筒石蒜的愈伤组织诱导率和分化率，最终提高繁殖效率和繁殖系数。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种长筒石蒜再生组培的基础培养基，其特征在于，所述基础培养基为改良B5培养基和/或改良MS培养基；所述改良B5培养基的组成包括：硫酸铵134mg/L，硼酸3mg/L，二水合氯化钙880mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，五水合硫酸铜0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，七水合硫酸亚铁27.8mg/L，七水合硫酸镁500mg/L，一水合硫酸锰10mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，碘化钾0.75mg/L，硝酸钾2500mg/L，磷酸二氢钠150mg/L，七水合硫酸锌2mg/L；肌醇100mg/L，1mg/L维生素B6，10mg/L维生素B1和烟酸5.0mg/L；
所述改良MS培养基包括：硝酸铵1650mg/L、硝酸钾1900mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、七水合硫酸镁370mg/L、二水合氯化钙880mg/L、四水合硫酸锰22.3mg/L、七水合硫酸锌8.6mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、二水合钼酸钠0.25mg/L、六水合氯化钴0.025mg/L、五水合硫酸铜0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、七水合硫酸亚铁27.8mg/L、烟酸5.0mg/L、维生素B110.0mg/L、维生素B61.0mg/L、甘氨酸2mg/L和肌醇100mg/L。
2.一种长筒石蒜再生的组培培养基，其特征在于，所述组培培养基包括诱导培养基、增殖培养基、分化培养基、壮芽培养基与壮苗和生根培养基；
所述诱导培养基以权利要求1所述的改良B5培养基为基本培养基，还包括：1.0～2.0mg/L 6-BA、6.0～10.0mg/L 2,4-D、酪蛋白水解物0.5～1.0g/L、蔗糖30g/L和琼脂6.5～7.0g/L；
所述增殖培养基以权利要求1所述的改良B5培养基为基本培养基，还包括：1.0～2.0mg/L 6-BA、3.0～5.0mg/L 2,4-D、酪蛋白水解物0.5～1.0g/L、碳纳米管1.0～2.0mg/L、蔗糖30g/L和琼脂6.5～7.0g/L；
所述分化培养基以权利要求1所述的改良MS培养基为基本培养基，还包括：2.0～4.0mg/L 6-BA、1.0～2.0mg/LNAA、酪蛋白水解物0.5～1.0g/L、碳纳米管1.0～2.0mg/L、30g/L蔗糖和6.5～7.0g/L琼脂；
所述壮芽培养基以权利要求1所述的改良MS培养基为基本培养基，还包括：1.5～3.0mg/L NAA、2.0～4.0mg/L 6-BA、碳纳米管1.0～2.0mg/L、40～60g/L蔗糖和6.5～7.0g/L琼脂；
所述壮苗和生根培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：1.5～2.0mg/L6-BA、0.5～1.0mg/LNAA、2.0～2.5mg/L IBA、碳纳米管1.0～2.0mg/L、40～60g/L蔗糖和6.5～7.0g/L琼脂。
3.一种长筒石蒜愈伤组织的再生组培方法，其特征在于，所述再生组培方法采用权利要求2所述的组培培养基，包括以下步骤：
将长筒石蒜的种胚接种在诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，得到已产生愈伤组织的胚；
将所述已产生愈伤组织的胚转接于增殖培养基中进行愈伤组织增殖培养，得到愈伤组织团块；
将所述愈伤组织团块转接于分化培养基中进行愈伤组织分化培养，得到丛生芽；
将所述丛生芽转接于壮芽培养基中进行壮芽培养，得到无根苗；
将所述无根苗转接到壮苗和生根培养基上进行壮苗生根培养，得到组培苗。
4.根据权利要求3所述的再生组培方法，其特征在于，在愈伤组织诱导培养前，还包括：将种胚进行清洗和消毒；所述清洗和消毒包括：先用无菌水清洗2～3次，然后采用有效氯含量0.1％～0.3％的次氯酸钠溶液消毒1～2min，无菌水清洗4～5次。
5.根据权利要求3或4所述的再生组培方法，其特征在于，所述种胚通过如下方式获得：去除长筒石蒜蒴果果皮，沿种子纵径切开，得到种胚。
6.根据权利要求3所述的再生组培方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养和愈伤组织增殖培养均为暗培养；所述愈伤组织分化培养、壮芽培养和壮苗生根培养均为光暗交替培养，光照的时间为12～16h/d，所述光照的强度800～1200Lx。
7.根据权利要求3所述的再生组培方法，其特征在于，所述愈伤组织团块的直径为1.5～2.5cm；所述丛生芽的长度为1.0～1.5cm。
8.根据权利要求3所述的再生组培方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养的时间为28～45d；所述愈伤组织增殖培养的时间为30～40d；所述愈伤组织分化培养的时间为30～40d；所述壮芽培养的时间为60～80d；所述壮苗生根培养的时间为30～40d。
9.根据权利要求3所述的再生组培方法，其特征在于，在所述壮芽培养过程中，还包括将壮芽培养30～40d的培养产物转接至新的壮芽培养基上进行继代培养，得到无根苗。
10.根据权利要求3所述的再生组培方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养、愈伤组织增殖培养、愈伤组织分化培养、壮芽培养和壮苗生根培养的温度均为25±1℃。
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