CN118201642A - 用于抗体药物缀合物的接头 - Google Patents

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CN118201642A
CN118201642A CN202280073943.XA CN202280073943A CN118201642A CN 118201642 A CN118201642 A CN 118201642A CN 202280073943 A CN202280073943 A CN 202280073943A CN 118201642 A CN118201642 A CN 118201642A
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N·菲什金
C·白
K·塔克罗里
P·U·朴
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Olong Pharmaceutical
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Abstract

本公开提供了能够将蛋白质‑蛋白质相互作用的诱导剂连接至细胞结合剂的无痕接头。还提供了包含所述连接的化合物的组合物。所述化合物和组合物可用于治疗有需要的受试者的疾病，诸如癌症。

Description

用于抗体药物缀合物的接头
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年9月8日提交的美国临时申请号63/241,914、2021年12月23日提交的美国临时申请号63/293,591、2022年6月13日提交的美国临时申请号63/351,639和2022年9月1日提交的美国临时申请号63/374,282的优先权权益，这些申请通过引用整体并入本文。
电子提交的序列表的引用
与本申请一起提交的电子递交的序列表(名称4547_020PC03_Seqlisting_ST26；大小：52,902字节；创建日期：2022年9月6日)的内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开提供了能够将蛋白质-蛋白质相互作用的诱导剂连接至细胞结合剂的无痕接头。还提供了包含所述连接的化合物的组合物。所述化合物和组合物可用于治疗有需要的受试者的疾病。
背景技术
蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)代表细胞内部和外部的一大类治疗靶标。PPI对所有生物过程都很重要并且常常在疾病中失调。尽管PPI在人类生物学中的重要性，但这个靶标类别在转化为治疗剂方面是极具挑战性的。因此，持续需要可有效诱导PPI并治疗疾病诸如癌症的新化合物。
靶向蛋白降解剂目前正被研究作为一类可用于靶向药物蛋白并难以降解药物蛋白的分子。最熟知的靶向蛋白降解剂利用基于蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)的蛋白质降解，并且是对于靶向不表现出酶活性并且不经受经典抑制的“无成药性”蛋白质具有重大前景的新兴领域。PROTAC是异双功能小分子，其同时结合靶蛋白和E3连接酶，从而导致靶标的泛素化和随后降解。分子胶是另一种类型的靶蛋白降解剂，其与PROTAC的不同之处在于它们结合E3连接酶并改变连接酶表面的形状，并使得连接酶能够结合靶蛋白，从而导致靶标的泛素化和降解。虽然靶向蛋白降解剂呈现以不依赖于酶活性或信号传导活性的方式调节蛋白质的令人激动的机会，但制备区分不同类型细胞的化合物可能具有挑战性。
抗体药物缀合物是一种创新的治疗应用，其将单克隆抗体的独特高特异性与常常不适于全身施用的小分子药物的有效活性相结合。这两种剂通过通常在靶位点处被切割的接头拴系。
在抗体药物缀合物中使用无痕接头允许释放治疗有效载荷，而没有接头连接的证据。理想地，接头必须具有足够的稳定性以使缀合分子定位到其目的地而不过早切割。接头还必须具有被迅速切割的能力，一旦内化到靶细胞中就释放有效载荷。无痕接头的已知实例需要UV光进行活化或使用化学触发剂，所述化学触发剂具有数分钟至数小时的稳定性半衰期或在活化时产生低活性副产物的混合物。
尽管进行了持续的工作，仍然持续需要选择性地靶向患病组织和细胞以及先前被认为与可诱导期望的蛋白质-蛋白质相互作用的化合物(包括诱导蛋白质降解的那些化合物)“无成药性”的蛋白质。
发明内容
在某些方面，本公开提供了式(XX)的缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
a为1至10；
n为0或1；
R1是诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物；
R2选自氢、-(CH2CH2O)v-CH3、C2-C6烯基、C1-C6烷基、C2-C6炔基、苄基、C3-C6环烷基和C3-C6环烷基(C1-C3烷基)，其中v为1至24；
每个Y独立地为S或O；
L为可切割接头；并且
Bm为能够特异性结合蛋白质的结合部分。在一些方面，所述蛋白质在细胞表面上。
在一些方面，本公开提供了式(XXXII)的缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
a为1至10；
A'为其中
n为0或1；
每个Y独立地为S或O；
指示与R1的连接点；并且
指示与亚甲基基团的连接点；
R1与A'一起是诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物；
R2选自氢、为R1-A'提供稳定性的基团、为R1-A'提供溶解性的基团和为R1-A'提供稳定性和溶解性的基团；
L为可切割接头；并且
Bm为能够特异性结合蛋白质的结合部分。在一些方面，所述蛋白质在细胞表面上。
在某些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中结合部分是抗体、抗体片段或抗原结合片段。
在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中a为2至8。
在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中接头可被蛋白酶切割。
在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中L选自由以下组成的组
其中：
q为2至10；
Z1、Z2、Z3、Z4和Z5各自独立地不存在或为L-或D-构型的天然存在的氨基酸残基，前提是Z1、Z2、Z3、Z4和Z5中的至少两者为氨基酸残基；
为与母体分子部分的连接点；并且
为与所述结合部分的连接点。
在一些方面，Z1、Z2、Z3、Z4和Z5独立地不存在或选自由以下组成的组：L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-瓜氨酸、D-瓜氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-谷氨酰胺、D-谷氨酰胺、L-谷氨酸、D-谷氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-天冬酰胺、D-天冬酰胺、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-赖氨酸、D-赖氨酸和甘氨酸；前提是Z1、Z2、Z3、Z4和Z5中的至少两者为氨基酸残基。
在一些方面：
Z1不存在或为甘氨酸；
Z2不存在或选自由以下组成的组：L-谷氨酰胺、D-谷氨酰胺、L-谷氨酸、D-谷氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸和甘氨酸；
Z3选自由以下组成的组：L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸和甘氨酸；
Z4选自由以下组成的组：L-瓜氨酸、D-瓜氨酸、L-天冬酰胺、D-天冬酰胺、L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸和甘氨酸；并且
Z5不存在或为甘氨酸。
在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中L为
在一些方面，q为4。
在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中L为生物还原性接头。
在一些方面，L选自由以下组成的组
q为2至10；
R、R'、R”和R”'各自独立地选自氢、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、(C1-C6)2NC1-C6烷基和C1-C6烷基，或者两个偕R基团与它们所连接的碳原子一起可形成环丁基或环丙基环；
为与母体分子部分的连接点；并且
为与所述结合部分的连接点。
在一些方面，L为
在一些方面，q为2。
在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中L为点击释放接头。
在一些方面，L为
其中：
q为2至10；
为与母体分子部分的连接点；并且
为与所述结合部分的连接点。
在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中L为β-葡萄糖醛酸酶可切割接头。
在一些方面，L为
其中：
q为2至10；
----不存在或为键；
为与母体分子部分的连接点；并且
为与所述结合部分的连接点。
在某些方面，L连接至所述Bm中的半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸或谷氨酰胺。在某些方面，所述半胱氨酸或赖氨酸为工程化半胱氨酸或赖氨酸。在一些方面，所述半胱氨酸或赖氨酸对于Bm是内源的。
在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中Bm是抗体或其抗原结合部分。在某些方面，根据EU编号，L连接至所述抗体或其抗原结合部分的重链位置S239和/或K334处的工程化半胱氨酸。在一些方面，根据EU编号，L连接至所述抗体或其抗原结合部分的重链位置295处的谷氨酰胺。
在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中Bm结合的蛋白质是表面抗原，任选地其中Bm与表面抗原的结合引起缀合物或其药学上可接受的盐内化到细胞中。
在一些方面，所述表面抗原包括5T4、ACE、ADRB3、AKAP-4、ALK、AOC3、APP、Axin1、AXL、B7H3、B7-H4、BCL2、BCMA、bcr-abl、BORIS、BST2、C242、C4.4a、CA 125、CA6、CA9、CAIX、CCL11、CCR5、CD123、CD133、CD138、CD142、CD15、CD15-3、CD171、CD179a、CD18、CD19、CD19-9、CD2、CD20、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27L、CD28、CD3、CD30、CD31、CD300LF、CD33、CD352、CD37、CD38、CD4、CD40、CD41、CD44、CD44v6、CD5、CD51、CD52、CD54、CD56、CD62E、CD62P、CD62L、CD70、CD71、CD72、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD90、CD97、CD125、CD138、CD141、CD147、CD152、CD154、CD326、CEA、CEACAM5、CFTR、凝集因子、cKit、闭合蛋白3、闭合蛋白18.2、CLDN6、CLEC12A、CLL-1、cll3、c-MET、Crypto 1生长因子、CS1、CTLA-4、CXCR2、CXORF61、细胞周期蛋白Bl、CYP1B1、钙粘蛋白-3、钙粘蛋白-6、DLL3、E7、EDNRB、EFNA4、EGFR、EGFRvIII、ELF2M、EMR2、ENPP3、EPCAM、EphA2、肝配蛋白A4、肝配蛋白B2、EPHB4、ERBB2(Her2/neu)、ErbB3、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、ETBR、ETV6-AML、FAP、FCAR、FCRL5、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT3、叶酸受体α、叶酸受体β、FOLR1、Fos相关抗原1、岩藻糖基GM1、GCC、GD2、GD3、GloboH、GM3、GPC1、GPC2、GPC3、gplOO、GPNMB、GPR20、GPRC5D、GUCY2C、HAVCR1、HER2、HER3、HGF、HMI.24、HMWMAA、HPV E6、hTERT、人端粒酶逆转录酶、ICAM、ICOS-L、IFN-α、IFN-γ、IGF-I受体、IGLL1、IL-2受体、IL-4受体、IL-13Ra2、IL-l lRa、IL-1受体、IL-12受体、IL-23受体、IL-13受体、IL-22受体、IL-4受体、IL-5受体、IL-6受体、干扰素受体、整联蛋白(包括α4、αvβ3、αvβ5、αvβ6、α1β4、α4β1、α4β7、α5β1、α6β4、αIIbβ3整联蛋白)、整联蛋白αV、肠羧基酯酶、KIT、LAGE-la、LAIR1、LAMP-1、LCK、豆荚蛋白、LewisY、LFA-1(CD11a)、L-选择素(CD62L)、LILRA2、LIV-1、LMP2、LRRC15、LY6E、LY6K、LY75、MAD-CT-1、MAD-CT-2、MAGE Al、MelanA/MARTl、间皮素、ML-IAP、MSLN、粘蛋白、MUC1、MUC16、mut hsp70-2、MYCN、肌肉生长抑制素、NA17、NaPi2b、NCA-90、NCAM、连接蛋白-4、NGF、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、NY-BR-1、NY-ESO-1、邻乙酰基-GD2、OR51E2、OY-TES1、p53、p53突变体、PANX3、PAP、PAX3、PAX5、p-CAD、PCTA-1/半乳凝素8、PD-L1、PD-L2、PDGFR、PDGFR-β、磷脂酰丝氨酸、PIK3CA、PLAC1、聚唾液酸、前列腺酶、前列腺癌细胞、前列腺癌相关蛋白(prostein)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、狂犬病毒、生存素和端粒酶、PD-1、PRSS21、PSCA、PSMA、PTK7、RAGE-1、RANKL、Ras突变体、呼吸道合胞病毒、恒河猴因子、RhoC、RON、ROR1、ROR2、RU1、RU2、肉瘤易位断点、SART3、SLAMF7、SLC44A4、sLe、SLITRK6、精子蛋白17、1-磷酸鞘氨醇、SSEA-4、SSX2、STEAP1、TAG72、TARP、TCRβ、TEM1/CD248、TEM7R、腱生蛋白C、TF、TGF-1、TGF-β2、TNF-α、TGS5、Tie 2、TIM-1、Tn Ag、TRAC、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TROP-2、TRP-2、TRPV1、TSHR、肿瘤抗原CTAA16.88、酪氨酸酶、UPK2、VEGF、VEGFR1、VEGFR2、波形蛋白、WTl、XAGE1或它们的组合。
在一些方面，所述表面抗原包括HER2、CD20、CD38、CD33、BCMA、CD138、EGFR、FGFR4、GD2、PDGFR、或它们的组合。在一些方面，所述表面抗原包括CD79b。在一些方面，所述表面抗原包括PSMA。
在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中Bm结合核激素受体。在一些方面，所述核激素受体是雄激素受体(AR)或雌激素受体(ER)。
在一些方面，抗体选自由以下组成的组：利妥昔单抗(rituximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、奥妥珠单抗(obinutuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、达雷木单抗(daratumumab)、STI-6129、林妥珠单抗(lintuzumab)、huMy9-6、贝兰他单抗(balantamab)、英达妥昔单抗(indatuximab)、西妥昔单抗(cetuximab)、地妥昔单抗(dinutuximab)、抗CD38 A2抗体、huAT15/3抗体、阿仑单抗(alemtuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、托西莫单抗(tositumomab)、贝伐单抗(bevacizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、替昔木单抗(ticilimumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、奥戈伏单抗(oregovomab)和维妥珠单抗(veltuzumab)。
在一些方面，抗体为利妥昔单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、huMy9-6、林妥珠单抗或吉妥珠单抗。在一些方面，抗体为泊洛妥珠单抗(polatuzumab)、J591或贝兰他单抗。在一些方面，抗体为CD33-D。
在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R2是为缀合物提供稳定性的基团。在一些方面，R2选自C2-C6烯基、C1-C6烷基、C2-C6炔基、苄基、C3-C6环烷基和C3-C6环烷基(C1-C3烷基)。
在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R2为氢或C1-C6烷基。在一些方面，R2为甲基。
在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R2为甲基。
在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R2是为缀合物提供溶解性的基团。在一些方面，R2选自：
其中：
每个n独立地为1、2、3、4或5；
每个y独立地为1或2；并且
每个R独立地为氢、C6H11O5、C12H21O10、C18H31O15或C24H41O20。在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中每个Y为O。
在一些方面，本公开提供了式(XX)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1为PPI调节剂。在一些方面，本公开提供了式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1-A'为PPI调节剂。
在一些方面，本公开提供了式(XX)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1为靶向蛋白降解剂。在一些方面，本公开提供了式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1-A'为靶向蛋白降解剂。在一些方面，靶向蛋白降解剂是取代的异吲哚啉。在一些方面，靶向蛋白降解剂是5'-取代的异吲哚啉。
在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1具有下式：
其中：
表示与母体分子部分的连接点；
A为苯基或C4-C10环烷基环；
R10独立地选自氢和卤代基；
U选自NH和CF2；并且
R20选自-CH3、-C(O)R3、-N(R4)2、-(CH2)nOH、-(CH2)nN(R4)2、-(CH2)nQ'(CH2)mOH、-(CH2)nQ'(CH2)mSH和-(CH2)nQ'(CH2)mN(R4)2；其中
R3为氢或C1-C6烷基；
每个R4独立地为氢或C1-C6烷基；
Q'为O、S或NR4；
n为1-6；并且
m为2-5。
在一些方面：
A为苯基；
U为NH；
R10为卤代基；并且
R20为甲基。
在一些方面：
A为苯基；
U为NH；
R10为卤代基；并且
R20为-(CH2)2O(CH2)2NHCH3。
在一些方面，本公开提供了式(XX)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1为蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)。在一些方面，本公开提供了式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1-A'为蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)。
在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1具有下式：
POI-L100-CBN；
其中：
POI是与所关注的蛋白质结合的化合物；
L100为PROTAC接头；并且
CBN为小脑蛋白(cereblon)结合部分。
在一些方面，所述所关注的蛋白质是核激素受体、翻译终止因子、转录因子、细胞周期蛋白依赖性激酶、酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶或E3连接酶。在一些方面，所述所关注的蛋白质选自CD33、GSPT1、BRD4、AR、ER、IKZF1/3、CK1a、BCL-XL、IKZF2、IRAK4、BTK、STAT3、BTK和iMiD、BRD9、TRK、MDM2、CDK2/CDK9、CD97b和EGFR。
在一些方面，L100包含一个或多个选自二醇、烷基、炔基、三唑基、哌嗪基、哌啶基及它们的组合的官能团。
在一些方面，CBN选自
其中
指示与A'的连接点；并且
指示与L100的连接点。
在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1选自
/>
/>
/>
/>
其中表示与A'的连接点。
在一些方面，本公开提供了式(XXI)的缀合物：
或其药学上可接受的盐；
其中：
a为1至10；并且
Bm为能够特异性结合蛋白质的结合部分。在一些方面，所述蛋白质在细胞表面上。
在一些方面，本公开提供了式(XXI)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中a为2至8。
在一些方面，本公开提供了式(XXI)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中Bm是抗体或其抗原结合部分。
在一些方面，本公开提供了式(XXI)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中结合部分特异性结合的蛋白质是表面抗原。
在一些方面，本公开提供了式(XXI)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述表面抗原包括5T4、ACE、ADRB3、AKAP-4、ALK、AOC3、APP、Axin1、AXL、B7H3、B7-H4、BCL2、BCMA、bcr-abl、BORIS、BST2、C242、C4.4a、CA 125、CA6、CA9、CAIX、CCL11、CCR5、CD123、CD133、CD138、CD142、CD15、CD15-3、CD171、CD179a、CD18、CD19、CD19-9、CD2、CD20、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27L、CD28、CD3、CD30、CD31、CD300LF、CD33、CD352、CD37、CD38、CD4、CD40、CD41、CD44、CD44v6、CD5、CD51、CD52、CD54、CD56、CD62E、CD62P、CD62L、CD70、CD71、CD72、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD90、CD97、CD125、CD138、CD141、CD147、CD152、CD154、CD326、CEA、CEACAM5、CFTR、凝集因子、cKit、闭合蛋白3、闭合蛋白18.2、CLDN6、CLEC12A、CLL-1、cll3、c-MET、Crypto 1生长因子、CS1、CTLA-4、CXCR2、CXORF61、细胞周期蛋白Bl、CYP1B1、钙粘蛋白-3、钙粘蛋白-6、DLL3、E7、EDNRB、EFNA4、EGFR、EGFRvIII、ELF2M、EMR2、ENPP3、EPCAM、EphA2、肝配蛋白A4、肝配蛋白B2、EPHB4、ERBB2(Her2/neu)、ErbB3、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、ETBR、ETV6-AML、FAP、FCAR、FCRL5、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT3、叶酸受体α、叶酸受体β、FOLR1、Fos相关抗原1、岩藻糖基GM1、GCC、GD2、GD3、GloboH、GM3、GPC1、GPC2、GPC3、gplOO、GPNMB、GPR20、GPRC5D、GUCY2C、HAVCR1、HER2、HER3、HGF、HMI.24、HMWMAA、HPV E6、hTERT、人端粒酶逆转录酶、ICAM、ICOS-L、IFN-α、IFN-γ、IGF-I受体、IGLL1、IL-2受体、IL-4受体、IL-13Ra2、IL-l lRa、IL-1受体、IL-12受体、IL-23受体、IL-13受体、IL-22受体、IL-4受体、IL-5受体、IL-6受体、干扰素受体、整联蛋白(包括α4、αvβ3、αvβ5、αvβ6、α1β4、α4β1、α4β7、α5β1、α6β4、αIIbβ3整联蛋白)、整联蛋白αV、肠羧基酯酶、KIT、LAGE-la、LAIR1、LAMP-1、LCK、豆荚蛋白、LewisY、LFA-1(CD11a)、L-选择素(CD62L)、LILRA2、LIV-1、LMP2、LRRC15、LY6E、LY6K、LY75、MAD-CT-1、MAD-CT-2、MAGE Al、MelanA/MARTl、间皮素、ML-IAP、MSLN、粘蛋白、MUC1、MUC16、mut hsp70-2、MYCN、肌肉生长抑制素、NA17、NaPi2b、NCA-90、NCAM、连接蛋白-4、NGF、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、NY-BR-1、NY-ESO-1、邻乙酰基-GD2、OR51E2、OY-TES1、p53、p53突变体、PANX3、PAP、PAX3、PAX5、p-CAD、PCTA-1/半乳凝素8、PD-L1、PD-L2、PDGFR、PDGFR-β、磷脂酰丝氨酸、PIK3CA、PLAC1、聚唾液酸、前列腺酶、前列腺癌细胞、前列腺癌相关蛋白、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、狂犬病毒、生存素和端粒酶、PD-1、PRSS21、PSCA、PSMA、PTK7、RAGE-1、RANKL、Ras突变体、呼吸道合胞病毒、恒河猴因子、RhoC、RON、ROR1、ROR2、RU1、RU2、肉瘤易位断点、SART3、SLAMF7、SLC44A4、sLe、SLITRK6、精子蛋白17、1-磷酸鞘氨醇、SSEA-4、SSX2、STEAP1、TAG72、TARP、TCRβ、TEM1/CD248、TEM7R、腱生蛋白C、TF、TGF-1、TGF-β2、TNF-α、TGS5、Tie 2、TIM-1、Tn Ag、TRAC、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TROP-2、TRP-2、TRPV1、TSHR、肿瘤抗原CTAA16.88、酪氨酸酶、UPK2、VEGF、VEGFR1、VEGFR2、波形蛋白、WTl、XAGE1或它们的组合。
在一些方面，所述表面抗原包括HER2、CD20、CD38、CD33、BCMA、CD138、EGFR、FGFR、GD2、PDGFR、或它们的组合。在一些方面，所述表面抗原包括CD79b。在一些方面，所述表面抗原包括PSMA。
在一些方面，抗体包括利妥昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗、帕妥珠单抗、奥妥珠单抗、奥法木单抗、达雷木单抗、STI-6129、林妥珠单抗、huMy9-6、贝兰他单抗、英达妥昔单抗、西妥昔单抗、地妥昔单抗、抗CD38 A2抗体、huAT15/3抗体、阿仑单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗、贝伐单抗、帕尼单抗、曲美木单抗、替昔木单抗、卡妥索单抗、奥戈伏单抗或维妥珠单抗。在一些方面，抗体包括洛伏妥珠单抗(lorvotuzumab)。在一些方面，抗体包括沙妥珠单抗(sacituzumab)。
在一些方面，抗体为利妥昔单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、huMy9-6、林妥珠单抗或吉妥珠单抗。在一些方面，抗体为泊洛妥珠单抗、J591或贝兰他单抗。在一些方面，抗体为CD33-D。
在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中(a)Bm结合的蛋白质是CD33并且R1结合小鼠双微体2同系物(MDM2)，(b)Bm结合的蛋白质是前列腺特异性膜抗原(PSMA)并且R1结合雄激素受体(AR)，(c)Bm结合的蛋白质是CD33并且R1结合含溴结构域的蛋白4(BRD4)，(d)Bm结合的蛋白质是HER2并且R1结合G1至S期转换蛋白1(GSPT1)或(e)Bm结合的蛋白质是CD33并且R1结合GSPT1。在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中Bm结合的蛋白质是CD79b并且R1结合IRAK4。在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中Bm结合的蛋白质是HER2并且R1结合BRD4。在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中Bm结合的蛋白质是BCMA并且R1结合BRD4。在一些方面，本公开提供了式(XX)或式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中Bm结合的蛋白质是HER2并且R1结合ER。
在一些方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含本文所述的缀合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载剂。
在一些方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用药学上可接受量的本文所述的缀合物或组合物、或其药学上可接受的盐。在一些方面，所述癌症是实体瘤。在一些方面，所述癌症是血液肿瘤。在一些方面，所述癌症为乳腺癌、胃癌、淋巴瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、头颈癌、鳞状细胞癌和/或肝细胞癌。在一些方面，所述癌症是前列腺癌、乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、胆管癌、结肠癌、卵巢癌、肺癌或神经调节蛋白-1(NRG1)阳性癌症。在一些方面，所述癌症是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在一些方面，所述癌症是B细胞非霍奇金淋巴瘤。在一些方面，所述癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些方面，所述方法还包括在本文所述的缀合物或化合物或其药学上可接受的盐之前、之后或同时向受试者施用药学上可接受量的附加剂。在一些方面，附加剂为细胞毒性剂或免疫应答调节剂。在一些方面，免疫应答调节剂为检查点抑制剂。在一些方面，检查点抑制剂包括PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIM3抑制剂和/或LAG-3抑制剂。
在所述方法的一些方面，(a)Bm结合的蛋白质是CD33，R1结合MDM2或G1至S期转换蛋白1(GSPT1)，并且所述癌症是急性髓性白血病，(b)Bm结合的蛋白质是前列腺特异性膜抗原(PSMA)，R1结合雄激素受体(AR)，并且所述癌症是前列腺癌，(c)Bm结合的蛋白质是CD33，R1结合含溴结构域的蛋白4(BRD4)，并且所述癌症是急性髓性白血病或(d)Bm结合的蛋白质是HER2，R1结合G1至S期转换蛋白1(GSPT1)，并且所述癌症为乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、胆管癌、结肠癌、卵巢癌或神经调节蛋白-1(NRG1)阳性癌症。在所述方法的一些方面，Bm结合的蛋白质是CD79b，R1结合IRAK4，并且所述癌症是非霍奇金淋巴瘤(NHL)，例如B细胞非霍奇金淋巴瘤或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些方面，Bm结合的蛋白质是HER2，R1结合BRD4，并且所述癌症是乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、胆管癌、结肠癌、卵巢癌或神经调节蛋白-1(NRG1)阳性癌症。在一些方面，Bm结合的蛋白质是BCMA，R1结合BRD4，并且所述癌症是多发性骨髓瘤。
在所述方法的一些方面，所述方法还包括在本文所述的缀合物或组合物之前、之后或同时向受试者施用药学上可接受量的附加剂。在一些方面，附加剂为细胞毒性剂或免疫应答调节剂。在一些方面，免疫应答调节剂为检查点抑制剂
在一些方面，本公开提供了式(XXII)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
n为0或1；
R1是诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物；
R2选自氢、-(CH2CH2O)v-CH3、C2-C6烯基、C1-C6烷基、C2-C6炔基、苄基、C3-C6环烷基和C3-C6环烷基(C1-C3烷基)，其中v为1至24；
每个Y独立地为S或O；并且
L*为与所述结合部分缀合的可切割接头前体。
在一些方面，本公开提供了式(XXXI)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
A'为其中
n为0或1；
每个Y独立地为S或O；
指示与A'的连接点；并且
指示与亚甲基基团的连接点；
R1与A'一起是诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物；
R2选自氢、为R1-A'提供稳定性的基团、为R1-A'提供溶解性的基团和为R1-A'提供稳定性和溶解性的基团；并且
L为与所述结合部分缀合的可切割接头前体。
在一些方面，本公开提供了式(XXII)或式(XXXI)的化合物或其药学上可接受的盐，其中L*为蛋白酶可切割接头前体。
在一些方面，本公开提供了式(XXII)或式(XXXI)的化合物或其药学上可接受的盐，其中L*选自由以下组成的组
其中：
q为2至10；
Z1、Z2、Z3、Z4和Z5各自独立地不存在或为L-或D-构型的天然存在的氨基酸残基，前提是Z1、Z2、Z3、Z4和Z5中的至少两者为氨基酸残基；并且
为与母体分子部分的连接点。
在一些方面，Z1、Z2、Z3、Z4和Z5独立地不存在或选自由以下组成的组：L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-瓜氨酸、D-瓜氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-谷氨酰胺、D-谷氨酰胺、L-谷氨酸、D-谷氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-天冬酰胺、D-天冬酰胺、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-赖氨酸、D-赖氨酸和甘氨酸；前提是Z1、Z2、Z3、Z4和Z5中的至少两者为氨基酸残基。
在一些方面：
Z1不存在或为甘氨酸；
Z2不存在或选自由以下组成的组：L-谷氨酰胺、D-谷氨酰胺、L-谷氨酸、D-谷氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸和甘氨酸；
Z3选自由以下组成的组：L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸和甘氨酸；
Z4选自由以下组成的组：L-瓜氨酸、D-瓜氨酸、L-天冬酰胺、D-天冬酰胺、L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸和甘氨酸；并且
Z5不存在或为甘氨酸。
在一些方面，本公开提供了式(XXII)或式(XXXI)的化合物或其药学上可接受的盐，其中L*为
其中为与母体分子部分的连接点。
在一些方面，q为4。
在一些方面，本公开提供了式(XXII)或式(XXXI)的化合物或其药学上可接受的盐，L*为生物还原性接头前体。
在一些方面，本公开提供了式(XXII)或式(XXXI)的化合物或其药学上可接受的盐，L*选自由以下组成的组
其中：
q为2至10；
R、R'、R”和R”'各自独立地选自氢、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、(C1-C6)2NC1-C6烷基和C1-C6烷基，或者两个偕R基团与它们所连接的碳原子一起可形成环丁基或环丙基环；
为与母体分子部分的连接点。
在一些方面，本公开提供了式(XXII)或式(XXXI)的化合物或其药学上可接受的盐，L*为
在一些方面，q为2。
在一些方面，本公开提供了式(XXII)或式(XXXI)的化合物或其药学上可接受的盐，其中L*为点击释放接头前体。
在一些方面，本公开提供了式(XXII)或式(XXXI)的化合物或其药学上可接受的盐，其中L*为
其中：
q为2至10；并且
为与母体分子部分的连接点。
在一些方面，本公开提供了式(XXII)或式(XXXI)的化合物或其药学上可接受的盐，L*为β-葡萄糖醛酸酶可切割接头前体。
在一些方面，本公开提供了式(XXII)或式(XXXI)的化合物或其药学上可接受的盐，其中L*为
其中：
q为2至10；
----不存在或为键；并且
为与母体分子部分的连接点。
在一些方面，本公开提供了式(XXXI)的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2是为R1-A'提供稳定性的基团。在一些方面，R2选自C2-C6烯基、C1-C6烷基、C2-C6炔基、苄基、C3-C6环烷基和C3-C6环烷基(C1-C3烷基)。
在一些方面，本公开提供了式(XXII)或式(XXXI)的化合物或其药学上可接受的盐，R2为氢或C1-C6烷基。在一些方面，R2为甲基。
在一些方面，本公开提供了式(XXXI)的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2是为R1-A'提供溶解性的基团。
在一些方面，R2选自：
/>
其中：
每个n独立地为1、2、3、4或5；
每个y独立地为1或2；
每个R独立地为氢、C6H11O5、C12H21O10、C18H31O15或C24H41O20；并且
在一些方面，本公开提供了式(XXII)或式(XXXI)的化合物或其药学上可接受的盐，其中每个Y为O。
在一些方面，本公开提供了式(XXXI)的化合物或其药学上可接受的盐，R1-A'为PPI调节剂。
在一些方面，本公开提供了式(XXII)的化合物或其药学上可接受的盐，R1为靶向蛋白降解剂。在一些方面，本公开提供了式(XXXI)的化合物或其药学上可接受的盐，R1-A'为靶向蛋白降解剂。在一些方面，靶向蛋白降解剂是取代的异吲哚啉。在一些方面，靶向蛋白降解剂是5'-取代的异吲哚啉。
在一些方面，本公开提供了式(XXII)或(XXXI)的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是式(XXX)的化合物：
其中：
表示与母体分子部分的连接点；
A为苯基或C4-C10环烷基环；
R10独立地选自氢和卤代基；
U选自NH和CF2；并且
R20选自-CH3、-C(O)R3、-N(R4)2、-(CH2)nOH、-(CH2)nN(R4)2、-(CH2)nQ'(CH2)mOH、-(CH2)nQ'(CH2)mSH和-(CH2)nQ'(CH2)mN(R4)2；其中
R3为氢或C1-C6烷基；
每个R4独立地为氢或C1-C6烷基；
Q'为O、S或NR4；
n为1-6；并且
m为2-5。
在一些方面，
A为苯基；
U为NH；
R10为卤代基；并且
R20为甲基。
在一些方面，
A为苯基；
U为NH；
R10为卤代基；并且
R20为-(CH2)2O(CH2)2NHCH3。
在一些方面，本公开提供了式(XXII)的化合物或其药学上可接受的盐，R1为蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)。
在一些方面，本公开提供了式(XXII)的化合物或其药学上可接受的盐，R1-A'为蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)。
在一些方面，R1具有下式：
POI-L100-CBN；
其中：
POI是与所关注的蛋白质结合的化合物；
L100为PROTAC接头；并且
CBN为小脑蛋白结合部分。
在一些方面，所述所关注的蛋白质是核激素受体、翻译终止因子、转录因子、细胞周期蛋白依赖性激酶、酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶或E3连接酶。在一些方面，所述所关注的蛋白质选自CD33、GSPT1、BRD4、AR、ER、IKZF1/3、CK1a、BCL-XL、IKZF2、IRAK4、BTK、STAT3、BTK和iMiD、BRD9、TRK、MDM2、CDK2/CDK9、CD97b和EGFR。
在一些方面，L100包含一个或多个选自二醇、烷基、炔基、三唑基、哌嗪基、哌啶基及它们的组合的官能团。
在一些方面，CBN选自
其中
指示与A'的连接点；并且
指示与L100的连接点。
在一些方面，本公开提供了式(XXII)或式(XXXI)的化合物或其药学上可接受的盐，R1选自/>
/>
/>
/>
其中表示与A'的连接点。
在某些方面，本公开提供了一种用于制备式(XXXII)的缀合物
或其药学上可接受的盐的方法，其中：
a为1至10；
A'为其中
n为0或1；
每个Y独立地为S或O；
指示与R1的连接点；并且
指示与亚甲基基团的连接点；
R1与A'一起是诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物；
R2选自氢、为R1-A'提供稳定性的基团、为R1-A提供溶解性的基团和为R1-A'提供稳定性和溶解性的基团；
L为可切割接头；并且
Bm为能够特异性结合蛋白质的结合部分；
所述方法包括：
使(XXXI)的化合物
或其药学上可接受的盐与结合部分反应，其中：
A'、R1和R2如以上所定义并且
L*为可切割接头前体；
所述结合部分能够特异性结合蛋白质。
在一些方面，L*连接至所述Bm中的半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸或谷氨酰胺。在一些方面，所述半胱氨酸或赖氨酸为工程化半胱氨酸或赖氨酸。在一些方面，所述半胱氨酸或赖氨酸对于Bm是内源的。
在一些方面，所述结合部分为抗体或其抗原结合部分。在一些方面，根据EU编号，L*连接至所述抗体或其抗原结合部分的重链位置S239和/或K334处的工程化半胱氨酸。在一些方面，根据EU编号，L*连接至所述抗体或其抗原结合部分的重链位置295处的谷氨酰胺。在一些方面，所述连接经由位点特异性缀合实现。
在所述方法的一些方面，(a)Bm结合的蛋白质是CD33并且R1结合小鼠双微体2同系物(MDM2)，(b)Bm结合的蛋白质是前列腺特异性膜抗原(PSMA)并且R1结合雄激素受体(AR)，(c)Bm结合的蛋白质是CD33并且R1结合含溴结构域的蛋白4(BRD4)，(d)Bm结合的蛋白质是HER2并且R1结合G1至S期转换蛋白1(GSPT1)，或(e)Bm结合的蛋白质是CD33并且R1结合GSPT1。在所述方法的一些方面，Bm结合的蛋白质是CD79b并且R1结合IRAK4。在所述方法的一些方面，Bm结合的蛋白质是HER2并且R1结合BRD4。在所述方法的一些方面，Bm结合的蛋白质是BCMA并且R1结合BRD4。在所述方法的一些方面，Bm结合的蛋白质是HER2并且R1结合ER。
在所述方法的一些方面，R1-A'为靶向蛋白降解剂。在一些方面，R1具有下式：
POI-L100-CBN；
其中：
POI是与所关注的蛋白质结合的化合物；
L100为PROTAC接头；并且
CBN为小脑蛋白结合部分。
在一些方面，所述所关注的蛋白质是核激素受体、翻译终止因子、转录因子、细胞周期蛋白依赖性激酶、酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶或E3连接酶。在一些方面，所述所关注的蛋白质选自CD33、GSPT1、BRD4、AR、ER、IKZF1/3、CK1a、BCL-XL、IKZF2、IRAK4、BTK、STAT3、BTK和iMiD、BRD9、TRK、MDM2、CDK2/CDK9、CD97b和EGFR。
在一些方面，L100包含一个或多个选自二醇、烷基、炔基、三唑基、哌嗪基、哌啶基及它们的组合的官能团。
在一些方面，CBN选自：
其中
指示与A'的连接点；并且
指示与L100的连接点。在一些方面，R1选自：/>
/>
/>
/>
其中表示与A'的连接点。
在一些方面，本公开提供了一种通过本文所述的方法制备的缀合物。
在一些方面，本公开提供了一种将诱导蛋白质-蛋白质相互作用的缀合物递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与如本文所述的缀合物或组合物或其药学上可接受的盐接触。
在一些方面，本公开提供了一种将式(XXXII)的缀合物：
或其药学上可接受的盐递送至细胞的方法，其中：
a为1至10；
A'为其中
n为0或1；
每个Y独立地为S或O；
指示与R1的连接点；并且
指示与亚甲基基团的连接点；
R1与A'一起是诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物；
R2选自氢、为R1-A'提供稳定性的基团、为R1-A'提供溶解性的基团和为R1-A'提供稳定性和溶解性的基团；L为可切割接头；并且
Bm为能够特异性结合蛋白质的结合部分；
所述方法包括使所述细胞与式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐接触。
附图说明
图1描绘了帕妥珠单抗-化合物(I)缀合物(DAR＝8)在4℃、pH 5.5下以及在37℃、pH 7.5孵育24小时后的LCMS光谱。
图2A和图2B描绘了帕妥珠单抗-化合物(VIII)缀合物(DAR＝8)在37℃、pH 7.4孵育24小时后的LCMS光谱。
图3描绘了帕妥珠单抗-化合物(X)缀合物(DAR＝3.66)在37℃、pH7.5孵育24小时后的LCMS光谱。
图4描绘了帕妥珠单抗-化合物(XI)缀合物(DAR＝3.74)在37℃、pH 7.5孵育24小时后的LCMS光谱。
图5描绘了帕妥珠单抗-化合物(XI)缀合物(DAR＝3.74)在用半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶处理之前和之后的RP-LC-UV曲线和新降解剂P1(neoDegrader P1)的RP-LC-UV曲线并且还描绘了所述缀合物在用半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶处理之前和之后的LCMS。
图6描绘了代表性缀合物针对BT-474乳腺癌细胞系的体外活性。X轴示出了对数抗体浓度(M)。Y轴示出了当用帕妥珠单抗-化合物(X)缀合物(三角形，实线)和利妥昔单抗-化合物(X)缀合物(圆形，虚线)处理时BT-474细胞的活力％。
图7描绘了代表性缀合物针对NCI-N87癌细胞系的体外活性。X轴示出了对数抗体浓度(M)。Y轴示出了当用帕妥珠单抗-化合物(X)缀合物(三角形，实线)和利妥昔单抗-化合物(X)缀合物(圆形，虚线)处理时NCI-87细胞的活力％。
图8描绘了代表性缀合物针对BT-474乳腺癌细胞系的体外活性。X轴示出了对数抗体浓度(M)。Y轴示出了当用帕妥珠单抗-化合物(XI)缀合物(三角形)和利妥昔单抗-化合物(XI)缀合物(圆形)处理时BT-474细胞的活力％。
图9描绘了代表性缀合物针对NCI-H929癌细胞系的体外活性。X轴示出了对数抗体浓度(M)。Y轴示出了当用贝兰他单抗-化合物(XIV)缀合物(圆形)、synagis-化合物(XIV)缀合物(正方形)、贝兰他单抗(正三角形)和未缀合的化合物(XIII)(倒三角形)处理时NCI-H929细胞的活力％。
图10描绘了在SK-BR-3细胞(HER2+)不存在和存在的情况下代表性缀合物针对Jurkat HiBiT标记的细胞(HER2-)的体外活性。X轴示出了对数有效载荷浓度(M)。Y轴示出了当用帕妥珠单抗-化合物(X)缀合物处理时，在SK-BR-3细胞存在(圆形，实线)和不存在(正方形，虚线)的情况下Jurkat HiBiT细胞的活力％。
图11描绘了代表性缀合物针对BT-474乳腺癌细胞系的体外活性。X轴示出了对数抗体浓度(M)。Y轴示出了当用帕妥珠单抗-化合物(XVIII)缀合物(圆形)、帕妥珠单抗-化合物(XI)缀合物(正方形)和利妥昔单抗-化合物(XVIII)缀合物(三角形)处理时BT-474细胞的活力％。
图12描绘了代表性缀合物针对BT-474乳腺癌细胞系的体外活性。X轴示出了对数抗体浓度(M)。Y轴示出了当用帕妥珠单抗-化合物(XLI)缀合物(圆形)、帕妥珠单抗-化合物(Ie)缀合物(正方形)、帕妥珠单抗-化合物(XIX)缀合物(正三角形)，帕妥珠单抗-化合物(Ii)缀合物(倒三角形)、帕妥珠单抗-化合物(Ia)缀合物(菱形)、利妥昔单抗-化合物(XLI)缀合物(六边形)和利妥昔单抗-化合物(XIX)缀合物(星形)处理时BT-474细胞的活力％。
图13描绘了代表性缀合物针对MV-411AML细胞系的体外活性。X轴示出了对数抗体浓度(M)。Y轴示出了当用吉妥珠单抗-化合物(XL)缀合物(圆形)、吉妥珠单抗-化合物(XL)缀合物加上吉妥珠单抗(正方形)、吉妥珠单抗-化合物(XL)缀合物加上曲妥珠单抗(正三角形)、化合物40-3(倒三角形)、吉妥珠单抗(菱形)和曲妥珠单抗(星形)处理时BT-474细胞的活力％。
图14描绘了化合物(XL)和化合物40-3对BRD4蛋白质的降解。
图15A描绘了当用3mg/kg或10mg/kg的帕妥珠单抗-化合物(Ia)(分别为正方形和正三角形)和用3mg/kg或10mg/kg的帕妥珠单抗-化合物(XI)(分别为倒三角形和菱形)治疗时HCC1569(乳腺癌)肿瘤体积随时间的变化。
图15B描绘了当用3mg/kg或10mg/kg的帕妥珠单抗-化合物(Ia)(分别为正方形和正三角形)和用3mg/kg或10mg/kg的帕妥珠单抗-化合物(XI)(分别为倒三角形和菱形)治疗时具有HCC1569(乳腺癌)肿瘤的小鼠体重随时间的变化。
图16描绘了具有Cys-突变的抗PSMA抗体-化合物(XV)内源半胱氨酸缀合物(DAR为4)的SEC色谱图。
图17描述了具有S239C突变的J591抗体-化合物(XV)位点特异性工程化半胱氨酸缀合物(DAR为1.85)的SEC色谱图。
图18描绘了化合物(XIX)的HPLC色谱图。
图19A描绘了当化合物(XIX)用半胱氨酸处理时反应混合物的HPLC色谱图。化合物(XIX)被完全消耗，唯一鉴定的产物具有2.41分钟的保留时间。
图19B描绘了对应于化合物18-6的在保留时间2.4分钟的峰的MS数据。
图20描绘了HER2-A抗体(野生型序列)-化合物(XLII)缀合物(DAR为3.3)的SEC色谱图。
图21描绘了HER2-A抗体(含有用于位点特异性缀合的半胱氨酸突变体)-化合物(XLII)缀合物(DAR为2.0)的SEC色谱图。
图22描绘了当用10mg/kg的CD33-D抗体-化合物(XL)缀合物(正方形)、0.4mg/kg的BRD4异双功能降解剂小分子(来自Xiamg,W.等人,Biorganic Chemistry 2021,第115卷的化合物15)(正三角形)、10mg/kg ARV-825(倒三角形)和媒介物(圆形)治疗时，MV-4-11肿瘤体积随时间的变化。
图23描绘了图22中描绘的每个组随时间变化的个体肿瘤体积。
图24描绘了在图22中描绘的研究中使用的小鼠的体重随时间的变化。
图25描绘了具有三种不同DAR的CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物(实心圆、正三角形和菱形)、Synagis N297A(空心圆)和CD79b-A抗体(正方形)的CD79b结合亲和力。
图26描绘了显示CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物、未缀合的有效载荷和未缀合的CD79b-A抗体对IRAK4的降解(与β-肌动蛋白对照相比)的蛋白质印迹(Western blot)。
图27描绘了显示在CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物、未缀合的CD79b-A抗体或CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物和未缀合的CD79b-A抗体两者存在的情况下IRAK4的量(与β-肌动蛋白对照相比)的蛋白质印迹。
具体实施方式
本公开涉及式(XX)的缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
a为1至10；
n为0或1；
R1是诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物；
R2选自氢、-(CH2CH2O)v-CH3、C2-C6烯基、C1-C6烷基、C2-C6炔基、苄基、C3-C6环烷基和C3-C6环烷基(C1-C3烷基)，其中v为1至24；
每个Y独立地为S或O；
L为可切割接头；并且
Bm为能够特异性结合蛋白质的结合部分。在一些方面，所述蛋白质在细胞表面上。
在一些方面，R2为甲基。
本公开还涉及式(XXXII)的缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
a为1至10；
A'为其中
n为0或1；
每个Y独立地为S或O；
指示与R1的连接点；并且
指示与亚甲基基团的连接点；
R1与A'一起是诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物；
R2选自氢、为R1-A'提供稳定性的基团、为R1-A'提供溶解性的基团和为R1-A'提供稳定性和溶解性的基团；
L为可切割接头；并且
Bm为能够特异性结合蛋白质的结合部分。在一些方面，所述蛋白质在细胞表面上。
本公开还提供了包含所述缀合物的组合物，使用所述缀合物的方法以及缀合至结合部分的上述化合物。
包括能够进行本文所述逆曼尼希反应(retro-Mannich reaction)的间隔区是将含有戊二酰胺(gluturamide)或二氢尿嘧啶的降解剂与抗体或其它细胞结合剂连接和释放的合适通用解决方案。通过使用该技术，不需要引入附加化学处理来实现基于抗体向癌细胞的递送。
I.定义
为了更容易地理解本说明书，首先对某些术语进行定义。在整个详细描述中阐述了附加定义。
需要注意的是，术语“一”或“一个(种)”实体是指该实体中的一者或多者；例如，“核苷酸序列”被理解为代表一个或多个核苷酸序列。因此，术语“一个(或一种)”、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。还应注意，权利要求书可被起草以排除任何任选元素。因此，该陈述旨在用作使用与要求保护要素的叙述有关的排他性术语诸如“单独地”、“仅”等或使用负面限制的先行基础。
此外，当在本文使用时，“和/或”应当视为具有或不具有另一者的两种特定特征或组分的每一者的具体公开。因此，本文在短语诸如“A和/或B”中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，在短语诸如“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在包括以下方面中的每个方面：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
应当理解，每当在本文中用语言“包括”来描述方面时，还提供以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其他类似方面。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科技术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；Dictionary of Cell andMolecular Biology,第3版,1999,Academic Press；和Oxford Dictionary OfBiochemistry And Molecular Biology,修订板,2000,Oxford University Press，给普通技术人员提供本发明中使用的许多术语的通用字典。
单位、前缀和符号以其Système International de Unites(SI)可接受的形式表示。数值范围包括限定该范围的数字。在列举值的范围的情况下，应当理解，在该范围的列举的上限和下限之间的每个中间整数值及其每个分数以及这些值之间的每个子范围也被具体公开。任何范围的上限和下限可独立地包括在该范围内或从该范围排除，并且包括任一限值、不包括限值或包括两个限值的每个范围也涵盖在本公开内。因此，本文所列举的范围被理解为该范围内的所有值的简写，包括所列举的端点。
在明确列举值的情况下，应理解作为与所列举的值大约相同的数量或量的值也在本公开的范围内。在公开组合的情况下，该组合的元素的每个子组合也被具体公开并且在本公开的范围内。相反，在单独公开不同元素或元素组的情况下，也公开了它们的组合。在公开的任何元素被公开为具有多个替代物的情况下，由此还公开了其中每个替代物被单独排除或与其他替代物的任何组合的该公开的实例；公开的多于一个元素可具有此类排除，并且由此公开具有此类排除的元素的所有组合。
如本文所用，术语“靶向蛋白降解剂”和“新降解剂”是指与E3泛素连接酶形成三元复合物的分子，其能够靶向蛋白质进行降解。实例包括但不限于分子胶和PROTAC。分子胶的实例包括但不限于CC-90009、来那度胺(lenalidomide)、泊马度胺(pomalidomide)、DKY709和WO2021/198965中描述的化合物P1。
如本文所用，术语“抗体”也指全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗原结合位点的分子，该抗原结合位点免疫特异性结合所关注靶标的抗原或其部分，此类靶标包括但不限于癌细胞或产生与自身免疫疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本文公开的免疫球蛋白可为免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。免疫球蛋白可源自任何物种。然而，在一个方面，免疫球蛋白为人、鼠或兔来源。
术语“单结构域抗体”，也称为纳米抗体，是由分子量为约12kDa至约15kDa的单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。单体抗体可基于重链可变结构域或轻链。单结构域抗体的实例包括但不限于VHH片段和VNAR片段。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，通常为其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体；由Fab表达文库产生的片段、抗独特型(抗Id)抗体、CDR(互补决定区)和上述免疫特异性结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原中的任一种的表位结合片段、单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“完整抗体”为包含抗原结合可变区以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即除了可能小量存在的可能的天然存在的突变之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优势在于它们可不受其他抗体污染地合成。修饰语“单克隆”指示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特性并且不应解释为需要通过任何特定方法产生该抗体。例如，根据本公开使用的单克隆抗体可通过杂交瘤方法制备，或者可通过重组DNA方法制备。“单克隆抗体”也可从噬菌体抗体文库中分离。
本文中的单克隆抗体具体地包括“嵌合”抗体以及此类抗体的片段，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而该链的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，只要它们表现出期望的生物活性。本文所关注的嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其包含源自非人灵长类(例如，旧大陆猴(Old World Monkey)、猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。
已采用各种方法产生单克隆抗体(MAb)。杂交瘤技术是指产生单一类型抗体的克隆细胞系，使用各种物种的细胞，包括小鼠(鼠类)、仓鼠、大鼠和人。另一种制备MAb的方法是使用基因工程，包括重组DNA技术。由这些技术制成的单克隆抗体包括嵌合抗体和人源化抗体。嵌合抗体组合了来自多于一种物种的DNA编码区。例如，嵌合抗体的可变区可源自小鼠并且恒定区源自人。人源化抗体主要来自于人，尽管它包含非人部分。像嵌合抗体一样，人源化抗体可包含完全人恒定区。但与嵌合抗体不同，可变区可部分源自人。人源化抗体的非人合成部分通常来自鼠抗体中的CDR。在任何情况下，这些区域对于抗体识别和结合特定抗原是至关重要的。虽然可用于诊断和短期治疗，但在不增加有害免疫原性应答的情况下不能长期向人施用鼠抗体。这种应答称为人抗小鼠抗体(HAMA)，当人免疫系统将鼠抗体识别为外来物并对其进行攻击时就会发生这种应答。HAMA应答可导致中毒性休克甚至死亡。
嵌合抗体和人源化抗体通过使施用抗体的非人部分最小化来降低HAMA应答的可能性。此外，嵌合和人源化抗体可以具有激活次级人体免疫应答的附加益处，所述次级人体免疫应答诸如抗体依赖性细胞毒性。
完整抗体可具有一种或多种“效应功能”，其是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性。抗体效应功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调等。
取决于它们重链恒定结构域的氨基酸序列，完整抗体可以分配为不同的“类别”。有五种主要类别的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几种可被进一步划分成“亚类”(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同抗体类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。
本文使用术语“约”意指大约、大致、左右或在其范围内。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过延伸所阐述数值的上下边界来修饰该范围。一般来讲，术语“约”用于修饰偏差为例如上或下(更高或更低)10％的所述值的上下数值。
术语“施用(administration、administering)”及其语法变体是指通过药学上可接受的途径将组合物诸如本公开的EV(例如，外来体)引入受试者。通过包括瘤内、口服、肺内、鼻内、胃肠外(静脉内、动脉内、肌内、腹膜内或皮下)、直肠、淋巴内、鞘内、眼周或局部的任何合适的途径将组合物诸如本公开的EV(例如，外来体)引入受试者。施用包括自我施用和他人施用。合适的施用途径允许组合物或剂发挥其预期功能。例如，如果合适的途径是静脉内，则通过将组合物或剂引入受试者的静脉来施用组合物。
如本文所用，术语“抗体”包括天然或部分或全部合成产生的免疫球蛋白及其片段。该术语还涵盖具有与免疫球蛋白结合结构域同源的结合结构域的任何蛋白质。“抗体”还包括包含特异性结合和识别抗原的免疫球蛋白基因或其片段的框架区的多肽。术语抗体的使用意在包括完整抗体、多克隆、单克隆和重组抗体、它们的片段，并且还包括单链抗体、人源化抗体、鼠抗体、嵌合抗体、小鼠-人、小鼠-灵长类、灵长类-人单克隆抗体、抗独特型抗体、抗体片段，例如scFv、(scFv)2、Fab、Fab'和F(ab')2、F(ab1)2、Fv、dAb和Fd片段、双抗体和抗体相关多肽。抗体包括双特异性抗体和多特异性抗体，只要它们表现出期望的生物学活性或功能。在本公开的一些方面，生物学活性分子为抗体或包含其抗原结合片段的分子。
术语“抗体-药物缀合物”和“ADC”可互换使用，指与治疗剂(本文有时称为剂、药物或活性药物成分)连接(例如，共价连接)的抗体。在本公开的一些方面，生物学活性分子为抗体-药物缀合物。
如本文所用，术语“大约”在应用于一个或多个所关注的值时，是指与所述参考值类似的值。在某些方面，术语“大约”是指在任一方向(大于或小于)上落在所述参考值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的值的范围，除非另有说明或从上下文中明显看出(除非该数字将超过可能值的100％)。
“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换。本领域已定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，如果多肽中的一个氨基酸被来自相同侧链家族的另一个氨基酸替换，则这种取代被认为是保守的。在另一个实施方案中，氨基酸串可被侧链家族成员的顺序和/或组成不同而结构上类似的串保守替换。
如本文所用，术语“保守的”分别指多核苷酸序列或多肽序列的核苷酸或氨基酸残基，它们是在被比较的两个或更多个序列的相同位置上未发生改变的那些。相对保守的核苷酸或氨基酸是在比出现在序列中其他地方的核苷酸或氨基酸更相关的序列中保守的那些。
在一些方面，如果两个或更多个序列彼此100％相同，则称它们为“完全保守的”或“相同的”。在一些方面，如果两个或更多个序列彼此至少约70％相同、至少约80％相同、至少约90％相同或至少约95％相同，则称它们为“高度保守的”。在一些方面，如果两个或更多个序列彼此至少约30％相同、至少约40％相同、至少约50％相同、至少约60％相同、至少约70％相同、至少约80％相同、至少约90％相同或至少约95％相同，则称它们是“保守的”。序列保守性可应用于多核苷酸或多肽的整个长度，或者可应用于其部分、区域或特征。
如本文所用，术语“连接”和“缀合”可互换使用，各自指包含诱导蛋白质-蛋白质相互作用的一种或多种化合物和结合部分的两个或更多个部分的共价或非共价连接。在一些方面，连接或缀合可包括接头。
术语“氨基酸序列变体”是指具有在某种程度上不同于天然序列多肽的氨基酸序列的多肽。通常，氨基酸序列变体将与天然抗体的至少一个受体结合结构域或与天然受体的至少一个配体结合结构域具有至少约70％的序列同一性，并且典型地，它们将与此类受体或配体结合结构域具有至少约80％、更典型地至少约90％的序列同源性。氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列中的某些位置具有取代、缺失和/或插入。氨基酸以常规名称、一字母和三字母代码命名。
“序列同一性”被定义为在比对序列和引入缺口(如果必要)以实现最大序列同一性百分比后氨基酸序列变体中相同的残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域熟知的。一种此类计算机程序是由Genentech,Inc.编写的“Align 2”，其于1991年12月10日在华盛顿特区美国版权局20559提交了用户文档。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体的Fc区结合的受体。示例性FcR为天然序列人FcR。此外，FcR可以是结合IgG抗体(γ受体)的FcR并且包括Fc.γ.RI、Fc.γ.RII和Fc.γ.RIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和替代性剪接形式。Fc.γ.RII受体包括Fc.γ.RIIA(一种“抑制受体”)和Fc.γ.RIIB(一种“抑制受体”)，它们具有类似的氨基酸序列，主要区别在于其细胞质结构域。激活受体Fc.γ.RIIA含有在其细胞质结构域中的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体Fc.γ.RIIB含有在其细胞质结构域中的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。本文的术语“FcR”涵盖其它FcR，包括将来鉴定的FcR。该术语还包括负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿受体FcRn。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体的存在下分子裂解靶标的能力。补体激活途径由补体系统的第一组分(C1q)结合到与同源抗原复合的分子(例如抗体)而启动。为了评估补体激活，可进行CDC测定。
“天然抗体”通常为约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键的数量各不相同。每条重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链具有在一端的一个可变结构域(VH)，随后是多个恒定结构域。每条轻链具有在一端的可变结构域(VL)并且在其另一端的恒定结构域。轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对准，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对准。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。
术语“可变”是指可变结构域的某些部分在抗体之间的序列差异很大，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性在抗体的整个可变结构域中并非均匀分布。它集中在轻链和重链可变结构域两者中称为高变区的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，它们主要采用由三个高变区连接的β-折叠构型，这些高变区形成连接β-折叠结构的环并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并且与来自另一条链的高变区一起为抗体的抗原结合位点的形成作出贡献。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
当在本文中使用时，术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，同上)和/或来自“高变环”的那些残基(例如，轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3))。“框架区”或“FR”残基为除本文所定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，每个片段具有单一抗原结合位点；和残余的“Fc”片段，其名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
“Fv”是含有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密非共价缔合的一条重链可变结构域和一条轻链可变结构域的二聚体组成。正是以这种每个可变结构域的三个高变区相互作用的构型限定了VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。这六个高变区共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，即便是单一可变域(或是仅包含对抗原具有特异性的三个高变区的Fv的一半)也具有识别并结合抗原的能力，尽管其亲合力低于完整的结合位点。
Fab片段也包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab片段与Fab'片段的不同之处在于其在重链CH1结构域的羧基末端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。本文中将其中恒定结构域的(多个)半胱氨酸残基具有至少一个游离硫醇基的Fab'称为Fab'-SH。F(ab')2抗体片段起初以Fab'片段对的形式产生，所述Fab'片段对在Fab'片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联物也是已知的。
基于其恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”可被归为两种明显不同的类型(称为κ(.κ.)和λ(.λ.))中的一种。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。Fv多肽还可包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，该多肽接头使得scFv能够形成用于抗原结合的期望结构。
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段包含在同一多肽链(VH-VL)中与可变轻结构域(VL)连接的可变重结构域(VH)。通过使用太短而无法在同一条链上的两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。
非人(例如，啮齿动物)抗体的“人源化”形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。人源化是将鼠抗原结合信息转移至非免疫原性人抗体受体的方法，并且已产生了许多治疗上有用的药物。人源化方法一般通过将所有六个鼠互补决定区(CDR)转移到人抗体框架上而开始。这些CDR移植的抗体通常不保留它们对抗原结合的原始亲和力，并且事实上，亲和力经常严重受损。除CDR外，还必须并入所选择的非人抗体框架残基以维持正确的CDR构象。已显示将关键小鼠框架残基转移至人受体以支持移植的CDR的结构构象可恢复抗原结合和亲和力。在大多数情况下，人源化抗体是其中来自受体高变区的残基被来自非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的具有期望特异性、亲和力和能力的高变区残基替换的人免疫球蛋白(受体抗体)。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被对应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步完善抗体性能。一般来讲，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个且通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些并且所有或基本上所有的FR为人免疫球蛋白序列的那些。所述人源化抗体任选还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。
“分离的抗体”是已经从其天然环境的组分中鉴定并分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可能包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在某些方面，抗体将被纯化(1)至通过Lowry方法测定的大于95重量％、或大于重量99％的抗体，(2)通过使用气相蛋白质测序仪足以获得至少15个N-端或内部氨基酸序列残基的程度，或(3)通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或银染色达到均一性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体天然环境中的至少一种成分将不存在。然而，通常通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体。
“癌症”是指以体内异常细胞不受控制的生长为特征的一大类各种疾病。不受调控的细胞分裂和生长导致恶性肿瘤的形成，这些恶性肿瘤侵袭邻近组织，并且还可通过淋巴系统或血流转移到身体的远处部位。如本文所用，“癌症”是指原发性、转移性和复发性癌症。
如本文所用，术语“免疫应答”是指脊椎动物内针对外来因子的生物学应答，该应答保护生物体抵抗这些因子和由它们引起的疾病。免疫应答由免疫系统细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞或嗜中性粒细胞)和由这些细胞中的任何细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用介导，其导致选择性靶向、结合、损害、破坏和/或消除脊椎动物体内的入侵病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或其他异常细胞、或在自身免疫或病理性炎症的情况下正常人细胞或组织。免疫反应包括例如T细胞(例如效应T细胞或Th细胞，诸如CD4+或CD8+T细胞)的激活或抑制，或Treg细胞的抑制。如本文所用，术语“T细胞”和“T淋巴细胞”是可互换的并且是指由胸腺产生或加工的任何淋巴细胞。在一些方面，T细胞为CD4+T细胞。在一些方面，T细胞为CD8+T细胞。在一些方面，T细胞为NKT细胞。
“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括但不限于脊椎动物诸如非人灵长类、绵羊、狗和啮齿类动物诸如小鼠、大鼠和豚鼠。在一些方面，受试者为人。术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。
术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指提供期望生物学、治疗和/或防预结果的剂(例如，本文公开的缀合物)的量。该结果可以是疾病的体征、症状或病因中的一种或多种的减少、改善、缓和、减轻、延迟和/或缓解，或生物学系统的任何其他期望的改变。关于实体瘤，有效量包括足以引起肿瘤缩小和/或降低肿瘤生长速率(例如抑制肿瘤生长)或预防或延迟其他不需要的细胞增殖的量。在一些方面，有效量是足以延迟肿瘤发展的量。在一些方面，有效量是足以预防或延迟肿瘤复发的量。因此，可以一次或多次施用来施用有效量。例如，有效量的组合物可例如(i)减少癌细胞的数量；(ii)减小肿瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、延缓、减缓并能阻止癌细胞向周围器官的浸润；(iv)抑制(即在一定程度上减缓并能阻止肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。
在一些方面，“治疗有效量”是经临床证明显著减少癌症诸如晚期实体瘤或减缓癌症进展(消退)的缀合物的量。治疗剂促进疾病消退的能力可使用本领域技术人员已知的多种方法诸如在临床试验期间在人受试者中、在预测人中功效的动物模型系统中、或通过在体外测定中测定该剂的活性来评估。
如本文所用，术语“护理标准”是指被医学专家接受为对某种类型疾病的适当治疗并被医疗保健专业人员广泛使用的治疗方法。该术语可与以下术语中的任一种互换使用：“最佳实践”、“标准医疗护理”和“标准疗法”。
举例来说，“抗癌剂”促进受试者的癌症消退或预防肿瘤的进一步生长。在某些方面，治疗有效量的药物促进癌症消退至消除癌症的程度。
关于治疗的术语“有效”和“有效性”包括药理有效性和生理安全性。药理有效性是指药物促进患者癌症消退的能力。生理安全性是指由施用药物引起的在细胞、器官和/或生物体水平上的毒性水平或其他不良生理效应(副作用)。
如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”是指完全或部分减少、抑制、干扰或调节一种或多种检查点蛋白的分子。检查点蛋白调节T细胞的激活或功能。许多检查点蛋白是已知的，诸如CTLA-4及其配体CD80和CD86以及PD-1及其配体PD-L1和PD-L2。Pardoll,D.M.,NatRev Cancer 12(4):252-64(2012)。这些蛋白质负责T细胞应答的共刺激或抑制相互作用。免疫检查点蛋白调节和维持自身耐受性以及生理免疫应答的持续时间和幅度。免疫检查点抑制剂包括抗体或来源于抗体。
术语“治疗(treat或treatment)”是指治疗性治疗和防预性或预防性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)不希望的生理变化或障碍，诸如癌症的发展或扩散。出于本公开的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的缓解、疾病程度的减轻、疾病状态的稳定(即，不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和、以及消除(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可意指与不接受治疗的预期生存期相比延长生存期。需要治疗的那些包括已患有病症或疾患的那些，以及易于患病症或疾患的那些或要预防病症或疾患的那些。
II.蛋白质-蛋白质相互作用诱导剂
本公开提供了式(XX)的缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中R1是诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物。
本公开还提供了式(XXXII)的缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
A'为其中
n为0或1；
每个Y独立地为S或O；
指示与R1的连接点；并且
指示与亚甲基基团的连接点；并且
R1与A'一起是诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物。
诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物包括蛋白质-蛋白质相互作用调节剂，诸如在Biophysical Reviews 2019,11:559-581中描述的那些。
在某些方面，蛋白质-蛋白质相互作用诱导剂包括靶向蛋白降解剂，其可以拆解和分解不需要的蛋白质。
在一些方面，靶向蛋白降解剂包含取代的异吲哚化合物。在一些方面，靶向蛋白降解剂包含5'-取代的异吲哚化合物。在某些方面，R1是如下所示的式(XXX)的化合物：
其中：
为与母体分子部分的连接点；
A为苯基或C4-C10环烷基环；
U选自NH和CF2；
R10独立地选自氢和卤代基；
R20选自-CH3、-C(O)R3、-N(R4)2、-(CH2)nOH、-(CH2)nN(R4)2、-(CH2)nQ'(CH2)mOH、-(CH2)nQ'(CH2)mSH和-(CH2)nQ'(CH2)mN(R4)2；其中
R3为氢或C1-C6烷基；
每个R4独立地为氢或C1-C6烷基；
Q'为O、S或NR4；
n为1-6；并且
m为2-5。
在某些方面，本公开提供了式(XXX)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
A为苯基环或C4-C10环烷基环；
U为NH；
R10选自氢和卤代基；
R20选自-(CH2)nQ'(CH2)mN(R4)2、-(CH2)nOH,-N(R4)2和-C(O)R3；其中
m为2；
n为2；
Q'为-O-；
R3为甲基；并且
每个R4独立地选自氢和甲基。
如本文所用，术语“C1-C6烷氧基”，如本文所用，是指通过氧原子连接到母体分子部分的C1-C6烷基基团。
如本文所用，术语“C1-C6烷氧基C1-C6烷基”是指通过C1-C6烷基基团连接到母体分子部分的C1-C6烷氧基基团。
如本文所用，术语“C1-C6烷基”是指衍生自含有一至六个碳原子的直链或支链饱和烃的基团。
如本文所用，术语“C4-C10环烷基”是指具有四至十个碳原子和零个杂原子的饱和单环烃环系统。环烷基的代表性实例包括但不限于环丁基、环戊基和环己基。含有七至十个原子的环烷基可以是单环或稠合、螺环或桥接双环结构。
如本文所用，术语“卤代基”是指F、Cl、Br或I。
在一些方面，式(XXX)的化合物是选自由以下组成的组的化合物：
在一些方面，靶向蛋白降解剂包含蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)。PROTAC的实例是本领域已知的(参见，例如，Acta Pharmaceutica Sinica B,2020；10(2):207-238。
在某些方面，PROTAC具有下式：
POI-L100-CBN；
其中：
POI是与所关注的蛋白质结合的化合物；
L100为PROTAC接头；并且
CBN为小脑蛋白结合部分。
已经报道了几种不同的蛋白类别作为PROTAC靶标。在某些方面，所述所关注的蛋白质可以是核激素受体、翻译终止因子、转录因子、细胞周期蛋白依赖性激酶、酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶或E3连接酶。
在不同的蛋白质类别中，有几种所关注的蛋白质可被本文所述的PROTAC靶向。在某些方面，所述所关注的蛋白质可以选自CD33、GSPT1、BRD4、雄激素受体(AR)、雌激素受体(ER)、IKZF1/3、CK1a、BCL-XL、IKZF2、IRAK4、BTK、STAT3、BTK和iMiD、BRD9、TRK、MDM2、CDK2/CDK9、CD97b和EGFR。在一些方面，所述所关注的蛋白质可选自BRD4、ER和IRAK4。在一些方面，所述所关注的蛋白质可选自BTK、BRD9、TRK、CDK2/CDK9和STAT3。
在某些方面，PROTAC包含接头L100。PROTAC接头已在本领域中得到充分研究(参见，例如Troup RI,Fallan C,Baud MGJ.“Current strategies for the design of PROTAClinkers:a critical review.”Explor Target Antitumor Ther.2020；1:273-312.https://doi.org/10.37349/etat.2020.00018)。
在某些方面，L100可包含烷基接头。在一些方面，烷基接头可以包含2至30个原子。在一些方面，烷基接头可以包含5至25个原子。在一些方面，烷基接头可以包含10至20个原子。在一些方面，烷基接头可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个原子。
在某些方面，L100可包含二醇接头。在一些方面，二醇接头可以包含3至30个原子。在一些方面，二醇接头可以包含5至25个原子。在一些方面，烷基接头可以包含10至20个原子。在一些方面，烷基接头可以包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个原子。
在某些方面，L100可包含二醇和烷基接头。在一些方面，接头可以包含5至35个原子。在一些方面，烷基接头可以包含10至30个原子。在一些方面，烷基接头可以包含15至25个原子。在一些方面，烷基接头可以包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个原子。
在某些方面，L100可包含一个或多个选自以下的官能团：聚乙二醇(PEG)、可选的二醇基团(诸如丙二醇)、烷基、炔基、三唑基、哌嗪基、哌啶基以及它们的混合物。应当理解，可以使用技术人员已知的方法选择适当的PROTAC接头。在一些方面，接头可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个原子。
通常，并且在某些实施方案中，PROTAC可以包含小脑蛋白结合部分(CNB)。在一些方面，小脑蛋白结合部分可选自：
其中
指示与A'的连接点；并且
指示与L100的连接点。
在一些方面，PROTAC可以是具有下式的化合物：
/>
/>
/>
/>
其中表示与A'的连接点。
III.稳定性和溶解性增强剂
本文所述的缀合物的稳定性和/或溶解性可以通过在R2处的官能化来改善。在某些方面，在不需要改善稳定性和/或溶解性的情况下，R2可以是氢。在其它方面，在需要额外的稳定性和/或溶解性的情况下，R2可以是氢以外的基团。
在某些方面，R2可以是赋予缀合物稳定性的基团。在一些方面，R2选自C2-C6烯基、C1-C6烷基、C2-C6炔基、苄基、C3-C6环烷基和C3-C6环烷基(C1-C3烷基)。在一些方面，R2为C1-C6烷基。在一些方面，R2为甲基。
在某些方面，R2可以是赋予缀合物溶解性的基团。在一些方面，R2可以选自：
/>
其中：
每个n独立地为1、2、3、4或5；
每个y独立地为1或2；并且
每个R独立地为氢、C6H11O5、C12H21O10、C18H31O15或C24H41O20。
IV.缀合物
本公开提供了一种或多种蛋白质-蛋白质相互作用诱导剂、接头和结合部分的缀合物。
在一些方面，本公开提供了式(I)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
a为1至10；
n为0或1；
R1是诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物；
R2选自氢、-(CH2CH2O)v-CH3、C2-C6烯基、C1-C6烷基、C2-C6炔基、苄基、C3-C6环烷基和C3-C6环烷基(C1-C3烷基)，其中v为1至24；
每个Y独立地为S或O；
L为可切割接头；并且
Bm为能够特异性结合蛋白质的结合部分。在一些方面，所述蛋白质在细胞表面上。
在一些方面，本公开提供了式(XXXII)的缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
a为1至10；
A'为其中/>
n为0或1；
每个Y独立地为S或O；
指示与R1的连接点；并且
指示与亚甲基基团的连接点；
R1与A'一起是诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物；
R2选自氢、为R1-A'提供稳定性的基团、为R1-A'提供溶解性的基团和为R1-A'提供稳定性和溶解性的基团；
L为可切割接头；并且
Bm为能够特异性结合蛋白质的结合部分。在一些方面，所述蛋白质在细胞表面上。
在一些方面，Bm结合的蛋白质是HER2并且R1结合G1至S期转换蛋白1(GSPT1)。在一些方面，Bm结合的蛋白质是CD33并且R1结合小鼠双微体2同系物(MDM2)。在一些方面，Bm结合的蛋白质是前列腺特异性膜抗原(PSMA)并且R1结合雄激素受体(AR)。在一些方面，Bm结合的蛋白质是CD33并且R1结合含溴结构域的蛋白4(BRD4)。在一些方面，Bm结合的蛋白质是CD33并且R1结合GSPT1。在一些方面，Bm结合的蛋白质是CD79b并且R1结合IRAK4。在一些方面，Bm结合的蛋白质是HER2并且R1结合BRD4。在一些方面，Bm结合的蛋白质是BCMA并且R1结合BRD4。在一些方面，Bm结合的蛋白质是HER2并且R1结合ER。
在一些方面，本文所述的缀合物具有针对肿瘤细胞系的体外抗增殖活性。在一些方面，包含一种或多种诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物和结合部分的缀合物具有比所述一种或多种化合物或单独的所述结合部分高至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约100％的体外抗增殖活性。在一些方面，包含一种或多种诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物和结合部分的缀合物具有比所述一种或多种化合物或单独的所述结合部分高至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍的体外抗增殖活性。
在一些方面，包含一种或多种诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物和结合部分的缀合物具有针对BT-474乳腺癌细胞系的体外抗增殖活性，例如与单独的所述一种或多种化合物或单独的所述结合部分相比针对BT-474乳腺癌细胞系的更高的抗增殖活性。在一些方面，包含一种或多种诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物和结合部分的缀合物具有针对SK-BR-3乳腺癌细胞系的体外抗增殖活性，例如与单独的所述一种或多种化合物或单独的所述结合部分相比针对SK-BR-3乳腺癌细胞系的更高的抗增殖活性。在一些方面，包含一种或多种诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物和结合部分的缀合物具有针对NCI-N87胃癌细胞系的体外抗增殖活性，例如与单独的所述一种或多种化合物或单独的所述结合部分相比针对NCI-N87胃癌细胞系的更高的抗增殖活性。在一些方面，包含一种或多种诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物和结合部分的缀合物具有针对Daudi淋巴瘤细胞系的体外抗增殖活性，例如与单独的所述一种或多种化合物或单独的所述结合部分相比针对Daudi淋巴瘤细胞系的更高的抗增殖活性。在一些方面，包含一种或多种诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物和结合部分的缀合物具有针对HL-60急性髓性白血病细胞系的体外抗增殖活性，例如与所述一种或多种化合物或单独的所述结合部分相比针对HL-60急性髓性白血病细胞系的更高的抗增殖活性。在一些方面，包含一种或多种诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物和结合部分的缀合物具有针对Ramos非霍奇金淋巴瘤细胞系的体外抗增殖活性，例如与单独的所述一种或多种化合物或单独的所述结合部分相比针对Ramos非霍奇金淋巴瘤细胞系的更高的抗增殖活性。在一些方面，本文所述的缀合物能够在存在人血清的情况下维持其抗增殖活性。在一些方面，本文所述的缀合物可用于治疗癌症。
在一些方面，本文提供的缀合物可用于治疗乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、胆管癌、结肠癌、卵巢癌或神经调节蛋白-1(NRG1)阳性癌症，例如，其中Bm结合的蛋白质是HER2并且其中R1结合G1至S期转换蛋白1(GSPT1)。在一些方面，本文提供的缀合物可用于治疗急性髓性白血病，例如，其中Bm结合的蛋白质是CD33并且其中R1结合MDM2、GSPT1或含溴结构域的蛋白4(BRD4)。在一些方面，本文提供的缀合物可用于治疗前列腺癌，例如，其中Bm结合的蛋白质是前列腺特异性膜抗原(PSMA)，并且其中R1结合雄激素受体(AR)。在一些方面，本文提供的缀合物可用于治疗NHL，例如B细胞NHL或DLBCL，例如，其中Bm结合的蛋白质是CD79b并且其中R1结合IRAK4。
III.A.接头
诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物可通过如本文所述的戊二酰胺或二氢尿嘧啶环与结合部分连接。如本文所用，术语“接头”是指能够将结合部分(Bm)连接到式(XX)或式(XXX)的化合物内的戊二酰胺或二氢尿嘧啶环的氮原子的任何化学部分。
在某些方面，接头可含有异双官能团。在本公开中，术语“异双官能团”是指将接头连接到结合部分的化学部分，其中接头是结合部分的一部分。异双官能团的特征在于在化学部分的任一端具有不同的反应性基团。与“Bm”的连接可通过化学或酶促缀合或两者的组合来实现。化学缀合涉及结合部分表面上可接近的氨基酸残基与异双官能团上的反应柄的受控反应。化学缀合的实例包括但不限于赖氨酸酰胺偶联、半胱氨酸偶联和通过基因工程并入的经由非天然氨基酸的偶联，其中具有期望反应柄的非天然氨基酸残基安装在“Bm”上。在酶促缀合中，酶介导接头与结合部分上可接近的氨基残基的偶联。酶促缀合的实例包括但不限于使用分选酶的转肽、使用微生物转谷氨酰胺酶的转肽和N-聚糖工程化。化学缀合和酶促缀合也可顺序使用。例如，酶促缀合也可用于在“Bm”上安装独特的反应柄，以用于随后的化学缀合。
在一些方面，异双官能团选自：
其中
为与接头的剩余部分的连接点；并且
为与Bm的连接点。
在某些方面，接头可以是可切割的。在一些方面，在诱导蛋白质-蛋白质相互作用的所述一种或多种化合物和/或结合部分可保持活性的条件下，接头可对酸诱导的切割、光诱导的切割、生物还原性切割、酶促切割等敏感。
在一些方面，可切割接头可被酶促切割。在一些方面，可切割接头可被蛋白酶、肽酶、酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、糖苷酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、焦磷酸酶或脂肪酶切割。
在一些方面，可切割接头可被蛋白酶切割。蛋白酶的实例包括但不限于组织蛋白酶B、VAGP四肽等。
在某些方面，可切割接头含有肽。在一些方面，肽为接头的切割位点，从而在暴露于细胞内蛋白酶诸如溶酶体酶时促进药物的释放。肽可被设计和优化以通过特定酶进行酶促切割，该特定酶例如肿瘤相关的蛋白酶、组织蛋白酶B、C和D或纤溶酶蛋白酶。具有两个氨基酸的肽的实例包括但不限于丙氨酸-丙氨酸(ala-ala)、缬氨酸-丙氨酸(val-ala)、缬氨酸-瓜氨酸(vc或val-cit)、丙氨酸-苯丙氨酸(af或ala-phe)、苯丙氨酸-赖氨酸(fk或phe-lys)、苯丙氨酸-高赖氨酸(phe-homolys)和N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸(Me-val-cit)。具有三个氨基酸的肽的实例包括但不限于甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-val-cit)、天冬氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(asp-val-cit)、丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺(ala-ala-asn)、丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸(ala-phe-lys)、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸(gly-gly-phe)和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-gly)。具有四个氨基酸的肽的实例包括但不限于甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸(gly-gly-val-cit)和甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸(gly-gly-phe-gly)。具有五个氨基酸的肽的实例包括但不限于甘氨酸-甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸-甘氨酸(gly-gly-val-cit-gly)和甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸(gly-gly-phe-gly-gly)。上述氨基酸组合也可以相反顺序存在(即，cit-val)。
本公开的肽可包含氨基酸残基的L-或D-异构体。术语“天然存在的氨基酸”是指Ala、Asp、Asx、Cit、Cys、Glu、Phe、Glx、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr。“D-”表示具有“D”(右旋)构型的氨基酸，与天然存在的(“L-”)氨基酸的构型相反。本文所述的氨基酸可商购(Sigma Chemical Co.,Advanced Chemtech)或使用本领域已知的方法合成。
在某些方面，接头(“L”)为选自以下的蛋白酶可切割接头
其中：
q为2至10；
Z1、Z2、Z3、Z4和Z5各自独立地不存在或为L-或D-构型的天然存在的氨基酸残基，前提是Z1、Z2、Z3、Z4和Z5中的至少两者为氨基酸残基；
为与母体分子部分的连接点；并且
为与所述结合部分的连接点。
在某些方面，Z1、Z2、Z3、Z4和Z5独立地不存在或选自由以下组成的组：L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-瓜氨酸、D-瓜氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-谷氨酰胺、D-谷氨酰胺、L-谷氨酸、D-谷氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-天冬酰胺、D-天冬酰胺、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-赖氨酸、D-赖氨酸和甘氨酸；前提是Z1、Z2、Z3、Z4和Z5中的至少两者为氨基酸残基。
在一些方面，Z1不存在或为甘氨酸；Z2不存在或选自L-谷氨酰胺、D-谷氨酰胺、L-谷氨酸、D-谷氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸和甘氨酸；Z3选自L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸和甘氨酸；Z4选自L-瓜氨酸、D-瓜氨酸、L-天冬酰胺、D-天冬酰胺、L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸和甘氨酸；并且Z5不存在或为甘氨酸。
在一些方面，L为
在一些方面，q为4。
在某些方面，L为β-葡萄糖醛酸酶可切割接头。
在一些方面，L为β-葡萄糖醛酸酶可切割接头，其为：
其中：
q为2至10；
----不存在或为键；
为与母体分子部分的连接点；并且
为与所述结合部分的连接点。
在一些方面，接头为生物还原性的。生物还原性接头利用细胞内区室相对于血浆的还原电位的差异。肿瘤细胞的细胞质中存在的还原型谷胱甘肽比正常细胞的细胞质中存在的还原型谷胱甘肽高出1000倍，并且肿瘤细胞还含有可有助于细胞区室减少的酶。接头在体循环期间保持缀合物完整，并被细胞内高浓度的谷胱甘肽选择性切割，在肿瘤部位处由无毒前药释放活性药物。
在一些方面，L是选自以下的生物还原性接头：
其中：
q为2至10；
R、R'、R”和R”'各自独立地选自氢、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、(C1-C6)2NC1-C6烷基和C1-C6烷基，或者两个偕R基团与它们所连接的碳原子一起可形成环丁基或环丙基环；
为与母体分子部分的连接点；并且
为与所述结合部分的连接点。
在某些方面，L为生物还原性接头，其为
在某些方面，L是其中L为点击释放接头，其中诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物的释放由四嗪或相关化合物化学触发。
在一些方面，L为点击释放接头，其为
其中：
q为2至10；
为与母体分子部分的连接点；并且
为与所述结合部分的连接点。
在一些方面，与结合部分的连接点是结合部分中的半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸或谷氨酰胺。在一些方面，与结合部分的连接点是半胱氨酸。在一些方面，与结合部分的连接点是赖氨酸。在一些方面，与结合部分的连接点是酪氨酸。在一些方面，与结合部分的连接点是谷氨酰胺。
半胱氨酸或赖氨酸可以是工程化的(即，不是结合部分内源的)半胱氨酸或赖氨酸，例如，对于位点特异性缀合。位点特异性缀合是指通过结合部分(例如，抗体或其抗原结合部分)上的独特且限定的位点上的连接。位点特异性缀合例如在Zhou,Qun.“Site-Specific Antibody Conjugation for ADC and Beyond.”Biomedicines第5,4卷,第64期.2017年11月9日,doi:10.3390/biomedicines5040064中有讨论(其通过引用整体并入)。
作为连接点的半胱氨酸或赖氨酸可以是结合部分内源的半胱氨酸或赖氨酸。
III.B.结合部分
本公开提供了一种或多种缀合至结合部分的诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物。如本文所用，术语“结合部分”是指识别并结合细胞表面标志物或受体的任何分子。在某些方面，结合部分结合蛋白质，不限于多肽部分。结合部分除了将所述一种或多种化合物靶向特定的细胞、组织或位置外，还可具有某些治疗作用，诸如针对靶细胞或途径的抗增殖(细胞抑制和/或细胞毒性)活性。在某些方面，结合部分可包含或可被工程化以包含至少一个化学反应性基团诸如羧酸、胺、硫醇或化学反应性氨基酸部分或侧链。在一些方面，结合部分可包含对于给定靶细胞群体的靶向部分，其与细胞表面分子，诸如细胞表面受体或抗原结合或复合。在与受体特异性结合或复合后，细胞允许摄取靶向部分或缀合物，然后将其内化到细胞中。
在一些方面，基团“Bm”可为与细胞表面受体或抗原结合的肽或蛋白质。
在某些方面，基团“Bm”可为抗体、抗体片段或抗原结合片段。抗体为由能够识别和结合特异性抗原的免疫系统所生成的蛋白质。靶抗原通常具有由多种抗体上的CDR识别的许多结合位点，也称为表位。特异性结合不同表位的每种抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可具有多于一种对应抗体。本文的术语“抗体”以最广义使用，并且具体涵盖单克隆抗体、单结构域抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物学活性。抗体可为鼠抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或源自其他物种的抗体。
可与所述一种或多种化合物缀合的单克隆抗体是针对特定抗原决定簇(例如癌细胞抗原、病毒抗原、微生物抗原、蛋白质、肽、碳水化合物、化学物质、核酸或其片段)的抗体的同质群体。可通过使用本领域已知的任何技术来制备针对所关注抗原的单克隆抗体(mAb)，这些技术通过培养中的连续细胞系产生抗体分子。这些技术包括但不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和EBV-杂交瘤技术。此类抗体可以是任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA和IgD以及它们的任何亚类。产生在本公开中使用的mAb的杂交瘤可在体外或体内培养。
有用的单克隆抗体包括但不限于人单克隆抗体、人源化单克隆抗体、抗体片段或嵌合人-小鼠(或其他物种)单克隆抗体。人单克隆抗体可通过本领域已知的多种技术中的任一种来制备。
抗体也可以是双特异性抗体。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条链具有不同的特异性。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadromas))产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。通常使用亲和色谱法步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦，并且产物产率低。
根据不同的方法，将具有期望结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合可与免疫球蛋白重链恒定结构域(包括铰链、CH2和CH3区的至少一部分)进行。第一重链恒定区(CH1)可含有轻链结合所必需的位点，存在于至少一个融合体中。将具有编码免疫球蛋白重链融合体和(如果需要)免疫球蛋白轻链的序列的核酸插入单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。当用于构建的三条多肽链的不等比率提供最佳产率时，这在各方面提供了调整三条多肽片段的相互比例的极大灵活性。然而，当至少两条多肽链以相等比率表达导致高产率时或当比率没有特别意义时，可将两条或所有三条多肽链的编码序列插入一个表达载体中。
双特异性抗体可在一个臂中具有带有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，并且在另一臂中具有杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)。这种不对称结构有利于从不需要的免疫球蛋白链组合中分离出期望的双特异性化合物，因为仅一半双特异性分子中存在免疫球蛋白轻链提供了简便的分离方式。使用此类技术，可制备双特异性抗体，用于在如本文所定义的疾病的治疗或预防中与诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物缀合。
杂合或双功能抗体可以是生物学衍生的，即通过细胞融合技术，或化学衍生的，尤其是用交联剂或二硫桥形成剂，并且可包含完整抗体或其片段。
抗体可以是免疫特异性结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的抗体的功能活性片段、衍生物或类似物，或结合肿瘤细胞或基质的其他抗体。在这方面，“功能活性”是指片段、衍生物或类似物能够引发抗-抗独特型抗体，该抗-抗独特型抗体识别与片段、衍生物或类似物所源自的抗体所识别的抗原相同的抗原。具体地，在示例性方面，免疫球蛋白分子的独特型的抗原性可通过缺失特异性识别抗原的CDR序列的C-端的框架和CDR序列来增强。为了确定哪些CDR序列结合抗原，含有CDR序列的合成肽可通过本领域已知的任何结合测定方法用于与抗原的结合测定。
其他有用的抗体包括抗体片段，诸如但不限于：F(ab')2片段，其含有可变区、轻链恒定区和重链CH1结构域，其可通过胃蛋白酶消化抗体分子产生；和Fab片段，其可通过还原F(ab')2片段的二硫桥生成。其他有用的抗体为抗体的重链和轻链二聚体，或其任何最小片段，诸如Fvs或单链抗体(SCA)，或具有与抗体相同特异性的任何其他分子。
另外，可使用标准重组DNA技术制备的重组抗体，诸如包含人和非人部分的嵌合和人源化单克隆抗体，是有用的抗体。嵌合抗体是其中不同部分源自不同动物物种的分子，诸如具有源自鼠单克隆的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些。人源化抗体是来自非人物种的抗体分子，其具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的框架区。此类嵌合和人源化单克隆抗体可通过本领域已知的重组DNA技术产生。
可使用不能表达内源免疫球蛋白重链和轻链基因但可表达人重链和轻链基因的转基因小鼠来生产完全人抗体。用所选择的抗原例如本公开的多肽的全部或一部分以正常方式免疫转基因小鼠。可使用常规杂交瘤技术获得针对该抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重新排列，随后发生类别转换和体细胞突变。因此，使用此类技术，可能产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。关于用于生产人抗体的这种技术的概述，参见Lonberg和Huszar(1995,Int.Rev.Immunol.13:65-93)。其他人抗体可从例如Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)和Genpharm(San Jose,Calif.)商购获得。
可使用称为“引导选择”的技术来生成识别所选择的表位的完全人抗体。在该方法中，使用所选择的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，来指导选择识别相同表位的完全人抗体。人抗体也可使用本领域已知的各种技术产生，包括噬菌体展示文库。
抗体可以是抗体或其功能活性片段的融合蛋白，例如其中抗体通过共价键(例如肽键)在N-末端或C-末端与不是抗体的另一种蛋白质(或其部分，诸如蛋白质的至少10、20或50个氨基酸部分)的氨基酸序列融合。抗体或其片段可在恒定结构域的N-端处与其他蛋白质共价连接。
抗体包括经修饰的类似物和衍生物，即通过任何类型分子的共价连接，只要此类共价连接允许抗体保持其抗原结合免疫特异性。例如，但不作为限制，抗体的衍生物和类似物包括例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、连接到细胞抗体单元或其他蛋白质等已被进一步修饰的那些。许多化学修饰中的任一种都可通过已知技术进行，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、在衣霉素存在下的代谢合成等。另外，类似物或衍生物可含有一个或多个非天然氨基酸。
缀合物中的抗体可包括在与Fc受体相互作用的氨基酸残基中具有修饰(例如，取代、缺失或添加)的抗体。特别地，抗体包括在被鉴定为参与抗Fc结构域和FcRn受体之间相互作用的氨基酸残基中具有修饰的抗体。对癌细胞抗原免疫特异性的抗体可从例如Genentech(San Francisco,Calif.)商购获得或通过本领域技术人员已知的任何方法(诸如例如，化学合成或重组表达技术)产生。编码对癌细胞抗原免疫特异性的抗体的核苷酸序列可例如从GenBank数据库或类似的数据库、文献出版物或通过常规克隆和测序获得。
在某些方面，缀合物的抗体可以是单克隆抗体，例如鼠单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在一些方面，抗体可以是抗体片段，例如Fab片段。
用于治疗或预防癌症的已知抗体可与本文所述的化合物缀合。对癌细胞抗原免疫特异性的抗体可商购获得或通过本领域技术人员已知的任何方法(诸如例如，重组表达技术)产生。编码对癌细胞抗原免疫特异性的抗体的核苷酸序列可例如从GenBank数据库或类似的数据库、文献出版物或通过常规克隆和测序获得。可用于治疗癌症的抗体的实例包括但不限于用于治疗转移性乳腺癌患者的人源化抗HER2单克隆抗体；(利妥昔单抗；Genentech)，其为一种用于治疗非霍奇金淋巴瘤患者的嵌合抗CD20单克隆抗体；(奥戈伏单抗；AltaRex Corporation,MA)，其为一种用于治疗卵巢癌的鼠抗体；Panorex(依决洛单抗(edrecolomab)，Glaxo Wellcome,NC)，其为一种用于治疗结直肠癌的鼠IgG2a抗体；Cetuximab Erbitux(西妥昔单抗，Imclone Systems Inc.,NY)，其为一种用于治疗表皮生长因子阳性癌症诸如头颈癌的抗EGFR IgG嵌合抗体；Vitaxin(埃达珠单抗(etaracizumab)，MedImmune,Inc.,MD)，其为一种用于治疗肉瘤的人源化抗体；CampathI/H(阿仑单抗，Leukosite,MA)，其为一种用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)的人源化IgG1抗体；Smart MI95(Protein Design Labs,Inc.,CA)，其为一种用于治疗急性髓性白血病(AML)的人源化抗CD33 IgG抗体；LymphoCide(依帕珠单抗(epratuzumab)，Immunomedics,Inc.,NJ)，其为一种用于治疗非霍奇金淋巴瘤的人源化抗CD22 IgG抗体；Smart ID10(Protein Design Labs,Inc.,CA)，其为一种用于治疗非霍奇金淋巴瘤的人源化抗HLA-DR抗体；Oncolym(Techniclone,Inc.,CA)，其为一种用于治疗非霍奇金淋巴瘤的放射性标记的鼠抗HLA-Dr10抗体；Allomune(BioTransplant,CA)，其为一种用于治疗霍奇金病或非霍奇金淋巴瘤的人源化抗CD2mAb；Avastin(贝伐单抗，Genentech,Inc.,CA)，其为一种用于治疗肺癌和结直肠癌的抗VEGF人源化抗体；依帕珠单抗(Immunomedics,Inc.,NJ和Amgen,CA)，其为一种用于治疗非霍奇金淋巴瘤的抗CD22抗体；和CEAcide(Immunomedics,NJ)，其为一种用于治疗结直肠癌的人源化抗CEA抗体。
可用于缀合物中的其他抗体包括但不限于曲妥珠单抗、吉妥珠单抗、帕妥珠单抗、奥妥珠单抗、奥法木单抗、达雷木单抗、STI-6129、林妥珠单抗、huMy9-6、贝兰他单抗、英达妥昔单抗、地妥昔单抗、抗CD38 A2抗体、buAT15/3H3s抗体、替伊莫单抗、托西莫单抗、帕尼单抗、曲美木单抗、替昔木单抗、卡妥索单抗和维妥珠单抗。在某些方面，抗体选自利妥昔单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、huMy9-6、林妥珠单抗和吉妥珠单抗。可用于缀合物中的其他抗体包括但不限于泊洛妥珠单抗、J591、洛伏妥珠单抗和沙妥珠单抗。
可用于缀合物的其他抗体包括但不限于针对以下抗原的抗体：CA125(卵巢)、CA15-3(癌)、CA19-9(癌)、L6(癌)、Lewis Y(癌)、Lewis X(癌)、甲胎蛋白(癌)、CA 242(结直肠)、胎盘碱性磷酸酶(癌)、前列腺特异性抗原(前列腺)、前列腺酸性磷酸酶(前列腺)、表皮生长因子(癌)、MAGE-1(癌)、MAGE-2(癌)、MAGE-3(癌)、MAGE-4(癌)、抗转铁蛋白受体(癌)、p97(黑素瘤)、MUC1-KLH(乳腺癌)、CEA(结直肠)、gp100(黑素瘤)、MART1(黑素瘤)、PSA(前列腺)、IL-2受体(T细胞白血病和淋巴瘤)、CD20(非霍奇金淋巴瘤)、CD52(白血病)、CD33(白血病)、CD22(淋巴瘤)、人绒毛膜促性腺激素(癌)、CD38(多发性骨髓瘤)、CD40(淋巴瘤)、粘蛋白(癌)、P21(癌)、MPG(黑素瘤)和Neu致癌基因产物(癌)。一些特定的有用的抗体包括但不限于BR96mAb(Trail,P.A.等人Science(1993)261,212-215)、BR64(Trail,P A等人CancerResearch(1997)57,100-105)、针对CD40抗原的mAb诸如S2C6 mAb(Francisco,J.A.等人Cancer Res.(2000)60:3225-3231)、针对CD70抗原的mAb诸如1F6 mAb，以及针对CD30抗原的mAb诸如AC10。可使用许多其他与肿瘤相关抗原结合的内化抗体，并已对其进行了综述。
本发明缀合物可结合的其他抗原包括但不限于5T4、ACE、ADRB3、AKAP-4、ALK、AOC3、APP、Axin1、AXL、B7H3、B7-H4、BCL2、BCMA、bcr-abl、BORIS、BST2、C242、C4.4a、CA 125、CA6、CA9、CAIX、CCL11、CCR5、CD123、CD133、CD138、CD142、CD15、CD15-3、CD171、CD179a、CD18、CD19、CD19-9、CD2、CD20、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27L、CD28、CD3、CD30、CD31、CD300LF、CD33、CD352、CD37、CD38、CD4、CD40、CD41、CD44、CD44v6、CD5、CD51、CD52、CD54、CD56、CD62E、CD62P、CD62L、CD70、CD71、CD72、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD90、CD97、CD125、CD138、CD141、CD147、CD152、CD154、CD326、CEA、CEACAM5、CFTR、凝集因子、cKit、闭合蛋白3、闭合蛋白18.2、CLDN6、CLEC12A、CLL-1、cll3、c-MET、Cripto蛋白、CS1、CTLA-4、CXCR2、CXORF61、细胞周期蛋白Bl、CYP1B1、钙粘蛋白-3、钙粘蛋白-6、DLL3、E7、EDNRB、EFNA4、EGFR、EGFRvIII、ELF2M、EMR2、ENPP3、EPCAM、EphA2、肝配蛋白A4、肝配蛋白B2、EPHB4、ERBB2(Her2/neu)、ErbB3、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、ETBR、ETV6-AML、FAP、FCAR、FCRL5、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT3、叶酸受体α、叶酸受体β、FOLR1、Fos相关抗原1、岩藻糖基GM1、GCC、GD2、GD3、GloboH、GM3、GPC1、GPC2、GPC3、gplOO、GPNMB、GPR20、GPRC5D、GUCY2C、HAVCR1、HER2、HER3、HGF、HMI.24、HMWMAA、HPV E6、hTERT、人端粒酶逆转录酶、ICAM、ICOS-L、IFN-α、IFN-γ、IGF-I受体、IGLL1、IL-2受体、IL-4受体、IL-13Ra2、IL-l lRa、IL-1受体、IL-12受体、IL-23受体、IL-13受体、IL-22受体、IL-4受体、IL-5受体、IL-6、干扰素受体、整联蛋白(包括α4、αvβ3、αvβ5、αvβ6、α1β4、α4β1、α4β7、α5β1、α6β4、αIIbβ3整联蛋白)、整联蛋白αV、肠羧基酯酶、KIT、LAGE-1a、LAIR1、LAMP-1、LCK、豆荚蛋白、LewisY、LFA-1(CD11a)、L-选择素(CD62L)、LILRA2、LIV-1、LMP2、LRRC15、LY6E、LY6K、LY75、MAD-CT-1、MAD-CT-2、MAGE Al、MelanA/MARTl、间皮素、ML-IAP、MSLN、粘蛋白、MUC1、MUC16、mut hsp70-2、MYCN、肌肉生长抑制素、NA17、NaPi2b、NCA-90、NCAM、连接蛋白-4、NGF、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、NY-BR-1、NY-ESO-1、邻乙酰基-GD2、OR51E2、OY-TES1、p53、p53突变体、PANX3、PAP、PAX3、PAX5、p-CAD、PCTA-1/半乳凝素8、PD-L1、PD-L2、PDGFR、PDGFR-β、磷脂酰丝氨酸、PIK3CA、PLAC1、聚唾液酸、前列腺酶、前列腺癌细胞、前列腺癌相关蛋白、铜绿假单胞菌、狂犬病毒、生存素和端粒酶、PD-1、PRSS21、PSCA、PSMA、PTK7、RAGE-1、RANKL、Ras突变体、呼吸道合胞病毒、恒河猴因子、RhoC、RON、ROR1、ROR2、RU1、RU2、肉瘤易位断点、SART3、SLAMF7、SLC44A4、sLe、SLITRK6、精子蛋白17、1-磷酸鞘氨醇、SSEA-4、SSX2、STEAP1、TAG72、TARP、TCRβ、TEM1/CD248、TEM7R、腱生蛋白C、TF、TGF-1、TGF-β2、TNF-α、TGS5、Tie 2、TIM-1、Tn Ag、TRAC、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TROP-2、TRP-2、TRPV1、TSHR、肿瘤抗原CTAA16.88、酪氨酸酶、UPK2、VEGF、VEGFR1、VEGFR2、波形蛋白、WTl和/或XAGE1。
与抗原呈递细胞相关的抗原诸如CD40、OX40L、Endoglin、DEC-205、4-1BBL、CD36、CD36、CD204、MARCO、DC-SIGN、CLEC9A、CLEC5A、Dectin 2、CLEC10A、CD206、CD64、CD32A、CD1A、HVEM、CD32B、PD-L1、BDCA-2、XCR-1和CCR2结合的抗体也可与诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物缀合。
本文所述的缀合物的抗体可结合在激活淋巴细胞上表达的受体或受体复合物两者。受体或受体复合物可包含免疫球蛋白基因超家族成员、TNF受体超家族成员、整联蛋白、细胞因子受体、趋化因子受体、主要组织相容性蛋白、凝集素或补体控制蛋白。合适的免疫球蛋白超家族成员的非限制性实例是CD2、CD3、CD4、CD8、CD 19、CD22、CD28、CD79、CD90、CD152/CTLA-4、PD-1和ICOS。合适的TNF受体超家族成员的非限制性实例是CD27、CD40、CD95/Fas、CD134/OX40、CD137/4-1BB、TNF-R1、TNFR-2、RANK、TACI、BCMA、骨保护素、Apo2/TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4和APO-3。合适的整联蛋白的非限制性实例是CD11a、CD11b、CD11c、CD18、CD29、CD41、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD 103和CD104。合适的凝集素的非限制性实例是C型、S型和I型凝集素。
在一些方面，可用于本公开的抗体包括但不限于3F8、8H9、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔单抗(abciximab)阿比妥珠单抗(abituzumab)、阿泽奇单抗(abrezekimab)、阿利鲁单抗(abrilumab)、阿克托舒单抗(actoxumab)、阿达木单抗(adalimumab)/>阿德木单抗(adecatumumab)、阿杜卡努单抗(aducanumab)、阿法库单抗(afasevikumab)、阿非莫单抗(afelimomab)、阿托珠单抗(afutuzumab)、阿拉赛珠单抗(alacizumab)、ALD518、阿伦单抗(alemtuzumab)/>阿利西尤单抗(alirocumab)/>阿妥莫单抗(altumomab)、阿马妥昔单抗(amatuximab)、安那莫单抗(anatumomab)、安德利昔单抗(andecaliximab)、阿奈妥单抗(anetumab)、阿尼鲁单抗(anifrolumab)、安芦组单抗(anrukinzumab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿普卢妥单抗(aprutumab)、阿西莫单抗(arcitumomab)/>阿伐库单抗(ascrinvacumab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、阿度尤单抗(atidortoxumab)、阿利珠单抗(atlizumab)(托珠单抗(tocilizumab)、/> )、阿替利珠单抗(atezolizumab)/>阿替奴单抗(atinumab)、阿托木单抗(atorolimumab)、阿维鲁单抗(avelumab)(Bavencio)、阿妥昔珠单抗(azintuxizumab)、贝兰他单抗、巴皮尼珠单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)/>巴维昔单抗(bavituximab)、BCD-100、贝妥莫单抗(bectumomab)/>贝戈洛单抗(begelomab)、贝兰他单抗、贝利木单抗(belimumab)/>贝马妥珠单抗(bemarituzumab)、贝那利珠单抗(benralizumab)/>贝迈奇单抗(bermekimab)、伯萨利单抗(bersanlimab)、柏替木单抗(bertilimumab)、贝索单抗(besilesomab)/>贝伐单抗(bevacizumab)/>贝洛托舒单抗(bezlotoxumab)/>比西单抗(biciromab)/>比玛卢单抗(bimagrumab)、比吉利珠单抗(bimekizumab)、泊特埃单抗(birtamimab)、贝伐珠单抗(bivatuzumab)、布来鲁单抗(bleselumab)、贝林妥欧单抗(blinatumomab)、布隆妥维单抗(blontuvetmab)、布索珠单抗(blosozumab)、博库斯珠单抗(bococizumab)、布雷库单抗(brazikumab)、维布妥昔单抗(brentuximab)、布雷奴单抗(briakinumab)、布罗利尤单抗(brodalumab)(SILIQTM)、布西珠单抗(brolucizumab)/>布隆妥珠单抗(brontictuzumab)、布罗索尤单抗(burosumab)/>卡比瑞珠单抗(cabiralizumab)、卡普赛珠单抗(caplacizumab)/>卡米丹卢单抗(camidanlumab)、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)、卡那奴单抗(canakinumab)/>坎妥珠单抗(cantuzumab)、卡普罗单抗(capromab)、卡芦单抗(carlumab)、卡罗妥昔单抗(carotuximab)、卡妥索单抗(catumaxomab)/>cBR96、CC49、西利珠单抗(cedelizumab)、西米普利单抗(cemiplimab)/>瑟妥珠单抗(cergutuzumab)、西利单抗(certrelimab)、塞利珠单抗(certolizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)赛必妥单抗(cibisatamab)、西妥珠单抗(cirmtuzumab)、西他珠单抗(citatuzumab)、西妥木单抗(cixutumumab)、克拉扎珠单抗(clazakizumab)、克立昔单抗(clenoliximab)、克立瓦妥珠单抗(clivatuzumab)、考曲妥珠单抗(codrituzumab)、考非妥珠单抗(cofetuzumab)、考妥昔单抗(coltuximab)、可那木单抗(conatumumab)、康赛珠单抗(concizumab)、考韦昔单抗(cosfroviximab)、CR6261、克瑞组单抗(crenezumab)、克立利珠单抗(crizanlizumab)/>克罗特度单抗(crotedumab)、古妥珠单抗(cusatuzumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、达利珠单抗(daclizumab)/>达罗托组单抗(dalotuzumab)、达必洛珠单抗(dapirolizumab)、达雷妥尤单抗(daratumumab)/>德屈库单抗(dectrekumab)、登西珠单抗(demcizumab)、地宁妥珠单抗(denintuzumab)、地诺单抗(denosumab)/>德帕妥昔组单抗(depatuxizumab)、地洛昔单抗(derlotuximab)、地莫单抗(detumomab)、迪扎米珠单抗(dezamizumab)、地妥昔单抗(dinutuximab)/>地利伏单抗(diridavumab)、多玛洛珠单抗(domagrozumab)、多塔利单抗(dostarlimab)、托度单抗(dorlimomab)、多立珠单抗(dorlixizumab)、曲齐妥单抗(drozitumab)、DS-8201、度戈妥珠单抗(duligotuzumab)、杜匹鲁单抗(dupilumab)/>度伐利尤单抗(durvalumab)度司妥单抗(dusigitumab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依库丽单抗(eculizumab)/>埃巴单抗(edobacomab)、依决洛单抗(edrecolomab)依法利珠单抗(efalizumab)/>依芬古单抗(efungumab)埃迪鲁单抗(eldelumab)、依来努单抗(elezanumab)、依更妥单抗(elgemtumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)/>艾西莫单抗(elsilimomab)、依米妥珠单抗(emactuzumab)、艾马鲁单抗(emapalumab)/>依米妥珠单抗(emibetuzumab)、艾美赛珠单抗(emicizumab)/>依那妥单抗(enapotamab)、依那妥组单抗(enavatuzumab)、恩诺单抗(enfortumab)/>恩莫单抗(enlimomab)、依诺妥珠单抗(enoblituzumab)、依诺珠单抗(enokizumab)、依诺替库单抗(enoticumab)、恩斯土昔单抗(ensituximab)、依匹莫单抗(epitumomab)、艾普奈珠单抗(eptinezumab)/>依帕珠单抗(epratuzumab)、依瑞奈尤单抗(erenumab)厄利珠单抗(erlizumab)、厄妥索单抗(ertumaxomab)/>埃达珠单抗(etaracizumab)/>艾替利单抗(etigilimab)、依曲利组单抗(etrolizumab)、依维苏单抗(evinacumab)、依洛尤单抗(evolocumab)/>艾韦单抗(exbivirumab)、法索单抗(fanolesomab)/>法拉莫单抗(faralimomab)、法瑞西单抗(faricimab)、法妥珠单抗(farletuzumab)、法司努单抗(fasinumab)、FBTA05、泛维珠单抗(felvizumab)、非扎奴单抗(fezakinumab)、菲巴珠单抗(fibatuzumab)、非拉妥珠单抗(ficlatuzumab)、芬妥木单抗(figitumumab)、非利伏单抗(firivumab)、法兰妥单抗(flanvotumab)、夫来库单抗(fletikumab)、伏妥珠单抗(flotetuzumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)/>、福雷芦单抗(foralumab)、福拉韦单抗(foravirumab)、瑞玛奈珠单抗(fremanezumab)/>非苏木单抗(fresolimumab)、弗洛西单抗(frovocimab)、夫卢维单抗(frunevetmab)、福拉奴单抗(fulranumab)、伏妥昔单抗(futuximab)、加卡奈珠单抗(galcanezumab)/>加利昔单抗(galiximab)、甘妥单抗(gancotamab)、加尼妥单抗(ganitumab)、更汀芦单抗(gantenerumab)、加维莫单抗(gavilimomab)、格迪伏单抗(gedivumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、吉伏珠单抗(gevokizumab)、吉维单抗(gilvetmab)、瑾司鲁单抗(gimsilumab)、吉妥昔单抗(girentuximab)、格巴妥木单抗(glembatumumab)、戈利木单抗(golimumab)/>戈利昔单抗(gomiliximab)、古塞奇尤单抗(guselkumab)huMy9-6、艾那鲁单抗(ianalumab)、伊巴珠单抗(ibalizumab)IBI308、替伊莫单抗(ibritumomab)、艾芦库单抗(icrucumab)、依达赛珠单抗(idarucizumab)/>依法妥木单抗(ifabotuzumab)、伊戈伏单抗(igovomab)(INDIMACIS-125)、艾拉达妥珠单抗(iladatuzumab)、IMAB362、依马鲁单抗(imalumab)、伊普利单抗(imaprelimab)、英西单抗(imciromab)/>英加妥珠单抗(imgatuzumab)、英克勒库单抗(inclacumab)、英达妥昔单抗(indatuximab)、英杜斯妥单抗(indusatumab)、伊奈利珠单抗(inebilizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)英妥木单抗(intetumumab)、伊诺莫单抗(inolimomab)、伊珠单抗(inotuzumab)、iomab-B、伊匹单抗(ipilimumab)、伊妥木单抗(iratumumab)、伊莎妥昔单抗(isatuximab)/>伊斯卡利单抗(iscalimab)、艾司妥单抗(istiratumab)、伊托珠单抗(itolizumab)、伊西贝单抗(ixekizumab)/>凯利昔单抗(keliximab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)(CEA-CIDETM)、拉妥珠单抗(lacnotuzumab)、拉迪拉珠单抗(ladiratuzumab)、兰帕珠单抗(lampalizumab)、拉那利尤单抗(lanadelumab)兰洛珠单抗(landogrozumab)、拉普妥昔单抗(laprituximab)、拉韦昔单抗(larcaviximab)、来瑞组单抗(lebrikizumab)、来马索单抗(lemalesomab)、兰达丽珠单抗(lendalizumab)、伦韦单抗(lenvervimab)、伦齐鲁单抗(lenzilumab)、乐德木单抗(lerdelimumab)、乐利单抗(leronlimab)、来索伏单抗(lesofavumab)、来利珠单抗(letolizumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、利韦单抗(libivirumab)、利法妥珠单抗(lifastuzumab)、利格利珠单抗(ligelizumab)、利洛托单抗(lilotomab)、林妥珠单抗、利瑞鲁单抗(lirilumab)、洛迪赛珠单抗(lodelcizumab)、洛基维特单抗(lokivetmab)、泰朗妥昔单抗(loncastuximab)、洛沃妥珠单抗(lorvotuzumab)、罗妥昔珠单抗(losatuxizumab)、卢卡木单抗(lucatumumab)、鲁利珠单抗(lulizumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、鲁妥珠单抗(lumretuzumab)、卢帕妥单抗(lupartumab)、鲁吉珠单抗(lutikizumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马吉妥昔单抗(margetuximab)、马塔西单抗(marstacimab)、马司莫单抗(maslimomab)、马妥珠单抗(matuzumab)、马维里单抗(mavrilimumab)、美泊利单抗(mepolizumab)/>美替木单抗(metelimumab)、米拉组单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗(minretumomab)、米瑞克珠单抗(mirikizumab)、米妥昔单抗(mirvetuximab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫妥昔单抗(modotuximab)、莫拉珠单抗(molalizumab)、莫加莫利珠单抗(mogamulizumab)/>莫罗木单抗(morolimumab)、莫妥珠单抗(mosunetuzumab)、莫维珠单抗(motavizumab)/>莫西妥单抗(moxetumomab)/>莫罗单抗(muromonab)-CD3(ORTHOCLONE)、那可洛单抗(nacolomab)、奈米布单抗(namilumab)、那普妥莫单抗(naptumomab)、那妥昔单抗(naratuximab)、那呐妥单抗(narnatumab)、那他珠单抗(natalizumab)/>纳维西珠单抗(navicixizumab)、那韦伏单抗(navivumab)、那西妥单抗(naxitamab)、奈巴库单抗(nebacumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)奈莫利珠单抗(nemolizumab)、NEOD001、奈瑞莫单抗(nerelimomab)、奈伐库单抗(nesvacumab)、尼塔奇单抗(netakimab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)尼塞韦单抗(nirsevimab)、纳武单抗(nivolumab)、诺非图莫单抗(nofetumomab)、奥托萨昔单抗(obiltoxaximab)/>奥妥珠单抗、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、奥克莱珠单抗(ocrelizumab)/>奥度莫单抗(odulimomab)、奥法妥木单抗(ofatumumab)/>奥拉单抗(olaratumab)奥莱克单抗(oleclumab)、奥仑达利珠单抗(olendalizumab)、奥洛基珠单抗(olokizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)/>奥博妥单抗(omburtamab)、OMS721、奥那妥珠单抗(onartuzumab)、昂替珠单抗(ontecizumab)、昂妥昔珠单抗(ontuxizumab)、奥瓦利单抗(onvatilimab)、奥匹单抗(opicinumab)、奥普珠单抗(oportuzumab)、奥戈伏单抗(oregovomab)(OVAREX)、奥替库单抗(orticumab)、奥昔组单抗(otelixizumab)、奥替利单抗(otilimab)、奥乐妥珠单抗(otlertuzumab)、奥索单抗(oxelumab)、奥扎奈珠单抗(ozanezumab)、奥佐加霉素(ozogamicin)、奥佐拉珠单抗(ozoralizumab)、帕吉昔单抗(pagibaximab)、帕利珠单抗(palivizumab)/>潘瑞鲁单抗(pamrevlumab)、帕尼单抗(panitumumab)/>潘科单抗(pankomab)、帕巴库单抗(panobacumab)、帕萨妥珠单抗(parsatuzumab)、帕斯考利珠单抗(pascolizumab)、帕索妥昔单抗(pasotuxizumab)、帕特利珠单抗(pateclizumab)、帕特利单抗(patritumab)、PDR001、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、培妥莫单抗(pemtumomab)培拉凯珠单抗(perakizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)培克珠单抗(pexelizumab)、匹地利珠单抗(pidilizumab)、匹那妥珠单抗(pinatuzumab)、平妥莫单抗(pintumomab)、普拉鲁单抗(placulumab)、泊洛妥珠单抗(polatuzumab)(Polivy)、普瑞鲁单抗(prezalumab)、普扎利珠单抗(plozalizumab)、波加珠单抗(pogalizumab)、泊奈珠单抗(ponezumab)、珀韦昔单抗(porgaviximab)、普尼珠单抗(prasinezumab)、普瑞鲁单抗(prezalizumab)、普立昔单抗(priliximab)、普立托昔单抗(pritoxaximab)、普林木单抗(pritumumab)、PRO 140、奎利珠单抗(quilizumab)、雷妥莫单抗(racotumomab)、雷曲妥单抗(radretumab)、雷韦单抗(rafivirumab)、雷泮赛珠单抗(ralpancizumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、雷奈维单抗(ranevetmab)、兰尼单抗(ranibizumab)/>雷韦加利单抗(ravagalimab)、依库丽单抗(ravulizumab)雷昔库单抗(raxibacumab)、瑞法奈珠单抗(refanezumab)、瑞加韦单抗(regavirumab)、(REGN-EB3)、瑞拉利单抗(renatlimab)、壬托鲁单抗(remtolumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)/>利妥木单抗(rilotumumab)、利努库单抗(rinucumab)、利生奇珠单抗(risankizumab)/>利妥昔单抗(rituximab)/>利伐巴珠单抗(rivabazumab)、罗莫索单抗(rmab)、罗妥木单抗(robatumumab)、罗来度单抗(roledumab)、若奇单抗(romilkimab)、罗姆珠单抗(romosozumab)/>罗塔里珠单抗(rontalizumab)、罗曼妥珠单抗(rosmantuzumab)、罗伐匹珠单抗(rovalpituzumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)/>罗诺利昔珠单抗(rozanolixizumab)、卢利珠单抗(ruplizumab)(ANTOVA)、SA237、戈沙妥珠单抗(sacituzumab)、萨马利珠单抗(samalizumab)、沙马妥单抗(samrotamab)、沙利姆单抗(sarilumab)/>萨特利珠单抗(satralizumab)、沙妥莫单抗喷地肽(satumomab pendetide)、司库奇尤单抗(secukinumab)/>塞鲁单抗(selicrelumab)、司里班妥单抗(seribantumab)、司托昔抗(setoxaximab)、赛特鲁单抗(setrusumab)、司韦单抗(sevirumab)、SGN-CD19A、SHP647、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、西法木单抗(sifalimumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、辛妥珠单抗(simtuzumab)、西利珠单抗(siplizumab)、斯妥尤单抗(sirtratumab)、西鲁库单抗(sirukumab)、索菲妥单抗(sofituzumab)、索拉奈珠单抗(solanezumab)、索利托单抗(solitomab)、索普昔单抗(sonepcizumab)、索妥单抗(sontuzumab)、斯巴达珠单抗(spartalizumab)、司他芦单抗(stamulumab)、STI-6129、硫索单抗(sulesomab)/>舒他伏单抗(suptavumab)、舒替利单抗(sutimlimab)、舒维组单抗(suvizumab)、苏托舒单抗(suvratoxumab)、他贝芦单抗(tabalumab)、他卡妥珠单抗(tacatuzumab)/>托珠单抗(tadocizumab)、塔妥珠单抗(talacotuzumab)、他利珠单抗(talizumab)、坦妥维单抗(tamtuvetmab)、他尼珠单抗(tanezumab)、帕他普莫单抗(taplitumomab paptox)、他瑞妥单抗(tarextumab)、他利昔珠单抗(tavolimab)、替非珠单抗(tefibazumab)替莫单抗(telimomab)、特立妥珠单抗(telisotuzumab)、特斯多鲁单抗(tesidolumab)、泰坦(tetraxetan)、替妥洛单抗(tetulomab)、替妥莫单抗(tenatumomab)、替奈昔单抗(teneliximab)、替妥木单抗(teprotumumab)/>替普利珠单抗(teplizumab)、替泽培单抗(tezepelumab)、TGN1412、替布利珠单抗(tibulizumab)、替昔木单抗(ticilimumab)(曲美木单抗/>替加珠单抗(tigatuzumab)、替米古珠单抗(timigutuzumab)、替莫鲁单抗(timolumab)、替瑞利尤单抗(tiragolumab)、替古妥单抗(tiragotumab)、替雷利珠单抗(tislelizumab)、替索单抗(tisotumab)、泰泽坦(tiuxetan)、特立达卡单抗(tildrakizumab)/>TNX-650、托珠单抗(tocilizumab)(阿替利珠单抗(atlizumab)、/>)、托木妥昔单抗(tomuzotuximab)、托利珠单抗(toralizumab)、托萨托舒单抗(tosatoxumab)、托西莫单抗(tositumomab)/>托维妥单抗(tovetumab)、曲罗芦单抗(tralokinumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)/>TRBS07、曲利组单抗(tregalizumab)、曲美木单抗(tremelimumab)、曲戈卢单抗(trevogrumab)、图科图珠单抗(tucotuzumab)、妥韦单抗(tuvirumab)、乌珠单抗(urtoxazumab)、乌司奴单抗(ustekinumab)/>乌妥昔单抗(ublituximab)、乌洛鲁单抗(ulocuplumab)、乌瑞芦单抗(urelumab)、乌托米卢单抗(utomilumab)、伐达妥昔单抗(vadastuximab)、瓦纳利单抗(vanalimab)、万多妥珠单抗(vandortuzumab)、万替妥单抗(vantictumab)、伐努赛珠单抗(vanucizumab)、伐帕利昔单抗(vapaliximab)、伐利苏单抗(varisacumab)、伐立鲁单抗(varlilumab)、维他利珠单抗(vatelizumab)、维得利珠单抗(vedolizumab)、维妥组单抗(veltuzumab)、维帕莫单抗(vepalimomab)、维森库单抗(vesencumab)、维西珠单抗(visilizumab)/>沃巴利珠单抗(vobarilizumab)、伏洛昔单抗(volociximab)/>珀伽利珠单抗(vonlerolizumab)、沃普拉利单抗(vopratelimab)、沃瑟妥珠单抗(vorsetuzumab)、伏妥莫单抗(votumumab)、夫那奇珠单抗(vunakizumab)、珍妥珠单抗(xentuzumab)、XMAB-5574、扎鲁图单抗(zalutumumab)(HuMEX-EGFr)、扎木单抗(zanolimumab)(HuMAX-CD4)、扎妥昔单抗(zatuximab)、泽妥珠单抗(zenocutuzumab)、齐拉明单抗(ziralimumab)、佐妥昔单抗(zolbetuximab)或佐莫单抗(zolimomab)。在一些方面，可用于本公开的抗体包括但不限于J591和贝兰他单抗。/>
在一些方面，结合部分是包含表A中的抗体的6个CDR(即，可变重链或重链的3个CDR和相同抗体的可变轻链或轻链的3个CDR)的抗体或其抗原结合部分。
术语“Kabat编号”和类似术语在本领域中是公认的并且是指对抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区中的氨基酸残基进行编号的系统。在一些方面，可以根据Kabat编号系统确定CDR(参见，例如，Kabat EA和Wu TT(1971)Ann NY Acad Sci 190:382-391及Kabat EA等人,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,FifthEdition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)。使用Kabat编号系统，抗体重链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置31至35，其任选地可以包括一个或两个另外的氨基酸，在35(在Kabat编号方案中称为35A和35B)(CDR1)、氨基酸位置50至65(CDR2)和氨基酸位置95至102(CDR3)之后。使用Kabat编号系统，抗体轻链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置24至34(CDR1)、氨基酸位置50至56(CDR2)和氨基酸位置89至97(CDR3)。在一些方面，结合部分是包含表A中抗体的6个Kabat定义的CDR(即，可变重链或重链的3个Kabat定义的CDR和相同抗体的可变轻链或轻链的3个Kabat定义的CDR)的抗体或其抗原结合部分。
抗体或其抗原结合片段的CDR可根据Chothia编号方案确定，该方案涉及免疫球蛋白结构环的位置(参见，例如,Chothia C和Lesk AM,(1987),J Mol Biol 196:901-917；Al-Lazikani B等人,(1997)J Mol Biol 273:927-948；Chothia C等人,(1992)J Mol Biol227:799-817；Tramontano A等人,(1990)J Mol Biol 215(1):175-82；和美国专利7,709,226号)。通常，当使用Kabat编号惯例时，Chothia CDR-H1环存在于重链氨基酸26至32、33或34处，Chothia CDR-H2环存在于重链氨基酸52至56处，且Chothia CDR-H3环存在于重链氨基酸95至102处，而Chothia CDR-L1环存在于轻链氨基酸24至34处，Chothia CDR-L2环存在于轻链氨基酸50至56处，且Chothia CDR-L3环存在于轻链氨基酸89至97处。Chothia CDR-H1环的末端在使用Kabat编号规则规定编号时，根据环的长度在H32和H34之间变化(这是因为Kabat编号方案将插入置于H35A和H35B处；如果35A和35B都不存在，则环结束于32处；如果仅存在35A，则环结束于33处；如果35A和35B都存在，则环结束于34处)。
在一些方面，结合部分是包含表A中抗体的6个Chothia定义的CDR(即，可变重链或重链的3个Chothia定义的CDR和相同抗体的可变轻链或轻链的3个Chothia定义的CDR)的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，结合部分是包含一个或多个CDR的抗体或其抗原结合部分，其中Chothia和Kabat CDR具有相同的氨基酸序列。在一些方面，结合部分是抗体或其抗原结合部分，其包含表A中抗体的Kabat CDR和Chothia CDR的组合。
在一些方面，抗体或其抗原结合片段的CDR可根据Lefranc M-P,(1999)TheImmunologist 7:132-136和Lefranc M-P等人,(1999)Nucleic Acids Res 27:209-212中描述的IMGT编号系统确定。根据IMGT编号方案，VH-CDR1处于位置26至35，VH-CDR2处于位置51至57，VH-CDR3处于位置93至102，VL-CDR1处于位置27至32，VL-CDR2处于位置50至52，且VL-CDR3处于位置89至97。在一些方面，结合部分是包含表A中抗体的6个IMGT定义的CDR(即，可变重链或重链的3个IMGT定义的CDR和相同抗体的可变轻链或轻链的3个IMGT定义的CDR)的抗体或其抗原结合部分，例如，如Lefranc M-P(1999)同上和Lefranc M-P等人,(1999)同上)中所述。
在一些方面，抗体或其抗原结合片段的CDR可根据MacCallum RM等人,(1996)JMol Biol 262:732-745确定。还参见，例如，Martin A.“Protein Sequence and StructureAnalysis of Antibody Variable Domains”在Antibody Engineering中,Kontermann和Dübel编辑，第31章，第422-439页，Springer-Verlag,Berlin(2001).在一些方面，结合部分是包含表A中抗体的6个MacCallum定义的CDR(即，可变重链或重链的3个MacCallum定义的CDR和相同抗体的可变轻链或轻链的3个MacCallum定义的CDR)的抗体或其抗原结合部分，例如通过MacCallum RM等人中的方法所确定的。
在一些方面，抗体或其抗原结合片段的CDR可根据AbM编号方案确定，该方案涉及代表Kabat CDR和Chothia结构环之间折衷的AbM高变区，并由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件(Oxford Molecular Group,Inc.)使用。在一些方面，结合部分是包含表A中抗体的6个AbM定义的CDR(即，可变重链或重链的3个AbM定义的CDR和相同抗体的可变轻链或轻链的3个AbM定义的CDR)的抗体或其抗原结合部分，如通过AbM编号方案确定。
在一些方面，结合部分是结合CD33的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合CD33并且包含美国专利10,711,062号中公开的抗CD33抗体的6个CDR，所述专利通过引用整体并入本文。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合CD33并包含美国专利10,711,062号中公开的抗CD33抗体的VH和VL。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合CD33并且包含美国专利申请公开2021/0047404号中公开的抗CD33抗体的6个CDR，所述专利通过引用整体并入本文。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合CD33并包含美国专利申请公开2021/0047404号中公开的抗CD33抗体的VH和VL。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合CD33并且包含美国专利申请公开2020/0297764号中公开的抗CD33抗体的6个CDR，所述专利通过引用整体并入本文。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合CD33并包含美国专利申请公开2020/0297764号中公开的抗CD33抗体的VH和VL。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合CD33且包含表A中提供的抗CD33抗体(例如CD33-A、CD33-B或CD33-C)的6个CDR。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合CD33并包含表A中提供的抗CD33抗体CD33-D的6个CDR。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合CD33并包含表A中提供的抗CD33抗体CD33 huMy9-6的6个CDR。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合CD33，并且包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的VL。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合CD33，并且包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH和含有SEQ IDNO:4的氨基酸序列的VL。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合CD33，并且包含含有SEQID NO:5的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VL。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合CD33，并且包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的VL。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合CD33，并且包含含有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的VL。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合CD33，并且包含含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链。
在一些方面，结合部分是结合PSMA的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合PSMA并且包含美国专利申请公开2019/0022205号中公开的抗PSMA抗体的6个CDR，所述专利通过引用整体并入本文。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合PSMA并包含美国专利申请公开2019/0022205号中公开的抗PSMA抗体的VH和VL。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合PSMA并且包含美国专利10,100,126号中公开的抗PSMA抗体的6个CDR，所述专利通过引用整体并入本文。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合PSMA并包含美国专利10,100,126号中公开的抗PSMA抗体的VH和VL。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合PSMA并且包含美国专利8,470,330号中公开的抗PSMA抗体的6个CDR，所述专利通过引用整体并入本文。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合PSMA并包含美国专利8,470,330号中公开的抗PSMA抗体的VH和VL。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合PSMA且包含表A中提供的抗PSMA抗体(例如PSMA-A、PSMA-B或PSMA-C)的6个CDR。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合PSMA并且包含表A中提供的抗PSMA抗体PSMA-D的6个CDR。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合PSMA并且包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合PSMA并且包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合PSMA，并且包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合PSMA，并且包含含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的VL。
在一些方面，结合部分是结合HER2的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合HER2并且包含美国专利7,862,817号中公开的抗HER2抗体的6个CDR，所述专利通过引用整体并入本文。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合HER2并包含美国专利7,862,817号中公开的抗HER2抗体的VH和VL。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合HER2并且包含美国专利7,850,966号中公开的抗HER2抗体的6个CDR，所述专利通过引用整体并入本文。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合HER2并包含美国专利7,850,966号中公开的抗HER2抗体的VH和VL。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合HER2并且包含PCT国际公开WO2016/201051号中公开的抗HER2抗体的6个CDR，所述专利通过引用整体并入本文。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合HER2并且包含PCT国际公开WO2016/201051号中公开的抗HER2抗体的VH和VL。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合HER2且包含表A中提供的抗HER2抗体(即HER2-A、HER2-B或HER2-C)的6个CDR。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合HER2，并且包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的VL。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合HER2，并且包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VL。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合HER2，并且包含含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL。
在一些方面，结合部分是结合CD20的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合CD20并包含表A中提供的抗CD20抗体CD20-A的6个CDR。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合CD20，并且包含含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的VH和含有SEQID NO:32的氨基酸序列的VL。
在一些方面，结合部分是结合CD79b的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合CD79b并包含表A中提供的抗CD79b抗体CD79b-A的6个CDR。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合CD79b，并且包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL。
在一些方面，结合部分是结合BCMA的抗体或其抗原结合部分。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合BCMA并包含表A中提供的抗BCMA抗体BCMA-A的6个CDR。在一些方面，抗体或其抗原结合部分结合BCMA-A，并且包含SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
表A：示例性抗体或其抗原结合部分的序列(CDR序列以粗体和下划线示出)
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在一些方面，抗体或其抗原结合部分包含恒定区。接头可以与恒定区中的氨基酸连接。在一些方面，抗体或其抗原结合部分包含CH1结构域。接头可以与CH1结构域中的氨基酸连接。在一些方面，抗体或其抗原结合部分包含CH2结构域。接头可以与CH2结构域中的氨基酸连接。在一些方面，抗体或其抗原结合部分包含CH3结构域。接头可以与CH3结构域中的氨基酸连接。在一些方面，抗体或其抗原结合部分包含CL结构域。接头可以与CL结构域中的氨基酸连接。
在一些方面，恒定区、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域或CL结构域是工程化的恒定区、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域或CL结构域。
在一些方面，抗体或其抗原结合部分包含重链恒定区，例如人重链恒定区。接头可与重链恒定区(例如，人重链恒定区)中的氨基酸连接。在一些方面，抗体或其抗原结合部分包含IgG重链恒定区，例如人IgG重链恒定区。接头可与IgG重链恒定区(例如，人IgG重链恒定区)中的氨基酸连接。在一些方面，抗体或其抗原结合部分包含IgG1重链恒定区，例如人IgG1重链恒定区。接头可与IgG1重链恒定区(例如，人IgG1重链恒定区)中的氨基酸连接。在一些方面，抗体或其抗原结合部分包含IgG4重链恒定区。接头可与IgG4重链恒定区(例如，人IgG4重链恒定区)中的氨基酸连接。
在一些方面，抗体或其抗原结合部分包含轻链恒定区，例如人轻链恒定区。接头可与轻链恒定区(例如，人轻链恒定区)中的氨基酸连接。在一些方面，抗体或其抗原结合部分包含κ轻链恒定区，例如人κ轻链恒定区。接头可与κ轻链恒定区(例如，人κ轻链恒定区)中的氨基酸连接。在一些方面，抗体或其抗原结合部分包含γ轻链恒定区，例如人γ轻链恒定区。接头可与γ轻链恒定区(例如，人γ轻链恒定区)中的氨基酸连接。
在一些方面，抗体或其抗原结合部分在根据EU编号的重链位置S239处包含工程化半胱氨酸。接头可以连接至S239C。在一些方面，抗体或其抗原结合部分在根据EU编号的重链位置K334处包含工程化半胱氨酸。接头可以连接至K334C。
因此，抗体或其抗原结合部分可以包含SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20或SEQ IDNO:21的重链恒定区。
IgG1重链恒定区
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:19)
IgG1重链恒定区S239C
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPCVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:20)
IgG1重链恒定区K334C
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIECTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:21)
抗体或其抗原结合部分可以包含SEQ ID NO:26的重链恒定区。
IgG4重链恒定区S228P
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:26)
抗体或其抗原结合部分可以包含SEQ ID NO:37的重链恒定区。
IgG1 N297A恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:37)
在一些方面，根据EU编号，接头可连接至抗体或其抗原结合部分的重链Q295。
“结合”分子靶标或所关注的抗原的抗体是能够以足够的亲和力结合该抗原以使得该抗体可用于靶向表达该抗原的细胞的抗体。
在本公开中，基团“Bm”可与多于一个诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物缀合。在一些方面，“Bm”可与1至10个化合物缀合。在一些方面，“Bm”可与1至9个化合物缀合。在一些方面，“Bm”可与1至8个化合物缀合。在一些方面，“Bm”可与1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个化合物缀合。在一些方面，“Bm”可与7或8个化合物缀合。在一些方面，“Bm”可与5个化合物缀合。在一些方面，“Bm”可与6个化合物缀合。在一些方面，“Bm”可与7个化合物缀合。在一些方面，“Bm”可与8个化合物缀合。在一些方面，“Bm”可与9个化合物缀合。
V.组合物及使用方法
本文所述的缀合物和/或化合物可以是药学上或药学上可接受的盐的形式。在一些方面，此类盐衍生自无机或有机酸或碱。
合适的酸加成盐的实例包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡萄糖庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸酯、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基-丙酸酯、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。
合适的碱加成盐的实例包括铵盐、碱性金属盐(诸如钠盐和钾盐)、碱土金属盐(诸如钙盐和镁盐)、具有有机碱的盐(诸如二环己基胺盐、N-甲基-D-葡糖胺)和具有氨基酸(诸如精氨酸、赖氨酸等)的盐。
例如，Berge列出了以下FDA批准的市售的盐：阴离子乙酸根、苯磺酸根(besylate、benzenesulfonate)、苯甲酸根、碳酸氢根、酒石酸氢根、溴离子、依地酸钙(乙二胺四乙酸根)、樟脑磺酸根(camsylate、camphorsulfonate)、碳酸根、氯离子、柠檬酸根、二盐酸盐、依地酸根(乙二胺四乙酸根)、乙二磺酸根(1,2-乙二磺酸根)、依托酸根(月桂基硫酸根)、乙磺酸根(esylate、ethanesulfonate)、富马酸根、葡庚糖酸盐(gluceptate、glucoheptonate)、葡糖酸根、谷氨酸根、对羟乙酰氨基苯胂酸根(glycollylarsanilate)(对羟乙酰氨基苯胂酸根(glycollamidophenylarsonate))、己基间苯二酚酸酯、海巴明(N,N'-二(脱氢枞基)乙二胺)、氢溴酸根、盐酸根、羟基萘甲酸根、碘离子、羟乙基磺酸根(2-羟基乙磺酸根)、乳酸根、乳糖醛酸根、苹果酸根、马来酸根、扁桃酸根、甲磺酸根(mesylate、methanesulfonate)、甲基溴化物、甲基硝酸根、甲基硫酸根、粘酸根、萘磺酸根(2-萘磺酸根)、硝酸根、双羟萘酸根(pamoate、embonate)、泛酸根、磷酸根/二磷酸根、聚半乳糖醛酸根、水杨酸根、硬脂酸根、次乙酸根、琥珀酸根、硫酸根、鞣酸根、酒石酸根、氯茶碱根(8-氯茶碱)和三乙基碘根(triethiodide)；有机阳离子苄星(N,N'-二苄基乙二胺)、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)和普鲁卡因；以及金属阳离子铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌。
Berge另外列出了以下非FDA批准的市售(美国以外)的盐：阴离子己二酸根、藻酸根、氨基水杨酸根、脱水亚甲基柠檬酸根、槟榔碱、天冬氨酸根、硫酸氢根、丁基溴、樟脑酸根、二葡糖酸根、二氢溴酸根、二琥珀酸根、甘油磷酸根、半硫酸根、氢氟酸根、氢碘酸根、亚甲基双(水杨酸根)、萘二磺酸根(1,5-萘二磺酸根)、草酸根、果胶酸根、过硫酸根、苯乙基巴比妥酸根、苦味酸根、丙酸根、硫氰酸根、甲苯磺酸根和十一烷酸根；有机阳离子苯乙胺(N-苄基苯乙胺)、克立咪唑(1-对氯苄基-2-吡咯啉-1'-基甲基苯并咪唑)、二乙胺、哌嗪和氨丁三醇(三(羟甲基)氨基甲烷)；以及金属阳离子钡和铋。
包含本文所述的缀合物的药物组合物还可包含合适的载剂、赋形剂和助剂，它们可根据施用模式而不同。
在一些方面，药物组合物可被配制成合适的肠胃外剂型。所述配制物可通过本领域已知的各种方法制备。药物组合物可直接施用到血流中、肌肉中或直接施用到器官中。适合的肠胃外施用的方式包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内和皮下。用于肠胃外施用的合适装置包括针式注射器、无针注射器和输注技术。
肠胃外组合物通常为水溶液，其可含有赋形剂诸如盐、碳水化合物和缓冲剂。然而，该组合物也可被配制成无菌的非水溶液或干燥形式，以与合适的媒介物诸如无菌无热原水联合使用。
在无菌条件下，例如通过冻干制备肠胃外组合物，可使用本领域技术人员熟知的标准技术容易地完成。
用于肠胃外施用的组合物可被配制成立即释放和/或改进释放。改进释放配制物包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放和程序化释放。因此，组合物可被配制成固体、半固体或触变液体，用于作为提供活性剂的改进释放的植入储库施用。
肠胃外配制物可与肠胃外剂型中使用的其他合适的药学上可接受的赋形剂诸如但不限于防腐剂混合。
在另一方面，药物组合物可被配制成合适的口服剂型，诸如片剂、胶囊、散剂、丸剂、混悬剂、溶液剂、乳剂等。可存在其他合适的载剂，诸如崩解剂、稀释剂、螯合剂、粘结剂、助流剂、润滑剂、填充剂、膨胀剂、抗粘附剂等。
口服剂型配制物也可含有其他合适的药物赋形剂，诸如甜味剂、媒介物/润湿剂、着色剂、调味剂、防腐剂、增粘/增稠剂等。
本文所述的缀合物可用于治疗各种癌症。本公开的某些缀合物在功效表达、药代动力学(例如，吸收、分布、代谢、排泄)、溶解度(例如，水溶性)、与其他药物的相互作用(例如，药物代谢酶抑制作用)、安全性(例如，急性毒性、慢性毒性、遗传毒性、生殖毒性、心脏毒性、致癌性、中枢毒性)和/或稳定性(例如，化学稳定性、对酶的稳定性)方面可为优越的，并且可用作药物。
本公开的缀合物可用作：药物，诸如用于预防或治疗疾病的剂，例如癌症-例如结直肠癌(例如，结直肠癌、直肠癌、肛门癌、家族性结直肠癌、遗传性非息肉性结直肠癌、胃肠间质瘤)、肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性间皮瘤)、间皮瘤、胰腺癌(例如，胰腺导管癌、胰腺内分泌肿瘤)、咽癌、喉癌、食道癌、胃部/胃癌症(例如，乳头状腺癌、粘液性腺癌、腺鳞癌)、十二指肠癌、小肠癌、乳腺癌(例如，浸润性导管癌、非浸润性导管癌、炎性乳腺癌)、卵巢癌(例如，卵巢上皮癌、性腺外生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤)、睾丸肿瘤、前列腺癌(例如，激素依赖性前列腺癌、非激素依赖性前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌)、肝癌(例如，肝细胞癌、原发性肝癌、肝外胆管癌)、甲状腺癌(例如，甲状腺髓样癌)、肾癌(例如，肾细胞癌(例如，透明细胞肾细胞癌)、肾盂和输尿管移行细胞癌)、子宫癌(例如，宫颈癌、子宫体癌、子宫肉瘤)、妊娠绒癌、脑肿瘤(例如，髓母细胞瘤、神经胶质瘤、松果体星形细胞瘤、毛细胞星形细胞瘤、弥漫性星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、垂体腺瘤)、视网膜母细胞瘤、皮肤癌(例如，基底细胞瘤、恶性黑素瘤)、肉瘤(例如，横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、软组织肉瘤、梭形细胞肉瘤)、恶性骨肿瘤、膀胱癌、血液/血癌(例如，多发性骨髓瘤、白血病(例如，急性骨髓性白血病)、恶性淋巴瘤、霍奇金病、慢性骨髓增生性疾病)、不明原发癌；癌症生长抑制剂；癌症转移抑制剂；凋亡促进剂；用于治疗癌前病变(例如，骨髓增生异常综合征)的药剂；等等。
在某些方面，本公开的缀合物可用作用于乳腺癌、胃癌、卵巢癌、子宫癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、淋巴瘤或血液癌症的药物。在某些方面，本公开的缀合物可用作前列腺癌、乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、胆管癌、结肠癌、卵巢癌或神经调节蛋白-1(NRG1)阳性癌症的药物。在某些方面，本公开的缀合物可用作非霍奇金淋巴瘤(NHL)，例如B细胞非霍奇金淋巴瘤或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的药物。
此外，本公开的缀合物或可与非药物疗法同时使用。确切地说，缀合物可与非药物疗法诸如(1)手术，(2)使用血管紧张素II等的高血压化疗，(3)基因疗法，(4)热疗，(5)冷冻疗法，(6)激光烧灼和(7)放射疗法组合。
例如，通过在上述手术等之前或之后使用本公开的缀合物，可提供诸如预防抗性出现、延长无病生存期、抑制癌症转移或复发、延长寿命等效果。
此外，可能将用本公开的缀合物的治疗与支持性疗法组合，所述支持性疗法为：(i)对于各种感染性疾病的并发症，施用抗生素(例如，β-内酰胺类诸如凡司颇灵等，大环内酯类诸如克拉霉素等)，(ii)施用高热量输血、氨基酸制剂或一般维生素制剂以改善营养不良，(iii)施用吗啡以缓解疼痛，(iv)施用制药剂以改善副作用诸如恶心、呕吐、厌食、腹泻、白细胞减少、血小板减少、血红蛋白浓度降低、脱发、肝病、肾病、DIC、发热等和(v)施用用于抑制癌症的多重耐药性的制药剂等。
在一些方面，本公开的缀合物可与标准护理疗法例如一种或多种治疗剂(例如，抗癌剂和/或免疫调节剂)组合使用。因此，在某些方面，本文公开的治疗肿瘤的方法包括将本公开的缀合物与一种或多种附加治疗剂组合施用。在一些方面，本公开的缀合物可与一种或多种抗癌剂组合使用，使得可靶向免疫途径的多个元件。在一些方面，抗癌剂包括免疫检查点抑制剂(即，阻断通过特定免疫检查点途径的信号传导)。可用于本发明方法的免疫检查点抑制剂的非限制性实例包括CTLA-4拮抗剂(例如，抗CTLA-4抗体)、PD-1拮抗剂(例如，抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体)、TIM-3拮抗剂(例如，抗TIM-3抗体)或它们的组合。免疫检查点抑制剂的其他实例包括T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域(TIGIT)拮抗剂、T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA)拮抗剂、B和T细胞淋巴细胞衰减剂(BTLA)拮抗剂和淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)拮抗剂。在本申请的组合治疗部分中详细公开了综合且非限制性的组合治疗列表。
在一些方面，本公开的缀合物在施用附加治疗剂之前或之后施用于受试者。在其他方面，本公开的缀合物与附加治疗剂同时施用于受试者。在某些方面，本公开的缀合物和附加治疗剂可作为在药学上可接受的载剂中的单一组合物同时施用。在其他方面，本公开的缀合物和附加治疗剂作为单独的组合物同时施用。
在一些方面，可用本公开的缀合物治疗的受试者为非人动物，诸如大鼠或小鼠。在一些方面，可治疗的受试者为人。
VI.制备化合物和缀合物的方法
本公开提供了制备所述缀合物的方法，所述方法包括使结合部分与式(XXII)的化合物：
或其药学上可接受的盐反应，其中：
n为0或1；
R1是诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物；
R2选自氢、-(CH2CH2O)v-CH3、C2-C6烯基、C1-C6烷基、C2-C6炔基、苄基、C3-C6环烷基和C3-C6环烷基(C1-C3烷基)，其中v为1至24；
每个Y独立地为S或O；并且
L*为与所述结合部分缀合的可切割接头前体。
本公开还提供了制备式(XXXII)的化合物：
或其药学上可接受的盐的方法，其中：
a为1至10；
A'为其中
n为0或1；
每个Y独立地为S或O；
指示与R1的连接点；并且
指示与亚甲基基团的连接点；
R1与A'一起是诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物；
R2选自氢、为R1-A'提供稳定性的基团、为R1-A提供溶解性的基团和为R1-A'提供稳定性和溶解性的基团；
L为可切割接头；并且
Bm为能够特异性结合蛋白质的结合部分；
所述方法包括：
使(XXXI)的化合物
或其药学上可接受的盐与结合部分反应，其中：
A'、R1和R2如以上所定义并且
L*为可切割接头前体；
所述结合部分能够特异性结合蛋白质。
如本文所述，接头前体含有连接到结合部分的异双官能团。
在一些方面，接头前体可被蛋白酶切割。在一些方面，接头前体选自由以下组成的组
其中：
q为2至10；
Z1、Z2、Z3、Z4和Z5各自独立地不存在或为L-或D-构型的天然存在的氨基酸残基，前提是Z1、Z2、Z3和Z4中的至少两者为氨基酸残基；并且
为与母体分子部分的连接点。
Z1、Z2、Z3、Z4和Z5独立地不存在或选自由以下组成的组：L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-瓜氨酸、D-瓜氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-谷氨酰胺、D-谷氨酰胺、L-谷氨酸、D-谷氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-天冬酰胺、D-天冬酰胺、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-赖氨酸、D-赖氨酸和甘氨酸；前提是Z1、Z2、Z3及Z4和Z5中的至少两者为氨基酸残基。
在一些方面，Z1不存在或为甘氨酸；Z2不存在或选自由以下组成的组：L-谷氨酰胺、D-谷氨酰胺、L-谷氨酸、D-谷氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸和甘氨酸；Z3选自由以下组成的组：L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸和甘氨酸；Z4选自由以下组成的组：L-瓜氨酸、D-瓜氨酸、L-天冬酰胺、D-天冬酰胺、L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸和甘氨酸；并且Z5不存在或为甘氨酸。
在一些方面，L*为
其中为与母体分子部分的连接点。
在一些方面，q为4。
在一些方面，L*为生物还原性接头前体。在一些方面，生物还原性接头前体选自由以下组成的组
其中：
q为2至10；
R、R'、R”和R”'各自独立地选自氢、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、(C1-C6)2NC1-C6烷基和C1-C6烷基，或者两个偕R基团与它们所连接的碳原子一起可形成环丁基或环丙基环；并且
为与母体分子部分的连接点。
在一些方面，L*为生物还原性接头，其为
在某些方面，L*为点击释放接头前体。在一些方面，L*为
其中：
q为2至10；并且
为与母体分子部分的连接点。
在某些方面，L*为β-葡萄糖醛酸酶可切割接头前体。在一些方面，L*为
其中：
q为2至10；
----不存在或为键；并且
为与母体分子部分的连接点。
在某些方面，R2可以是为缀合物提供稳定性的基团。在一些方面，R2选自C2-C6烯基、C1-C6烷基、C2-C6炔基、苄基、C3-C6环烷基和C3-C6环烷基(C1-C3烷基)。在一些方面，R2为C1-C6烷基。在一些方面，R2为甲基。
在某些方面，R2可以是为缀合物提供溶解性的基团。在一些方面，R2选自：
/>
其中：
每个n独立地为1、2、3、4或5；
每个y独立地为1或2；并且
每个R独立地为氢、C6H11O5、C12H21O10、C18H31O15或C24H41O20。在一些方面，R1为式(XXX)的化合物：
其中：
表示与母体分子部分的连接点；
A为苯基或C4-C10环烷基环；
R10独立地选自氢和卤代基；
U选自NH和CF2；并且
R20选自-C(O)R3、-N(R4)2、-(CH2)nOH、-(CH2)nN(R4)2、-(CH2)nQ'(CH2)mOH、-(CH2)nQ'(CH2)mSH和-(CH2)nQ'(CH2)mN(R4)2；其中
R3为氢或C1-C6烷基；
每个R4独立地为氢或C1-C6烷基；
Q'为O、S或NR4；
n为1-6；并且
m为2-5。
在一些方面，
A为苯基；
U为NH；
R10为卤代基；并且
R20为甲基。
在一些方面，A为苯基；
U为NH；
R10为卤代基；并且
R20为-(CH2)2O(CH2)2NHCH3。
在一些方面，式(XXX)的化合物是选自由以下组成的组的化合物：
在一些方面，R1-A'为蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)。在某些方面，R1具有下式：
POI-L100-CBN；
其中：
POI是与所关注的蛋白质结合的化合物；
L100为PROTAC接头；并且
CBN为小脑蛋白结合部分。
在一些方面，所述所关注的蛋白质是核激素受体、翻译终止因子、转录因子、细胞周期蛋白依赖性激酶、酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶或E3连接酶。在一些方面，所述所关注的蛋白质选自CD33、GSPT1、BRD4、AR、ER、IKZF1/3、CK1a、BCL-XL、IKZF2、IRAK4、BTK、STAT3、BTK和iMiD、BRD9、TRK、MDM2、CDK2/CDK9、CD97b和EGFR。
在某些方面，L100包含一个或多个选自二醇、烷基、炔基、三唑基、哌嗪基、哌啶基及它们的组合的官能团。
在一些方面，CBN选自
其中
指示与A'的连接点；并且/>指示与L100的连接点。
在某些实施方案中，R1选自：
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/>
/>
其中表示与A'的连接点。
在一些方面，结合部分在其与式(XXII)或(XXXI)的化合物反应之前被预处理。在某些方面，使式(XXII)或(XXXI)的化合物与结合部分反应，该结合部分包括抗体或其抗原结合部分。在结合部分为抗体的方面，抗体可在与式(XXII)或(XXXI)的化合物反应之前被预处理以还原链间二硫键。
通过接头的马来酰亚胺组分将式(XXII)或式(XXXI)的化合物缀合至Bm中的半胱氨酸的一般方法示于方案I-I中。R1、R2和Y如本文所定义且L**为如本文所定义的接头的一部分。
方案I-1
通过接头的N-羟基马来酰亚胺组分将式(XXII)或式(XXXI)的化合物缀合至Bm中的赖氨酸的一般方法示于方案I-2中。R1、R2和Y如本文所定义且L**为如本文所定义的接头的一部分。
方案I-2
制备式(XX)和式(XXX)的化合物和在细胞内活化以释放诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物的一般方法示于方案I-3中。R1、R2和Y如本文所定义且L**为如本文所定义的接头的一部分。
在步骤1中，接头内的异双官能团被活化。在步骤2中，将受保护的接头连接至环A的氮。步骤3示出胺的脱保护，步骤4示出Bm基团的连接，步骤5示出Bm与PPI-接头部分的缀合(其在方案I-1和I-2中示出)。步骤6描绘通过逆曼尼希反应激活癌细胞中的缀合物，从而释放诱导蛋白质-蛋白质相互作用的活性化合物。
方案I-3
实施例
一般合成方法和中间体
本公开的化合物可由本领域普通技术人员根据本公开和本领域的知识和/或通过参考下文所示的方案和合成实施例来制备。一些试剂和中间体是本领域已知的。其他试剂和中间体可以通过本领域已知的方法使用容易获得的材料制备。示例性合成路线在以下方案和实施例中阐述。应当理解，在以下方案和实施例中出现的变量(例如“R”基团)应独立于在本申请其他地方出现的那些来阅读。本领域普通技术人员将容易理解下文所示的方案和实施例如何说明本文所述化合物的制备。
方案中使用的缩写通常遵循本领域中使用的惯例。说明书和实施例中使用的化学缩写定义如下：
“Et3N”和“TEA”表示三甲胺；“DMF”表示N,N-二甲基甲酰胺；“r.t.”或“rt”或“RT”表示室温或保留时间(上下文将规定)；“h”表示小时；“min”表示分钟；“CDI”表示1,1'-羰二咪唑；“DMAP”表示N,N-二甲基氨基吡啶；“TBAI”表示四丁基溴化铵；“HATU”表示1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐或N-[(二甲基氨基)-1H-1,2,3-三唑并-[4,5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸盐N-氧化物；“DIEA”和“iPrNEt2”表示二异丙基乙胺；“ACN”表示乙腈；“DCM”表示二氯甲烷；“MeOH”表示甲醇；“Me”表示甲基；“PE”表示石油醚；“TFA”表示三氟乙酸；“BOC”或“Boc”“DMSO”表示二甲亚砜；“Cbz”表示苄氧羰基；“EtOH”表示乙醇；“HOBt”或“HOBT”表示1-羟基苯并三唑水合物；“NBS”表示N-溴代琥珀酰亚胺；“TMS”表示三甲基甲硅烷基；且“THF”表示四氢呋喃；
实施例1：化合物的制备
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方案1：化合物(I)的制备
步骤1.化合物1-3的合成
在0℃下向Gly-Gly-Gly(化合物1-1，5.00g，25.1mmol，1.00当量)在H2O(25mL)中的搅拌混合物中滴加TEA(7.6g，75.1mmol，2.99当量)。在0℃下向上述混合物中滴加在DMF(25mL)中的6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(化合物1-2，9.29g，30.1mmol，1.20当量)。将所得混合物在室温下再搅拌3h。LCMS指示反应完成。将混合物用HCl(2N，水溶液)酸化至pH 4。通过反相快速色谱法用以下条件纯化残余物：柱，C18硅胶(330g，20-40um)；流动相，水(含有0.05％TFA)、ACN(30min内0％至20％梯度)；检测器，UV220nm。这样提供呈白色固体的(2-[2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基]-乙酰胺基)乙酸(化合物1-3，1g，8％)。LCMS(ES,m/s):383[M+H]+
步骤1A：化合物1-4的合成
步骤a：1:3-(5-溴-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮
在25℃下在氮气气氛下向4-溴-2-(溴甲基)苯甲酸甲酯(60.0g，194.8mmol，1.00当量)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(38.48g，233.8mmol，1.20当量)于DMF(120ml)中的搅拌混合物中滴加TEA(67.70mL，669.0mmol，2.50当量)。将混合物在25℃下搅拌16h。随后在25℃下依次添加H2O(120mL)、AcOH(46mL)和Et2O(120mL)。将混合物在25℃下搅拌2h。LCMS指示反应完成。将沉淀的固体通过过滤收集并用Et2O(60mL)洗涤。这样产生呈白色固体的3-(5-溴-1-氧代-3H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮(40.0g，63％)。LCMS(ESI,ms):323,325(M+H)+.1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.00(s,1H),7.90(d,J＝1.5Hz,1H),7.74-7.66(m,2H),5.15-5.10(m,1H),4.51-4.32(m,2H),2.93-2.85(m,1H),2.74-2.56(m,1H),2.43-2.32(m,1H),2.06-1.99(m,1H)。
步骤b：2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-甲腈
在室温下在氮气气氛下，向3-(5-溴-1-氧代-3H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮(2.00g，6.19mmol，1.00当量)在DMF(40.00mL)中的搅拌溶液中分批添加Zn(CN)2(872mg，7.42mmol，1.20当量)和Pd(PPh3)4(715mg，0.62mmol，0.10当量)。将所得混合物在80℃下在氮气气氛下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。使混合物冷却至室温。将混合物添加到水(120.00mL)中并搅拌30min。通过过滤收集沉淀的固体，并用水(3x20 mL)和EtOAc(3x20mL)洗涤。将所得固体在日光灯下干燥。这样产生呈白色固体的2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-甲腈(1.2g，72％)。LCMS(ESI,ms):270(M+H)+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.03(s,1H),8.17(d,J＝1.6Hz,1H),8.00-7.91(m,2H),5.18-5.13(m,1H),4.57-4.40(m,2H),2.92-2.88(m,1H),2.74-2.56(m,1H),2.48-2.37(m,1H),2.07-1.99(m,1H)。
步骤c：3-(5-(氨基甲基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮盐酸盐
在25℃下向2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)1-氧代-3H-异吲哚-5-甲腈(8.00g，29.7mmol，1.00当量)在MeOH(67.00mL)中的浆液中添加HCl(12M，9.60mL)和PtO2(3.30g，14.5mmol，0.49当量)。使用氢气球在氢气气氛下将混合物在室温下搅拌16h。LCMS指示反应完成。将反应物过滤并用MeOH(2x30 mL)洗涤。将滤液减压蒸发至干。将所得固体用DCM:MeOH(3:1)(3x30 mL)洗涤。这样产生呈白色固体的3[5-(氨基甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮盐酸盐(5.08g，57％)。LCMS(ESI,ms):274(M+H-HCl)+；1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.88(d,J＝8.0Hz,1H),7.68(s,1H),7.62(d,J＝8.0Hz,1H),5.19-5.15(m,1H),4.55-4.53(m,2H),4.26(s,2H),2.95-2.88(m,1H),2.81-2.80(m,1H),2.55-2.45(m,1H),2.22-2.16(m,1H)。
步骤2.化合物1-5的合成
在0℃下在氮气气氛下，向3-[5-(氨基甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮(化合物1-4，1.00g，3.66mmol，1.00当量)在DMF(10.00mL)中的搅拌溶液中分批添加CDI(0.59g，3.66mmol，1.00当量)和TEA(0.37g，3.66mmol，1.00当量)。将所得混合物在0℃下在氮气气氛下搅拌2h。在室温下向上述混合物中分批添加DMAP(1.34g，10.98mmol，3.00当量)和3-氯-对甲苯胺(0.52g，3.66mmol，1.00当量)。将所得混合物在60℃下在氮气气氛下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将反应在室温下用水/冰淬灭。将沉淀的固体通过过滤收集并用DCM和水洗涤。这样提供了呈浅棕色固体的1-(3-氯-4-甲基苯基)-3-[[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基]脲(化合物1-5，1.0g，51％)。LCMS(ES,m/s):441,443[M+1]+。
步骤3.化合物1-6的合成
在0℃下在氮气气氛下，向1-(3-氯-4-甲基苯基)-3-[[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基]脲(化合物I-5，500.00mg，1.13mmol，1.00当量)在DMF(5.00mL)中的搅拌混合物中分批添加K2CO3(500.0mg，3.62mmol，3.19当量)。将所得混合物在0℃下在氮气气氛下搅拌30min。在0℃下向上述混合物中分批添加TBAI(100.0mg，0.27mmol，0.24当量)、NaI(200.0mg，1.34mmol，1.18当量)和4-硝基苯基碳酸氯甲酯(801.0mg，3.46mmol，3.05当量)。将所得混合物在0℃下于黑暗中再搅拌1h。LCMS指示反应完成。反应混合物不经任何处理即用于下一步。LCMS(ES,m/s):636,638[M+H]+
步骤4.化合物1-7的合成
在0℃下在氮气气氛下，向4-硝基苯基碳酸[3-[5-([[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基]甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(化合物1-6，500mg，0.78mmol，1.00当量)和K2CO3(500mg，3.62mmol，4.60当量)在DMF(5.00mL)中的搅拌混合物中分批添加N-(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(400mg，2.50mmol，3.18当量)。将所得混合物在室温下搅拌1h。LCMS指示反应完成。将反应用水淬灭。将所得混合物用乙醚(3x20mL)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。将残余物通过制备型TLC(EA)纯化得到呈白色固体的N-[2-[(叔丁氧羰基)氨基]乙基]-氨基甲酸[3-[5-([[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基]甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(化合物1-7，270mg，44％)。LCMS(ES,m/s):657,659[M+H]+。
步骤5.化合物1-8的合成
将在HCl(气体)中的N-[2-[(叔丁氧羰基)氨基]乙基]-氨基甲酸[3-[5-([[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基]甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(化合物1-7，100mg，0.13mmol，1.00当量)在1,4-二噁烷(4M)(1.5mL)中的混合物在0℃下搅拌30min。LCMS指示反应完成。将所得混合物减压浓缩。这样产生呈白色固体的N-(2-氨基乙基)氨基甲酸[3-[5-([[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基]甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯盐酸盐(化合物1-8，100mg，61％)。LCMS(ES,m/s):557,559[M+H]+。
步骤6.化合物(I)的合成
在0℃下向(2-[2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基]-乙酰胺基)乙酸(化合物1-3，64mg，0.17mmol，1.10当量)在DMF(3.5mL)中的搅拌混合物中分批添加HATU(69mg，0.18mmol，1.20当量)。将所得混合物在25℃下搅拌20min。在0℃下向上述混合物中添加N-(2-氨基乙基)氨基甲酸[3-[5-([[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基]甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯盐酸盐(化合物1-8，100mg，0.15mmol，1.00当量)和DIEA(49mg，0.37mmol，2.50当量)。将所得混合物在25℃下再搅拌16h。LCMS指示反应完成。用以下条件下通过制备型HPLC纯化粗产物：柱，XSelect CSH Prep C18 OBD柱，19x 250mm，5um；流动相，水(含有0.05％TFA)和ACN(在7min内24％至43％)；检测器，UV254nm。将收集的级分冻干，得到N-[2-[2-(2-[2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]-乙酰胺基]乙酰胺基)乙酰胺基]乙基]氨基甲酸[3-[5-([[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基]甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(化合物(I)，18.2mg，12％)。LCMS(ES,m/z):921,923[M+H]+.1H-NMR(CD3OD,400MHz)δ(ppm):7.76(d,J＝7.6Hz,1H),7.56-7.48(m,3H),7.13-7.12(m,2H),6.76(s,2H),5.75-5.71(m,2H),5.25-5.20(m,1H),4.51-4.46(m,4H),3.85-3.80(m,6H),3.46-3.42(m,2H),3.28-3.26(m,2H),3.23-3.21(m,2H),3.08-2.86(m,2H),2.66-2.39(m,1H),2.27-2.21(m,6H),1.61-1.51(m,4H),1.28-1.24(m,2H)。
方案2：化合物(II)的制备
步骤1.化合物2-2的合成
在室温下向2-甲基-2-硫烷基丙-1-醇(化合物2-1，1.00g，9.41mmol，1.00当量)于DCM(3.00mL)和MeOH(3.00mL)中的搅拌混合物中添加5-硝基-2-[(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基]吡啶(1.46g，4.70mmol，0.50当量)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。在室温下向上述混合物中分批添加MnO2(1.50g，17.25mmol，1.83当量)。将所得混合物在室温下再搅拌2h。LCMS指示反应完成。将所得混合物过滤，将滤饼用DCM(20mL)洗涤。将滤液减压浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物，用PE/EtOAc(8:1)洗脱，得到呈橙色固体的2-甲基-2-[(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基]丙-1-醇(化合物2-2，1.4g，57％)。LCMS(ESI,ms):261[M+H]+
步骤2.化合物2-3的合成
在0℃下向2-甲基-2-[(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基]丙-1-醇(化合物2-2，1.20g，4.61mmol，1.00当量)和吡啶(0.90g，11.38mmol，2.47当量)在DCM(20.00mL)中的搅拌混合物中滴加在DCM(2.00mL)中的氯甲酸氯甲酯(0.60g，4.65mmol，1.01当量)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。通过LCMS检测到30％的期望产物。将反应用水/冰淬灭。将所得混合物用DCM(3x 20mL)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物，用PE/EtOAc(10:1)洗脱，得到呈浅黄色油状物的2-甲基-2-[(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基]丙基碳酸氯甲酯(化合物2-3，330mg，20％)。LCMS(ESI,ms):353,355[M+H]+
步骤3.化合物2-4的合成
在0℃下在氮气气氛下向3-氯-对甲苯胺(102mg，0.72mmol，0.99当量)于THF(10.00mL)中的搅拌混合物中滴加双光气(145.00mg，0.73mmol，1.00当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌1h。将所得混合物减压浓缩。在0℃下在氮气气氛下，向3-[5-(氨基甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮(INT，根据针对化合物1-4描述的程序制备，200mg，0.73mmol，1.00当量)和TEA(61.00mg，0.60mmol，0.82当量)于DMF(10.00mL)中的搅拌混合物中滴加在DMF(15.00mL)中的上述混合物。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌3h。LCMS指示反应完成。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.1％FA)，40min内0％至80％梯度；检测器，UV 254nm。这样产生呈白色固体的1-(3-氯-4-甲基苯基)-3-[[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基]脲(8化合物2-45mg，26.34％)。将产物通过制备型HPLC用以下条件纯化：柱：XBridge Shield RP18 OBD柱，19x 250mm,10um；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：25mL/min；梯度：18min内25B至38B；220nm；RT 1：14.25；将收集的级分冻干，得到呈白色固体的1-(3-氯-4-甲基苯基)-3-[[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基]脲(化合物2-4，21.4mg，7％)。LCMS(ESI,ms):441,443[M+H]+
步骤4.化合物2-5的合成
在室温下在氮气气氛下向1-(3-氯-4-甲基苯基)-3-[[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基]脲(化合物2-5，300.00mg，0.68mmol，1.00当量)和K2CO3(180mg，1.30mmol，1.91当量)在DMF(0.50mL)中的搅拌混合物中添加2-甲基-2-[(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基]丙基碳酸氯甲酯(600mg，1.70mmol，2.50当量)、TBAI(119.00mg，0.46mmol，0.67当量)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.1％FA)，40min内00％至85％梯度；检测器，UV 254nm。这样产生呈棕色固体的2-甲基-2-[(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基]丙基碳酸[3-[5-([[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基]甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(85mg，14.85％)。通过以下条件进一步纯化粗产物：柱：XBridge Prep OBD C18柱，19x250mm，5um；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：25mL/min；梯度：10min内53B至68B；220nm；RT1：9.80；将收集的级分冻干得到呈白色固体的2-甲基-2-[(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基]丙基碳酸[3-[5-([[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基]甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(化合物2-5，8.5mg)。LCMS(ESI):757,757[M+H]+；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)9.23(d,J＝2.4Hz,1H),8.75(s,1H),8.58(d,J＝2.7Hz,1H),8.05(d,J＝8.7Hz,1H),7.72-7.6(m,2H),7.53(s,1H),7.46(d,J＝6.3Hz,1H),7.25-7.11(m,2H),6.82-6.78(m,1H),5.68-5.63(m,2H),5.35-5.28(m,1H),4.52-4.30(m,4H),4.08(s,2H),3.12-3.06(m,1H),2.87-2.73(m,1H),2.49-2.44(m,1H),2.28(s,3H),2.10-2.00(m,1H),1.33(s,6H)。
步骤5.化合物(II)的合成
在0℃下向2-甲基-2-[(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基]丙基碳酸[3-[5-([[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基]甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(化合物2-5，70.00mg，0.092mmol，1.00当量)和甲基亚磺酸钠(28.00mg，0.27mmol，2.97当量)在DCM(14.00mL)中的搅拌混合物中滴加Br2(14mg，0.087mmol，0.95当量)。将所得混合物在室温下搅拌3h。在室温下向上述搅拌的混合物中添加甲基亚磺酸钠(28.00mg，0.27mmol，2.97当量)和Br2(14mg，0.087mmol，0.95当量)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将所得混合物过滤，将滤饼用DCM(20mL)洗涤。将滤液减压浓缩。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(40min内5％至85％梯度)；检测器，UV 254nm。将粗产物通过以下条件纯化：柱：YMC-Actus TriartC18，30x250，5um；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：25mL/min；梯度：在7min内55B至75B；220nm；RT1：6.35。将收集的级分冻干，得到呈白色固体的1-(3-氯-4-甲基苯基)-3-[(2-[1-[([[2-(甲磺酰基硫烷基)-2-甲基丙氧基]羰基]氧基)-甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基]-1-氧代-3H-异吲哚-5-基)甲基]脲(化合物(II)，3.3mg，5.05％)。LCMS(ESI):681,683[M+H]+1H NMR(300MHz,DMSO-d6)8.75(s,1H),7.73-7.66(m,2H),7.53(s,1H),7.47(d,J＝7.8Hz,1H),7.20-7.12(m,2H),6.82-6.79(m,1H),5.75-5.66(m,2H),5.33-5.27(m,1H),4.51-4.29(m,6H),3.35(s,3H),3.11-3.06(m,1H),2.87-2.73(m,1H),2.49-2.44(m,1H),2.28(s,3H),2.10-2.00(m,1H),1.48(s,6H)
方案3：化合物(III)的制备
步骤1.化合物3-2的合成
在室温下向2-甲基-2-硫烷基丙-1-醇(1.00g，9.41mmol，1.00当量)于DCM(3.00mL)和MeOH(3.00mL)中的搅拌混合物中添加5-硝基-2-[(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基]吡啶(1.46g，4.70mmol，0.50当量)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。在室温下向上述混合物中分批添加MnO2(1.50g，17.25mmol，1.83当量)。将所得混合物在室温下再搅拌2h。LCMS指示反应完成。将所得混合物过滤，将滤饼用DCM(20mL)洗涤。将滤液减压浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物，用PE/EtOAc(8:1)洗脱，得到呈橙色固体的2-甲基-2-[(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基]丙-1-醇(化合物3-2，1.4g，57％)。LCMS(ESI,ms):261[M+H]。
步骤2.化合物3-3的合成
在0℃下向2-甲基-2-[(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基]丙-1-醇(化合物3-2，1.20g，4.61mmol，1.00当量)和吡啶(0.90g，11.38mmol，2.47当量)在DCM(20.00mL)中的搅拌混合物中滴加在DCM(2.00mL)中的氯甲酸氯甲酯(0.60g，4.65mmol，1.01当量)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。LCMS检测到30％的期望产物。将反应用水/冰淬灭。将所得混合物用DCM(3x20 mL)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物，用PE/EtOAc(10:1)洗脱，得到呈浅黄色油状物的2-甲基-2-[(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基]丙基碳酸氯甲酯(化合物3-3，330mg，20％)。LCMS(ESI,ms):353,355[M+H]+。
步骤3.化合物3-4的合成
在0℃下在氮气气氛下向3-氯-对甲苯胺(102mg，0.72mmol，0.99当量)于THF(10.00mL)中的搅拌混合物中滴加双光气(145.00mg，0.73mmol，1.00当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌1h。将所得混合物减压浓缩。在0℃下在氮气气氛下，向3-[5-(氨基甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮(INT，根据针对化合物1-4描述的程序制备，200mg，0.73mmol，1.00当量)和TEA(61.00mg，0.60mmol，0.82当量)于DMF(10.00mL)中的搅拌混合物中滴加在DMF(15.00mL)中的上述混合物。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌3h。LCMS指示反应完成。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.1％FA)，40min内0％至80％梯度；检测器，UV 254nm。这样产生呈白色固体的1-(3-氯-4-甲基苯基)-3-[[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基]脲(化合物3-4，85mg，26.34％)。将产物通过制备型HPLC用以下条件纯化：柱：XBridge Shield RP18 OBD柱，19x250 mm,10um；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：25mL/min；梯度：18min内25B至38B；220nm；RT 1：14.25；将收集的级分冻干，得到呈白色固体的1-(3-氯-4-甲基苯基)-3-[[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基]脲(化合物3-4，21.4mg，7％)。LCMS(ESI,ms):441,443[M+H]+
步骤4.化合物(III)的合成
在室温下在氮气气氛下向1-(3-氯-4-甲基苯基)-3-[[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基]脲(化合物3-4，300.00mg，0.68mmol，1.00当量)和K2CO3(180mg，1.30mmol，1.91当量)在DMF(0.50mL)中的搅拌混合物中添加2-甲基-2-[(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基]丙基碳酸氯甲酯(化合物3-3，600mg，1.70mmol，2.50当量)、TBAI(119.00mg，0.46mmol，0.67当量)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.1％FA)，40min内0％至85％梯度；检测器，UV 254nm。这样产生呈棕色固体的2-甲基-2-[(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基]丙基碳酸[3-[5-([[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基]甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(化合物(III)，85mg，14.85％)。将粗产物通过以下条件进一步纯化：柱：XBridge Prep OBD C18柱，19x250mm，5um；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：25mL/min；梯度：10min内53B至68B；220nm；RT1：9.80；将收集的级分冻干得到呈白色固体的2-甲基-2-[(5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基]丙基碳酸[3-[5-([[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基]甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(8.5mg)。LCMS(ESI):757,757[M+H]+；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)9.23(d,J＝2.4Hz,1H),8.75(s,1H),8.58(d,J＝2.7Hz,1H),8.05(d,J＝8.7Hz,1H),7.72-7.6(m,2H),7.53(s,1H),7.46(d,J＝6.3Hz,1H),7.25-7.11(m,2H),6.82-6.78(m,1H),5.68-5.63(m,2H),5.35-5.28(m,1H),4.52-4.30(m,4H),4.08(s,2H),3.12-3.06(m,1H),2.87-2.73(m,1H),2.49-2.44(m,1H),2.28(s,3H),2.10-2.00(m,1H),1.33(s,6H)。
方案4：化合物(IV)的制备
步骤1.化合物(IV)的合成
在0℃下在黑暗中，向1-(3-氯-4-甲基苯基)-3-[[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基]脲(化合物4-1，根据针对化合物1-5描述的程序制备，200.00mg，0.45mmol，1.00当量)在DMF(2.00mL)中的搅拌混合物中分批添加K2CO3(200.00mg，1.44mmol，3.19当量)。将所得混合物在0℃下搅拌1h。在0℃下在黑暗中向上述混合物中添加NaI(80mg，0.53mmol，1.18当量)、TBAI(40mg，0.10mmol，0.24当量)和4-硝基苯基碳酸氯甲酯(化合物4-2，320mg，1.38mmol，3.05当量)。将所得混合物在0℃下再搅拌1h。在0℃下在黑暗中向上述混合物中滴加在DMF(0.10mL)中的N-甲基-N-[2-(甲基氨基)乙基]氨基甲酸叔丁酯(化合物4-3，180mg，0.95mmol，2.11当量)。将所得混合物在0℃下在黑暗中再搅拌3h。通过LCMS可以检测到24％的期望产物。将反应混合物通过以下条件纯化：柱：Kinetex EVO C18柱，30x150，5um；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：25mL/min；梯度：14min内20B至45B，210nm；RT1：12.93min。将收集的级分冻干得到呈白色固体的N-[2-[(叔丁氧羰基)(甲基)氨基]乙基]-N-甲基氨基甲酸[3-[5-([[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]-氨基]甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(化合物(IV)，23.9mg，7％)。LCMS:(ms,ESI):707,709[M+Na]+,585,587[M+H-100]+1HNMR:(400MHz,DMSO-d6):8.81(s,1H),7.71-7.66(m,2H),7.51(s,1H),7.45(d,J＝8.0Hz,1H),7.18-7.11(m,2H),6.86(t,J＝6.0Hz,1H),5.61-5.56(m,2H),5.27-5.24(m,1H),4.49-4.26(m,4H),3.29(s,3H),3.21(s,1H),3.08-3.03(m,1H),2.83-2.66(m,7H),2.42-2.38(m,1H),2.22(s,3H),2.07-2.05(m,1H),1.35(s,9H)。
方案5：化合物(V)的制备
步骤1.化合物5-2的合成
在0℃下向2-羧基苯甲醛(化合物5-1，2.00g，12.65mmol，1.00当量)在MeOH(27.00mL)中的搅拌混合物中添加在H2O(4.00mL)中的CH3NH2.HCl(0.79g，25.30mmol，2.00当量)。将所得混合物在25℃下搅拌1h。在25℃下向上述混合物中添加NaBH4(0.24g，6.33mmol，0.50当量)。将所得混合物在25℃下再搅拌0.5h。LCMS指示反应完成。在室温下通过添加丙酮(20mL)淬灭反应。将所得混合物减压浓缩。通过用丙酮(30mL)研磨来纯化残余物。这样产生呈白色固体的2-[(甲基氨基)甲基]苯甲酸(化合物5-2，2g，86％)。LCMS(ES,m/z)：166[M+H]+
步骤2.化合物5-3的合成
在0℃下向2-[(甲基氨基)甲基]苯甲酸(化合物5-2，1.00g，5.44mmol，1.00当量)、在H2O中的NaOH(1M)(20.00mL)在二噁烷(27.00mL)中的搅拌混合物中添加(Boc)2O(2.38g，10.88mmol，2.00当量)。将所得混合物在25℃下搅拌2h。LCMS指示反应完成。将所得混合物减压浓缩。将残余物用HCl(1N，水溶液)酸化至pH 3。将所得混合物用EtOAc(3x 30mL)萃取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。粗产物不经进一步纯化即用于下一步。LCMS(ES,m/z)：266[M+H]+
步骤3.化合物5-4的合成
在0℃下向2-([[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]甲基)苯甲酸(化合物5-3，500mg，1.70mol，1当量)在DCM(6mL)和H2O(7.5mL)中的搅拌混合物中添加NaHCO3(570mg，6.78mmol，4当量)和四丁基硫酸氢铵(57mg，0.17mmol，0.10当量)。将所得混合物在0℃下搅拌10min。在0℃下向上述混合物中添加氯甲烷磺酰氯(303mg，2.04mol，1.20当量)。将所得混合物在25℃下再搅拌3h。LCMS指示反应完成。在室温下通过添加水(20mL)淬灭反应。将所得混合物用CH2Cl2(3x 30mL)萃取。将合并的有机层用盐水(21mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。这样产生呈黄色油状物的2-([[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]甲基)苯甲酸氯甲酯(化合物5-4，250mg，42％)。LCMS(ES,m/z):314,316[M+H]+,214,216[M+H-100]+
步骤4.化合物(V)的合成
在0℃下向1-(3-氯-4-甲基苯基)-3-[[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-5-基]甲基]脲(化合物5，根据针对化合物1-5描述的程序制备，100mg，0.20mmol，1.00当量)和K2CO3(84mg，0.61mmol，3.00当量)在DMF(2.00mL)中的搅拌混合物中添加2-([[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]甲基)苯甲酸氯甲酯(化合物5-4，128mg，0.40mmol，2当量)。将所得混合物在25℃下搅拌16h。LCMS指示反应完成。在室温下通过添加水(10mL)淬灭反应。将所得混合物用EtOAc(3x 20mL)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EtOAc(1:1)洗脱。用以下条件下通过制备型HPLC纯化粗产物：柱，XSelect CSH FluoroPhenyl，30mm x 150mm，5um；流动相，水(0.1％FA)和ACN(在10min内45％至58％)；检测器，UV 254nm。将收集的级分冻干得到呈白色固体的2-([[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]甲基)苯甲酸[3-[5-([[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基]甲基)-1-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(化合物(V)，9.4mg，6％)。LCMS(ES,m/z):716,718[M-H]-1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.83(br s,1H),7.83-7.80(m,1H),7.71-7.61(m,3H),7.51-7.38(m,3H),7.19-7.11(m,3H),6.90(br s,1H),5.93-5.82(m,2H),5.35-5.30(m,1H),4.67(d,J＝6.8Hz,2H),4.46-4.29(m,4H),3.20-3.05(m,1H),2.96-2.86(m,4H),2.44-2.43(m,1H),2.22(s,3H),2.08-2.06(m,1H),1.43-1.26(m,9H)。
方案6：化合物(VI)的制备
步骤1.化合物6-2的合成
在0℃下向N-[2-(甲基氨基)乙基]氨基甲酸叔丁酯(化合物6-1，2.00g，11.48mmol，1.00当量)和TEA(1.40g，13.83mmol，1.21当量)在DCM(20.00mL)中的搅拌混合物中滴加在DCM(5mL)中的CbzCl(2.05g，12.01mmol，1.05当量)。将所得混合物在室温下搅拌1h。LCMS显示反应完成。通过添加水淬灭反应。将所得混合物用CH2Cl2(3x 20mL)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。这样产生呈浅黄色油状物的N-(2-[[(苄氧基)羰基](甲基)氨基]乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物6-2，3.5g，98％)。LCMS(ms,ESI):309[M+H]+,331[M+Na]+
步骤2.化合物6-3的合成
在0℃下在氮气气氛下向N-(2-[[(苄氧基)羰基]-(甲基)氨基]乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物6-2，1.50g)在DCM(20.00mL)中的搅拌溶液中滴加在1,4-二噁烷(20.00mL)中的HCl(4N)。将所得混合物在室温下搅拌1h。LCMS显示反应完成。将所得混合物减压浓缩，得到呈白色固体的N-(2-氨基乙基)-N-甲基氨基甲酸苄酯盐酸盐(化合物6-3，1.4g，粗品)。LCMS(ESI,ms):209[M+H]+
步骤3.化合物6-5的合成
在室温下在氮气气氛下，向N-(2-氨基乙基)-N-甲基氨基甲酸苄酯盐酸盐(化合物6-3，1.20g，4.90mmol，1.00当量)和K2CO3(2.03g，14.71mmol，3.00当量)在ACN(150mL)中的搅拌溶液中添加KI(0.41g，2.45mmol，0.50当量)和2-(2-氯乙氧基)-乙醇(0.73g，5.88mmol，1.20当量)。将所得混合物在60摄氏度下在氮气气氛下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。过滤所得混合物，用MeCN(3x100 mL)洗涤滤饼。将滤液减压浓缩。所得混合物不经进一步纯化直接用于下一步。LCMS(ESI,ms):297[M+H]+
步骤4.化合物6-6的合成
在0℃下在氮气气氛下向N-(2-[[2-(2-羟基乙氧基)乙基]氨基]乙基)-N-甲基氨基甲酸苄酯(化合物6-5，1.40g，4.72mmol，1.00当量)和NaHCO3(396mg，4.72mmol，1.00当量)在THF(14.00mL)和H2O(14.00mL)中的搅拌溶液中添加Boc2O(1.03g，4.72mmol，1.00当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌过夜。LCMS指示完全反应。将所得混合物用EtOAc(3x 20mL)萃取。将合并的有机层用盐水(3x20 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液减压浓缩，得到呈白色固体的N-[2-[(叔丁氧羰基)[2-(2-羟基乙氧基)乙基]氨基]乙基]-N-甲基氨基甲酸苄酯(化合物6-6，1.4g，74％)。LCMS(ESI,ms):397[M+H]+1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ7.42-7.29(m,5H),5.13(s,2H),3.81-3.31(m,12H),2.97(t,J＝2.7Hz,3H),1.46(s,9H)。
步骤5.化合物6-7的合成
在室温下向N-[2-[(叔丁氧羰基)[2-(2-羟基乙氧基)乙基]氨基]乙基]-N-甲基氨基甲酸苄酯(化合物6-6，1.30g，3.28mmol，1.00当量)在EtOH(65.00mL)中的搅拌溶液中添加Pd/C(26mg，10％)。将所得混合物在室温下在H2气氛下搅拌过夜。LCMS指示完全反应。过滤所得混合物，用EtOH(3x10 mL)洗涤滤饼。减压浓缩滤液，得到呈灰白色固体的N-[2-(2-羟基乙氧基)乙基]-N-[2-(甲基氨基)乙基]氨基甲酸叔丁酯(800mg，93％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ3.70-3.64(m,2H),3.59(d,J＝5.7Hz,2H),3.55-3.50(m,2H),3.39(s,4H),3.11(s,1H),2.77(t,J＝6.3Hz,2H),2.41(s,3H),1.44(s,9H)。
步骤6.化合物(VI)的合成
在室温下在氮气气氛下，向1-(3-氯-4-甲基苯基)-3-[[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基]脲(化合物6-7，200mg，0.45mmol，1.00当量)在DMF(2.00mL)中的搅拌溶液中添加K2CO3(188mg，1.36mmol，3.00当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌30min。在室温下向上述混合物中添加4-硝基苯基碳酸氯甲酯(105mg，0.45mmol，1.00当量)、NaI(34mg，0.22mmol，0.50当量)和TBAI(167mg，0.45mmol，1.00当量)。将所得混合物在室温下再搅拌1h。然后添加N-[2-(2-羟基乙氧基)乙基]-N-[2-(甲基氨基)乙基]氨基甲酸叔丁酯(238mg，0.90mmol，2.00当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将反应混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.1％FA)，40min内10％至80％梯度；检测器，UV 254nm。将收集的级分冻干。这样产生呈白色固体的N-[2-[(叔丁氧羰基)[2-(2-羟基乙氧基)乙基]氨基]乙基]-N-甲基氨基甲酸[3-[5-([[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基]甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(化合物(VI)，50mg，14.52％)。用以下条件下通过制备型HPLC纯化粗产物(50mg)：柱，XSelect CSH Fluoro Phenyl，30mm X150mm，5um；流动相，水(0.05％FA)和ACN(在7min内43％相B达到63％)；检测器，UV 254nm。将收集的级分冻干得到呈白色固体的N-[2-[(叔丁氧羰基)[2-(2-羟基乙氧基)-乙基]氨基]乙基]-N-甲基氨基甲酸[3-[5-([[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基]甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(13.3mg，3.86％)。LCMS(ESI,ms):759,761[M+H]+,559,561[M+H-100]+1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.75(s,1H),7.75-7.60(m,2H),7.54-7.41(m,2H),7.23-7.10(m,2H),6.80(t,J＝6.0Hz,1H),5.64-5.47(m,2H),5.26-5.22(m,2H),4.56(br s,1H),4.50-4.28(m,4H),3.46(d,J＝5.2Hz,4H),3.42-3.41(m,2H),3.29-3.28(m,2H),3.28-3.17(m,4H),3.07-3.05(m,1H),2.87-2.76(m,4H),2.49-2.47(m,1H),2.23(s,3H),2.07(s,1H),1.36(s,9H)。
方案7：化合物(VII)的制备
步骤1.化合物7-3的合成
在0℃下在氮气气氛下，向3-[5-(氨基甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮(化合物7-1，根据针对化合物1-4描述的程序制备，1.00g，3.66mmol，1.00当量)和TEA(0.37g，3.66mmol，1.00当量)于DMF(10mL)中的搅拌溶液中添加CDI(0.59g，3.66mmol，1.00当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌2h。在室温下向上述混合物中添加DMAP(1.34g，10.98mmol，3.00当量)和3-氯-对甲苯胺(0.52g，3.66mmol，1.00当量)。将所得混合物在60℃下再搅拌过夜。LCMS指示反应完成。使混合物冷却至室温。将反应混合物倒入冰/水中，然后过滤所得混合物，用MeCN(3x50 mL)洗涤滤饼。将滤饼在红外光下干燥。这样产生呈白色固体的1-(3-氯-4-甲基苯基)-3-[[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基]脲(化合物7-3，1.1g，68％)。LCMS(ESI,ms):441,443[M+H]+。
步骤2.化合物(VII)的合成
在室温下在氮气气氛下，向1-(3-氯-4-甲基苯基)-3-[[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基]脲(化合物7-3，200.00mg，0.45mmol，1.00当量)在DMF(2.00mL)中的搅拌溶液中添加K2CO3(188mg，1.36mmol，3.00当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌30min。在室温下向上述混合物中添加4-硝基苯基碳酸氯甲酯(化合物7-4，315mg，1.36mmol，3.00当量)、TBAI(84mg，0.23mmol，0.50当量)和NaI(68mg，0.45mmol，1.00当量)。将所得混合物在室温下再搅拌1h。然后添加(2S)-2-[(甲基氨基)甲基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(化合物7-5，194mg，0.91mmol，2.00当量)。将最终反应混合物在室温下搅拌1h。LCMS指示反应完成。将反应混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.1％FA)，40min内10％至80％梯度；检测器，UV 254nm。将收集的级分真空浓缩，得到呈白色固体的(2S)-2-([[([3-[5-([[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基]甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲氧基)羰基](甲基)氨基]甲基)吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(化合物(VII)，5mg，2％)。LCMS(ESI,ms):711,713[M+H]+,611,613[M+H-100]+.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.75(s,1H),7.71-7.60(m,2H),7.52-7.46(m,2H),7.19-7.13(m,2H),6.80(s,1H),5.61-5.47(m,2H),5.32-5.18(m,1H),4.60(s,1H),4.52-4.26(m,4H),3.46-3.40(m,4H),3.39(s,1H),3.30-3.22(m,4H),3.14-3.08(m,1H),2.91-2.78(m,4H),2.33(s,1H),2.22(s,3H),2.07(s,1H),1.36(s,9H)。
方案8：化合物(VIII)的制备
步骤1.化合物8-2的合成
在0℃下向2-羧基苯甲醛(化合物8-1，10g，63.27mmol，1.00当量)在MeOH(100mL)中的搅拌混合物中添加在H2O(20mL)中的CH3NH2(65.0mL，129.72mmol，2N的THF溶液，2.05当量)。将所得混合物在25℃下搅拌1h。在25℃下向上述混合物中添加NaBH4(1.20g，31.72mmol，0.50当量)。将所得混合物在25℃下再搅拌2h。LCMS指示反应完成。在室温下通过添加丙酮(100mL)淬灭反应。将所得混合物减压浓缩。通过用丙酮(100mL)研磨来纯化残余物。这样产生呈灰白色固体的2-[(甲基氨基)甲基]苯甲酸(化合物8-2，10.4g，84％)。LCMS(ES,m/z):166[M+H]+。
步骤2.化合物8-3的合成
在0℃下向2-[(甲基氨基)甲基]苯甲酸(化合物8-2，9g，54.48mmol，1.00当量)在二噁烷(90mL)中的搅拌混合物中添加在H2O中的NaOH(1M)(90mL)和(Boc)2O(24g，108.96mmol，2.00当量)。将所得混合物在25℃下搅拌4h。LCMS指示反应完成。将残余物用HCl(水溶液)酸化至pH 3。将所得混合物用CH2Cl2(3x 300mL)萃取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液减压浓缩，得到呈黄色油状物的2-[[(叔丁氧羰基)(甲基)氨基]甲基]苯甲酸(化合物8-3，12g，81％)。LCMS(ES,m/z):266[M+H]+,166[M+H-100]+。
步骤3.化合物8-4的合成
在0℃下向2-([[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]甲基)苯甲酸(化合物8-3，8g，27.14mmol，1.00当量)在DCM(80mL)和H2O(80mL)中的搅拌混合物中添加NaHCO3(9g，108.55mmol，4.00当量)、四丁基硫酸氢铵(0.92g，2.71mmol，0.10当量)和氯甲烷磺酰氯(4.9g，32.82mmol，1.2当量)。将所得混合物在25℃下再搅拌5h。LCMS指示反应完成。在室温下通过添加水(20mL)淬灭反应。将所得混合物用CH2Cl2(3x 100mL)萃取。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EtOAc(3:1)洗脱，得到呈黄色油状物的2-([[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]甲基)苯甲酸氯甲酯(化合物8-4，6.6g，65％)。LCMS(ES,m/z):314[M+H]+,214[M+H-100]+。1H NMR(300MHz,CDCl3):8.06(t,J＝3Hz,1H),7.62-7.57(m,1H),7.39-7.30(m,2H),5.95(s,2H),4.87(s,2H),2.92(d,J＝3Hz,3H),1.61-1.25(m,9H)。
步骤4.化合物8-6的合成
在室温下向1-(3-氯-4-甲基苯基)-3-[[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-5-基]甲基]脲(化合物8-5，根据针对化合物1-5描述的程序制备，500mg，1.13mmol，1.00当量)和K2CO3(470mg，3.40mmol，3.00当量)在DMF(10mL)中的搅拌混合物中添加2-([[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]甲基)苯甲酸氯甲酯(化合物8-4，712mg，2.29mmol，2.00当量)。将所得混合物在室温下搅拌16h。可以通过LCMS检测所需产物。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相TFA，ACN的水溶液，40min内10％至80％梯度；检测器，UV 254nm。将收集的级分浓缩得到呈半固体的2-([[(叔丁氧基)羰基](甲基)氨基]甲基)苯甲酸[3-[5-([[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基]甲基)-1-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(化合物8-6，200mg，24％)。LCMS(ES,m/z):618,620[M+H-100]+,718,720[M+H]+。
步骤5.化合物8-7的合成
在室温下在氮气气氛下，向在HCl(气体)中的2-[[(叔丁氧羰基)(甲基)-氨基]甲基]苯甲酸[3-[5-([[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基]甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(化合物8-6，200mg，0.28mmol，1.00当量)的搅拌混合物中添加1,4-二噁烷(4mL)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌1h。LCMS指示反应完成。将所得混合物真空浓缩。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相TFA，ACN的水溶液，30min内10％至50％梯度；检测器，UV 254nm。将混合物冻干，得到呈白色固体的2-[(甲基氨基)甲基]苯甲酸[3-[5-([[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基]甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(化合物8-7，80mg，41％)。LCMS(ES,m/z):618,620[M+H]+,640,642[M+Na]+。
步骤6.化合物8-9的合成
在0℃下向(2S)-2-(2-[2-[(叔丁氧羰基)氨基]乙酰胺基]乙酰胺基)-3-苯基丙酸(化合物8-8，1.50g，3.95mmol，1.00当量)在DMF(15mL)中的搅拌混合物中添加HATU(2.25g，5.92mmol，1.50当量)、HOBT(0.53g，3.92mmol，0.99当量)、甘氨酸(0.36g，4.79mmol，1.21当量)和DIEA(1.53g，11.84mmol，2.99当量)。将所得混合物在25℃下搅拌过夜。LCMS检测到12％的期望产物。将反应混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相FA(0.1％)，ACN的水溶液，40min内10％至50％梯度；检测器，UV 254nm。将所得混合物真空浓缩，得到呈白色固体的[(2S)-2-(2-[2-[(叔丁氧羰基)氨基]乙酰胺基]乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酸(化合物8-9，300mg，15％)。LCMS(ES,m/z):437[M+H]+,337[M+H-100]+。
步骤7.化合物8-10的合成
在0℃下，向在HCl(气体)中的[(2S)-2-(2-[2-[(叔丁氧羰基)氨基]-乙酰胺基]乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酸(化合物8-9，290mg，0.66mmol，1.00当量)在1,4-二噁烷(6.0mL)搅拌混合物。将所得混合物在25℃下再搅拌3h。LCMS指示反应完成。将所得混合物真空浓缩，得到呈白色固体的[(2S)-2-[2-(2-氨基乙酰胺基)乙酰胺基]-3-苯基丙酰胺基]乙酸盐酸盐(化合物8-10，330mg，93％)。粗产物无需任何纯化即用于下一步骤。LCMS(ES,m/z):337[M+H]+。
步骤8.化合物8-12的合成
在室温下在氮气气氛下，向[(2S)-2-[2-(2-氨基乙酰胺基)乙酰胺基]-3-苯基丙酰胺基]乙酸盐酸盐(化合物8-10，320mg，0.86mmol，1.00当量)在DMSO(6mL)中的搅拌混合物中分批添加6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(化合物8-11，318mg，1.03mmol，1.20当量)和DIEA(333mg，2.58mmol，3.0当量)。将所得混合物在室温下再搅拌3h。LCMS指示反应完成。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相TFA(0.5％)，ACN的水溶液，30min内10％至50％梯度；检测器，UV 254nm。将收集的级分冻干，得到呈白色固体的[(2S)-2-(2-[2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基]乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酸(化合物8-12，330mg，68％)。LCMS(ES,m/z):530[M+H]+,552[M+Na]+.1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:8.36-8.30(m,1H),8.11-8.06(m,2H),8.06-7.97(m,1H),7.26-7.15(m,5H),6.99(s,2H),4.57-4.49(m,1H),3.79-3.59(m,6H),3.37(t,J＝6Hz,2H),3.04(t,J＝9Hz,1H),2.82-2.77(m,1H),2.11(t,J＝9Hz,2H),1.52-1.44(m,4H),1.24-1.16(m,2H)。
步骤9.化合物(VIII)的合成
在室温下在氮气气氛下，向[(2S)-2-(2-[2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]-乙酰胺基]乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酸(化合物8-7，60mg，0.11mmol，1.00当量)和HATU(65mg，0.17mmol，1.50当量)在DMF(2mL)中的搅拌混合物中分批添加HOBT(15mg，0.11mmol，1.0当量)、2-[(甲基氨基)甲基]苯甲酸[3-[5-([[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基]甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(70mg，0.11mmol，1.00当量)和DIEA(44mg，0.34mmol，3.0当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌2h。LCMS指示反应完成。将粗产物通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：YMC-Actus TriartC18，30mm X 150mm，5um；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：60mL/min)。将收集的级分冻干得到呈白色固体的2-([2-[(2S)-2-(2-[2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基]乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]-N-甲基乙酰胺基]甲基)苯甲酸[3-[5-([[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基]甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(化合物(VIII)，40mg，30％)。LCMS(ES,m/z):566[M/2+1]+,1129,1131[M+1]+,1151,1153[M+Na]+.1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:8.77(s,1H),8.28-7.80(m,5H),7.73-7.40(m,6H),7.30-7.10(m,8H),6.99(s,2H),6.85-6.80(m,1H),5.95-5.84(m,2H),5.36-5.30(m,1H),4.88-4.82(m,2H),4.62-4.25(m,5H),4.12(d,J＝3Hz,1H),3.89(d,J＝3Hz,1H),3.70-3.65(m,5H),3.36(t,J＝6Hz,2H),3.20-2.70(m,7H),2.23(s,3H),2.10(t,J＝9Hz,3H),1.50-1.44(m,4H),1.28-1.10(m,2H)。
方案9：化合物(IX)的制备
步骤1.化合物9-2的合成
在室温下在氮气气氛下向(2-氯-4-硝基苯基)乙酸(化合物9-1，10g，46.38mmol，1.00当量)于THF(100mL)中的搅拌溶液中分批添加BH3-Me2S(8.8g，115.97mmol，2.50当量)。将所得混合物在70℃下在氮气气氛下搅拌2h。TLC指示反应完成。将反应混合物冷却至室温并浓缩至干。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EtOAc(2:1)洗脱，得到呈红色油状物的2-(2-氯-4-硝基苯基)乙醇(化合物9-2，6.4g，68％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.22(s,1H),8.07-8.03(m,1H),7.51(d,J＝3Hz,1H),3.92(t,J＝6Hz,2H),3.09(t,J＝6Hz,2H)。
步骤2.化合物9-3的合成
在室温下向2-(2-氯-4-硝基苯基)乙醇(化合物9-2，6.4g，31.74mmol，1.00当量)于DCM(120mL)中的搅拌溶液中分批添加NBS(8.48g，47.64mmol，1.50当量)和PPh3(12.50g，47.62mmol，1.50当量)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。TLC迹线指示反应完成。将反应真空浓缩至干。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EtOAc(4:1)洗脱，得到呈红色油状物的1-(2-溴乙基)-2-氯-4-硝基苯(7.0g，66％)。1H NMR(化合物9-3,300MHz,CDCl3)δ8.28(d,J＝2.4Hz,1H),8.13(d,J＝9.0Hz,1H),7.51(d,J＝3Hz,1H),3.66(t,J＝6.0Hz,2H),3.42(t,J＝6.0Hz,2H)。
步骤3.化合物9-4的合成
在0℃下在氮气气氛下，向1-(2-溴乙基)-2-氯-4-硝基苯(化合物9-3，6g，22.68mmol，1.00当量)在EtOH(60mL)中的搅拌混合物中分批添加甲硫醇钠(1.92g，27.45mmol，1.21当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌3h。通过LCMS不能检测到期望的产物，但是TLC(PE:EA＝10:1)显示新的点。将所得混合物真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EtOAc(9:1)洗脱，得到呈黄色固体的2-氯-1-[2-(甲基硫烷基)乙基]-4-硝基苯(化合物9-4，1.7g，32％)。1H NMR(300MHz,CDCl3):8.28(t,J＝3Hz,1H),8.10(d,J＝3Hz,1H),7.45(d,J＝9Hz,1H),3.14(t,J＝6Hz,2H),2.80(t,J＝3Hz,2H),2.18(s,3H)。
步骤4.化合物9-5的合成
向2-氯-1-[2-(甲基硫烷基)乙基]-4-硝基苯(化合物9-4，2g，8.63mmol，1.00当量)和Fe(1.45g，25.96mmol，3.01当量)在EtOH(60mL)中的搅拌混合物中添加在H2O(20mL)中的NH4Cl(4.6g，86.32mmol，10.00当量)。将所得混合物在90℃下搅拌3h。LCMS指示反应完成。使混合物冷却至室温。将所得混合物过滤，将滤饼用CH2Cl2洗涤。将所得混合物真空浓缩。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相TFA(0.05％)，ACN的水溶液，40min内10％至50％梯度；检测器，UV 254nm。将收集的级分浓缩，得到呈黄色油状物的3-氯-4-[2-(甲基硫烷基)乙基]苯胺(化合物9-5，2.0g，69％)。LCMS(ESI,ms):202,204[M+H]+,243,245[M+H+ACN]+。
步骤5.化合物9-6的合成
在0℃下在氮气气氛下，向3-[5-(氨基甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮(INT1，根据针对化合物1-4描述的程序制备，1.4g，4.96mmol，1.00当量)在DMF(25mL)中的搅拌混合物中分批添加CDI(0.80g，4.96mmol，1.00当量)和TEA(0.50g，4.94mmol，1.00当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌3h。在室温下向上述混合物中分批添加3-氯-4-[2-(甲基硫烷基)乙基]苯胺(化合物9-5，1g，4.96mmol，1.00当量)和DMAP(1.82g，14.90mmol，3.00当量)。将所得混合物在60℃下在氮气气氛下搅拌过夜。通过LCMS可检测到58％的期望产物。将反应混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相TFA(0.05％)，ACN的水溶液，40min内10％至70％梯度；检测器，UV 254nm。将收集的级分浓缩，得到呈固体的1-[3-氯-4-[2-(甲基硫烷基)乙基]苯基]-3-[[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基]脲(化合物9-6，700mg，27％)。LCMS(ES,m/z):501,503[M+H]+.1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.98(s,1H),8.79(s,1H),7.71-7.67(m,2H),7.52-7.25(m,2H),7.25-7.15(m,2H),6.82(t,J＝6Hz,1H),5.14-5.08(m,1H),4.49-4.29(m,4H),2.98-2.84(m,3H),2.84-2.63(m,3H),2.42-2.34(m,1H),2.09(s,3H),2.03-1.90(m,1H)。
步骤6.化合物9-7的合成
在室温下在氮气气氛下，向1-[3-氯-4-[2-(甲基硫烷基)乙基]苯基]-3-[[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基]脲(化合物9-6，700mg，1.40mmol，1.00当量)和K2CO3(579mg，4.19mmol，3.00当量)在DMF(10mL)中的搅拌混合物中分批添加2-[[(叔丁氧羰基)(甲基)氨基]甲基]苯甲酸氯甲酯(化合物8-4，526mg，1.68mmol，1.20当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌2天。LCMS指示反应完成。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相TFA(0.05％)，ACN的水溶液，40min内30％至80％梯度；检测器，UV 254nm。将收集的级分冻干，得到呈白色固体的2-[[(叔丁氧羰基)(甲基)氨基]甲基]苯甲酸[3-(5-[[([3-氯-4-[2-(甲基硫烷基)乙基]苯基]氨基甲酰基)氨基]甲基]-1-氧代-3H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(化合物9-7，260mg，21％)。LCMS(ES,m/z):778,780[M+H]+,678,780[M+H-100]+。
步骤7.化合物9-8的合成
在室温下在氮气气氛下，向在HCl(气体)中的2-[[(叔丁氧羰基)(甲基)氨基]甲基]苯甲酸[3-(5-[[([3-氯-4-[2-(甲基硫烷基)乙基]苯基]氨基甲酰基)氨基]甲基]-1-氧代-3H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(化合物9-7，250mg，0.32mmol，1.00当量)的搅拌混合物中分批添加1,4-二噁烷(5mL)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌1h。LCMS指示反应完成。将所得混合物真空浓缩。将粗产物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相TFA(0.05％)，ACN的水溶液，40min内10％至50％梯度；检测器，UV254nm。将混合物冻干，得到呈黄色固体的2-[(甲基氨基)甲基]苯甲酸[3-(5-[[([3-氯-4-[2-(甲基硫烷基)乙基]苯基]氨基甲酰基)氨基]甲基]-1-氧代-3H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(化合物9-8，132mg，56％)。LCMS(ES,m/z):678,680[M+H]+,700,702[M+Na]+。
步骤8.化合物(IX)的合成
在室温下在氮气气氛下，向[(2S)-2-(2-[2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]-乙酰胺基]乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酸(化合物8-12，100mg，0.19mmol，1.00当量)和HATU(108mg，0.28mmol，1.5当量)在DMF(2.00mL)中的搅拌混合物中分批添加HOBT(26mg，0.19mmol，1.0当量)、2-[(甲基氨基)甲基]苯甲酸[3-(5-[[([3-氯-4-[2-(甲基硫烷基)乙基]苯基]氨基甲酰基)氨基]甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(化合物9-8，115mg，0.17mmol，0.90当量)和DIEA(73mg，0.57mmol，3.0当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌2h。LCMS指示反应完成。将粗产物通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XSelect CSH Prep C18 OBD柱，19x 250mm，5um；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：25mL/min)。将收集的级分冻干，得到呈白色固体的2-([2-[(2S)-2-(2-[2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基]乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]-N-甲基乙酰胺基]甲基)苯甲酸[3-(5-[[([3-氯-4-[2-(甲基硫烷基)乙基]苯基]氨基甲酰基)氨基]甲基]-1-氧代-3H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲酯(化合物(IX)，52.1mg，23％)。LCMS(ES,m/z):596[M/2+1]+,1189,1191[M+1]+.1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.82(s,1H),8.12-7.83(m,5H),7.73-7.38(m,6H),7.26-7.15(m,8H),6.99(s,2H),6.83(t,J＝6Hz,1H),5.98-5.84(m,2H),5.32(t,J＝6Hz,1H),4.884.81(m,2H),4.65-4.30(m,5H),4.12(d,J＝3Hz,1H),3.94-3.85(m,4H),3.72-3.59(m,3H),3.36(t,J＝6Hz,2H),3.20-2.95(m,4H),2.89-2.74(m,4H),2.62-2.50(m,2H),2.12-2.05(m,6H),1.58-1.40(m,4H),1.28-1.10(m,2H)。
方案10：化合物(X)的制备
步骤1.化合物10-2的合成
在0℃下向Gly-Gly(10g，75.69mmol，1.00当量)和NaHCO3(12.72g，151.3mmol，2当量)在H2O(70mL)中的搅拌混合物中滴加在THF(35mL)中的氯(丙-2-烯-1-基氧基)甲酮(10.95g，90.82mmol，1.2当量)。将所得混合物在25℃下搅拌5h。LCMS指示反应完成。将所得混合物减压浓缩。将混合物用HCl(水溶液1N)酸化至pH 5。将沉淀的固体通过过滤收集并用HCl(水溶液1N)(2x 5mL)洗涤。这样产生呈白色固体的(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)乙酸(化合物10-2，9g，55％)。LCMS(ES,m/z):217[M+H]+
步骤2.化合物10-3的合成
将(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)乙酸(化合物10-2，9g，41.62mmol，1.00当量)和Cu(OAc)2(0.76g,4.16mmol，0.1当量)在THF(220mL)中的混合物在60℃下在氮气气氛下搅拌1h。使混合物冷却至室温。在室温下向上述混合物中添加Pb(OAc)4(22.15g，49.9mmol，1.2当量)。将所得混合物在25℃下再搅拌1h。LCMS指示反应完成。将所得混合物过滤，将滤饼用MeOH(3x 50mL)洗涤。将滤液减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(1:10)洗脱，得到呈白色固体的(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)乙酸甲酯(化合物10-3，5g，52％)。LCMS(ES,m/z)：231[M+H]+
步骤3.化合物10-4的合成
在0℃下向(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)乙酸甲酯(化合物10-3，1g，4.34mmol，1.00当量)于DCM(40mL)中的搅拌混合物中滴加TMSCl(1.89g，17.37mmol，4当量)。将所得混合物在0℃下搅拌1h。LCMS(对于LCMS，用MeOH淬灭)指示反应完成。将所得混合物减压浓缩。粗产物不经进一步纯化直接用于下一步。这样产生呈黄色固体的N-[(氯甲基氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物10-3，1g，77％)。LCMS(ES,m/z):203[M+H]+(用MeOH淬灭)
步骤4.化合物10-6的合成
将1-(3-氯-4-甲基苯基)-3-{[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基}脲(化合物10-5，根据针对化合物1-5描述的程序制备，750mg，1.70mmol，1.00当量)和Ag2CO3(938mg，3.40mmol，2当量)在NMP(15.00mL)中的混合物在50℃下搅拌1h。使混合物冷却至室温。在室温下向上述混合物中添加N-[(氯甲基氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物10-4，703mg，3.40mmol，2.00当量)。将所得混合物在60℃下再搅拌36h。LCMS指示反应完成。将残余物通过以下纯化：YMC-Actus Triart C18 ExRS,30x150mm；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：60mL/min；梯度：10min内27％B至53％B，53％B；波长：254nm；RT1(min)：9.22min。这样产生呈黄色固体的N-{[({3-[5-({[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基}甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基}甲基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物10-6，100mg，8％)。LCMS(ES,m/z)：611,613[M+H]+
步骤5.化合物10-7的合成
在25℃下在氮气气氛下向N-{[({3-[5-({[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基}甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基}甲基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物10-6，100mg，0.17mmol，1.00当量)和Pd(PPh3)4(19mg，0.017mmol，0.10当量)在THF(1.50mL)中的搅拌混合物中滴加苯基硅烷(36mg，0.34mmol，2.00当量)。将所得混合物在25℃下在氮气气氛下搅拌2h。LCMS指示反应完成。将反应混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，水(0.05％TFA)，ACN(30min内5％至50％梯度)；检测器，UV 254nm。这样产生呈黄色固体的2-氨基-N-({3-[5-({[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基}甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基}甲基)乙酰胺(化合物10-7，70mg，79％)。LCMS(ES,m/z)：527,529[M+H]+
步骤6.化合物(X)的合成
在0℃下向[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酸(化合物10-8，根据针对化合物8-12描述的程序制备，65mg，0.12mmol，1当量)和HATU(56mg，0.14mmol，1.2当量)、HOBT(20mg，0.14mmol，1.2当量)在DMF(650uL)中的搅拌混合物中添加2-氨基-N-({3-[5-({[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基}甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基}甲基)乙酰胺(化合物10-7，65mg，0.12mmol，1.00当量)和DIEA(47mg，0.36mmol，3当量)。将所得混合物在25℃下搅拌16h。LCMS指示反应完成。将反应混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，水(含0.5％TFA)，ACN(30min内10％至50％梯度)；检测器，UV 254nm。将粗产物通过制备型HPLC用以下条件再纯化：柱：Kinetex EVO prep C18,30x 150,5um；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：60mL/min；梯度：在17min内25％B至35％B，35％B；波长：254nm；RT1(min)：16。将收集的级分冻干，得到呈白色固体的N-{[({[(1S)-1-{[({[({3-[5-({[(3-氯-4-甲基苯基)氨基甲酰基]氨基}甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基}甲基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酰基}-2-苯基乙基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]甲基}-6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺(化合物(X)，11.4mg，8.84％)。LCMS(ES,m/z):1038,1040[M+H]+.1H-NMR(DMSO,400MHz)δ(ppm):8.75(s,1H),8.31-8.29(m,1H),8.19-8.16(m,1H),8.12-8.05(m,2H),7.99-7.94(m,2H),7.71-7.66(m,2H),7.52(s,1H),7.44(d,J＝8.0Hz,1H),7.24-7.08(m,7H),6.99-6.86(m,2H),6.82-6.79(m,1H),5.20-5.13(m,2H),4.99-4.95(m,1H),4.49-4.40(m,4H),4.31-4.27(m,1H),3.76-3.56(m,8H),3.37-3.30(m,2H),3.07-2.97(m,2H),2.79-2.67(m,2H),2.40-2.30(m,1H),2.22(s,3H),2.11-2.02(m,3H),1.49-1.42(m,4H),1.23-1.14(m,2H)。
方案11：化合物(XI)的制备
步骤1.化合物11-2的合成
在0℃下在氮气气氛下，向3-[5-(氨基甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮(INT，根据针对化合物1-4描述的程序制备，1.99g，7.29mmol，1.2当量)在DMF(20mL)中的搅拌混合物中添加CDI(0.99g，6.08mmol，1当量)、TEA(0.62g，6.08mmol，1当量)。将所得混合物在0℃下在氮气气氛下搅拌1h。在0℃下向上述混合物中添加N-{2-[2-(4-氨基-2-氯苯基)乙氧基]乙基}-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(化合物11-1，2g，6.08mmol，1.00当量)。将所得混合物在60℃下再搅拌16h。LCMS指示60％的期望产物。使混合物冷却至室温。在室温下通过添加水(20mL)淬灭反应。将所得混合物用EtOAc(3x 30mL)萃取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，水(0.05％TFA)、ACN(30min内5％至50％梯度)；检测器，UV 254nm。这样产生呈黄色固体的N-[2-(2-{2-氯-4-[({[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基}氨基甲酰基)氨基]苯基}乙氧基)乙基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(化合物11-2，2g，52％)。LCMS(ES,m/z):628,630[M+H]+
步骤2.化合物11-4的合成
在0℃下向(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)乙酸甲酯(化合物11-3，1g，4.34mmol，1.00当量)于DCM(40mL)中的搅拌混合物中滴加TMSCl(1.89g，17.37mmol，4当量)。将所得混合物在0℃下搅拌2h。LCMS指示反应完成。将所得混合物减压浓缩。这样产生呈白色固体的N-[(氯甲基氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物11-4，0.8g，89％)。LCMS(ES,m/z):203[M+H]+(对于LCMS用MeOH淬灭)
步骤3.化合物11-5的合成
在25℃下向N-[2-(2-{2-氯-4-[({[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基}氨基甲酰基)氨基]苯基}乙氧基)乙基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(化合物11-2，1g，1.59mmol，1.00当量)和K2CO3(0.44g，3.18mmol，2当量)在NMP(16mL)中的搅拌混合物中分批添加N-[(氯甲基氨甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物11-4，0.82g，3.98mmol，2.5当量)。将所得混合物在60℃下搅拌16h。LCMS指示反应完成。使混合物冷却至室温。在室温下通过添加水(20mL)淬灭反应。将所得混合物用EtOAc(3x 30mL)萃取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，水(0.05％TFA)、ACN(30min内5％至50％梯度；检测器，UV 254nm。这样产生呈黄色固体的N-(2-{2-[2-氯-4-({[(2-{2,6-二氧代-1-[(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)甲基]哌啶-3-基}-1-氧代-3H-异吲哚-5-基)甲基]氨基甲酰基}氨基)苯基]乙氧基}乙基)-N-甲基氨基甲酸叔丁酯化合物11-5，(0.5g，39％)。LCMS(ES,m/z)：798,800[M+H]+
步骤4.化合物11-6的合成
在0℃下在氮气气氛下向N-(2-{2-[2-氯-4-({[(2-{2,6-二氧代-1-[(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)甲基]哌啶-3-基}-1-氧代-3H-异吲哚-5-基)甲基]氨基甲酰基}氨基)苯基]乙氧基}乙基)-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(化合物11-5，500mg，0.62mmol，1.00当量)在THF(6mL)中的搅拌混合物中添加Pd(PPh3)4(72mg，0.063mmol，0.1当量)、苯基硅烷(136mg，1.25mmol，2当量)。将所得混合物在25℃下在氮气气氛下搅拌3h。LCMS指示反应完成。使混合物冷却至室温。在室温下通过添加水(20mL)淬灭反应。将所得混合物用EtOAc(3x 30mL)萃取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，水(0.05％TFA)、ACN(30min内5％至50％梯度)；检测器，UV 254nm。这样产生呈黄色固体的N-(2-{2-[4-({[(2-{1-[(2-氨基乙酰胺基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基}-1-氧代-3H-异吲哚-5-基)甲基]氨基甲酰基}氨基)-2-氯苯基]乙氧基}乙基)-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(化合物11-6，400mg，89％)。LCMS(ES,m/z):714,716[M+H]+
步骤5.化合物11-8的合成
在0℃下向[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酸(化合物11-7，根据针对化合物8-12描述的程序制备，163mg，0.30mmol，1.1当量)、HATU(159mg，0.42mmol，1.5当量)和HOBT(57mg，0.42mmol，1.5当量)在DMF(3mL)中的搅拌混合物中添加N-(2-{2-[4-({[(2-{1-[(2-氨基乙酰胺基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基}-1-氧代-3H-异吲哚-5-基)甲基]氨基甲酰基}氨基)-2-氯苯基]乙氧基}乙基)-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(化合物11-6，200mg，0.28mmol，1.00当量)、DIEA(108mg，0.84mmol，3当量)。将所得混合物在25℃下搅拌5h。LCMS指示反应完成。将反应通过添加水(10mL)淬灭。将沉淀的固体通过过滤收集并用水(11mL)洗涤。这样产生呈黄色固体的基N-(2-{2-[2-氯-4-({[(2-{1-[(2-{2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基}-1-氧代-3H-异吲哚-5-基)甲基]氨基甲酰基}氨基)苯基]乙氧基}乙基)-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(化合物11-8，100mg，29％)。LCMS(ES,m/z)：1225.1227[M+H]+
步骤6.化合物(XI)的合成
在0℃下向N-(2-{2-[2-氯-4-({[(2-{1-[(2-{2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基}-1-氧代-3H-异吲哚-5-基)甲基]氨基甲酰基}氨基)苯基]乙氧基}乙基)-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(化合物11-8，100mg，0.08mmol，1.00当量)在DCM(0.8mL)中的搅拌混合物中添加TFA(0.2mL)。将所得混合物在25℃下搅拌4h。LCMS指示反应完成。将所得混合物减压浓缩。将粗产物通过制备型HPLC用以下条件纯化：柱：XBridge ShieldRP18 OBD柱，30x150mm，5μm；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：60mL/min；梯度：在7min内20％B至40％B，40％B；波长：254nm；RT1(min)：5.7min。将收集的级分冻干，得到呈白色固体的N-{[({[(1S)-1-{[({[({3-[5-({[(3-氯-4-{2-[2-(甲基氨基)乙氧基]乙基}苯基)氨基甲酰基]氨基}甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基}甲基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酰基}-2-苯基乙基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]甲基}-6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺；三氟乙酸(化合物(XI)，30.5mg，29％)LCMS(ES,m/z):1125,1127[M+H]+.1H-NMR(DMSO,400MHz)δ(ppm):8.88(s,1H),8.39(br s,2H),8.33-8.29(m,1H),8.21-8.17(m,1H),8.13-8.06(m,2H),8.01-7.94(m,2H),7.71(d,J＝7.6Hz,1H),7.72(d,J＝2.0Hz,1H),7.51(s,1H),7.44(d,J＝8.0Hz,1H),7.26-7.14(m,7H),6.99(s,2H),6.93-6.90(m,1H),5.26-5.08(m,2H),5.02-4.88(m,1H),4.58-4.39(m,4H),4.35-4.18(m,1H),3.76-3.56(m,12H),3.37-3.34(m,2H),3.10-3.00(m,4H),2.90-2.87(m,2H),2.81-2.75(m,2H),2.57-2.54(m,3H),2.42-2.32(m,1H),2.11-2.08(m,2H),2.06-1.99(m,1H),1.49-1.43(m,4H),1.19-1.16(m,2H)。
方案12：化合物(XII)的制备
步骤1.化合物12-3的合成
在室温下在氮气气氛下，向3-(4-溴-1-氧代-3H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮(化合物12-1，3g，9.28mmol，1.00当量)和N-(戊-4-炔-1-基)氨基甲酸叔丁酯(化合物12-2，3.06g，16.71mmol，1.8当量)在DMF(31mL)和TEA(31mL)中的搅拌混合物中添加CuI(0.35g，1.85mmol，0.2当量)和Pd(PPh3)2Cl2(0.65g，0.92mmol，0.1当量)。将所得混合物在80℃下在氮气气氛下搅拌16h。LCMS指示反应完成。使混合物冷却至室温。在室温下通过添加水(100mL)淬灭反应。将所得混合物用EtOAc(3x 50mL)萃取。将合并的有机层用盐水(3x50mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用CH2Cl2/MeOH(10:1)洗脱，得到呈棕色固体的N-{5-[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-4-基]戊-4-炔-1-基}氨基甲酸叔丁酯(化合物12-32g，50％)。LCMS(ES,m/z)：426[M+H]+
步骤2.化合物12-5的合成
在0℃下向(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)乙酸甲酯(化合物12-4，根据针对化合物10-3描述的程序制备，0.9g，3.90mmol，1.00当量)在DCM(38mL)中的搅拌混合物中滴加TMSCl(1.9mL，14.86mmol，3.80当量)。将所得混合物在0℃下搅拌2h。LCMS指示反应完成。将所得混合物减压浓缩。粗产物不经进一步纯化直接用于下一步。这样产生呈白色固体的N-[(氯甲基氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物12-5，0.8g，99％)。LCMS(ES,m/z):203[M+H]+(用甲醇衍生)
步骤3.化合物12-6的合成
在室温下向N-{5-[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-4-基]戊-4-炔-1-基}氨基甲酸叔丁酯(化合物12-3，1g，2.35mmol，1.00当量)和N-[(氯甲基氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物12-5，0.73g，3.52mmol，1.5当量)在NMP(24mL)中的搅拌混合物中添加K2CO3(0.65g，4.70mmol，2当量)。将所得混合物在60℃下搅拌16h。LCMS指示反应完成。在室温下通过添加水(30mL)淬灭反应。将所得混合物用EtOAc(3x30mL)萃取。将合并的有机层用盐水(3x 30mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，水(0.05％TFA)、ACN(30min内5％至50％梯度；检测器，UV 254nm。这样产生呈黄色油状物的N-[5-(2-{2,6-二氧代-1-[(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)甲基]哌啶-3-基}-1-氧代-3H-异吲哚-4-基)戊-4-炔-1-基]氨基甲酸叔丁酯(化合物12-6，1.2g，85％)。LCMS(ES,m/z)：596[M+H]+
步骤4.化合物12-7的合成
在氮气气氛下，向N-[5-(2-{2,6-二氧代-1-[(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)甲基]哌啶-3-基}-1-氧代-3H-异吲哚-4-基)戊-4-炔-1-基]氨基甲酸叔丁酯(化合物12-6，1.4g，2.35mmol，1.00当量)和Pd(PPh3)4(0.27g，0.23mmol，0.1当量)在THF(30mL)中的搅拌混合物中添加苯基硅烷(0.51g，4.70mmol，2当量)。将所得混合物在25℃下在氮气气氛下搅拌3h。LCMS指示反应完成。在室温下通过添加水(1mL)淬灭反应。将所得混合物减压浓缩。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，水(0.05％TFA)、ACN(30min内5％至50％梯度)；检测器，UV 254nm。这样产生呈黄色固体的N-[5-(2-{1-[(2-氨基乙酰胺基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基}-1-氧代-3H-异吲哚-4-基)戊-4-炔-1-基]氨基甲酸叔丁酯；三氟乙酸(化合物12-7，500mg，34％)。LCMS(ES,m/z)：512[M+H]+
步骤5.化合物12-9的合成
在0℃下向[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酸(化合物12-8，根据针对化合物8-12描述的程序制备，279.33mg，0.52mmol，1.1当量)在DMF(6.00mL)中的搅拌混合物中添加HATU(218.80mg，0.57mmol，1.2当量)和HOBT(77.76mg，0.57mmol，1.2当量)。将所得混合物在25℃下搅拌30min。在0℃下向上述混合物中添加N-[5-(2-{1-[(2-氨基乙酰胺基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基}-1-氧代-3H-异吲哚-4-基)戊-4-炔-1-基]氨基甲酸叔丁酯；三氟乙酸(化合物12-7，300mg，0.48mmol，1.00当量)和DIEA(185.93mg，1.44mmol，3当量)。将所得混合物在25℃下再搅拌16h。LCMS指示反应完成。在室温下通过添加水(0.5mL)淬灭反应。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，水(0.05％TFA)、ACN(30min内5％至50％梯度)；检测器，UV 254nm。这样产生呈黄色固体的N-[5-(2-{1-[(2-{2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基}-1-氧代-3H-异吲哚-4-基)戊-4-炔-1-基]氨基甲酸叔丁酯(化合物12-9，300mg，61％)。LCMS(ES,m/z)：1023[M+H]+
步骤6.化合物12-10的合成
在0℃向N-[5-(2-{1-[(2-{2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基}-1-氧代-3H-异吲哚-4-基)戊-4-炔-1-基]氨基甲酸叔丁酯(化合物12-9，300mg，0.29mmol，1.00当量)在DCM(3.00mL)中的搅拌混合物中滴加TFA(0.75mL)。将所得混合物在25℃下搅拌3h。LCMS指示反应完成。将所得混合物减压浓缩。这样产生呈黄色固体的N-{[({[(1S)-1-{[({[({3-[4-(5-氨基戊-1-炔-1-基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基}甲基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酰基}-2-苯基乙基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]甲基}-6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺；三氟乙酸(化合物12-10，300mg，98％)。LCMS(ES,m/z)：923[M+H]+
步骤7.化合物12-12的合成
在0℃下向(3'S,4'R,5'S)-6”-氯-4'-(3-氯-2-氟苯基)-2”-氧代-1”H-二螺[环己烷-1,2'-吡咯烷-3',3”-吲哚]-5'-羧酸(化合物12-11，如J.Med.Chem.2014,57,10486-10498中所述那样制备，300mg，0.64mmol，1.00当量)和4-氨基苯甲酸甲酯(117mg，0.77mmol，1.2当量)在DMA(8mL)中的搅拌混合物中添加DIEA(100mg，0.77mmol，1.2当量)。将所得混合物在0℃下搅拌30min。在0℃下向上述混合物中添加HATU(295mg，0.77mmol，1.2当量)。将所得混合物在25℃下再搅拌16h。LCMS指示反应完成。在室温下通过添加水(0.5mL)淬灭反应。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，水(0.05％TFA)、ACN(30min内5％至50％梯度；检测器，UV 254nm。这样产生呈黄色固体的4-[(3'S,4'R,5'S)-6”-氯-4'-(3-氯-2-氟苯基)-2”-氧代-1”H-二螺[环己烷-1,2'-吡咯烷-3',3”-吲哚]-5'-基酰胺基]苯甲酸甲酯(化合物12-12，200mg，51％)。LCMS(ES,m/z)：596,598[M+H]+
步骤8.化合物12-13的合成
在0℃下，向4-[(3'S,4'R,5'S)-6”-氯-4'-(3-氯-2-氟苯基)-2”-氧代-1”H-二螺[环己烷-1,2'-吡咯烷-3',3”-吲哚]-5'-基酰胺基]苯甲酸甲酯(化合物12-12，190mg，0.31mmol，1.00当量)在THF(2mL)中的搅拌混合物中滴加在H2O(2mL)中的NaOH(12mg，0.31mmol，1当量)和LiOH(15mg，0.63mmol，2当量)。将所得混合物在25℃下搅拌4h。LCMS指示反应完成。将所得混合物减压浓缩。将混合物用HCl(水溶液)酸化至pH 6。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，水(0.05％TFA)、ACN(30min内5％至50％梯度)；检测器，UV 254nm。这样产生呈黄色固体的4-[(3'S,4'R,5'S)-6”-氯-4'-(3-氯-2-氟苯基)-2”-氧代-1”H-二螺[环己烷-1,2'-吡咯烷-3',3”-吲哚]-5'-基酰胺基]苯甲酸(化合物12-13，50mg，26％)。LCMS(ES,m/z)：582,584[M+H]+
步骤9.化合物(XII)的合成
在0℃向4-[(3'S,4'R,5'S)-6”-氯-4'-(3-氯-2-氟苯基)-2”-氧代-1”H-二螺[环己烷-1,2'-吡咯烷-3',3”-吲哚]-5'-基酰胺基]苯甲酸(化合物12-13，50mg，0.086mmol，1.00当量)在DMF(0.9mL)中的搅拌混合物中分批添加HATU(36mg，0.095mmol，1.1当量)。将所得混合物在0℃下搅拌10min。在0℃下向上述混合物中添加N-{[({[(1S)-1-{[({[({3-[4-(5-氨基戊-1-炔-1-基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基}甲基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酰基}-2-苯基乙基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]甲基}-6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺；三氟乙酸(化合物12-10，98mg，0.095mmol，1.10当量)和DIEA(33mg，0.25mmol，3当量)。将所得混合物在25℃下再搅拌16h。LCMS指示反应完成。在室温下通过添加水(0.1mL)淬灭反应。将粗产物通过制备型HPLC用以下条件纯化：柱：XBridge Shield RP18 OBD柱，30x 150mm，5μm；流动相A：水(0.1％FA)，流动相B：ACN；流速：60mL/min；梯度：在10min内37％B至53％B，在11min内53％B至53％B；波长：254nm；RT1(min)：10.52。将收集的级分冻干，得到呈白色固体的(3'R,4'S,5'R)-6”-氯-4'-(3-氯-2-氟苯基)-N-(4-{[5-(2-{1-[(2-{2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基}-1-氧代-3H-异吲哚-4-基)戊-4-炔-1-基]氨基甲酰基}苯基)-2”-氧代-1”H-二螺[环己烷-1,2'-吡咯烷-3',3”-吲哚]-5'-甲酰胺(化合物(XII)，24.1mg，18％)。LCMS(ES,m/z):1486,1488[M+H]+1H-NMR(DMSO,400MHz)δ(ppm):10.59(s,1H),10.23(s,1H),8.47-8.44(m,1H),8.36-8.26(m,1H),8.25-7.90(m,5H),7.80(d,J＝8.8Hz,2H),7.76-7.58(m,5H),7.53-7.45(m,2H),7.37-7.34(m,1H),7.26-7.13(m,6H),7.05-6.99(m,3H),6.68(d,J＝2.0Hz,1H),5.32-5.10(m,2H),5.02-4.90(m,1H),4.77-4.68(m,2H),4.50-4.46(m,2H),4.36-4.32(m,1H),3.76-3.60(m,9H),3.42-3.36(m,4H),3.06-3.02(m,2H),2.82-2.70(m,2H),2.55-2.54(m,2H),2.46-2.43(m,1H),2.11-2.04(m,4H),1.84-1.80(m,3H),1.68-1.52(m,4H),1.49-1.36(m,6H),1.19-1.15(m,2H),1.05-0.96(m,1H),0.92-0.82(m,1H)。
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方案13：化合物(XIII)的制备
步骤1.化合物13-3的合成
将[(9S)-7-(4-氯苯基)-4,5,13-三甲基-3-硫杂-1,8,11,12-四氮杂三环[8.3.0.0^{2,6}]十三碳-2(6),4,7,10,12-五烯-9-基]乙酸(化合物13-1，1.00g，2.50mmol，1.00当量)和HATU(1.90g，4.99mmol，2.00当量)在DMF(10mL)中的溶液在室温下搅拌0.5h。然后添加6-氨基己酸甲酯盐酸盐(化合物13-2，0.54g，2.994mmol，1.2当量)和DIEA(1.93g，14.97mmol，6.00当量)。将所得混合物在室温下搅拌2小时。LCMS指示反应完成。将所得混合物用水(100mL)稀释，用EA(50mLx3)萃取，将合并的有机层用水(50mL)、盐水(50mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥并真空浓缩至干。将残余物通过硅胶柱色谱法(DCM:MeOH＝13:1)纯化，得到呈棕色固体的6-{2-[(9S)-7-(4-氯苯基)-4,5,13-三甲基-3-硫杂-1,8,11,12-四氮杂三环[8.3.0.0^{2,6}]十三碳-2(6),4,7,10,12-五烯-9-基]乙酰胺基}己酸甲酯(化合物13-3，1.22g，91％)。LCMS(ES,m/z):528,530[M+H]+
步骤2.化合物13-4的合成
在室温下向6-{2-[(9S)-7-(4-氯苯基)-4,5,13-三甲基-3-硫杂-1,8,11,12-四氮杂三环[8.3.0.0^{2,6}]十三碳-2(6),4,7,10,12-五烯-9-基]乙酰胺基}己酸甲酯(化合物13-3，1.20g，2.27mmol，1.00当量)在THF(10mL)和H2O(5mL)中的溶液中添加LiOH.H2O(65mg，2.73mmol，1.20当量)。将所得混合物在室温下搅拌2小时。LCMS指示反应完成。真空除去溶剂。将残余物用EA(100ml)和水(300mL)溶解。分离出有机层。将水相用EA(100mLx3)萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并真空浓缩至干，得到呈黄色固体的6-{2-[(9S)-7-(4-氯苯基)-4,5,13-三甲基-3-硫杂-1,8,11,12-四氮杂三环[8.3.0.0^{2,6}]十三碳-2(6),4,7,10,12-五烯-9-基]乙酰胺基}己酸(化合物13-4，1g，84％)。LCMS(ES,m/z):514,516[M+H]+
步骤3.化合物13-6的合成
在室温下向IR[DF(CF3)PPY]2(DTBPY)PF6(166mg，0.15mmol，0.10当量)、镍(2+)、四水[4,4'-双(1,1-二甲基乙基)-2,2'-联吡啶-κN1,κN1']-氯化物(69mg，0.15mmol，0.10当量)、4-溴-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚-1,3-二酮(化合物13-5，500mg，1.48mmol，1.00当量)和[(叔丁氧羰基)氨基]乙酸(390mg，2.22mmol，1.50当量)在DMSO(25.00mL)中的溶液中添加2-叔丁基l-1,1,3,3-四甲基胍(381mg，2.22mmol，1.50当量)。将反应小瓶密封并将反应混合物用氮气鼓泡5min。然后用蓝色LED(365nm)照射搅拌的反应混合物24小时。LCMS指示反应完成。将反应并行运行两次。将反应物用水(250mL)稀释，用EA(75mLx3)萃取，将合并的有机层用水(75mL)、盐水(75mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥并真空浓缩至干。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.1％FA)，30min内0％至60％梯度；检测器，UV 254nm。将收集的级分浓缩，得到呈黄色固体的N-{[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚-4-基]甲基}氨基甲酸叔丁酯(化合物13-6，300mg，22％)。LCMS(ES,m/z):388[M+H]+,288[M+H-Boc]+,329[M+H-Boc+ACN]+
步骤4.化合物13-7的合成
将在HCl(气体)中的N-{[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚-4-基]甲基}氨基甲酸叔丁酯(化合物13-6，300mg，0.77mmol，1.00当量)在1,4-二噁烷(15mL)中的溶液在室温下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将反应物真空浓缩至干，得到呈黄色固体的4-(氨基甲基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚-1,3-二酮(化合物13-7，380mg，粗品)。粗产物不经进一步纯化即用于下一步。LCMS(ES,m/z):288[M+H]+
步骤5.化合物(XIII)的合成
在室温下在空气中向6-{2-[(9S)-7-(4-氯苯基)-4,5,13-三甲基-3-硫杂-1,8,11,12-四氮杂三环[8.3.0.0^{2,6}]十三碳-2(6),4,7,10,12-五烯-9-基]乙酰胺基}己酸(化合物13-4，390mg，0.76mmol，1.00当量)在DMF(5mL)中的溶液中添加4-(氨基甲基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚-1,3-二酮(化合物13-7，376mg，0.76mmol，1.00当量，58％)、HATU(577mg，1.52mmol，2.00当量)、DIEA(294mg，2.28mmol，3.00当量)。将所得混合物在室温下搅拌2小时。LCMS指示反应完成。将所得混合物用水(50mL)稀释，用EA(50mLx3)萃取，将合并的有机层用盐水(50mL)、水(50mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥并真空浓缩至干。将残余物通过制备型TLC(DCM:MeOH＝10:1)纯化，得到呈黄色固体的6-{2-[(9S)-7-(4-氯苯基)-4,5,13-三甲基-3-硫杂-1,8,11,12-四氮杂三环[8.3.0.0^{2,6}]十三碳-2(6),4,7,10,12-五烯-9-基]乙酰胺基}-N-{[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚-4-基]甲基}己酰胺(化合物(XIII)，330mg，52％)。MS:(ES,m/s):783,785[M+H]+1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.14(s,1H),8.45(t,J＝5.6Hz,1H),8.18(t,J＝4.4Hz,1H),7.85-7.77(m,2H),7.67(d,J＝7.6Hz,1H),7.50-7.40(dd,J＝8.8Hz,20.8Hz,4H),5.22-5.16(m,1H),4.71-4.72(m,2H),4.53-4.49(m,1H),3.30-3.06(m,4H),2.95-2.87(m,1H),2.67-2.51(m,5H),2.41(s,1H),2.20(t,J＝7.2Hz,2H),2.08-2.04(m,2H),1.62(s,1H),1.53-1.59(m,2H),1.48-1.42(m,2H),1.35-1.29(m,2H)。
方案14：化合物(XIV)的制备
步骤1.化合物14-2的合成
在室温下向(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)乙酸甲酯(化合物14-1，根据针对化合物10-3描述的程序制备，100mg，0.44mmol，1.00当量)在DCM(10mL)中的溶液中添加TMSCl(70mg，0.66mmol，1.50当量)。将反应在室温下搅拌0.5h。LCMS指示反应完成。将反应物真空浓缩至干，并将残余物直接用于下一步骤。LCMS(ES,m/z):203[M+H]+(用甲醇衍生)
步骤2.化合物14-4的合成
在室温下向6-{2-[(9S)-7-(4-氯苯基)-4,5,13-三甲基-3-硫杂-1,8,11,12-四氮杂三环[8.3.0.0^{2,6}]十三碳-2(6),4,7,10,12-五烯-9-基]乙酰胺基}-N-{[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚-4-基]甲基}己酰胺(化合物(XIII)，100mg，0.12mmol，1.00当量)和N-[(氯甲基甲酰胺基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物14-3，106mg，0.52mmol，4.00当量)在DMF(5mL)中的溶液中添加K2CO3(70mg，0.52mmol，4.00当量)。将所得混合物在室温下搅拌48小时。LCMS指示反应完成。将反应混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.1％FA)，30min内0％至60％梯度；检测器，UV 254nm和220nm。将收集的级分浓缩，得到呈黄色固体的N-({[(3-{4-[(6-{2-[(9S)-7-(4-氯苯基)-4,5,13-三甲基-3-硫杂-1,8,11,12-四氮杂三环[8.3.0.0^{2,6}]十三碳-2(6),4,7,10,12-五烯-9-基]乙酰胺基}己酰胺基)甲基]-1,3-二氧代异吲哚-2-基}-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物14-4，110mg，83％)。LCMS(ES,m/z):953,955[M+H]+
步骤3.化合物14-5的合成
在N2下，向N-({[(3-{4-[(6-{2-[(9S)-7-(4-氯苯基)-4,5,13-三甲基-3-硫杂-1,8,11,12-四氮杂三环[8.3.0.0^{2,6}]十三碳-2(6),4,7,10,12-五烯-9-基]乙酰胺基}己酰胺基)甲基]-1,3-二氧代异吲哚-2-基}-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物14-4，100mg，0.11mmol，1.00当量)在THF(5mL)中的溶液中添加苯基硅烷(23mg，0.21mmol，2.00当量)和Pd(PPh3)4(12mg，0.01mmol，0.10当量)。将所得混合物在室温下搅拌3小时。LCMS指示反应完成。将所得混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.1％FA)，30min内0％至60％梯度；检测器，UV 254nm和220nm，得到呈浅黄色固体的(化合物14-5，55mg，57％)。LCMS(ES,m/z):869,871[M+H]+
步骤4.化合物(XIV)的合成
在室温下向N-[(2-{1-[(2-氨基乙酰胺基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基}-1,3-二氧代异吲哚-4-基)甲基]-6-{2-[(9S)-7-(4-氯苯基)-4,5,13-三甲基-3-硫杂-1,8,11,12-四氮杂三环[8.3.0.0^{2,6}]十三碳-2(6),4,7,10,12-五烯-9-基]乙酰胺基}己酰胺(化合物14-5，50mg，0.06mmol，1.00当量)、[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酸(化合物14-4，根据针对化合物8-12描述的程序制备，34mg，0.06mmol，1.10当量)在DMF(3mL)中的溶液添加HOBT(16mg，0.12mmol，2.00当量)、HATU(44mg，0.12mmol，2.00当量)和DIEA(67mg，0.52mmol，9.00当量)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。将所得混合物通过以下纯化：柱：XSelect CSH Prep C18 OBD柱，19*150mm，5μm；流动相A：水(0.05％FA)，流动相B：ACN；流速：25mL/min；梯度：7min内29％B至59％B，59％B；波长：254nm；RT1(min)：6.8，得到呈浅黄色固体的6-{2-[(9S)-7-(4-氯苯基)-4,5,13-三甲基-3-硫杂-1,8,11,12-四氮杂三环[8.3.0.0^{2,6}]十三碳-2(6),4,7,10,12-五烯-9-基]乙酰胺基}-N-[(2-{1-[(2-{2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基}-1,3-二氧代异吲哚-4-基)甲基]己酰胺(化合物(XIV)，14.4mg，17％)。LCMS(ES,m/z):1380,1382[M+H]+1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.47-8.44(m,1H),8.29-8.21(m,2H),8.19-8.15(m,1H),8.13-8.04(m,2H),8.00-7.92(m,2H),7.89-7.72(m,2H),7.68-7.66(m,1H),7.50-7.41(m,4H),7.35-7.23(m,4H),7.20-7.11(m,1H),6.99(s,2H),5.25-5.12(m,2H),5.08-5.00(m,1H),4.72(d,J＝6Hz,2H),4.53-4.50(m,2H),3.76-3.69(m,5H),3.68-3.65(m,4H),3.36(t,J＝7.2Hz,2H),3.24-3.20(m,2H),3.10-3.03(m,4H),2.82-2.78(m,2H),2.60(s,3H),2.41(s,3H),2.23-2.19(m,2H),2.19-2.01(m,3H),1.62(s,3H),1.59-1.55(m,2H),1.50-1.42(m,6H),1.33-1.31(m,2H),1.20-1.16(m,2H)。
方案15：化合物(XV)的制备
步骤1.化合物15-2的合成
在0℃下向(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)乙酸甲酯(化合物15-1，根据针对化合物10-3描述的程序制备，736mg，3.19mmol，1当量)在DCM(30mL)中的搅拌混合物中滴加TMSCl(1389mg，12.78mmol，4.00当量)。将所得混合物在0℃下搅拌2h。LCMS指示反应完成。将所得混合物减压浓缩。这样产生呈白色固体的N-[(氯甲基氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物15-2，736mg，89％)。LCMS(ES,m/z):203[M+H]+(用MeOH衍生)。
步骤2.化合物15-4的合成
在0℃下在氮气气氛下，向6-[4-({4-[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-6-氟-1,3-二氧代异吲哚-5-基]哌嗪-1-基}甲基)哌啶-1-基]-N-[(1r,4r)-4-(3-氯-4-氰基苯氧基)环己基]哒嗪-3-甲酰胺(化合物15-3，500mg，0.61mmol，1当量)在DMF(8mL)中的搅拌混合物中分批添加NaH(37mg，0.92mmol，1.50当量，60％)。将所得混合物在0℃下在氮气气氛下搅拌30min。在0℃下向上述混合物中添加N-[(氯甲基氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物15-2，254mg，1.23mmol，2当量)。将所得混合物在25℃下再搅拌16h。LCMS指示反应完成。在室温下通过添加水(1mL)淬灭反应。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，水(0.05％TFA)、ACN(30min内5％至50％梯度)；检测器，UV 254nm。这样产生呈黄色固体的N-{[({3-[5-氟-1,3-二氧代-6-(4-{[1-(6-{[(1r,4r)-4-(3-氯-4-氰基苯氧基)环己基]氨基甲酰基}哒嗪-3-基)哌啶-4-基]甲基}哌嗪-1-基)异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基}甲基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物15-4，130mg，21％)。LCMS(ES,m/z)：982,984[M+H]+
步骤3.化合物15-5的合成
在室温下在氮气气氛下向N-{[({3-[5-氟-1,3-二氧代-6-(4-{[1-(6-{[(1r,4r)-4-(3-氯-4-氰基苯氧基)环己基]氨基甲酰基}哒嗪-3-基)哌啶-4-基]甲基}哌嗪-1-基)异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基}甲基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物15-4，120mg，0.12mmol，1当量)和Pd(PPh3)4(14mg，0.012mmol，0.1当量)在THF(1.2mL)中的搅拌混合物中滴加苯基硅烷(26mg，0.24mmol，2当量)。将所得混合物在25℃下在氮气气氛下搅拌3h。LCMS指示反应完成。将所得混合物减压浓缩。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，水(0.05％TFA)、ACN(30min内5％至50％梯度)；检测器，UV 254nm。这样产生呈黄色固体的6-(4-{[4-(2-{1-[(2-氨基乙酰胺基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基}-6-氟-1,3-二氧代异吲哚-5-基)哌嗪-1-基]甲基}哌啶-1-基)-N-[(1r,4r)-4-(3-氯-4-氰基苯氧基)环己基]哒嗪-3-甲酰胺(化合物15-5，40mg，36％)。LCMS(ES,m/z):899,901[M+H]+
步骤4.化合物(XV)的合成
在0℃下在氮气气氛下向[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酸(化合物15-6，根据针对化合物8-12描述的程序制备，21mg，0.040mmol，1当量)和HATU(18mg，0.048mmol，1.2当量)、HOBT(7mg，0.048mmol，1.2当量)在DMF(0.4mL)中的搅拌混合物中添加6-(4-{[4-(2-{1-[(2-氨基乙酰胺基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基}-6-氟-1,3-二氧代异吲哚-5-基)哌嗪-1-基]甲基}哌啶-1-基)-N-[(1r,4r)-4-(3-氯-4-氰基苯氧基)环己基]哒嗪-3-甲酰胺(化合物15-5，40mg，0.040mmol，1当量)和DIEA(16mg，0.12mmol，3当量)。将所得混合物在25℃下在氮气气氛下搅拌16h。LCMS指示反应完成。将粗产物通过制备型HPLC用以下条件进行纯化：柱：XBridge Shield RP18 OBD柱，30x 150mm，5μm；流动相A：水(0.1％FA)，流动相B：ACN；流速：60mL/min；梯度：10min内23％B至43％B，43％B；波长：254nm；RT1(min)：8.92；将收集的级分冻干，得到呈黄色固体的6-(4-{[4-(2-{1-[(2-{2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基}-6-氟-1,3-二氧代异吲哚-5-基)哌嗪-1-基]甲基}哌啶-1-基)-N-[(1r,4r)-4-(3-氯-4-氰基苯氧基)环己基]哒嗪-3-甲酰胺(化合物(XV)，7.2mg，10％)。LCMS(ES,m/z):1409,1411[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.59(d,J＝8.0Hz,1H),8.28-8.24(m,2H),8.13-8.06(m,2H),7.99-7.92(m,2H),7.86-7.73(m,3H),7.39-7.31(m,3H),7.24-7.21(m,4H),7.17-7.12(m,2H),6.99(s,2H),5.17-5.14(m,3H),4.53-4.47(m,4H),3.74-3.50(m,11H),3.37-3.59(m,2H),3.30-3.22(m,3H),3.07-2.76(m,7H),2.62-2.52(m,3H),2.32-2.00(m,7H),1.91-1.83(m,5H),1.65-1.62(m,2H),1.52-1.43(m,6H),1.20-1.14(m,4H)。
方案16：化合物(XVII)的制备
步骤1.化合物17-7的合成
在室温下向(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)乙酸甲酯(化合物17-6，100mg，0.43mmol，1.00当量)于DCM(5mL)中的溶液中添加TMSCl(71mg，0.65mmol，1.50当量)。将反应在室温下搅拌0.5h。LCMS指示反应完成。将反应物真空浓缩至干，并将残余物直接用于下一步骤。LCMS(ES,m/z):203[M+H]+(用甲醇衍生)
步骤2.化合物17-8的合成
将1-{3-氯-4-[2-(甲基硫烷基)乙基]苯基}-3-{[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基}脲(化合物9-6，50mg，0.100mmol，1.00当量)、N-[(氯甲基氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物17-7，82mg，0.40mmol，4.00当量)和K2CO3(41mg，0.30mmol，3.00当量)在NMP(2500uL)中的溶液在50℃下搅拌24小时。然后添加在NMP(0.5mL)中的N-[(氯甲基氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(82mg，0.40mmol，4.00当量)和K2CO3(14mg，0.10mmol，1.00当量)。将所得到的混合物在50℃下搅拌24小时。LCMS指示反应完成。将反应并行运行八次。将所得混合物通过制备型HPLC用以下条件纯化：柱：Sunfire Prep C18 OBD柱，19*250mm，10μm；流动相A：水(0.1％FA)，流动相B：ACN；流速：25mL/min；梯度：10min内41％B至57％B，57％B；波长：254nm；RT1(min)，得到呈黄色固体的产物N-[({[3-(5-{[({3-氯-4-[2-(甲基硫烷基)乙基]苯基}氨基甲酰基)氨基]甲基}-1-氧代-3H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物17-8，64mg，11％)。LCMS(ES,m/z):671[M+H]+
步骤3.化合物17-9的合成
在N2下向N-[({[3-(5-{[({3-氯-4-[2-(甲基硫烷基)乙基]苯基}氨基甲酰基)氨基]甲基}-1-氧代-3H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物17-8，64mg，0.10mmol，1.00当量)在THF(5mL)和苯基硅烷(21mg，0.19mmol，2.00当量)中的溶液中添加Pd(PPh3)4(11mg，0.01mmol，0.10当量)。将所得混合物在室温下搅拌3小时。LCMS指示反应完成。过滤后，将反应混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.1％FA)，30min内0％至60％梯度；检测器，UV 254nm。将收集的级分冻干，得到呈灰白色固体的2-氨基-N-{[3-(5-{[({3-氯-4-[2-(甲基硫烷基)乙基]苯基}氨基甲酰基)氨基]甲基}-1-氧代-3H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基}乙酰胺(化合物17-9，32mg，51％)。LCMS(ES,m/z):587[M+H]+
步骤4.化合物XVII的合成
将[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酸(化合物17-9，32mg，0.06mmol，1.20当量)、HOBT(7mg，0.05mmol，1.00当量)和HATU(19mg，0.05mmol，1.00当量)在DMF(3mL)中的溶液在室温下搅拌1h。然后在室温下添加2-氨基-N-{[3-(5-{[({3-氯-4-[2-(甲基硫烷基)乙基]苯基}氨基甲酰基)氨基]甲基}-1-氧代-3H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基}乙酰胺(化合物17-10，根据针对化合物8-12描述的程序制备，30mg，0.05mmol，1.00当量)和DIEA(26mg，0.20mmol，4.00当量)。将所得到的混合物在室温下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将反应物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱：Kinetex EVO C18，21.2*250mm，5μm；流动相A：水(0.1％FA)，流动相B：ACN；流速：25mL/min；梯度：7min内34％B至64％B，64％B；波长：254nm；RT1(min)：6。将收集的级分冻干，得到呈白色固体的N-{[({[(1S)-1-[({[({[3-(5-{[({3-氯-4-[2-(甲基硫烷基)乙基]苯基}氨基甲酰基)氨基]甲基}-1-氧代-3H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]-2-苯基乙基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]甲基}-6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺(化合物(XVII)，6.5mg，10.57％)。LCMS(ES,m/z):1098[M+H]+1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.80(s,1H),8.35-8.28(m,1H),8.19-8.17(m,1H),8.12-8.10(m,1H),8.07-8.06(m,1H),8.02-7.98(m,1H),7.97-7.92(m,1H),7.73-7.67(m,2H),7.53(s,1H),7.47-7.45(m,1H),7.24-7.22(m,5H),7.20-7.15(m,2H),7.00(s,2H),6.84-6.80(m,1H),5.22-4.96(m,3H),4.55-4.50(m,1H),4.44-4.41(m,2H),4.34-4.28(m,1H),3.73-3.66(m,7H),3.37-3.36(m,4H),3.10-2.95(m,2H),2.90-2.70(m,4H),2.69-2.62(m,3H),2.15-2.00(m,5H),2.09-2.00(m,1H),1.50-1.45(m,4H),1.21-1.19(m,2H)。
方案17：化合物(XVIII)的制备
步骤1.化合物18-2的合成
在0℃下向Gly-Gly(10g，75.68mmol，1.00当量)和NaHCO3(12.72g，151.37mmol，2当量)在H2O(70mL)中的搅拌混合物中滴加在THF(35mL)中的氯(丙-2-烯-1-基氧基)甲酮(10.95g，90.82mmol，1.2当量)。将所得混合物在25℃下搅拌5h。LCMS指示反应完成。将所得混合物减压浓缩。将混合物用HCl(水溶液1N)酸化至pH 5。通过过滤收集沉淀的固体并用HCl(水溶液1N)(2x50 mL)洗涤。这样产生呈白色固体的(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)乙酸(化合物18-2，9g，55％)。LCMS(ES,m/z):217[M+H]+。
步骤2.化合物18-3的合成
将(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)乙酸(化合物18-2，9g，41.62mmol，1.00当量)和Cu(OAc)2(0.76g,4.16mmol，0.1当量)在THF(220mL)中的混合物在60℃下在氮气气氛下搅拌1h。使混合物冷却至室温。在室温下向上述混合物中添加Pb(OAc)4(22.15g，49.95mmol，1.2当量)。将所得混合物在25℃下再搅拌1h。LCMS指示反应完成。过滤所得混合物，用MeOH(3x50 mL)洗涤滤饼。将滤液减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(1:10)洗脱，得到呈白色固体的(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)乙酸甲酯(化合物18-3，5g，52％)。LCMS:(ES,m/z):253[M+Na]+。
步骤3.化合物18-4的合成
在0℃下在氮气气氛下向(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)乙酸甲酯(化合物18-3，100mg，0.43mmol，1当量)于DCM(1mL)中的搅拌混合物中滴加TMSCl(188mg，1.73mmol，4当量)。将所得混合物在0℃下在氮气气氛下搅拌2h。反应混合物用甲醇衍生用于LCMS测试。将所得混合物真空浓缩，得到呈白色固体的粗产物N-[(氯甲基氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物18-4，80mg，89％)。LCMS(ESI,m/z):203[M+H]+(用甲醇衍生)
化合物18-5的合成
步骤5.
在室温下向(2-氯-4-硝基苯基)乙酸(40.7g，188.78mmol，1.00当量)在THF(610mL)中的搅拌溶液中滴加BH3-Me2S(47mL，10N，470mmol，2.5当量)。将所得混合物在70℃下在氮气气氛下搅拌3h。LCMS指示反应完成。使反应混合物冷却至室温并减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(1:1)洗脱，得到呈黄色固体的2-(2-氯-4-硝基苯基)乙醇(35g，91％)。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.25(s,1H),8.16-8.12(m,1H),7.68-7.65(m,1H),4.87-4.84(m,1H),3.71-3.65(m,2H),2.9-2.95(m,2H)。
步骤6.
在室温下在氮气气氛下向2-(2-氯-4-硝基苯基)乙醇(6.0g，29.76mmol，1当量)和1-(4-甲基苯磺酰基)氮杂环丙烷(5.87g，29.75mmol，1.0当量)在DCM(60mL)中的搅拌混合物中。将所得混合物在0℃下搅拌10min。在0℃下向上述混合物中分批添加AMBERLYST 15(H)(12.0g)。将所得混合物在室温下再搅拌2h。LCMS指示反应为45％产物。在0℃向上述混合物中分批添加1-(4-甲基苯磺酰基)氮杂环丙烷(8.81g，44.64mmol，1.5当量)。将所得混合物在℃下再搅拌10min。在0℃下向上述混合物中分批添加AMBERLYST 15(H)(12.0g)。将所得混合物在室温下再搅拌2h。LCMS指示反应完成。通过过滤对固体过滤并用DCM(3x50mL)洗涤。将有机物真空浓缩至干。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(1:1)洗脱，得到呈灰白色油状物的N-{2-[2-(2-氯-4-硝基苯基)乙氧基]乙基}-4-甲基苯磺酰胺(6.8g，57％)。LCMS:(ES.m/z):399,401[M+1]+。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.25(s,1H),8.14-8.10(m,1H),7.68-7.59(m,4H),7.39-7.36(m,2H),3.61-3.57(m,2H),3.41-3.33(m,2H),3.00-2.97(m,2H),2.89-2.85(m,2H),2.37(s,3H)。
步骤7.
在室温下向N-{2-[2-(2-氯-4-硝基苯基)乙氧基]乙基}-4-甲基苯磺酰胺(6.8g，17.04mmol，1.00当量)在DMF(68mL)中的搅拌混合物中分批添加K2CO3(4.71g，34.08mmol，2.00当量)。将所得混合物在室温下搅拌10min。在室温下向上述混合物中滴加MeI(3.7g，26.06mmol，1.53当量)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将所得混合物用水(132mL)稀释并用EtOAc(3x 150mL)萃取。将合并的有机层用水和盐水(150mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(1:1)洗脱，得到呈黄色油状物的N-{2-[2-(2-氯-4-硝基苯基)乙氧基]乙基}-N,4-二甲基苯磺酰胺(7.3g，粗品)。LCMS:(ES.m/z):413,415[M+1]+。
步骤8.
在室温下，向N-{2-[2-(2-氯-4-硝基苯基)乙氧基]乙基}-N,4-二甲基苯磺酰胺(7.3g，粗品)在EtOH(133mL)中的搅拌混合物中分批添加Fe(5.55g，99.30mmol)和在H2O(27mL)中的NH4Cl(3.19g，59.58mmol)。将所得混合物在80℃下搅拌4h。使混合物冷却至室温。LCMS指示反应完成。过滤所得混合物，用EtOH(3x20 mL)洗涤滤饼。将滤液减压浓缩。将残余物用硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(1:1)洗脱，得到呈黄色固体的N-{2-[2-(4-氨基-2-氯苯基)乙氧基]乙基}-N,4-二甲基苯磺酰胺(4.4g，57％，两步)。LCMS:(ES.m/z):382,384[M+1]+。
步骤9.
在室温下向3-[5-(氨基甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮(3.14g，11.49mmol，1.1当量)在DMF(48mL)中的搅拌混合物中分批添加CDI(1.86g，11.49mmol，1.1当量)并滴加TEA(1.06g，10.47mmol，1.00当量)。将所得混合物在室温下搅拌2h。LCMS指示反应完全转化为中间体(MS＝368)。在室温下经10min向上述混合物中分批添加N-{2-[2-(4-氨基-2-氯苯基)乙氧基]乙基}-N,4-二甲基苯磺酰胺(4.0g，10.44mmol，1当量)和DMAP(3.83g，31.34mmol，3当量)。将所得混合物在60℃下再搅拌过夜。LCMS指示反应完成。使反应混合物冷却至室温。将反应混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：C18柱；流动相，ACN的水溶液(0.10％FA)，45min内10％至60％梯度；检测器，UV 254/220nm。将收集的级分真空浓缩。这样产生呈黄色固体的1-(3-氯-4-{2-[2-(N-甲基4-甲基苯磺酰胺基)乙氧基]乙基}苯基)-3-{[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基}脲(化合物18-5，3.2g，45％)。LCMS:(ES,m/z):682,684[M+1]+。
步骤4.化合物18-6的合成
将1-(3-氯-4-{2-[2-(N-甲基4-甲基苯磺酰胺基)乙氧基]乙基}苯基)-3-{[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基}脲(化合物18-5，4.3g，6.30mmol，1当量)在HBr(30％的AcOH溶液，86mL)中的混合物在室温下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将所得混合物真空浓缩。将混合物用饱和NaHCO3(水溶液)碱化至pH 7。将混合物用DCM(3*50mL)萃取。将合并的有机层真空浓缩至干。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：C18柱；流动相，ACN的水溶液(0.1％FA)，40min内10％至50％梯度；检测器，UV 254nm。将收集的级分减压浓缩。这样产生呈黄色固体的1-(3-氯-4-{2-[2-(甲基氨基)乙氧基]乙基}苯基)-3-{[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基}脲(化合物18-6，2.5g，75％)。LCMS:(ES.m/z):528[M+1]+。
步骤5.化合物18-7的合成
在0℃下在氮气气氛下向1-(3-氯-4-{2-[2-(甲基氨基)乙氧基]乙基}苯基)-3-{[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基}脲(化合物18-6，700mg，1.32mmol，1当量)在THF(7mL)中的搅拌混合物中添加饱和NaHCO3至pH＝8～9。在0℃向上述混合物中分批添加Boc2O(450mg，2.06mmol，1.56当量)。将所得混合物在室温下再搅拌2h。LCMS指示反应完成。将混合物用DCM(3*50mL)萃取。将合并的有机层真空浓缩至干。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用CH2Cl2/MeOH(10:1)洗脱，得到呈白色固体的N-[2-(2-{2-氯-4-[({[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基}氨基甲酰基)氨基]苯基}乙氧基)乙基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(化合物18-6，402mg，48％)。LCMS:(ES.m/z):528[M+1-100]+,572[M+1-56]+。
步骤6.化合物18-8的合成
将N-[2-(2-{2-氯-4-[({[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基}氨基甲酰基)氨基]苯基}乙氧基)乙基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(化合物18-7，500mg，0.79mmol，1当量)和K2CO3(220.0mg，1.59mmol，2当量)在NMP(5mL)中的搅拌溶液在室温下在氮气气氛下搅拌30min。在0℃下向上述混合物中滴加N-[(氯甲基氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(328mg，1.59mmol，2当量)。将所得混合物在室温下再搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将反应混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.05％TFA)，40min内5％至80％梯度；检测器，UV 254nm。这样产生呈白色固体的粗产物(300mg)。将粗产物(300mg)通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XBridge ShieldRP18 OBD柱，30*150mm，5μm；流动相A：水(0.1％FA)，流动相B：ACN；流速：60mL/min；梯度：在10min内30％B至53％B，53％B；波长：254nm；RT1(min)：9.18；将收集的级分冻干，得到呈白色固体的N-(2-{2-[2-氯-4-({[(2-{2,6-二氧代-1-[(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)甲基]哌啶-3-基}-1-氧代-3H-异吲哚-5-基)甲基]氨基甲酰基}氨基)苯基]乙氧基}乙基)-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(化合物18-8，140mg，20％)。LCMS(ESI,ms):798[M+H]+。
步骤7.化合物18-9的合成
在0℃下在氮气气氛下向N-(2-{2-[2-氯-4-({[(2-{2,6-二氧代-1-[(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)甲基]哌啶-3-基}-1-氧代-3H-异吲哚-5-基)甲基]氨基甲酰基}氨基)苯基]乙氧基}乙基)-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(化合物18-8，500mg，0.62mmol，1.00当量)在THF(6mL)中的搅拌混合物中添加Pd(PPh3)4(72mg，0.06mmol，0.1当量)、苯基硅烷(135mg，1.25mmol，2当量)。将所得混合物在25℃下在氮气气氛下搅拌3h。LCMS指示反应完成。将反应混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，水(0.05％TFA)，ACN(30min内5％至50％梯度)；检测器，UV 254nm。这样产生呈黄色固体的N-(2-{2-[4-({[(2-{1-[(2-氨基乙酰胺基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基}-1-氧代-3H-异吲哚-5-基)甲基]氨基甲酰基}氨基)-2-氯苯基]乙氧基}乙基)-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(化合物18-7，400mg，89％)。LCMS(ES,m/z):714[M+H]+。
化合物18-10的合成
步骤4.
在0℃下向(2S)-2-[2-(2-氨基乙酰胺基)乙酰胺基]-3-苯基丙酸(1.00g，3.58mmol，1.00当量)和DIEA(0.66g，5.10mmol，1.50当量)在DMF(18mL)中的搅拌混合物中添加6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(1.10g，3.57mmol，1.11当量)。将所得混合物在25℃下搅拌2h。LCMS指示反应完成。将反应混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶(330g，20-40um)；流动相，水(含有0.1％FA)、ACN(30min内5％至50％梯度)；检测器，UV 254nm。这样产生呈白色固体的(2S)-2-(2-[2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基]乙酰胺基)-3-苯基丙酸(化合物18-10，500mg，29％)。LCMS(ES,m/z):473[M+H]+
步骤8.化合物18-11的合成
在0℃下在氮气气氛下向(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酸(化合物18-10，158mg，0.33mmol，1.20当量)和HATU(127mg，0.33mmol，1.2当量)在DMF(4mL)中的搅拌溶液中添加HOBT(37mg，0.28mmol，1当量)。将所得混合物在0℃下在氮气气氛下搅拌30min。在0℃下向上述混合物中添加N-(2-{2-[4-({[(2-{1-[(2-氨基乙酰胺基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基}-1-氧代-3H-异吲哚-5-基)甲基]氨基甲酰基}氨基)-2-氯苯基]乙氧基}乙基)-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(化合物18-9，200mg，0.28mmol，1当量)和DIEA(72mg，0.56mmol，2当量)。将所得混合物在℃下再搅拌2h。LCMS指示反应完成。将反应混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液，40min内5％至80％梯度；检测器，UV 254nm。将收集的级分冻干，得到呈黄色固体的N-{2-[2-(2-氯-4-{[({2-[1-({2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酰胺基}甲基)-2,6-二氧代哌啶-3-基]-1-氧代-3H-异吲哚-5-基}甲基)氨基甲酰基]氨基}苯基)乙氧基]乙基}-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(化合物18-8，175mg，53％)。LCMS(ESI,ms):1168[M+H]+。
步骤9.化合物(XVIII)的合成
在0℃下在氮气气氛下向N-{2-[2-(2-氯-4-{[({2-[1-({2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酰胺基}甲基)-2,6-二氧代哌啶-3-基]-1-氧代-3H-异吲哚-5-基}甲基)氨基甲酰基]氨基}苯基)乙氧基]乙基}-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(化合物18-11，70mg，0.06mmol，1当量)在DCM(700uL)中的搅拌溶液中滴加TFA(140uL)。将所得混合物在0℃下在氮气气氛下搅拌1h。LCMS指示完全反应。将所得混合物减压浓缩。将粗产物(50mg)通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XSelect CSH Prep C18OBD柱，19*250mm，5μm；流动相A：水(0.1％FA)，流动相B：ACN；流速：25mL/min；梯度：7min内19％B至49％B，49％B；波长：254nm；RT1(min)：5；将收集的级分冻干，得到呈白色固体的N-{[({[(1S)-1-({[({3-[5-({[(3-氯-4-{2-[2-(甲基氨基)乙氧基]乙基}苯基)氨基甲酰基]氨基}甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基}甲基)氨基甲酰基]甲基}氨基甲酰基)-2-苯基乙基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]甲基}-6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺(化合物(XVIII)，11.5mg，17％)。LCMS(ESI,ms):1068[M+H-FA]+1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.90(s,1H),8.40(br s,1H),8.22-8.18(m,1H),8.14-8.06(m,3H),7.99-7.95(m,1H),7-72-7.66(m,2H),7.49-7.42(m,2H),7.27-7.16(m,7H),6-99(s,2H),6.91(t,J＝5.7Hz,1H),5.21-5.14(m,2H),4.98-4.94(m,1H),4.48-4.39(m,5H),3.77-3.53(m,10H),3.09-3.01(m,5H),2.89(t,J＝7.2Hz,2H),2.78-2.73(m,2H),2.55-2.50(m,3H),2.37-2.26(m,2H),2.07-2.03(m,3H),1.50-1.43(m,4H),1.20-1.15(m,2H)。
方案18：化合物(XIX)的制备
步骤1.化合物19-3的合成
在0℃下向4-氟-3-硝基苯甲酸甲酯(10g，50.21mmol，1当量)和K2CO3(13.88g，100.43mmol，2当量)在DMF(160mL)中的搅拌混合物中滴加苄硫醇(12.47g，100.43mmol，2当量)。将所得混合物在25℃下搅拌3h。TLC指示反应完成。在0℃下通过添加水(450mL)淬灭反应。将沉淀的固体通过过滤收集并用水(3x 150mL)洗涤。通过用PE(300mL)研磨来纯化固体。这样产生呈黄色固体的4-(苄基硫烷基)-3-硝基苯甲酸甲酯(化合物19-3，10g，65％)。LCMS(ES,m/z)：304[M+H]+
步骤2.化合物19-4的合成
在0℃下向[4-(苄基硫烷基)-3-硝基苯基]甲醇(化合物19-3，10g，36.32mmol，1当量)在DCM(200mL)中的搅拌混合物中滴加HCl(200mL，4N)和NaClO(100mL,30％)。将所得混合物在0℃下搅拌1h。LCMS指示反应完成。将所得混合物用CH2Cl2(3x 20mL)萃取。将合并的有机层用盐水(300mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(1:4)洗脱，得到呈黄色固体的4-(氯磺酰基)-3-硝基苯甲酸甲酯(化合物19-4，8g，78％)。LCMS(ES,m/z):278[M-H]-
步骤3.化合物19-5的合成
在0℃下向4-(氯磺酰基)-3-硝基苯甲酸甲酯(化合物19-4，5g，17.87mmol，1当量)在THF(60mL)中的搅拌混合物中滴加CH3NH2(60mL，1N的THF溶液)。将所得混合物在25℃下搅拌3h。LCMS指示反应完成。将所得混合物减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(1:1)洗脱，得到呈黄色固体的4-(甲基氨磺酰基)-3-硝基苯甲酸甲酯(化合物19-5，2.5g，50％)。LCMS(ES,m/z):273[M-H]-
步骤4.化合物19-6的合成
在0℃下向4-(甲基氨磺酰基)-3-硝基苯甲酸甲酯(化合物19-5，600mg，2.18mmol，1当量)在DCM(15mL)中的搅拌混合物中滴加TMSCl(475mg，4.37mmol，2当量)。将所得混合物在25℃下搅拌3h。LCMS指示反应完成。将所得混合物减压浓缩。这样产生呈白色固体的4-[氯甲基(甲基)氨磺酰基]-3-硝基苯甲酸甲酯(化合物19-6，600mg，84％)。粗产物不经进一步纯化即用于下一步。LCMS(ES,m/z):341[M+Na]+,(MeOH衍生物)。
步骤5.化合物19-8的合成
在0℃下向N-[2-(2-{2-氯-4-[({[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基}氨基甲酰基)氨基]苯基}乙氧基)乙基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(化合物19-7，如针对化合物11-2所述制备，583mg，0.92mmol，1当量)和Cs2CO3(302mg，0.92mmol，1当量)在DMF(15mL)中的搅拌混合物中添加4-[氯甲基(甲基)氨磺酰基]-3-硝基苯甲酸甲酯(600mg，1.85mmol，2当量)。将所得混合物在0℃下搅拌0.5h。LCMS指示反应完成。将反应混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，水(0.05％TFA)，ACN(30min内5％至100％梯度)；检测器，UV 254nm。这样产生呈白色固体的4-{[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(叔丁氧羰基)(甲基)氨基]乙氧基}乙基)-3-氯苯基]氨基甲酰基}氨基)甲基]-1-氧代-3H-异吲哚-2-基}-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲基](甲基)氨磺酰基}-3-硝基苯甲酸甲酯(化合物19-8，250mg，26％)。LCMS(ES,m/z):814[M+H-Boc]+
步骤6.化合物19-9的合成
在室温下向4-{[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(叔丁氧羰基)(甲基)氨基]乙氧基}乙基)-3-氯苯基]氨基甲酰基}氨基)甲基]-1-氧代-3H-异吲哚-2-基}-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲基](甲基)氨磺酰基}-3-硝基苯甲酸甲酯(化合物19-8，200mg，0.21mmol，1当量)在THF(0.8mL)中的搅拌混合物中添加HCl(6N，0.8mL)。将所得混合物在室温下搅拌16h。LCMS指示反应完成。将混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，水(0.05％TFA)、ACN(30min内5％至50％梯度)；检测器，UV 254nm。这样产生呈白色固体的4-[({3-[5-({[(3-氯-4-{2-[2-(甲基氨基)乙氧基]乙基}苯基)氨基甲酰基]氨基}甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基}甲基)(甲基)氨磺酰基]-3-硝基苯甲酸(化合物19-9，60mg，30％)。LCMS(ES,m/z):800[M+H]+
步骤7.化合物(XIX)的合成
在0℃下向4-[({3-[5-({[(3-氯-4-{2-[2-(甲基氨基)乙氧基]乙基}苯基)氨基甲酰基]氨基}甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基}甲基)(甲基)氨磺酰基]-3-硝基苯甲酸(55mg，0.069mmol，1当量)、1-(2-氨基乙基)吡咯-2,5-二酮(10mg，0.076mmol，1.1当量)和DIEA(26mg，0.20mmol，3当量)在DMF(0.5mL)中的搅拌混合物中添加HATU(31mg，0.083mmol，1.2当量)。将所得混合物在25℃下搅拌4h。LCMS指示反应完成。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，水(0.05％TFA)、ACN(30min内5％至50％梯度)；检测器，UV 254nm。将粗产物通过制备型HPLC用以下条件进行纯化：柱：Xselect CSH F-Phenyl OBD柱，19x 250mm，5μm；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：25mL/min；梯度：8min内21％B至41％B，41％B；波长：254nm；RT1(min)：7.27；将收集的级分冻干，得到呈白色固体的4-[({3-[5-({[(3-氯-4-{2-[2-(甲基氨基)乙氧基]乙基}苯基)氨基甲酰基]氨基}甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基}甲基)(甲基)氨磺酰基]-N-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙基]-3-硝基苯甲酰胺；三氟乙酸(化合物(XIX)，4.3mg，5％)。LCMS(ES,m/z):922[M+H]+.1H-NMR(CD3OD,400MHz)(ppm):8.27-7.88(m,3H),7.82-7.46(m,4H),7.23(d,J＝1.2Hz,2H),6.79(s,2H),5.47-5.25(m,2H),5.15-5.10(m,1H),4.63-4.28(m,4H),3.80-3.70(m,6H),3.65-3.54(m,2H),3.25-3.15(m,2H),3.09(d,J＝2.4Hz,3H),3.04-2.96(m,2H),2.96-2.86(m,2H),2.71(s,3H),2.48-2.26(m,1H),2.24-2.03(m,1H)。
方案19：化合物(XL)的制备
步骤1.化合物40-2的合成
在0℃下在氮气气氛下向(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)乙酸甲酯(化合物40-1，400mg，1.73mmol，1当量)在DCM(8mL)中的搅拌溶液中分批添加TMSCl(755mg，6.94mmol，4当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌2h。LCMS指示反应完成。将所得混合物减压浓缩。粗产物混合物不经进一步纯化直接用于下一步。LCMS(ES,m/z):203[M+H]+(用甲醇衍生)。
步骤2.化合物40-4的合成
在0℃下在氮气气氛下向N'-[4-(2,4-二氟苯氧基)-3-{6-甲基-7-氧代-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-4-基}苯基]-N-(4-{[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚-4-基]氨基}丁基)己二酰二胺(化合物40-3，根据https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2021.105238中描述的程序制备，300mg，0.36mmol，1当量)和K2CO3(151mg，1.09mmol，3当量)在DMF(7mL)中的搅拌混合物滴加N-[(甲氧基甲基氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(147mg，0.73mmol，2当量)。将所得混合物在60℃下在氮气气氛下搅拌2h。LCMS指示反应完成。将反应混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.05％TFA)，30min内10％至50％梯度；检测器，UV 254nm。这样产生呈黄色固体的N-[({[3-(4-{[4-(5-{[4-(2,4-二氟苯氧基)-3-{6-甲基-7-氧代-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-4-基}苯基]氨基甲酰基}戊酰胺基)丁基]氨基}-1,3-二氧代异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物40-4，200mg，56％)。LCMS(ES,m/z):992[M+H]+
步骤3.化合物40-5的合成
在室温下在氮气气氛下，向N-[({[3-(4-{[4-(5-{[4-(2,4-二氟苯氧基)-3-{6-甲基-7-氧代-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-4-基}苯基]氨基甲酰基}戊酰胺基)丁基]氨基}-1,3-二氧代异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物40-4，100mg，0.10mmol，1当量)和Pd(PPh3)4(11mg，0.01mmol，0.1当量)在THF(1mL)中的搅拌混合物中分批添加苯基硅烷(21mg，0.20mmol，2当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌2h。LCMS指示反应完成。将所得混合物减压浓缩。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.05％TFA)，30min内10％至50％梯度；检测器，UV 254nm。这样产生呈黄色固体的N-{4-[(2-{1-[(2-氨基乙酰胺基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基}-1,3-二氧代异吲哚-4-基)氨基]丁基}-N'-[4-(2,4-二氟苯氧基)-3-{6-甲基-7-氧代-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-4-基}苯基]己二酰二胺(80mg，87％)。LCMS(ES,m/z):930[M+Na]+
步骤4.化合物(XL)的合成
在0℃下在氮气气氛下向(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酸(化合物40-6，如化合物18-10中所述那样制备，18mg，0.040mmol，1.2当量)在DMF(0.4mL)中的搅拌溶液中滴加HATU(15mg，0.04mmol，1.2当量)。在室温下向上述混合物中滴加N-{4-[(2-{1-[(2-氨基乙酰胺基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基}-1,3-二氧代异吲哚-4-基)氨基]丁基}-N'-[4-(2,4-二氟苯氧基)-3-{6-甲基-7-氧代-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-4-基}苯基]己二酰二胺(化合物40-5，30mg，0.033mmol，1当量)和DIEA(13mg，0.10mmol，3当量)。将所得混合物在室温下再搅拌2h。LCMS指示反应完成。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.05％TFA)，30min内10％至50％梯度；检测器，UV 254nm。这样产生呈黄色固体的N'-[4-(2,4-二氟苯氧基)-3-{6-甲基-7-氧代-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-4-基}苯基]-N-[4-({2-[1-({2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酰胺基}甲基)-2,6-二氧代哌啶-3-基]-1,3-二氧代异吲哚-4-基}氨基)丁基]己二酰二胺；三氟乙酸(3.5mg，7％)。LCMS(ES,m/z):682[M/2]+,1362[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.04(s,1H),9.98(s,1H),8.24-8.11(m,2H),8.09-7.99(m,2H),7.97-7.83(m,1H),7.83-7.79(m,2H),7.58-7.52(m,2H),7.35-7.30(m,1H),7.29-7.28(m,2H),7.25-7.19(m,4H),7.18-7.18(m,1H),7.17-7.15(m,1H),7.10-7.03(m,4H),6.99-6.90(m,1H),6.55(s,1H),6.26(s,1H),5.13-5.03(m,3H),4.49-4.45(m,1H),3.76-3.65(m,5H),3.29-3.20(m,5H),3.07-2.97(m,5H),2.80-2.74(m,2H),2.33-2.27(m,3H),2.12-2.06(m,6H),1.53-1.44(m,12H),1.23-1.16(m,3H)
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方案20：化合物(XLI)的制备
步骤1.化合物41-1的合成
在室温下在氮气气氛下，向3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(5.0g，18.78mmol，1.0当量)在DMSO(50mL)中的搅拌溶液中分批添加β-丙氨酸(化合物41-17，2.01g，22.53mmol，1.2当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌6h。LCMS指示反应完成。将反应混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.1％FA)，30min内0％至10％梯度；检测器，UV 220nm。将收集的级分冻干，得到呈白色固体的3-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰胺基]丙酸(化合物41-1，3.0g，61％)。LCMS:(ES,m/s):241[M+H]+,263[M+Na]+。
化合物41-2的合成
在室温下在N2气氛下向4-甲酰基-2-硝基酚(4.21g，25.19mmol，1.00当量)和Ag2O(7.00g，30.20mmol，1.20当量)在ACN(100mL，190.24mmol，75.00当量)中的搅拌溶液中分批添加(2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-三(乙酰基氧基)-6-溴噁烷-2-甲酸甲酯(10.00g，25.17mmol，1.00当量)。将所得混合物在室温下在N2气氛下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将所得混合物过滤，将滤饼用DCM(50mlx3)洗涤。将滤液减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(PE:EA＝1:2)洗脱，得到呈白色固体的(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三(乙酰基氧基)-6-(4-甲酰基-2-硝基苯氧基)噁烷-2-甲酸甲酯(化合物41-2，10.5g，86％)。H-NMR分析指示其为期望的产物。LCMS(ES,m/z):484[M+1]+.1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ10.00(s,1H),8.34(s,1H),8.13-8.09(m,1H),7.52(d,J＝3.0Hz,1H),5.47-5.29(m,4H),
步骤2.化合物41-3的合成
在室温下在N2气氛下向(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三(乙酰基氧基)-6-(4-甲酰基-2-硝基苯氧基)噁烷-2-甲酸甲酯(化合物41-2，54.6g，112.95mmol，1.00当量)于MeOH(800mL)中的搅拌溶液中分批添加NaBH4(3.4g，90.36mmol，0.80当量)。将所得混合物在室温下在N2气氛下搅拌2h。LCMS指示反应完成。在室温下用HCl(0.02mol/L)淬灭反应。将所得混合物用CH2Cl2(3x 300mL)萃取。将所得混合物真空浓缩，得到呈绿色固体的(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三(乙酰基氧基)-6-[4-(羟甲基)-2-硝基苯氧基]噁烷-2-甲酸甲酯(化合物41-3，44g，64％)。LCMS(ES,m/z):486[M+H]+,508[M+Na]+。
步骤3.化合物41-4的合成
在室温下在N2气氛下向(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三(乙酰氧基)-6-[4-(羟甲基)-2-硝基苯氧基]噁烷-2-甲酸甲酯(化合物41-3，28g，57.68mmol，1.00当量)在DMF(300mL)中的搅拌溶液中分批添加咪唑(5.89g，86.52mmol，1.50当量)和TBDMS-Cl(13.04g，86.52mmol，1.50当量)。将所得混合物在室温下在N2气氛下搅拌4h。LCMS指示反应完成。将反应在室温下用水淬灭。将所得混合物用CH2Cl2(3x300mL)萃取。将合并的有机物真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(1:1)洗脱，得到呈白色固体的(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三(乙酰氧基)-6-(4-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}-2-硝基苯氧基)噁烷-2-甲酸甲酯(30g，80％)。LCMS(ES,m/z):600[M+H]+,622[M+Na]+；1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):7.80(d,J＝9Hz,1H),7.65-7.61(m,1H),7.42(d,J＝9Hz,1H),5.72(d,J＝9Hz,1H),5.47(t,J＝9Hz,1H),5.15-5.05(m,2H),4.74(d,J＝4.5Hz,3H),3.65(s,3H),2.02(t,J＝9Hz,9H),0.91(t,J＝9Hz,9H),0.09(s,6H)。
步骤4.化合物41-5的合成
在室温下在N2气氛下，向(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三(乙酰氧基)-6-(4-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}-2-硝基苯氧基)噁烷-2-甲酸甲酯(化合物41-4，30g，50.02mmol，1.00当量)在MeOH(600mL)中的搅拌溶液中分批添加NaOMe(16.19g，299.68mmol，6.0当量)。将所得混合物在室温下在N2气氛下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将所得混合物真空浓缩。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.1％FA)，30min内0％至10％梯度；检测器，UV 220nm。将收集的级分真空浓缩，得到呈黄色固体的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}-2-硝基苯氧基)-3,4,5-三羟基噁烷-2-甲酸(化合物41-5，28g，92％)。LCMS(ES,m/z):477[M+H2O]+,482[M+Na]+。
步骤5.化合物41-6的合成
在室温下在N2气氛下向(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}-2-硝基苯氧基)-3,4,5-三羟基噁烷-2-甲酸(化合物41-5，28g，46.30mmol，1.00当量，76％)在DMF(300mL)中的搅拌溶液中分批添加DBU(14.10g，92.61mmol，2.00当量)和烯丙基溴(16.8g，138.92mmol，3.00当量)。将所得混合物在40℃下在N2气氛下搅拌过夜。可以通过LCMS检测所需产物。将所得混合物真空浓缩。将反应在室温下用水淬灭。将所得混合物用CH2Cl2(3x 200ml)萃取。将合并的有机层减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用CH2Cl2/MeOH(9:1)洗脱，得到呈浅红色油状物的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}-2-硝基苯氧基)-3,4,5-三羟基噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(19g，41％)。LCMS(ES,m/z):517[M+H2O]+,522[M+Na]+。
步骤6.化合物41-7的合成
在室温下在氮气气氛下向(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}-2-硝基苯氧基)-3,4,5-三羟基噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物41-6，19g，38.03mmol，1.00当量)在吡啶(300mL)中的搅拌溶液中分批添加氯甲酸烯丙酯(137.47g，1140.55mmol，29.99当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌4h。通过LCMS可检测到约60％的期望产物。将反应在室温下用水淬灭。将所得混合物用CH2Cl2(3x100mL)萃取。将合并的有机层洗涤并减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(3:1)洗脱，得到呈浅红色油状物的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}-2-硝基苯氧基)-3,4,5-三({[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氧基})噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物41-7，13.9g，43％)。LCMS:(ES,m/s):769[M+H2O]+,774[M+Na]+。
步骤7.化合物41-8的合成
在室温下在氮气气氛下向(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}-2-硝基苯氧基)-3,4,5-三({[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氧基})噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物41-7，13.9g，18.48mmol，1.00当量)在THF(280mL)中的搅拌溶液中分批添加HF-吡啶(65mL，65％)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌2h。LCMS指示反应完成。将反应在室温下用水淬灭。将所得混合物用CH2Cl2(3x 500mL)萃取。将混合物减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(2:3)洗脱，得到呈浅黄色油状物的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[4-(羟甲基)-2-硝基苯氧基]-3,4,5-三({[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氧基})噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物41-8，10.5g，80％)。LCMS:(ES,m/s):655[M+H2O]+,660[M+Na]+。
步骤8.化合物41-9的合成
在室温下在氮气气氛下向(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[4-(羟甲基)-2-硝基苯氧基]-3,4,5-三({[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氧基})噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(10.5g，16.46mmol，1.00当量)在DMF(100mL)中的搅拌溶液中分批添加碳酸双(4-硝基苯基)酯(7.52g，24.71mmol，1.50当量)和DIEA(6.39g，49.44mmol，3.00当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌6h。LCMS指示反应完成。将反应在室温下用水淬灭。将所得混合物用CH2Cl2(3x 500mL)萃取。将合并的有机层减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(3:2)洗脱，得到呈浅黄色半固体的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-硝基-4-{[(4-硝基苯氧基羰基)氧基]甲基}苯氧基)-3,4,5-三({[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氧基})噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(10.6g，74％)。LCMS:(ES,m/s):820[M+H2O]+,825[M+Na]+。
步骤9.化合物41-10的合成
在0℃下在氮气气氛下向(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-硝基-4-{[(4-硝基苯氧基羰基)氧基]甲基}苯氧基)-3,4,5-三({[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氧基})噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物41-9，1g，1.24mmol，1.0当量)在DMF(1.0mL)中的搅拌溶液中分批添加DIEA(0.48g，3.73mmol，3.0当量)和甲胺盐酸盐(0.12g，1.86mmol，1.5当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌30min。LCMS指示反应完成。将反应混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.1％FA)，30min内10％至70％梯度；检测器，UV 220nm。将所得混合物用CH2Cl2(3x 200mL)萃取。将合并的有机层减压浓缩，得到呈半固体的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(甲基氨基甲酰基)氧基]甲基}-2-硝基苯氧基)-3,4,5-三({[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氧基})噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物41-10，900mg，95％)。LCMS:(ES,m/s):712[M+H2O]+,717[M+Na]+。
步骤10.化合物41-11的合成
在室温下在氮气气氛下向(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(甲基氨基甲酰基)氧基]甲基}-2-硝基苯氧基)-3,4,5-三({[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氧基})噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物41-10，500mg，0.72mmol，1.0当量)在DCM(10mL)中的搅拌溶液中分批添加多聚甲醛(129mg，1.44mmol，2.00当量)和TMSCl(234mg，2.16mmol，3.00当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌1h。LCMS指示反应完成(用MeOH衍生)。将所得混合物真空浓缩，得到呈粗产物的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[4-({[氯甲基(甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)-2-硝基苯氧基]-3,4,5-三({[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氧基})噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物41-11，500mg，93％)。粗产物不经进一步纯化直接用于下一步。LCMS:(ES,m/s):756[M+H2O]+,761[M+Na]+(用MeOH衍生)
步骤11.化合物41-12的合成
在0℃下在氮气气氛下，向N-[2-(2-{2-氯-4-[({[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基}氨基甲酰基)氨基]苯基}乙氧基)乙基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(化合物41-11，338mg，0.53mmol，1.0当量)和Cs2CO3(175mg，0.53mmol，1.0当量)在DMF(6.0mL)中的搅拌溶液。在0℃下经30min向上述混合物中分批添加(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[4-({[氯甲基(甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)-2-硝基苯氧基]-3,4,5-三({[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氧基})噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(400mg，0.53mmol，1.0当量)。将所得混合物在0℃下在氮气气氛下搅拌30min。LCMS指示反应完成。将反应混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.1％FA)，30min内10％至100％梯度；检测器，UV 254nm。将所得混合物真空浓缩，得到呈固体的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(叔丁氧羰基)(甲基)氨基]乙氧基}乙基)-3-氯苯基]氨基甲酰基}氨基)甲基]-1-氧代-3H-异吲哚-2-基}-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]-2-硝基苯氧基}-3,4,5-三({[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氧基})噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物41-12，310mg，38％)。LCMS:(ES,m/s):1334[M+H]+,1234[M+H-100]+。
步骤12.化合物41-13的合成
在室温下在氮气气氛下向(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(叔丁氧羰基)(甲基)氨基]乙氧基}乙基)-3-氯苯基]氨基甲酰基}氨基)甲基]-1-氧代-3H-异吲哚-2-基}-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]-2-硝基苯氧基}-3,4,5-三({[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氧基})噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物41-12，430mg，0.32mmol，1.0当量)在甲醇(8.0mL)中的搅拌溶液中分批添加AcOH(8.0mL)和Zn(210mg，3.22mmol，10.00当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将所得混合物真空浓缩。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.05％TFA)，30min内10％至80％梯度；检测器，UV254nm。将收集的级分冻干，得到呈绿色固体的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{2-氨基-4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(叔丁氧羰基)(甲基)氨基]乙氧基}乙基)-3-氯苯基]氨基甲酰基}氨基)甲基]-1-氧代-3H-异吲哚-2-基}-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯氧基}-3,4,5-三({[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氧基})噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物41-13，360mg，77％)。LCMS:(ES,m/s):1304[M+H]+,653[M/2+H]+,1326[M+Na]+。
步骤13.化合物41-14的合成
在室温下在氮气气氛下，向3-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰胺基]丙酸(化合物41-13，110mg，0.46mmol，1.5当量)和HATU(175mg，0.46mmol，1.5当量)在DMF(6.0mL)中的搅拌溶液中分批添加(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-氨基-4-{[({[3-(5-{[({3-氯-4-[2-(2-{甲基[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙氧基)乙基]苯基}氨基甲酰基)氨基]甲基}-1-氧代-3H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基}(甲基)氨基甲酰基)氧基]甲基}苯氧基)-3,4,5-三({[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氧基})噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(750mg，0.58mmol，1.0当量)和DIEA(118mg，0.92mmol，3.0当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将反应混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.05％TFA)，30min内10％至70％梯度；检测器，UV254nm和220nm。将所得混合物冻干，得到呈白色固体的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(叔丁氧羰基)(甲基)氨基]乙氧基}乙基)-3-氯苯基]氨基甲酰基}氨基)甲基]-1-氧代-3H-异吲哚-2-基}-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]-2-{3-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰胺基]丙酰胺基}苯氧基}-3,4,5-三({[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氧基})噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物41-14，300mg，57％)。LCMS:(ES,m/s):1527[M+H]+,1427[M+H-100]+,1549[M+Na]+。
步骤14.化合物41-15的合成
在室温下在氮气气氛下向(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(叔丁氧羰基)(甲基)氨基]乙氧基}乙基)-3-氯苯基]氨基甲酰基}氨基)甲基]-1-氧代-3H-异吲哚-2-基}-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]-2-{3-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰胺基]丙酰胺基}苯氧基}-3,4,5-三({[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氧基})噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物41-14，200mg,0.13mmol，1.0当量)在THF(20mL)中的搅拌溶液中分批添加TEA(53mg，0.52mmol，4.0当量)、甲酸(18mg，0.39mmol，3.00当量)、Pd(PPh3)4(60mg，0.05mmol，0.4当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌4h。LCMS指示反应完成。将所得混合物真空浓缩。粗产物不经进一步纯化直接用于下一步。LCMS:(ES,m/s):1134[M+H-100]+,1234[M+H]+,1256[M+Na]+。
步骤15.化合物(XLI)的合成
在0℃下在氮气气氛下向(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(叔丁氧羰基)(甲基)氨基]乙氧基}乙基)-3-氯苯基]氨基甲酰基}氨基)甲基]-1-氧代-3H-异吲哚-2-基}-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲基](甲基)氨基甲酰基}氧基)甲基]-2-{3-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰胺基]丙酰胺基}苯氧基}-3,4,5-三羟基噁烷-2-甲酸(200mg，0.16mmol，1.0当量)在DCM(5.0mL)中的搅拌溶液中滴加TFA(1.0mL)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌2h。LCMS指示反应完成。将反应混合物真空浓缩至干。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.1％FA)，30min内0％至50％梯度；检测器，UV 254nm。将收集的级分冻干至干，得到粗产物。将粗产物通过制备型HPLC用以下条件进行再纯化：柱：XBridge Prep OBD C18柱，19*250mm，5μm；流动相A：水(0.1％FA)，流动相B：ACN；流速：25mL/min；梯度：7min内24％B至44％B，44％B；波长：254nm；RT1(min)：4.63；将收集的级分冻干，得到呈白色固体的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[4-({[({3-[5-({[(3-氯-4-{2-[2-(甲基氨基)乙氧基]乙基}苯基)氨基甲酰基]氨基}甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基}甲基)(甲基)氨基甲酰基]氧基}甲基)-2-{3-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰胺基]丙酰胺基}苯氧基]-3,4,5-三羟基噁烷-2-甲酸(化合物(LXI)，7.3mg，3％)。LCMS:(ES,m/s):1134[M+H]+,568[M/2+H]+；1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.7-10.5(m,1H),9.17(s,1H),8.90-8.30(m,1H),8.15-8.10(m,2H),7.73-7.68(m,2H),7.65-7.40(m,2H),7.35-7.00(m,4H),6.97(s,2H),5.78(br s,1H),5.40-4.75(m,6H),4.70-4.00(m,5H),3.61-3.48(m,8H),3.25-3.20(m,3H),3.06-3.00(m,3H),2.97-2.70(m,7H),2.58(s,3H),2.40-2.20(m,3H),2.08-1.88(m,1H)。
/>
/>
方案21：化合物(XLII)的制备
步骤1.化合物42-2的合成
在0℃下向6-羟基-3,4-二氢-2H-萘-1-酮(化合物42-1，30g，184.97mmol，1当量)和2,2,2-三氯乙脒酸叔丁酯(40.42g，184.97mmol，1当量)在DCM(1L)中的搅拌混合物中分批添加PPTS(4.65g，18.50mmol，0.1当量)。将所得混合物在25℃下搅拌72h。LCMS指示反应完成。将所得混合物减压浓缩并将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(1:1)洗脱，得到呈黄色油状物的6-(叔丁氧基)-3,4-二氢-2H-萘-1-酮(化合物42-2，9g，22％)。LCMS(ES,m/z):219[M+H]+。
步骤2.化合物42-3的合成
在-78℃下在氮气气氛下向6-(叔丁氧基)-3,4-二氢-2H-萘-1-酮(化合物42-2，10g，45.81mmol，1当量)在THF(150mL)中的搅拌混合物中滴加LDA(9mL，1.5当量，68.71mmol，2.0M的THF溶液)。将所得混合物在-78℃下在氮气气氛下搅拌1h。在-78℃下向上述混合物中添加1,1,1-三氟-N-苯基-N-三氟甲烷磺酰基甲磺酰胺(19.6g，54.87mmol，1.20当量)。将所得混合物在25℃下再搅拌16h。LCMS指示反应完成。将所得混合物在室温下通过添加饱和NH4Cl(水溶液)淬灭并用EtOAc(3x 200mL)萃取。将合并的有机层用盐水(200mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(5:1)洗脱，得到呈黄色油状物的6-(叔丁氧基)-3,4-二氢萘-1-基三氟甲磺酸盐(化合物42-3，9.0g，56％)。LCMS:(ES.m/z):351[M+H]+；1H-NMR(300MHz,CDCl3):7.45(d,J＝8.4Hz,1H),6.91-6.86(m,1H),6.71-6.66(m,1H),5.94(t,J＝4.8Hz,1H),2.86-2.81(m,2H),2.54-2.48(m,2H),1.38(s,9H)。
步骤3.化合物42-4的合成
将6-(叔丁氧基)-3,4-二氢萘-1-基三氟甲磺酸盐(化合物42-3，16g，45.67mmol，1当量)、4-羟苯基硼酸酸(7.56g，54.80mmol，1.2当量)、K2CO3(12.62g，91.34mmol，2当量)和Pd(dppf)Cl2(3.34g，4.57mmol，0.1当量)在二噁烷(250mL)和H2O(50mL)中的混合物在100℃在氮气气氛下搅拌4h。LCMS指示反应完成。使混合物冷却至室温。将所得混合物用水(200mL)淬灭并用EtOAc(3x 200mL)萃取。将合并的有机层用盐水(200mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(3:1)洗脱，得到呈黄色固体的4-[6-(叔丁氧基)-3,4-二氢萘-1-基]苯酚(化合物42-4，11g，82％)。LCMS(ES,m/z):295[M+H]+；1H-NMR(400MHz,CDCl3):7.27-7.16(m,2H),7.00-6.92(m,1H),6.91-6.83(m,3H),6.76-6.74(m,1H),5.97(t,J＝4.8Hz,1H),2.82-2.80(m,2H),2.39-2.35(m,2H),1.40(s,9H)。
步骤4.化合物42-5的合成
在室温下向4-[6-(叔丁氧基)-3,4-二氢萘-1-基]苯酚(化合物42-4，11g，37.36mmol，1当量)在ACN(250mL)中的搅拌混合物中添加NBS(5.99g，33.63mmol，0.9当量)。将反应物在25℃下搅拌1.5h。LCMS指示反应完成。将所得混合物减压浓缩。将残余物用硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(3:1)洗脱，得到呈黄色油状物的4-[2-溴-6-(叔丁氧基)-3,4-二氢萘-1-基]苯酚(化合物42-5，9g，64％)。LCMS(ES,m/z):373[M+H]+；1H-NMR(400MHz,CDCl3):7.21-7.00(m,2H),6.98-6.87(m,2H),6.85-6.74(m,1H),6.68-6.64(m,1H),6.59(d,J＝8.4Hz,1H),3.08-2.82(m,4H),1.37(s,9H)。
步骤5.化合物42-6的制备
将4-[2-溴-6-(叔丁氧基)-3,4-二氢萘-1-基]苯酚(化合物42-5，9g，24.11mmol，1当量)、苯基硼酸(3.09g，25.32mmol，1.05当量)、K2CO3(6.66g，48.22mmol，2当量)和Pd(dppf)Cl2(1.76g，2.41mmol，0.1当量)在二噁烷(100mL)和H2O(20mL)中的混合物在100℃下在氮气气氛下搅拌12h。LCMS指示反应完成。使混合物冷却至室温并用EtOAc(3x 100mL)萃取。将合并的有机层用盐水(60mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(3:1)洗脱，得到呈黄色油状物的4-[6-(叔丁氧基)-2-苯基-3,4-二氢萘-1-基]苯酚(化合物42-6，6g，67％)。LCMS(ES,m/z):371[M+H]+；1H-NMR(400MHz,CDCl3):7.24-7.15(m,2H),7.10-7.01(m,3H),6.98-6.92(m,2H),6.87-6.85(m,1H),6.76-6.68(m,4H),2.95-2.91(m,2H),2.83-2.80(m,2H),1.39(s,9H)。
步骤6.化合物42-7的制备
在氮气气氛下在500mL圆底烧瓶中向4-[6-(叔丁氧基)-2-苯基-3,4-二氢萘-1-基]苯酚(化合物42-6，6g，16.20mmol，1当量)在MeOH(200mL)中的溶液中添加Pd(OH)2/C(20％，1.8g)。使用氢气球在氢气气氛下将混合物在室温下氢化16h。LCMS指示反应完成。将混合物通过硅藻土(CeliteTM)垫过滤并减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(1:1)洗脱，得到呈黄色固体的4-[6-(叔丁氧基)-2-苯基-1,2,3,4-四氢萘-1-基]苯酚(化合物42-7，4g，66％)。LCMS(ES,m/z):371[M-H]-。
步骤7.化合物42-7a和42-7b的制备
通过SFC-HPLC用以下条件分离4-[6-(叔丁氧基)-2-苯基-1,2,3,4-四氢萘-1-基]苯酚(化合物42-7，3.5g)：柱：CHIRALPAK IG，3*25cm，5μm；流动相A：CO2，流动相B：MEOH(0.1％2M NH3-MEOH)；流速：70mL/min；梯度：等度35％B；柱温(℃)：35；背压(巴)：100；波长：220nm；RT1(min)：3.08；RT2(min)：3.94；样品溶剂：MeOH:DCM＝1:2；进样量：1.8mL；将第二洗脱异构体(RT2＝3.94min)浓缩至干，得到4-[(1R,2S)-6-(叔丁氧基)-2-苯基-1,2,3,4-四氢萘-1-基]苯酚(化合物42-7b，1.5g)。LCMS(ES,m/z):371[M-H]-；1H-NMR(300MHz,CDCl3):7.15-7.10(m,3H),6.89-6.67(m,5H),6.43-6.30(m,2H),6.28-6.15(m,2H),4.24-4.20(m,1H),3.36-3.34(m,1H),3.05-3.01(m,2H),2.28-2.05(m,1H),1.93-1.73(m,1H),1.37(s,9H)。
步骤8.化合物42-8的制备
将4-[(1R,2S)-6-(叔丁氧基)-2-苯基-1,2,3,4-四氢萘-1-基]苯酚(化合物42-7，1.8g，4.83mmol，1当量)和全氟丁烷磺酰氟(1.46g，4.83mmol，1.00当量)在ACN(10mL)和THF(10mL)中的混合物在室温下在氮气气氛下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将所得混合物真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(10:1)洗脱，得到呈无色油状物的1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟丁烷-1-磺酸4-[(1R,2S)-6-(叔丁氧基)-2-苯基-1,2,3,4-四氢萘-1-基]苯酯(化合物42-8，2.1g，59％)。LCMS:(ES,m/z):655[M+H]+；1H-NMR(400MHz,CDCl3):7.18-7.10(m,3H),6.97-6.87(m,3H),6.85-6.74(m,4H),6.54-6.37(m,2H),4.35-4.31(m,1H),3.49-3.45(m,1H),3.19-2.98(m,2H),2.21-2.09(m,1H),1.96-1.84(m,1H),1.40(s,9H)。
步骤9.化合物42-10的制备
在室温下在氮气气氛下，向4-甲酰基哌啶-1-甲酸苄酯(化合物42-9，10g，40.43mmol，1.0当量)在MeOH(20mL)中的搅拌溶液中分批添加在DCM＝2.2mL中的TiCl4(0.38g，2.02mmol，0.05当量)。在室温下经30min向上述混合物中分批添加TEA(0.41g，4.04mmol，0.1当量)。将所得混合物在室温下再搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将所得混合物真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(1:1)洗脱，得到呈油状物的4-(二甲氧基甲基)哌啶-1-甲酸苄酯(化合物42-10，11g，83％)。LCMS:(ES,m/z):294[M+H]+；1H-NMR(300MHz,CDCl3):7.47-7.26(m,5H),5.14(s,2H),1.20-4.16(m,2H),4.04(d,J＝6.6Hz,1H),3.37(s,6H),2.756-2.73(m,2H),1.85-1.66(m,3H),1.41-1.04(m,2H)。
步骤10.化合物42-11的制备
在室温下在氢气气氛下，向4-(二甲氧基甲基)哌啶-1-甲酸苄酯(化合物42-10，10g，34.08mmol，1.0当量)在MeOH(100mL)中的搅拌溶液中分批添加Pd(OH)2/C(0.96g，20％)。将所得混合物在室温下在氢气气氛下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将所得混合物过滤，将滤饼用MeOH(2x 5mL)洗涤。减压浓缩滤液，得到呈无色油状物的4-(二甲氧基甲基)哌啶(5.6g，100％)。粗产物不经进一步纯化直接用于下一步。LCMS:(ES,m/z):160[M+H]+；1H-NMR(300MHz,CDCl3):4.13-3.88(m,3H),3.35(s,6H),3.19-3.16(m,2H),2.63-2.60(m,2H),1.76-1.73(m,3H),1.47-1.12(m,2H)。
步骤11.化合物42-12的制备
在室温下在氮气气氛下，向1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟丁烷-1-磺酸4-[(1R,2S)-6-(叔丁氧基)-2-苯基-1,2,3,4-四氢萘-1-基]苯酯(化合物42-8，500mg，0.76mmol，1当量)和4-(二甲氧基甲基)哌啶(化合物42-11，175mg，1.10mmol，1.44当量)在甲苯(5mL)中的搅拌混合物中分批添加Xphos(76mg，0.16mmol，0.21当量)和Pd(OAc)2(26mg，0.11mmol，0.15当量)。将所得混合物在90℃下在氮气气氛下搅拌过夜。通过LCMS检测到30％的期望产物。使混合物冷却至室温。将所得混合物减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(8:1)洗脱，得到呈黄色固体的1-{4-[(1R,2S)-6-(叔丁氧基)-2-苯基-1,2,3,4-四氢萘-1-基]苯基}-4-(二甲氧基甲基)哌啶(化合物42-12，300mg，76％)。LCMS:(ES,m/z):514[M+H]+
步骤12.化合物42-13的制备
将1-{4-[(1R,2S)-6-(叔丁氧基)-2-苯基-1,2,3,4-四氢萘-1-基]苯基}-4-(二甲氧基甲基)哌啶(化合物42-12，1g，1.94mmol，1当量)在H2SO4(20mL)和THF(20mL)中的混合物在70℃下在氮气气氛下搅拌1h。LCMS指示反应完成。将混合物用饱和NaHCO3(水溶液)碱化至pH 8。将所得混合物用EtOAc(3x 40mL)萃取。将合并的有机层用盐水(40mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。这样产生呈白色固体的1-{4-[(1R,2S)-6-羟基-2-苯基-1,2,3,4-四氢萘-1-基]苯基}哌啶-4-甲醛(化合物42-13，650mg，81％)。LCMS(ES,m/z):412[M+H]+。
步骤13.化合物42-14的制备
在室温下在氮气气氛下向1-{4-[(1R,2S)-6-羟基-2-苯基-1,2,3,4-四氢萘-1-基]苯基}哌啶-4-甲醛(化合物42-13，350mg，0.85mmol，1当量)在DMF(8mL)中的搅拌溶液中滴加TBSCl(153mg，1.02mmol，1.2当量)和咪唑(174mg，2.55mmol，3当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌3h。LCMS指示反应完成。在室温下用水淬灭反应并用EtOAc(3x15mL)萃取。将合并的有机层用盐水(3x10 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。这样产生呈白色固体的1-{4-[(1R,2S)-6-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-2-苯基-1,2,3,4-四氢萘-1-基]苯基}哌啶-4-甲醛(380mg，84％)。LCMS(ES,m/z):526[M+H]+。
步骤14.化合物42-16的制备
在室温下向2-氰基-4-氟苯甲酸甲酯(化合物42-15，10g，55.82mmol，1当量)和哌嗪-1-甲酸叔丁酯(化合物42-19，12.5g，67.11mmol，1.20当量)在DMSO(100mL)中的搅拌混合物中滴加DIEA(28.5g，220.51mmol，3.95当量)。将所得混合物在120℃下在氮气气氛下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。使混合物冷却至室温，用水(500mL)稀释并用EtOAc(3x 500mL)萃取。将合并的有机层用盐水(500mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(1:1)洗脱，得到呈黄色固体的4-[3-氰基-4-(甲氧基羰基)苯基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(化合物42-16，12g，59％)。LCMS:(ES,m/z):346[M+H]+；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.91(d,J＝8.8Hz,1H),7.43(d,J＝2.8Hz,1H),7.22(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H),3.83(s,3H),3.59 -3.38(m,8H),1.42(s,9H)。
步骤15.化合物42-17的制备
在室温下在氮气气氛下，向4-[3-氰基-4-(甲氧基羰基)苯基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(化合物42-16，10g，28.95mmol，1当量)和AcOH(10mL，174.51mmol，6.03当量)在H2O(10mL)中的搅拌混合物中分批添加次磷酸钠(25.50g，289.84mmol，10.01当量)和雷尼镍(Raney-Ni)(7.49g，87.42mmol，3.02当量)。将所得混合物在60℃下在氮气气氛下搅拌48h。LCMS指示约50％的产物和约30％的原材料剩余。使混合物冷却至室温并真空浓缩。在室温下用水/冰淬灭反应并用EtOAc(3x 100mL)萃取。将合并的有机层用盐水(100mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(1:1)洗脱，得到呈黄色固体的4-[3-甲酰基-4-(甲氧基羰基)苯基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(化合物42-17，4.8g，43％)。LCMS:(ES,m/z):349[M+H]+。
步骤16.化合物42-18的制备
在室温下在氮气气氛下向4-[3-甲酰基-4-(甲氧基羰基)苯基]哌嗪-1-甲酸叔丁酯(化合物42-17，6.0g，17.22mmol，1当量)和(4S)-4-氨基-4-氨基甲酰基丁酸叔丁酯盐酸盐(4.93g，20.67mmol，1.20当量)在MeOH(170mL)中的搅拌混合物中添加AcOH(1.50g，24.97mmol，1.45当量)和STAB(14.42g，68.03mmol，3.95当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将混合物用饱和NaHCO3(水溶液)中和至pH 7并用EtOAc(3x 50mL)萃取。将合并的有机层用盐水(60mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(1:1)洗脱，得到呈黄色固体的4-{2-[(1S)-4-(叔丁氧基)-1-氨基甲酰基-4-氧代丁基]-1-氧代-3H-异吲哚-5-基}哌嗪-1-甲酸叔丁酯(化合物42-18，1.5g，17％)。LCMS(ES,m/z):503[M+H]+。
步骤17.化合物42-19的制备
将4-{2-[(1S)-4-(叔丁氧基)-1-氨基甲酰基-4-氧代丁基]-1-氧代-3H-异吲哚-5-基}哌嗪-1-甲酸叔丁酯(化合物42-18，1.5g，2.98mmol，1当量)和苯磺酸(0.94g，5.97mmol，2当量)在ACN(20mL)中的混合物在85℃下搅拌16h。LCMS指示反应完成。使混合物冷却至室温并减压浓缩。通过用EtOAc(10mL)研磨来纯化残余物。这样产生呈黄色固体的(3S)-3-[1-氧代-5-(哌嗪-1-基)-3H-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮；苯磺酸(1.3g，89％)。LCMS(ES,m/z):329[M+H]+。
步骤18.化合物42-21的制备
在0℃下在氮气气氛下向(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)乙酸甲酯(化合物42-20，500mg，2.17mmol，1当量)于DCM中的搅拌混合物中滴加TMSCl(944mg，8.69mmol，4当量)。将所得混合物在0℃下在氮气气氛下搅拌1h。LCMS指示反应完成。将所得混合物减压浓缩。粗产物混合物不经进一步纯化直接用于下一步。
步骤19.化合物42-22的制备
在室温下在氮气气氛下向(3S)-3-[1-氧代-5-(哌嗪-1-基)-3H-异吲哚-2-基]哌啶-2,6-二酮；苯磺酸(化合物42-19，422mg，0.87mmol，1.2当量)在DCM(7mL)和MeOH(7mL)中的搅拌溶液中滴加NaOAc(119mg，1.44mmol，2当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌0.5h。在室温下向上述混合物中滴加1-{4-[(1R,2S)-6-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-2-苯基-1,2,3,4-四氢萘-1-基]苯基}哌啶-4-甲醛(化合物42-14，380mg，0.72mmol，1当量)和NaBH3CN(136mg，2.17mmol，3当量)，并且将所得混合物在室温下再搅拌2h。LCMS指示反应完成。将所得混合物减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用CH2Cl2/MeOH(10:1)洗脱，得到呈白色固体的(3S)-3-(5-{4-[(1-{4-[(1R,2S)-6-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-2-苯基-1,2,3,4-四氢萘-1-基]苯基}哌啶-4-基)甲基]哌嗪-1-基}-1-氧代-3H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮(化合物42-22，255mg，42％)。LCMS(ES,m/z):824[M+H]+。
步骤20.化合物42-23的制备
在室温下在氮气气氛下向(3S)-3-(5-{4-[(1-{4-[(1R,2S)-6-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-2-苯基-1,2,3,4-四氢萘-1-基]苯基}哌啶-4-基)甲基]哌嗪-1-基}-1-氧代-3H-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮(化合物42-22，250mg，0.29mmol，1当量)在DMF(5mL)中的搅拌混合物中滴加K2CO3(82mg，0.59mmol，2当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌30min。在室温下向上述混合物中滴加N-[(氯甲基氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物42-21，123mg，0.59mmol，2当量)并且将所得混合物在30℃下再搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将混合物真空浓缩至干。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，ACN的水溶液(0.05％TFA)，30min内10％至60％梯度；检测器，UV254nm。这样产生呈白色固体的N-[({[(3S)-3-(5-{4-[(1-{4-[(1R,2S)-6-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-2-苯基-1,2,3,4-四氢萘-1-基]苯基}哌啶-4-基)甲基]哌嗪-1-基}-1-氧代-3H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(60mg，20％)。LCMS(ES,m/z):1008[M+H]+。
步骤21.化合物42-24的制备
在室温下在氮气气氛下，向N-[({[(3S)-3-(5-{4-[(1-{4-[(1R,2S)-6-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-2-苯基-1,2,3,4-四氢萘-1-基]苯基}哌啶-4-基)甲基]哌嗪-1-基}-1-氧代-3H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物42-23，50mg，0.050mmol，1当量)和Pd(PPh3)4(10mg，0.009mmol，0.17当量)在THF(50mL)中的搅拌溶液中分批添加苯基硅烷(10mg，0.092mmol，1.86当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌30min。可以通过LCMS检测所需产物。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，MeCN的水溶液(0.1％TFA)，30min内5％至50％梯度；检测器，UV 254nm。这样产生呈白色固体的2-氨基-N-{[(3S)-3-(5-{4-[(1-{4-[(1R,2S)-6-[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]-2-苯基-1,2,3,4-四氢萘-1-基]苯基}哌啶-4-基)甲基]哌嗪-1-基}-1-氧代-3H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基}乙酰胺(15mg，32.73％)，LCMS(ES,m/z):924[M+H]+和呈白色固体的2-氨基-N-{[(3S)-3-(5-{4-[(1-{4-[(1R,2S)-6-羟基-2-苯基-1,2,3,4-四氢萘-1-基]苯基}哌啶-4-基)甲基]哌嗪-1-基}-1-氧代-3H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基}乙酰胺(化合物42-24，20mg，49％)。LCMS(ES,m/z):810[M+H]+。
步骤22.化合物(XLII)的制备
在室温下在氮气气氛下，向(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酸(化合物40-6，10mg，0.021mmol，1.01当量)和HATU(10mg，0.026mmol，1.25当量)在DMF(2mL)中的搅拌混合物中添加HOBT(3mg，0.022mmol，1.06当量)、2-氨基-N-{[(3S)-3-(5-{4-[(1-{4-[(1R,2S)-6-羟基-2-苯基-1,2,3,4-四氢萘-1-基]苯基}哌啶-4-基)甲基]哌嗪-1-基}-1-氧代-3H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基}乙酰胺(化合物42-24，17mg，0.021mmol，1.0当量)和DIEA(10mg，0.077mmol，3.69当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌1h。LCMS指示反应完成。将反应混合物通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XSelect CSH Prep C18 OBD柱，19*250mm，5μm；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：25mL/min；梯度：10min内25％B至40％B，40％B；波长：254nm；RT1(min)：9.38；将收集的级分冻干，得到呈白色固体的6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)-N-{[({[(1S)-1-{[({[(3S)-3-(5-{4-[(1-{4-[(1R,2S)-6-羟基-2-苯基-1,2,3,4-四氢萘-1-基]苯基}哌啶-4-基)甲基]哌嗪-1-基}-1-氧代-3H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酰基}-2-苯基乙基]氨基甲酰基}甲基)氨基甲酰基]甲基}己酰胺；三氟乙酸(化合物(XLII)，8.5mg，29％)。LCMS(ES,m/z):1265[M+H-TFA]+,633[M/2+H-TFA]+；1H-NMR(300MHz,DMSO-d6):9.37(br s,1H),9.14(br s,1H),8.23-8.08(m,5H),7.60-7.58(m,1H),7.25-7.23(m,4),7.17-7.14(m,5H),7.10(s,1H),6.99-6.97(m,3H),6.85-6.83(m,2H),6.65-6.61(m,3H),6.45-6.42(m,1H),6.25-6.23(m,1H),5.15-4.90(m,3H),4.50-4.41(m,1H),4.47-4.44(m,1H),4.28-4.15(m,2H),4.05-3.95(m,2H),3.80-3.65(m,5H),3.60-3.56(m,3H),3.38-3.31(m,4H),3.25-2.90(m,10H),2.85-2.75(m,2H),2.70-2.61(m,2H),2.35-2.31(m,1H),2.15-2.08(m,3H),2.05-1.90(m,2H),1.85-1.70(m,3H),1.47-1.45(m,4H),1.35-1.12(m,5H)。
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方案22：化合物(XLIII)的制备
步骤1.化合物43-3的合成
将4-羟基哌啶-1-甲酸叔丁酯(化合物43-1，1.00g，4.96mmol，1当量)在DMF(5mL)中的混合物在0℃下用NaH(0.24g，5.96mmol，1.2当量，60％)分批处理。将所得混合物在氮气气氛下在0℃下搅拌30min。然后将炔丙基溴(化合物43-2，0.59g，4.96mmol，1当量)滴加到上述混合物中。将所得混合物再搅拌2h。TLC指示反应完成。在0℃下通过添加水(10mL)淬灭反应。将所得混合物用EA(3x 10mL)萃取。将合并的有机层用盐水(15ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(3:1)洗脱，得到呈黄色油状物的4-(丙-2-炔-1-基氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(化合物43-3，350mg，29％)。LCMS(ESI,m/z):240[M+H]+。
步骤2.化合物43-5的制备
在0℃下在氮气气氛下向3-羟基-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]哌啶-2,6-二酮(化合物43-4，6.00g，24.07mmol，1当量)和吡啶(3.81g，48.14mmol，2当量)在DCM(240mL)中的搅拌混合物中滴加(三氟甲烷)磺酰基三氟甲磺酸酯(10.18g，36.10mmol，1.5当量)。将所得混合物在0℃下搅拌1.5h。LCMS指示反应完成。在减压下去除溶剂。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(3:1)洗脱，得到呈白色固体的1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基三氟甲磺酸酯(化合物43-5，7.2g，78％)。LCMS(ESI,m/z):404[M+Na]+。
步骤3.化合物43-7的制备
将7-溴-1-甲基-3H-1,3-苯并二唑-2-酮(化合物43-6，2.98g，13.11mmol，1当量)和叔丁醇钾(1.77g，15.73mmol，1.2当量)在THF(170mL)中的混合物在0℃在氮气气氛下搅拌30min。在0℃下将在THF(30mL)中的1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基三氟甲磺酸酯(化合物43-5，5.00g，13.11mmol，1当量)滴加到上述混合物中。将所得混合物在25℃下搅拌30min。LCMS指示反应完成。通过添加氯化铵溶液(100mL)淬灭反应。将所得混合物用EA(3x 200mL)萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶，120g，20-35um；流动相，含0.5％NH4HCO3的水和ACN(在50min内0％至100％梯度)；检测器，UV 254nm。将洗脱液浓缩，得到呈白色固体的3-(4-溴-3-甲基-2-氧代-1,3-苯并二唑-1-基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]哌啶-2,6-二酮(化合物43-7，1.1g，18％)。LCMS(ESI,m/z):458,460[M+H]+。
步骤4.化合物43-8的制备
将3-(4-溴-3-甲基-2-氧代-1,3-苯并二唑-1-基)-1-[(4-甲氧基苯基)甲基]哌啶-2,6-二酮(化合物43-7，4.00g，8.72mmol，1当量)和CH3SO3H(11.33mL，174.56mmol，20当量)在甲苯(30mL)中的混合物在120℃下搅拌2h。LCMS指示反应完成。使反应混合物冷却至室温。在减压下去除溶剂。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶，80g，20-35um；流动相，含0.1％NH4HCO3的水和ACN(在50min内5％至95％梯度)；检测器，UV254nm。浓缩洗脱液，得到呈白色固体的3-(4-溴-3-甲基-2-氧代-1,3-苯并二唑-1-基)哌啶-2,6-二酮(化合物43-8，1.5g，50％)。LCMS(ESI,m/z):338,340[M+H]+。
步骤5.化合物43-9的制备
将3-(4-溴-3-甲基-2-氧代-1,3-苯并二唑-1-基)哌啶-2,6-二酮(化合物43-8，1.5g，4.43mmol，1当量)、4-(丙-2-炔-1-基氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(化合物43-3，1.59g，6.65mmol，1.5当量)、二氯化钯双(三苯基膦)(0.62g，0.88mmol，0.2当量)、CuI(0.17g，0.88mmol，0.2当量)和碳酸铯(5.78g，17.74mmol，4当量)在DMF(35mL)中的混合物在80℃下在氮气气氛下搅拌2h。LCMS指示反应完成。使反应混合物冷却至室温。用水(50mL)淬灭反应。将所得混合物用EA(3x 50mL)萃取。将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶，80g，20-35um；流动相，含0.1％TFA的水和ACN(在50min内0％至100％梯度)；检测器，UV254nm。将洗脱液浓缩，得到呈白色固体的4-({3-[1-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-3-甲基-2-氧代-1,3-苯并二唑-4-基]丙-2-炔-1-基}氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(化合物43-9，700mg，31％)。LCMS(ESI,m/z):497[M+H]+。
步骤6.化合物43-10的制备
向4-({3-[1-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-3-甲基-2-氧代-1,3-苯并二唑-4-基]丙-2-炔-1-基}氧基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(化合物43-9，700mg，1.41mmol，1当量)在DCM(20mL)中的搅拌混合物中添加TFA(4mL)。将所得混合物在25℃下搅拌1h。LCMS指示反应完成。减压去除溶剂，得到呈黄色油状物的粗3-{3-甲基-2-氧代-4-[3-(哌啶-4-基氧基)丙-1-炔-1-基]-1,3-苯并二唑-1-基}哌啶-2,6-二酮(化合物43-10，800mg，粗品)。LCMS(ESI,m/z):397[M+H]+。
步骤7.化合物43-13的制备
在0℃下在空气气氛下向5-氯吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(化合物43-11，10.00g，44.32mmol，1当量)和(1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷(6.59g，66.48mmol，1.5当量)在ACN(200.00mL)中的搅拌混合物中添加DIEA(22.91g，177.28mmol，4当量)。将所得混合物在60℃下在空气气氛下搅拌1h。LCMS指示反应完成。使反应混合物冷却至室温。将所得混合物用水(400mL)稀释。将所得混合物用EtOAc(3x 400mL)萃取。将合并的有机层用盐水(3x100 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。这样产生呈黄色固体的5-[(1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(化合物43-13，10g，78％)。LCMS:(ES.m/z):289[M+H]+。
步骤8.化合物43-14的制备
在0℃下在空气气氛下向5-[(1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(化合物43-13，10g，34.68mmol，1当量)在MeOH(100mL)中的搅拌溶液中分批添加H2O(20mL)和LiOH(4.15g，173.42mmol，5当量)。将所得混合物在60℃下在空气气氛下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。使反应混合物冷却至室温。将所得混合物减压浓缩。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，TFA的水溶液(0.05％TFA)，30min内0％至50％梯度；检测器，UV 254nm。这样产生呈黄色固体的5-[(1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸(化合物43-14，3.7g，40％)。LCMS:(ES.m/z):261[M+1]+。
步骤9.化合物43-16的制备
在0℃下在氮气气氛下向(1s,4s)-4-羟基环己烷-1-甲酸甲酯(化合物43-15，6.00g，37.92mmol，1当量)和三乙胺(1.15g，113.78mmol，3当量)在DCM(150mL)中的搅拌混合物中滴加甲磺酰氯(5.21g，45.51mmol，1.2当量)。将所得混合物在0℃下搅拌2h。TLC指示反应完成。通过添加水(50mL)淬灭反应。将所得混合物用DCM(3x 150mL)萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥。过滤后，减压浓缩滤液，得到呈黄色油状物的(1s,4s)-4-(甲磺酰基氧基)环己烷-1-甲酸甲酯(化合物43-16，6.1g，68％)。GCMS:(ES.m/z):236[M]+。
步骤10.化合物43-18的制备
将3-(二氟甲基)-4-硝基-1H-吡唑(化合物43-17，1.70g，10.42mmol，1当量)、(1s,4s)-4-(甲磺酰基氧基)环己烷-1-甲酸甲酯(2.46g，10.42mmol，1当量)和K2CO3(2.88g，20.84mmol，2当量)在DMF(25mL)中的混合物在80℃下搅拌24h。LCMS指示产生约50％产物。在减压下去除溶剂。将残余物用水(25mL)淬灭。将所得混合物用EA(3x 30mL)萃取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用PE/EA(3:1)洗脱，得到呈黄色固体的(1r,4r)-4-[3-(二氟甲基)-4-硝基吡唑-1-基]环己烷-1-甲酸甲酯(化合物43-18，1.1g，34％)。LCMS(ESI,m/z):304[M+H]+。
步骤11.化合物43-19的制备
向(1r,4r)-4-[3-(二氟甲基)-4-硝基吡唑-1-基]环己烷-1-甲酸甲酯(化合物43-18，900mg，2.96mmol，1当量)在THF(30mL)中的搅拌混合物中添加Pd/C(240mg，10％)。将所得混合物在25℃下在氢气气氛下搅拌4h。LCMS指示反应完成。过滤出固体。减压浓缩滤液，得到呈白色固体的粗(1r,4r)-4-[4-氨基-3-(二氟甲基)吡唑-1-基]环己烷-1-甲酸甲酯(化合物43-19，890mg，粗品)。LCMS(ESI,m/z):274[M+H]+。
步骤12.化合物43-20的制备
在0℃下向(1r,4r)-4-[4-氨基-3-(二氟甲基)吡唑-1-基]环己烷-1-甲酸甲酯(化合物43-19，850mg，3.11mmol，1当量)在MeOH(3mL)和THF(18mL)中的搅拌混合物中添加LiBH4(3.10mL，6.22mmol，2当量)。将所得混合物在60℃下搅拌2h。LCMS指示反应完成。在25℃下通过添加水(10mL)淬灭反应。将所得混合物用EA(3x 20mL)萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用DCM/MeOH(96:4)洗脱，得到呈白色固体的[(1r,4r)-4-[4-氨基-3-(二氟甲基)吡唑-1-基]环己基]甲醇(化合物43-20，550mg，72％)。LCMS(ESI,m/z):246[M+H]+。
步骤13.化合物43-21的制备
将5-[(1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸(化合物43-14，230mg，0.89mmol，1当量)、[氯(二甲基氨基)亚甲基]二甲基铵；六氟-λ5-膦酰胺(300mg，1.07mmol，1.2当量)和1-甲基-1H-咪唑(260mg，3.13mmol，3.5当量)在ACN(15mL)中的混合物在25℃下搅拌30min。然后将[(1r,4r)-4-[4-氨基-3-(二氟甲基)吡唑-1-基]环己基]甲醇(化合物43-20，220mg，0.89mmol，1当量)添加到上述混合物中。将所得混合物搅拌2h。LCMS指示反应完成。在减压下去除溶剂。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶，80g，20-35um；流动相，含0.1％TFA的水和ACN(在50min内0％至100％梯度)；检测器，UV 254nm。将洗脱液减压浓缩，得到呈黄色固体的N-[3-(二氟甲基)-1-[(1r,4r)-4-(羟甲基)环己基]吡唑-4-基]-5-[(1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(化合物43-21，200mg，45.74％)。LCMS(ESI,m/z):488[M+H]+。
步骤14.化合物43-22的制备
向N-[3-(二氟甲基)-1-[(1r,4r)-4-(羟甲基)环己基]吡唑-4-基]-5-[(1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(化合物43-21，1.00g，2.05mmol，1当量)在DCM(20mL)中的搅拌混合物中添加乙酸1,1-双(乙酰氧基)-3-氧代-3H-1λ5,2-苯碘酰-1-基酯(960mg，2.25mmol，1.1当量)。将所得混合物在25℃下搅拌1.5h。LCMS指示反应完成。用饱和碳酸氢钠溶液(15mL)淬灭反应。将所得混合物用DCM(3x 15mL)萃取。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥。过滤后，将滤液减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用DCM/MeOH(96:4)洗脱，得到呈黄色固体的N-[3-(二氟甲基)-1-[(1r,4r)-4-甲酰基环己基]吡唑-4-基]-5-[(1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(化合物43-22，600mg，60％)。LCMS(ESI,m/z):486[M+H]+。
步骤15.化合物43-23的制备
将N-[3-(二氟甲基)-1-[(1r,4r)-4-甲酰基环己基]吡唑-4-基]-5-[(1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(化合物43-22，600mg，1.23mmol，1当量)、3-{3-甲基-2-氧代-4-[3-(哌啶-4-基氧基)丙-1-炔-1-基]-1,3-苯并二唑-1-基}哌啶-2,6-二酮(化合物43-10，490mg，1.23mmol，1当量)和AcOK(240mg，2.47mmol，2当量)在DMF(3mL)和THF(15mL)中的混合物在25℃下搅拌30min。然后将STAB(520mg，2.47mmol，2当量)添加到上述混合物中。将所得混合物搅拌1h。LCMS指示反应完成。在减压下去除溶剂。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶，80g，20-35um；流动相，含0.1％TFA的水和ACN(在50min内0％至100％梯度)；检测器，UV 254nm。将洗脱液浓缩，得到呈黄色固体的N-[3-(二氟甲基)-1-[(1r,4r)-4-{[4-({3-[1-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-3-甲基-2-氧代-1,3-苯并二唑-4-基]丙-2-炔-1-基}氧基)哌啶-1-基]甲基}环己基]吡唑-4-基]-5-[(1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(600mg，56％)。LCMS(ES,m/z):866[M+H-TFA]+。
步骤16.化合物43-25的制备
将(2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)乙酸甲酯(化合物43-24，300mg，1.30mmol，1当量)和氯三甲基硅烷(565mg，5.21mmol，4当量)在DCM(5mL)中的混合物在0℃下在氮气气氛下搅拌1h。将分析样品用MeOH淬灭并且质量信号显示203。LCMS指示反应完成。减压去除溶剂，得到呈白色固体的粗N-[(氯甲基氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物43-25，350mg，粗品)。粗产物不经任何纯化即用于下一步。
步骤17.化合物43-26的制备
将N-[3-(二氟甲基)-1-[(1r,4r)-4-{[4-({3-[1-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-3-甲基-2-氧代-1,3-苯并二唑-4-基]丙-2-炔-1-基}氧基)哌啶-1-基]甲基}环己基]吡唑-4-基]-5-[(1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(化合物43-23，500mg，0.57mmol，1当量)和碳酸钾(160mg，1.15mmol，2当量)在DMF(7.5mL)中的混合物在0℃下在氮气气氛下搅拌20min。然后将N-[(氯甲基氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物43-25，240mg，1.15mmol，2当量)添加到上述混合物中。将所得混合物在25℃下搅拌1.5h。LCMS指示反应完成。将反应体系通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶，80g，20-35um；流动相，含0.1％TFA的水和ACN(在50min内0％至100％梯度)；检测器，UV 254nm。将洗脱液减压浓缩，得到呈黄色固体的N-[({[3-(3-甲基-2-氧代-4-{3-[(1-{[(1r,4r)-4-[3-(二氟甲基)-4-{5-[(1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-酰胺基}吡唑-1-基]环己基]甲基}哌啶-4-基)氧基]丙-1-炔-1-基}-1,3-苯并二唑-1-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物43-26，400mg，66％)。LCMS(ESI,m/z):1036[M+H]+。
步骤18.化合物43-27的制备
将N-[({[3-(3-甲基-2-氧代-4-{3-[(1-{[(1r,4r)-4-[3-(二氟甲基)-4-{5-[(1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-酰胺基}吡唑-1-基]环己基]甲基}哌啶-4-基)氧基]丙-1-炔-1-基}-1,3-苯并二唑-1-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基}氨基甲酰基)甲基]氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物43-26，150mg，0.14mmol，1当量)、Pd(PPh3)4(17mg，0.014mmol，0.1当量)和苯基硅烷(32mg，0.29mmol，2当量)在THF(7.5mL)中的混合物在0℃下在氮气气氛下搅拌1h。LCMS指示反应完成。在减压下去除溶剂。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶，80g，20-35um；流动相，含0.1％FA的水和ACN(在50min内0％至100％梯度)；检测器，UV 254nm。将洗脱液浓缩，得到呈白色固体的N-[3-(二氟甲基)-1-[(1r,4r)-4-[(4-{[3-(1-{1-[(2-氨基乙酰胺基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基}-3-甲基-2-氧代-1,3-苯并二唑-4-基)丙-2-炔-1-基]氧基}哌啶-1-基)甲基]环己基]吡唑-4-基]-5-[(1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(化合物43-27，105mg，76％)。LCMS(ESI,m/z):952[M+H]+。
步骤19.化合物(XLIII)的制备
将(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酸(化合物40-6，47mg，0.10mmol，1当量)、HATU(57mg，0.15mmol，1.5当量)和HOBT(14mg，0.10mmol，1当量)在DMF(3mL)中的混合物在0℃下搅拌5min。然后将N-[3-(二氟甲基)-1-[(1r,4r)-4-[(4-{[3-(1-{1-[(2-氨基乙酰胺基)甲基]-2,6-二氧代哌啶-3-基}-3-甲基-2-氧代-1,3-苯并二唑-4-基)丙-2-炔-1-基]氧基}哌啶-1-基)甲基]环己基]吡唑-4-基]-5-[(1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(化合物43-27，95mg，0.10mmol，1当量)添加上述混合物中，随后添加DIEA(26mg，0.20mmol，2当量)。将所得混合物在0℃下搅拌1h。LCMS指示反应完成。将反应体系通过制备型HPLC用以下条件纯化：柱：XSelect CSH Prep C18 OBD柱，19*150mm，5μm；流动相A：水(0.05％TFA)，流动相B：ACN；流速：25mL/min；梯度：7min内24％B至44％B，44％B；波长：254nm；RT1(min)：6.23。将收集的级分冻干，得到呈白色固体的N-[3-(二氟甲基)-1-[(1r,4r)-4-({4-[(3-{1-[1-({2-[(2S)-2-(2-{2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰胺基]乙酰胺基}乙酰胺基)-3-苯基丙酰胺基]乙酰胺基}甲基)-2,6-二氧代哌啶-3-基]-3-甲基-2-氧代-1,3-苯并二唑-4-基}丙-2-炔-1-基)氧基]哌啶-1-基}甲基)环己基]吡唑-4-基]-5-[(1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(25.4mg，18％)。LCMS(ESI,m/z):1406[M+H]+.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.52(d,J＝6.4Hz,1H),9.00-8.80(m,2H),8.41(d,J＝4.0Hz,1H),8.30-8.15(m,3H),8.15-7.95(m,3H),7.27-7.11(m,9H),7.06-6.99(m,2H)6.68(dd,J＝164,7.8Hz,1H),5.50(dd,J＝13.2,5.2Hz,1H),5.31-5.09(m,3H),4.78(d,J＝22.0Hz,1H),4.55-4.48(m,3H),4.30-4.23(m,1H),3.86-3.74(m,5H),3.73-3.52(m,10H),3.48-3.27(m,4H),3.04-2.95(m,6H),2.89-2.60(m,3H),2.27-2.03(m,8H),2.03-1.87(m,5H),1.85-1.75(m,2H),1.51-1.40(m,4H),1.25-1.10(m,4H)。
方案23：化合物(XLIV)的制备
步骤1.化合物44-2的制备
在0℃下向(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三(乙酰氧基)-6-[4-(羟甲基)-2-硝基苯氧基]噁烷-2-甲酸甲酯(化合物44-1，17g，35.02mmol，1当量)和咪唑(3.58g，52.53mmol，1.5当量)在N,N-二甲基甲酰胺(170mL)中的搅拌溶液中滴加叔丁基二甲基甲硅烷基氯(7.92g，52.53mmol，1.5当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将所得混合物用水(600mL)稀释。将沉淀的固体通过过滤收集并用Et2O(3x50 mL)洗涤。这样产生呈灰白色固体的(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三(乙酰氧基)-6-(4-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}-2-硝基苯氧基)噁烷-2-甲酸甲酯(化合物44-2，16.1g，76％)。LCMS(ESI,m/z):617[M+H+NH3]+。
步骤2.化合物44-3的制备
在室温下，向(2S,3S,4S,5R,6S)-3,4,5-三(乙酰氧基)-6-(4-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}-2-硝基苯氧基)噁烷-2-甲酸甲酯(化合物44-2，16g，26.68mmol，1当量)在甲醇(320mL)中的搅拌溶液中添加甲醇钠(8.65g，160.09mmol，6.00当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将所得混合物真空浓缩。这样产生呈灰白色固体的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}-2-硝基苯氧基)-3,4,5-三羟基噁烷-2-甲酸(化合物44-3，10g，81％)。LCMS(ESI,m/z):477[M+H+NH3]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.50(s,1H),7.76(d,J＝2.0Hz,1H),7.57-7.49(m,1H),7.41(d,J＝8.8Hz,1H),5.05(d,J＝7.2Hz,1H),4.72(s,2H),3.49(d,J＝10.2Hz,1H),3.30-3.08(m,6H),0.91(s,9H),0.09(s,6H)。
步骤3.化合物44-4的制备
在室温下在N2气氛下向(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}-2-硝基苯氧基)-3,4,5-三羟基噁烷-2-甲酸(化合物44-3，10g，21.76mmol，1.00当量)在N,N-二甲基甲酰胺(100mL)中的搅拌溶液中分批添加烯丙基溴(6.58g，54.40mmol，2.50当量)。将所得混合物在40℃下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。使混合物冷却至室温。将所得混合物用水(500mL)稀释。将所得混合物用乙酸乙酯(3x 200mL)萃取。将合并的有机层用盐水(5x 200mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用石油醚/乙酸乙酯(12:1)洗脱，得到呈白色固体的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}-2-硝基苯氧基)-3,4,5-三羟基噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物44-4，10g，91％)。LCMS(ES,m/z):517[M+H+NH3]+,522[M+Na]+
步骤4.化合物44-5的制备
在0℃下向(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}-2-硝基苯氧基)-3,4,5-三羟基噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物44-4，10g，20.01mmol，1当量)在吡啶(200mL)中的搅拌溶液中滴加氯甲酸丙-2-烯-1-基酯(72.38g，600.48mmol，30当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。将所得混合物用水(500mL)稀释。将所得混合物用乙酸乙酯(3x 200mL)萃取。将合并的有机层用盐水(5x200 mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用石油醚/乙酸乙酯(3:1)洗脱，得到呈黄色油状物的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}-2-硝基苯氧基)-3,4,5-三({[丙-2-烯-1-基氧基]羰基}氧基)噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物44-5，11.7g，83％)。LCMS(ESI,m/z):769[M+H+NH3]+。
步骤5.化合物44-6的制备
在0℃下向(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-{[(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基]甲基}-2-硝基苯氧基)-3,4,5-三({[丙-2-烯-1-基氧基]羰基}氧基)噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物44-5，11.6g，15.42mmol，1当量)在四氢呋喃(240mL)中的搅拌溶液中滴加氟化氢吡啶(60mL)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌1h。LCMS指示反应完成。将所得混合物真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用石油醚/乙酸乙酯(1:1)洗脱，得到呈黄色油状物的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[4-(羟甲基)-2-硝基苯氧基]-3,4,5-三({[(丙-2-烯-1-基氧基]羰基}氧基)噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物44-6，8.9g，90％)。LCMS(ESI,m/z):655[M+H+NH3]+。
步骤6.化合物44-7的制备
在室温下向(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[4-(羟甲基)-2-硝基苯氧基]-3,4,5-三({[丙-2-烯-1-基氧基]羰基}氧基)噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物44-6，8.8g，13.80mmol，1当量)和碳酸双(4-硝基苯基)酯(4.62g，15.18mmol，1.1当量)在N,N-二甲基甲酰胺(190mL)中的搅拌溶液中滴加N,N-二异丙基乙胺(3.57g，27.60mmol，2当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌2h。LCMS指示反应完成。将所得混合物用水(600mL)稀释。将所得混合物用乙酸乙酯(3x 200mL)萃取。将合并的有机层用盐水(3x200 mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，用石油醚/乙酸乙酯(3:1)洗脱，得到呈黄色油状物的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-硝基-4-{[(4-硝基苯氧基羰基)氧基]甲基}苯氧基)-3,4,5-三({[丙-2-烯-1-基氧基]羰基}氧基)噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物44-7，8g，72％)。LCMS(ESI,m/z):802[M+H]+。
步骤7.化合物44-8的制备
在0℃下向(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(2-硝基-4-{[(4-硝基苯氧基羰基)氧基]甲基}苯氧基)-3,4,5-三({[丙-2-烯-1-基氧基]羰基}氧基)噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物44-6，3.5g，4.36mmol，1当量)在N,N-二甲基甲酰胺(35mL)中的搅拌溶液中添加2-丙炔基胺(0.48g，8.72mmol，2当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌2h。LCMS指示反应完成。将混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，乙腈的水溶液(0.05％TFA)，30min内5％至80％梯度；检测器，UV 254nm。将收集的级分冻干，得到呈黄色油状物的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[2-硝基-4-({[(丙-2-炔-1-基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯氧基]-3,4,5-三({[丙-2-烯-1-基氧基]羰基}氧基)噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物44-8，1.6g，51％)。LCMS(ESI,m/z):736[M+H+NH3]+
步骤8.化合物44-9的制备
在0℃下向(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[2-硝基-4-({[(丙-2-炔-1-基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯氧基]-3,4,5-三({[丙-2-烯-1-基氧基]羰基}氧基)噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物44-8，1.4g，1.94mmol，1当量)和多聚甲醛(0.12g，3.89mmol，2当量)在二氯甲烷(140mL)中的搅拌溶液中滴加三甲基甲硅烷基氯(0.42g，3.89mmol，2当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌2h。反应混合物用甲醇衍生用于LCMS测试。将所得混合物减压浓缩，得到(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[4-({[氯甲基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酰基]氧基}甲基)-2-硝基苯氧基]-3,4,5-三({[丙-2-烯-1-基氧基]羰基}氧基)噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物44-9)。粗产物不经进一步纯化直接用于下一步。LCMS(ESI,m/z):763[M+H]+(用MeOH衍生)。
步骤9.化合物44-11的制备
在室温下向(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[4-({[氯甲基(丙-2-炔-1-基)氨基甲酰基]氧基}甲基)-2-硝基苯氧基]-3,4,5-三({[丙-2-烯-1-基氧基]羰基}氧基)噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物44-9，1.3g，1.69mmol，1当量)和N-[2-(2-{2-氯-4-[({[2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代-3H-异吲哚-5-基]甲基}氨基甲酰基)氨基]苯基}乙氧基)乙基]-N-甲基氨基甲酸叔丁酯(化合物11-2，1.06g，1.69mmol，1当量)在N,N-二甲基甲酰胺(13mL)中的搅拌溶液添加碳酸铯(0.55g，1.69mmol，1当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌1h。LCMS指示反应完成。将混合物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，乙腈的水溶液(0.05％TFA)，30min内5％至80％梯度；检测器，UV 254nm。将收集的级分冻干，得到呈白色固体的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(叔丁氧羰基)(甲基)氨基]乙氧基}乙基)-3-氯苯基]氨基甲酰基}氨基)甲基]-1-氧代-3H-异吲哚-2-基}-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲基](丙-2-炔-1-基)氨基甲酰基}氧基)甲基]-2-硝基苯氧基}-3,4,5-三({[丙-2-烯-1-基氧基]羰基}氧基)噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物44-11，360mg，15％)。LCMS(ESI,m/z):1358[M+H]+
步骤10.化合物44-12的制备
在室温下，向(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(叔丁氧羰基)(甲基)氨基]乙氧基}乙基)-3-氯苯基]氨基甲酰基}氨基)甲基]-1-氧代-3H-异吲哚-2-基}-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲基](丙-2-炔-1-基)氨基甲酰基}氧基)甲基]-2-硝基苯氧基}-3,4,5-三({[丙-2-烯-1-基氧基]羰基}氧基)噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物44-11，350mg，0.25mmol，1当量)在MeOH(3mL)和乙酸(3mL)中的搅拌溶液中添加Zn(125mg，1.91mmol，10当量)。将所得混合物在室温下搅拌过夜。LCMS指示反应完成。过滤所得混合物，用甲醇(3x5 mL)洗涤滤饼。将滤液减压浓缩。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，乙腈的水溶液(0.05％TFA)，30min内5％至80％梯度；检测器，UV254nm。将收集的级分冻干，得到呈白色固体的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{2-氨基-4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(叔丁氧羰基)(甲基)氨基]乙氧基}乙基)-3-氯苯基]氨基甲酰基}氨基)甲基]-1-氧代-3H-异吲哚-2-基}-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲基](丙-2-炔-1-基)氨基甲酰基}氧基)甲基]苯氧基}-3,4,5-三({[丙-2-烯-1-基氧基]羰基}氧基)噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物44-12，110mg，32.14％)。LCMS(ESI,m/z):1328[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.81(s,1H),7.77-7.66(m,2H),7.53(s,1H),7.45(d,J＝8.0Hz,1H),7.19(t,J＝7.2Hz,2H),6.98(d,J＝8.0Hz,1H),6.84(s,2H),6.70(s,1H),6.57(s,1H),6.26(s,1H),6.09(s,1H),5.90-5.88(m,4H),5.47-5.17(m,12H),4.93(s,3H),4.81(s,2H),4.79-4.55(m,9H),4.42(d,J＝5.6Hz,3H),3.99(s,2H),3.55-3.51(m,5H),3.31-3.14(m,4H),2.85-2.75(m,6H),1.38(s,9H)。
步骤11.化合物44-14的制备
在室温下向化合物44-12(110mg，0.08mmol，1当量)和3-[3-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰胺基]丙酸(化合物44-13，40mg，0.16mmol，2当量)在乙腈(2mL)中的搅拌溶液中添加1-甲基咪唑(27mg，0.33mmol，4当量)。将所得混合物在室温下搅拌1h。LCMS指示反应完成。将所得混合物真空浓缩。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，MeCN的水溶液(0.1％FA)，30min内5％至80％梯度；检测器，UV 254nm。将收集的级分冻干，得到呈白色固体的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(叔丁氧羰基)(甲基)氨基]乙氧基}乙基)-3-氯苯基]氨基甲酰基}氨基)甲基]-1-氧代-3H-异吲哚-2-基}-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲基](丙-2-炔-1-基)氨基甲酰基}氧基)甲基]-2-{3-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰胺基]丙酰胺基}苯氧基}-3,4,5-三({[丙-2-烯-1-基氧基]羰基}氧基)噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物44-14，70mg，54％)。LCMS(ESI,m/z):1550[M+H]+
步骤12.化合物(44-15)的合成
在室温下在氮气气氛下，向(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(叔丁氧羰基)(甲基)氨基]乙氧基}乙基)-3-氯苯基]氨基甲酰基}氨基)甲基]-1-氧代-3H-异吲哚-2-基}-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲基](丙-2-炔-1-基)氨基甲酰基}氧基)甲基]-2-{3-[3-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)丙酰胺基]丙酰胺基}苯氧基}-3,4,5-三({[丙-2-烯-1-基氧基]羰基}氧基)噁烷-2-甲酸丙-2-烯-1-基酯(化合物44-14，50mg，0.03mmol，1当量)和三乙胺(13mg，0.12mmol，4当量)在四氢呋喃(5mL)中的搅拌溶液添加甲酸(5mg，0.09mmol，3当量)和四(三苯基膦)钯(15mg，0.012mmol，0.4当量)。将所得混合物在室温下在氮气气氛下搅拌2h。LCMS指示反应完成。将所得混合物真空浓缩。将残余物通过反相快速色谱法用以下条件纯化：柱，C18硅胶；流动相，MeCN的水溶液(0.05％TFA)，30min内5％至80％梯度；检测器，UV 254nm。将收集的级分冻干，得到呈白色固体的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(叔丁氧羰基)(甲基)氨基]乙氧基}乙基)-3-氯苯基]氨基甲酰基}氨基)甲基]-1-氧代-3H-异吲哚-2-基}-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲基](丙-2-炔-1-基)氨基甲酰基}氧基)甲基]-2-{3-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰胺基]丙酰胺基}苯氧基}-3,4,5-三羟基噁烷-2-甲酸(化合物44-15，10mg，24％)LCMS(ESI,m/z):1258[M+H]+
步骤13.化合物(XLIV)的制备
在0℃下向(2S,3S,4S,5R,6S)-6-{4-[({[(3-{5-[({[4-(2-{2-[(叔丁氧羰基)(甲基)氨基]乙氧基}乙基)-3-氯苯基]氨基甲酰基}氨基)甲基]-1-氧代-3H-异吲哚-2-基}-2,6-二氧代哌啶-1-基)甲基](丙-2-炔-1-基)氨基甲酰基}氧基)甲基]-2-{3-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰胺基]丙酰胺基}苯氧基}-3,4,5-三羟基噁烷-2-甲酸(化合物44-15，10mg，0.008mmol，1当量)在二氯甲烷(1mL)的搅拌溶液中滴加三氟乙酸(0.2mL)。将所得混合物在0℃下在氮气气氛下搅拌2h。LCMS指示反应完成。将所得混合物真空浓缩。将粗产物(10mg)通过制备型HPLC用以下条件纯化(柱：XSelect CSH Prep C18 OBD柱，19*150mm，5μm；流动相A：水(0.1％TFA)，流动相B：ACN；流速：25mL/min；梯度：在10min内18％B至38％B，38％B；波长：254nm；RT1(min)：7.75；进样量：0.7mL；将收集的级分冻干，得到呈白色固体的(2S,3S,4S,5R,6S)-6-[4-({[({3-[5-({[(3-氯-4-{2-[2-(甲基氨基)乙氧基]乙基}苯基)氨基甲酰基]氨基}甲基)-1-氧代-3H-异吲哚-2-基]-2,6-二氧代哌啶-1-基}甲基)(丙-2-炔-1-基)氨基甲酰基]氧基}甲基)-2-{3-[3-(2,5-二氧代吡咯-1-基)丙酰胺基]丙酰胺基}苯氧基]-3,4,5-三羟基噁烷-2-甲酸(化合物(XLIV)，1.2mg，13％)。LCMS(ESI,m/z):1158[M+H-FA]+；1HNMR(400MHz,CD3OD)δ8.20(s,1H),7.78(d,J＝4.0Hz,1H),7.57(s,2H),7.51(d,J＝8.0Hz,1H),7.23(s,2H),7.22-7.13(m,2H),6.72(s,2H),5.58-5.35(m,2H),5.26-5.20(m,1H),5.12-5.11(m,2H),4.54(s,2H),4.48-4.22(m,2H),4.17(br s,2H),3.95-3.88(m,1H),3.76-3.70(m,6H),3.68-3.59(m,3H),3.55-3.42(m,3H),3.21-3.19(m,2H),3.02-2.85(m,4H),2.75-2.70(m,4H),2.60(s,2H),2.46-2.25(m,3H),2.18-2.05(m,1H)。
方案24：具有水溶性取代基的化合物的制备
向装有28.75μL脱气的、无水DMA的干燥小瓶中，以在无水脱气DMA中的20mM储备溶液的形式添加25μL化合物(XLIV)(0.5μmol，最终浓度5mM)、5μL CuBr(0.1μmol)、10μL N,N′,N″,N″-五甲基二亚乙基三胺(0.2μmol)和31.25μL(0.625μmol)R-N3，其中R是任何高度水溶性基团(以有助于疏水性降解剂的缀合)。将反应物在环境温度下在氮气下搅拌并通过LC-MS监测。当化合物(XLIV)被消耗时，判断反应完成，并且根据上述程序使用粗产物而无需纯化用于缀合。
实施例2：制备抗体缀合物的一般程序
用12摩尔当量的TCEP处理在50mM EPPS、5mM EDTA pH 7.0缓冲液中的抗体，并在37℃下孵育2h以完全还原链间二硫键。使用Zeba 40K柱通过凝胶过滤将还原抗体纯化到50mM EPPS、5mM EDTA pH 7.0中。以在DMA中的储备溶液的形式添加12摩尔当量的接头-有效载荷，使得DMA的最终浓度为10％v/v，并将所得反应混合物在环境温度下孵育2h。使用Zeba 40K柱通过凝胶过滤将所得缀合物纯化到20mM琥珀酸盐、8％蔗糖、0.01％吐温(Tween)-20pH5.5配制缓冲液中，然后使用Slide-a-Lyzer 10K盒对配制缓冲液进行透析。通过LC-MS发现纯化的ADC具有平均8.1个药物/Ab；通过SEC发现由98.8％的单体组成；并且通过反相HPLC发现含有<1.2％未结合的接头-有效载荷。使用其它抗体和接头-有效载荷的类似程序得到相应的完全负载的ADC。
实施例2-1：CD33-D抗体-化合物(XL)缀合物的制备
将CD33-D抗体(8mg/mL，在50mM EPPS、5mM EDTA pH 7.0中)用12当量TCEP处理并在37℃下孵育以还原链间二硫键。通过使用Zeba 40K脱盐柱脱盐，将还原抗体纯化到50mMEPPS、5mM EDTA pH 7.0中。通过以下方式实现缀合：稀释抗体并添加12当量在DMA中的储备溶液形式的化合物(XL)，使得最终反应混合物由在50mM EPPS、5mM EDTA pH 7.0+20％DMA中的2mg/mL还原抗体+12当量化合物(XL)组成。将反应物在环境温度下孵育。使用Zeba40K脱盐柱将缀合物纯化到20mM琥珀酸盐、8％蔗糖、0.01％吐温-20pH 5.5配制缓冲液中。此时，通过LC-MS发现缀合物具有6.0个化合物(XL)/抗体。
为了增加载药量，通过添加0.1体积的1M Tris pH 7.5来调节缀合物溶液的pH并且以在DMA中的储备溶液的形式添加另外5当量的化合物(XL)，使得最终DMA浓度为10％。1h后，通过使用Zebra40K脱盐柱脱盐将缀合物纯化到20mM琥珀酸盐、8％蔗糖、0.01％吐温-20pH 5.5配制缓冲液中。
为了去除残留的游离药物，将250mg活性炭用1mL水洗涤三次，然后悬浮于1mL配制缓冲液中。将0.1体积的这种炭浆液添加到缀合物中并在环境温度下翻转混合1h。通过0.22um过滤器过滤去除活性炭。
通过LC-MS发现缀合物具有8.0个化合物(XL)/抗体；通过SEC发现具有87％单体；并且通过混合模式HPLC，使用HISEP柱发现具有<1.7％游离药物。
实施例2-2：CD33-D抗体-化合物(XIV)缀合物的制备
将CD33-D抗体(5mg/mL，在50mM EPPS、5mM EDTA中)用12当量TCEP处理并在37℃下孵育2h以还原链间二硫键。使用Zeba40K脱盐柱，将还原抗体纯化到50mM EPPS、5mM EDTApH 7.0中。
通过以下方式实现缀合：稀释抗体并以在DMA中的储备溶液的形式添加化合物(XIV)，使得最终反应混合物由在50mM EPPS、5mM EDTA pH 7.0+10％DMA中的4.0mg/mL还原抗体+12当量化合物(XIV)组成。将反应物在环境温度下孵育1h。使用Zebra 40K脱盐柱将缀合物纯化到20mM琥珀酸盐、8％蔗糖、0.01％吐温-20pH 5.5中。
通过LC-MS发现缀合物具有7.9个化合物(XIV)/抗体；通过SEC发现具有98.9％单体；并且通过混合模式HPLC，使用HISEP柱发现具有<0.6％游离药物。
实施例2-3：贝兰他单抗-化合物(XIV)缀合物的制备
将贝兰他单抗(11mg/mL，在20mM组氨酸、250mM蔗糖pH 6.5中)用15当量TCEP处理并在37℃下孵育1h以还原链间二硫键。使用Zebra 40K脱盐柱，将还原抗体纯化到50mMEPPS、5mM EDTA pH 7.0中。
通过以下方式实现缀合：稀释抗体并以在DMA中的储备溶液的形式添加化合物(XIV)，使得最终反应混合物由在50mM EPPS、5mM EDTA pH 7.0+10％DMA中的3.0mg/mL还原抗体+12当量化合物(XIV)组成。将反应物在环境温度下孵育1h，然后用0.01体积的100mMN-乙酰半胱氨酸淬灭。
使用NAP脱盐柱通过两轮凝胶过滤纯化缀合物。在第一轮中，将该柱用20mM琥珀酸盐、8％蔗糖、0.01％吐温-20pH 5.5+10％DMA平衡并洗脱。在第二轮中，将该柱用20mM琥珀酸盐、8％蔗糖、0.01％吐温-20pH 5.5平衡并洗脱。最后，使用50K MWCO Amicon离心浓缩机浓缩缀合物。
通过LC-MS发现缀合物具有8个化合物(XIV)/抗体；通过SEC发现具有98.4％单体；并且通过混合模式HPLC，使用HISEP柱发现具有2.5％游离药物。
实施例2-4：HER2-B抗体-化合物(XIV)缀合物的制备
将HER2-B抗体(4.4mg/mL，在50mM EPPS、5mM EDTA中)用15当量TCEP处理并在37℃下孵育2h以还原链间二硫键。使用Zeba 40K脱盐柱，将还原抗体纯化到50mM EPPS、5mMEDTA pH7.0中。
通过以下方式实现缀合：稀释抗体并以在DMA中的储备溶液的形式添加化合物(XIV)，使得最终反应混合物由在50mM EPPS、5mM EDTA pH 7.0+10％DMA共溶剂中的4.0mg/mL还原抗体+12当量化合物(XIV)组成。将反应物在环境温度下孵育1h。然后使用Zebra 40K脱盐柱纯化到20mM琥珀酸盐、8％蔗糖、0.01％吐温-20pH 5.5中。
通过LC-MS发现缀合物具有7.9个化合物(XIV)/抗体；通过SEC发现具有98.8％单体；并且通过混合模式HPLC，使用HISEP柱发现具有<0.6％游离药物。
实施例2-4：HER2-A抗体-化合物(XLII)缀合物的制备
将HER2-A抗体(8mg/mL，在50mM EPPS、5mM EDTA pH 7.0中)用2.25当量TCEP处理并在37℃下孵育2h以部分还原链间二硫键。在冷却至环境温度后，通过以下方式实现缀合：稀释还原抗体并以在DMA中的储备溶液的形式添加化合物(XLII)，使得最终反应混合物由在50mM EPPS、5mM EDTA pH 7.0+20％DMA共溶剂中的2.0mg/mL还原抗体+7当量化合物(XLII)组成。将反应物在环境温度下孵育1h。使用Zeba 40K柱将缀合物纯化到20mM琥珀酸盐、8％蔗糖、0.01％吐温-20pH 5.5配制缓冲液中，然后使用10K MWCO Slide-a-Lyzer盒对配制缓冲液进行透析。通过LC-MS发现缀合物具有3.3个化合物(XLII)/Ab，并且通过SEC发现具有48.6％单体(参见图20)。发现与天然半胱氨酸的缀合会引起抗体的显著聚集。
实施例2-5：HER2-A抗体-化合物(XLII)缀合物的制备
使用Zeba 40K脱盐柱，将HER2-A抗体缓冲液交换为PBS pH7.4。通过用12当量的TCEP处理并且在37℃下孵育2h，将6.5mg/mL的抗体完全还原。冷却至环境温度后，使用Zebra 40K脱盐柱将还原抗体纯化到50mM HEPES、1mM EDTA pH 7.5中。将5mg/mL的还原抗体用20当量脱氢抗坏血酸(以在DMSO中的50mM储备溶液添加)处理并在环境温度下孵育2小时以再氧化链间二硫键。用0.015体积的1M乙酸盐pH 5.0将还原/再氧化的抗体溶液的pH调节至7，并通过以下方式实现缀合：添加4当量在DMA中的储备溶液形式的化合物(XLII)，使得最终反应混合物由在50mM HEPES、1mM EDTA pH 7+20％DMA中的2mg/mL Ab+4当量化合物(XLII)组成。将反应物在环境温度下孵育过夜。
使用NAP5脱盐柱将缀合物纯化到20mM琥珀酸盐、8％蔗糖、0.01％吐温-20pH 5.5中，稀释至4mL，并使用50K MWCO Amicon离心浓缩机浓缩至约0.25mL。
通过还原RPLC-MS发现缀合物具有2.0个SMol00408/抗体；通过SEC发现具有97.1％单体(参见图21)；并且通过混合模式HPLC，使用HISEP柱发现检测不到游离药物。与通过链间半胱氨酸静态缀合的WT帕妥珠单抗相比，当缀合至mal-GGFG-ARV-471时，用每个重链结构域中的半胱氨酸突变体工程化的帕妥珠单抗抗体显示显著改善的单体％。具有高单体状态的抗体缀合物倾向于具有比具有高聚集的抗体缀合物更长的循环半衰期和更少的过早清除，导致更大的临床前治疗指数。
实施例2-6：CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物的制备
将CD79b-A抗体(5mg/mL，在50mM MES、5mM EDTA pH 6.0中)用3.25当量TCEP处理并在37℃下孵育2h以部分还原链间二硫键。在冷却至环境温度后，通过以下方式实现缀合：稀释还原抗体并以在DMA中的储备溶液的形式添加化合物(XLIII)，使得最终反应混合物由在50mM MES、5mM EDTA pH 6.0+15％DMA中的2.0mg/mL还原抗体+7当量化合物(XLIII)组成。使用NAP脱盐柱通过两轮凝胶过滤纯化缀合物。在第一轮中，将该柱用20mM琥珀酸盐、8％蔗糖、0.01％吐温-20pH 5.5+10％DMA平衡并洗脱。在第二轮中，将该柱用20mM琥珀酸盐、8％蔗糖、0.01％吐温-20pH 5.5平衡并洗脱。最后，使用50K MWCO Amicon离心浓缩机浓缩缀合物。通过LC-MS发现缀合物具有4.6个化合物(XLIII)/Ab；发现具有98.4％单体；并且通过混合模式HPLC，使用HISEP柱发现检测不到游离药物。
实施例3：一般稳定性研究
将帕妥珠单抗-化合物(I)缀合物(DAR＝8，根据上述一般程序由化合物(I)制备)在37℃、pH 7.5下孵育24h。如图1的顶部画面所示，所得产物的LCMS分析显示-496amu处的卫星峰显著增加，这表明氨基甲酸酯切割并且证明含有该接头的化合物在生理条件下通常不稳定。相反，如该图的底部图所示，当帕妥珠单抗-化合物(I)缀合物在pH 5.5(对照条件)于4℃储存过夜时，没有观察到-496amu峰。
类似地，如图2A和图2B中所示，帕妥珠单抗-化合物(VIII)缀合物(DAR＝8，根据上述一般程序由化合物(VIII)制备并还原成轻链和重链亚基)处于37℃、pH 7.5下24h后显示-452amu处的LCMS卫星峰增加，指示发生酯水解。每个画面的顶行显示保持在pH 5.5并储存在4℃的缀合物的光谱，中间行显示处于pH 5.5并在37℃下孵育24小时的缀合物的光谱，并且底行显示在37℃在pH 7.5孵育24小时的缀合物的光谱。底行中-452amu峰的存在表明酯水解，并且提供了含有酯接头的该缀合物在生理条件下通常不稳定的证据。
相反，帕妥珠单抗-化合物(X)缀合物在相同条件下孵育后保持稳定。如图3所示，缀合物还原成轻链和重链亚基，并在37℃下在pH7.5下孵育24小时。通过LC-MS没有看到接头切割的证据，显示缀合物在生理条件下是稳定的。
类似地，帕妥珠单抗-化合物(XI)缀合物在相同条件下孵育后保持稳定。如图4所示，只观察到预期种类(轻链、轻链+化合物(XI)；重链、重链+化合物(XI)、重链+2个化合物(XI)和重链+3个化合物(XI)。没有观察到质量与轻链+接头片段或重链+接头片段一致的峰，这将表明接头切割。
实施例4：无痕接头的酶促切割
木瓜蛋白酶消化1
将帕妥珠单抗-化合物(XI)缀合物用木瓜蛋白酶根据酶与缀合物的比率为1:16在室温下消化3小时。用冰冷的乙腈萃取释放的有效载荷，干燥并在95:5:0.1H2O:乙腈:甲酸中复原，随后提交进行LC-MS分析。
LC-MS分析：
配备Waters ACQUITY UPLC的Waters SQD2质谱仪以如下设置使用：阳性检测模式，全测量扫描和SIR扫描(对于新降解剂P1的分子离子，选择离子监测扫描靶向至528.3的m/z)。UPLC梯度如下，流速为0.8mL/min。将UPLC的洗脱液分别分裂到UV和质谱仪中。进样量为各10uL。流动相A是含有0.1％三氟乙酸的HPLC级水，流动相B是含有0.1％三氟乙酸的乙腈。
时间(min) 0.0 0.5 2.2 2.6 2.61 3.0
A％ 95.0 95.0 5.0 5 95.0 95.0
B％ 5.0 5.0 95.0 95 5.0 5.0
图5显示用木瓜蛋白酶消化提供了与形成新降解剂P1一致的峰，其结构如下所示。还显示了没有木瓜蛋白酶处理的帕妥珠单抗-化合物(XI)的对照样品和新降解剂P1标准品(214nm迹线)的色谱图。此外，图5示出了在木瓜蛋白酶处理的缀合物样品中新降解剂P1标准品和新降解剂P1的MS光谱。
方案6示出了所提出的用于形成新降解剂的机制。
如以上实施例所示，仅要求保护的无痕接头在切割条件下提供足够的稳定性和期望的新降解剂(化合物18-6)。
木瓜蛋白酶消化2
将10μM化合物(XL)、化合物(XI)、化合物(XIV)、化合物(XV)、化合物(XII)或化合物(XVII)(PBS pH 7.4、5％DMA共溶剂)与木瓜蛋白酶(2摩尔当量)在室温下温和振荡孵育2小时。用5体积冰冷的乙腈萃取消化物并干燥，然后在95:5:0.1水:乙腈:甲酸中复原。提交样品进行LC-MS分析(Thermo Exploris 240)，并使用适当的参考标准，鉴定和定量释放的有效载荷和/或不完全切割的接头副产物。结果示于下面表1中。
表1：体外有效载荷释放
a副产物是有效载荷-CH2NHC(O)CH2NH2，其通过接头的两个甘氨酸之间的切割而形成。
b化合物XII-1的结构：
如表1所示，用木瓜蛋白酶处理化合物(XL)和(XVIII)以优异的产率释放期望的有效载荷。全部含有GGFGG接头的化合物(XIV)、(XV)、(XII)和(XVII)提供较低产率的期望的有效载荷。不受特定理论的束缚，认为木瓜蛋白酶在有效切割该接头方面是无效的。该理论得到图11中所示的结果的支持，因为含有GGFG接头的化合物(XVIII)的帕妥珠单抗缀合物和含有GGFGG接头的化合物(XI)的帕妥珠单抗缀合物均针对BT-474癌细胞显示出优异活性，指示两种接头在生理条件下在体内有效切割。
β-葡萄糖醛酸酶消化
将10μM化合物(XLI)与β-葡萄糖醛酸酶(Sigma，IX-A型；1mg/mL在PBS中的溶液，2U/ng)，并将反应混合物在37℃下温和振荡孵育3小时。用5体积冰冷的乙腈萃取消化物并干燥，然后在95:5:0.1水:乙腈:甲酸中复原。提交样品进行LC-MS分析(Thermo Exploris240)，并使用适当的参考标准，鉴定和定量释放的有效载荷和/或不完全切割的接头副产物。结果示于表2中。
表2：体外有效载荷释放
化合物 接头 释放的有效载荷 释放的有效载荷％ 副产物
XLI β-葡糖苷酸 化合物18-6 90.9％ -
如表2所示，用β-葡萄糖醛酸酶处理化合物(XLI)以优异的产率释放期望的有效载荷。
半胱氨酸消化
将1mM化合物(XIX)与10摩尔当量的L-半胱氨酸(PBS pH 7.4+20％DMA)在37℃下温和振荡孵育24小时。用5X冰冷的乙腈萃取消化物并干燥，然后在95:5:0.1水:乙腈:甲酸中复原。提交样品进行LC-MS分析(Waters,SQD2)，并使用适当的参考标准，鉴定和定量释放的有效载荷和/或不完全切割的接头副产物。结果示于表3中。
表3：体外有效载荷释放
化合物 接头 释放的有效载荷 释放的有效载荷％ 副产物
XIX 硝基苯磺酰胺 化合物18-6 唯一鉴定的产物 -
如表3所示，用半胱氨酸处理化合物(XIX)以优异的产率释放期望的有效载荷。化合物18-6的释放的光谱证据示于图18、图19A和图19B中。图18描绘了保留时间为3.4分钟的母体化合物(XIX)的HPLC色谱图。图19A描绘了当化合物(XIX)用半胱氨酸处理时反应混合物的HPLC色谱图。化合物(XIX)被完全消耗，唯一鉴定的产物具有2.41分钟的保留时间。图19B描绘了对应于化合物18-6的在保留时间2.4分钟、m/z为528.4时的峰的质谱。
实施例5A：体外抗增殖测定的一般程序
使用体外抗增殖测定来测量要求保护的缀合物抑制细胞生长的能力。将靶细胞以4,000-5,000个细胞/孔接种在100μL完全细胞生长培养基(RPMI 1640，10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素)中。使用3倍连续稀释度将缀合物稀释于完全细胞生长培养基中，并且每孔添加100μL。最终浓度通常在1x 10-9M至1.52x 10-13M或1x 10-6M至1.53x 10-11M的范围内。将细胞在37℃湿润的5％CO2培养箱中孵育5天。通过比色WST-8测定(Dojindo MolecularTechnologies,Inc.,Rockville,MD,US)确定剩余细胞的活力。将WST-8添加到最终体积的10％，并将板在37℃湿润的5％CO2培养箱中孵育2-4小时。通过在多孔板读数器中测量450nm处的吸光度(A450)来分析板。从所有值中减去仅具有培养基和WST-8的孔的背景A450吸光度。通过将每个经处理的样品值除以具有未处理细胞的孔的平均值来计算活力百分比。对于每种处理，将活力百分比值相对于测试样品浓度绘制在半对数图中。IC50值是自动计算的。
图6中示出了化合物(X)的利妥昔单抗和帕妥珠单抗缀合物对BT-474乳腺癌细胞系的抗增殖活性。如图所示，发现非细胞结合性对照缀合物利妥昔单抗-化合物(X)对BT-474细胞的活性显著较低。
图7中示出了化合物(X)的利妥昔单抗和帕妥珠单抗缀合物对NCI-N87胃癌细胞系的抗增殖活性。如图所示，发现非细胞结合性对照缀合物利妥昔单抗-化合物(X)对NCI-N87细胞的活性显著较低。
图8中示出了化合物(XI)的利妥昔单抗和帕妥珠单抗缀合物对BT-474乳腺癌细胞系的抗增殖活性。如图所示，发现非细胞结合性对照缀合物利妥昔单抗-化合物(X)对BT-474细胞的活性显著较低。
图9中示出了化合物(XI)的利妥昔单抗和帕妥珠单抗缀合物对NCI-N87胃癌细胞系的抗增殖活性。如图所示，发现非细胞结合性对照缀合物利妥昔单抗-化合物(X)对NCI-N87细胞的活性显著较低。
图11中示出了化合物(XVIII)和化合物(XI)的帕妥珠单抗缀合物对BT-474乳腺癌细胞系的抗增殖活性。如图所示，发现非细胞结合性对照缀合物利妥昔单抗-化合物(XVIII)对BT-474细胞的活性显著较低。
图12中示出了如WO2021/198965中所述的化合物(XLI)、化合物(XIX)和化合物(Ie)和(Ii)的帕妥珠单抗缀合物对BT-474乳腺癌细胞系的抗增殖活性。如附图和下面相应的表所示，通过戊二酰亚胺环连接至帕妥珠单抗的降解剂针对BT-474细胞具有与通过末端苯环上的取代连接的降解剂相似的活性。相反，发现非细胞结合性对照缀合物或利妥昔单抗对BT-474细胞的活性显著较低。这证明包括能够进行本文所述的逆曼尼希反应的间隔区是将含有戊二酰胺或二氢尿嘧啶的降解剂与抗体或其它细胞结合剂连接和释放的合适通用解决方案。通过使用该技术，不需要引入附加化学处理来实现基于抗体向癌细胞的递送。
表4：缀合物对BT-474细胞系的IC50值
化合物/缀合物 IC50
帕妥珠单抗-化合物(XLI) 2.094E-12
帕妥珠单抗-化合物(Ie) 1.723E-12
帕妥珠单抗-化合物(XIX) 2.051E-11
帕妥珠单抗-化合物(Ii) 4.259E-12
帕妥珠单抗-化合物(Ia) 4.194E-12
利妥昔单抗-化合物(XLI) >2E-09
利妥昔单抗-化合物(XIX) >2E-09
实施例5B：体外MV-4-11抗增殖测定的程序
使用体外抗增殖测定来测量要求保护的缀合物抑制MV-4-11细胞的细胞生长的能力。将MV-4-11细胞在有/无1μM封闭抗体吉妥珠单抗或曲妥珠单抗的情况下暴露于不同浓度的缀合物或抗体4天。通过alamarBlue测定细胞的活力。图13中示出了化合物(XL)的吉妥珠单抗缀合物和未缀合的BRD4降解剂小分子化合物40-3的抗增殖活性。如图所示，单独的化合物(XL)的吉妥珠单抗缀合物是高活性的，但当CD33表面抗原被吉妥珠单抗预饱和时，活性低约1000倍。用曲妥珠单抗(抗HER2抗体，在MV-4-11中没有HER2表达)预封闭对缀合物活性没有影响。BRD4降解剂小分子化合物40-3也是高活性的。单独的抗体直到1mM都没有活性。
实施例5C：体外BRD4蛋白降解测定的程序
使用体外降解测定测量要求保护的缀合物降解BRD4的能力。将MV4-11细胞与试验品一起孵育过夜。将蛋白质负载到4-12％NuPAGE Bis-Tris凝胶。以1:1,000稀释度用兔抗BRD4 Ab(Cell Signaling#13440)进行蛋白质印迹并以1:1,000用β-肌动蛋白HRP(CellSignaling#5125)进行再印迹。图14中示出了吉妥珠单抗缀合物化合物(XL)和未缀合的BRD4降解剂小分子化合物40-3的降解活性。化合物40-3在10nM下引起BRD4蛋白条带强度降低>90％。化合物(XL)的吉妥珠单抗缀合物在10nM下引起BRD4蛋白条带强度降低>70％，并且BRD4耗竭依赖于缀合物浓度。
实施例5D：确定缀合物与代表性癌细胞系的结合的体外测定
使用实施例10中描述的程序，计算代表性IC50值，显示缀合物和未缀合的抗体与代表性癌细胞系的结合。结果示于表5中。
表5：缀合物对BT-474细胞系的IC50值
如表中所示，与接头-有效载荷的缀合对抗体的靶细胞结合亲和力没有显著影响。
实施例6：旁邻细胞杀伤测定的一般程序
使用旁邻细胞活性测定来测量来自于从靶细胞释放的缀合物的药物抑制非靶向细胞(Jurkat HiBiT)生长的能力。将每孔2,000个细胞的靶细胞和每孔1,000个细胞的Jurkat HiBiT接种在100μL完全细胞生长培养基(RPMI 1640，10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素)中。使用3倍连续稀释度将缀合物稀释于完全细胞生长培养基中，并且每孔添加100μL。最终浓度在3x 10-8M至1.37x 10-11M的范围内。将细胞在37℃湿润的5％CO2培养箱中孵育5天。通过NanoGlo HiBiT裂解试剂(Promega N3030)确定剩余Jurkat HiBiT细胞的活力。将NanoGlo HiBiT裂解试剂80μL添加到板中并在RT下孵育20分钟。通过在多孔板读数器中测量发光来分析板。从所有值中减去仅具有培养基和NanoGlo HiBiT裂解试剂的孔的背景发光。通过将每个经处理的样品值除以具有未处理细胞的孔的平均值来计算活力百分比。对于每种处理，将活力百分比值相对于测试样品浓度绘制在半对数图中。IC50值是自动计算的。
图10中示出了在存在和不存在Jurkat HiBiT的情况下，化合物(X)的帕妥珠单抗缀合物对SK-BR-3乳腺癌细胞系的抗增殖活性。如图所示，缀合物通过仅在SK-BR3(Her 2+)细胞的存在下降低Jurkat HiBiT标记细胞(HER 2-)的活力来证明旁邻细胞杀伤。
实施例7：缀合物对体内乳腺癌肿瘤模型的活性的确定
五至八周龄的雌性ICR SCID小鼠来自Taconic。对小鼠在腹股沟脂肪垫中原位植入悬浮于Matrigel和培养基的混合物中的1e7个HCC1569人乳腺癌细胞。使用卡尺每周监测肿瘤生长几次，并将小鼠随机分配到治疗组中以获得大约100-150mm3的起始肿瘤体积。在组分配后，以3mg/kg或10mg/kg，单次10ml/kg侧尾静脉注射如WO2021/198965中所述的帕妥珠单抗-化合物(XI)缀合物或帕妥珠单抗-化合物(Ia)缀合物处理小鼠。注射后，每天监测小鼠并每周测量两次体重和肿瘤体积。使用(a x b2)/2的标准计算方法确定肿瘤体积，其中“b”是最小直径，“a”是最大直径。结果示于图14和图15中。
如图15A所示，两种类型的缀合物相对于媒介物减小肿瘤大小或减缓肿瘤生长，这显示通过戊二酰亚胺环连接至抗体的降解剂和通过末端苯环上的取代连接的降解剂都是有效的肿瘤疗法。
如图15B中所示，相对于媒介物对照组或与给药前记录的初始体重比较时，用任一类型的缀合物治疗均未显著改变随时间的组均体重变化。用缀合物治疗小鼠不产生不良反应，并且在研究期间不需要人道干预。因此，用如上所述两种类型的缀合物治疗是良好耐受的。
实施例7-1：缀合物对体内髓性白血病肿瘤模型的活性的确定
皮下肿瘤模型-将MV-4-11人急性髓性白血病细胞(1x 107个细胞，0.1mL)皮下接种到雌性无胸腺裸鼠的右胁腹。当肿瘤大小达到100-150mm3时，用每种试验品处理小鼠。通过每周一次静脉内施用(IV)递送10mg/kg的CD33-D抗体-化合物(XL)缀合物(在20mM琥珀酸盐、8％蔗糖、0.01％吐温-20pH 5.5中)，持续2周。将在1.5mg/mL、5％Kolliphor、HS15 WFI缓冲液中0.4mg/kg的化合物(XL)(在5％NMP、45％PEG300、20mM NaPi pH 6.5中)和10mg/kg的ARV-825(如Liu等人Chemistry&Biology 2015，第22卷，第755-763页中所述)通过腹膜内施用(IP)处理，每天一次，持续14天。每周测量肿瘤大小和小鼠体重两次。用下式计算皮下肿瘤体积(mm3)：(a xb2/2)，其中“b”是最小直径，“a”是最大直径。研究终点是按照各自的肿瘤体积≥1,000mm3或第60天(以先到者为准)对个体小鼠实施安乐死。
在第1天和第8天给药CD33-D抗体-化合物(XL)缀合物(使用自毁间隔区和本发明的方法制备)显示在22天的过程中MV-4-11肿瘤生长延迟(图22)。每天给药相应的BRD4异双功能降解剂小分子(化合物15来自Xiamg,W.等人,Biorganic Chemistry 2021，第115卷)(相当于缀合的有效载荷剂量)是无活性的。ARV-825(一种良好分析的BRD4 PROTAC)当根据其公开的给药方案(https://doi.org/10.3389/fonc.2020.574525；Blood(2016)128(22):748.)施用时也是无活性的。图23示出了每个剂量组随时间的个体肿瘤体积，并且图24示出了研究过程中每个剂量组中小鼠的平均体重。
实施例8：J591内源半胱氨酸缀合
用2.5当量的TCEP处理具有Cys突变的抗PSMA抗体(6.1mg/mL，在50mM EPPS、5mMEDTA pH 7.0缓冲液中，并在37℃下孵育2小时以部分还原链间二硫键。冷却至环境温度后，将8当量的化合物(XV)以在DMA中的储备溶液的形式添加到还原抗体中，得到最终反应混合物，其由在含10％(v/v)DMA的50mM EPPS、5mM EDTA pH 7.0中的5.5mg/mL还原抗体+8当量的化合物(XV)组成。将反应物在环境温度下孵育2小时。使用Zeba 40K脱盐柱，通过凝胶过滤将缀合物纯化到20mM琥珀酸盐、8％蔗糖、0.01％吐温-20pH5.5中。如图16所示，通过LC-MS发现缀合物具有平均4.0个药物/抗体和25.8％单体。
实施例9：J591 S239C位点特异性工程化半胱氨酸缀合
用0.1体积的1M Tris、200mM EDTA pH 8.0处理在20mM组氨酸、250mM蔗糖pH 6.5中的重链中具有S239C突变的J591抗体以将pH调节至约7.5。通过用100当量的DTT处理9.4mg/mL溶液并在环境温度下孵育过夜来还原抗体。通过使用Zeba脱盐柱脱盐，将还原抗体纯化到50mM Tris、100mM NaCl pH 8.0中。通过用20当量的脱氢抗坏血酸处理10mg/mL的还原抗体溶液并在环境温度下孵育2小时，重新形成链间二硫键，得到在重链中具有未配对的半胱氨酸的抗体中间体。通过SEC使用HiLoad 16/200Superdex 200pg柱，用20mM琥珀酸盐、150mM NaCl(pH 5.5)洗脱，纯化该中间体。通过以下方式实现缀合：用0.1体积的1MTris pH 7.5将中间体的pH调节至约7，添加丙二醇，并以在DMA中的储备溶液的形式添加6当量的化合物(XV)，使得最终反应混合物由在20mM琥珀酸盐、150mM NaCl中的2mg/mL抗体+6当量化合物(XV)组成，用50％(v/v)丙二醇共溶剂调节至pH 7.0。将反应混合物在环境温度下孵育2小时。使用Zeba 40K脱盐柱，通过凝胶过滤将缀合物纯化到20mM琥珀酸盐、8％蔗糖、0.01％吐温-20pH 5.5中。发现缀合物具有1.85个药物/抗体、96.7％单体和<2.5％未缀合的有效载荷，如图17所示。
实施例10：CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物中靶抗原结合保留的确认
为了确保CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物中的缀合不影响抗体部分的靶抗原结合特性，测试CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物与CD79b-A抗体(泊洛妥珠单抗)相比的CD79b结合亲和力。将一种B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞系Ramos通过离心从其生长培养基中漂洗并重悬于流式细胞术缓冲液(5％FBS的PBS溶液)中。然后将细胞接种在96孔板中并与CD79b-A抗体、三种不同DAR的CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物(2.0、3.2和4.6)或非结合性对照抗体Synagis N297A在4℃下孵育1小时。通过离心洗涤细胞，然后重悬于流式细胞术缓冲液中。洗涤两次后，将细胞在抗人Alexa FluorTM488缀合的二抗(Invitrogen,A11013)中以2μg/mL的浓度在4℃下孵育1小时。将细胞洗涤两次并在AttuneTMNxT流式细胞仪(ThermoFisher Scientific)上通过流式细胞术分析。如图25所示，显示缀合对抗原结合亲和力的影响可忽略，因为所有三种DAR的CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物以与CD79b-A抗体类似的方式与CD79b结合。非结合性对照Synagis N297A显示相对可忽略的信号强度。
实施例11：通过CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物降解IRAK的确认
为了显示CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物降解IRAK4的能力，将Ramos细胞接种在6孔细胞培养板中，并用在生长培养基(RPMI1640+10％热灭活FBS)中的浓度范围为0至50nM的三种不同DAR(2.0、3.2和4.6)的CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物处理。包括WO2021247897 A1中描述的其未缀合的有效载荷以及未缀合的抗体对照CD79b-A抗体用于比较。在37℃、5％CO2下孵育48小时后，收获细胞并通过离心冲洗，随后重悬于冰冷的PBS中。洗涤两次后，通过离心沉淀细胞，并使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA(ThermoFisher Scientific，78440)进行裂解。超声处理样品以进行更彻底的裂解过程。在4℃下孵育20分钟后，将样品以12,000rcf离心20分钟并收集上清液。使用Pierce BCA测定试剂盒(ThermoFisher Scientific，23227)根据制造商的方案，确定每份样品中的蛋白质含量。添加BoltTM LDS样品缓冲液(ThermoFisher Scientific，B0007)和β-巯基乙醇(Bio-Rad Laboratories，1610710)，最终v/v比率分别为25％和2.5％。在10％聚丙烯酰胺凝胶(ThermoFisher Scientific，NW00105BOX)的每个孔中添加总计10μg蛋白质，并在150V下进行电泳50分钟。使用iBlot 2干印迹系统(ThermoFisher Scientific)根据制造商的方案，进行转移过程。在转移过程之后，通过在RT下与5％脱脂乳在TBST中孵育1小时来封闭PVDF膜。使用IRAK4的一抗(Abcam，ab119942)以1:1000的稀释比率在封闭溶液中在RT下将膜染色1小时。将膜在TBST中洗涤3次，每次5分钟，然后用HRP缀合的二抗(Cell Signaling，7076)在RT下以1:5000的稀释度染色1小时。使用ECL在iBrightTMFL1500成像系统(ThermoFisher Scientific)上对膜成像。对于负载对照，使用相同的程序，但改为用HRP缀合的抗β-肌动蛋白抗体(Cell Signaling，5125)以1:5000的稀释度对膜进行染色。
如图26所示，用CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物处理的细胞显示IRAK4的剂量依赖性降解，DAR越高显示降解越有效。CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物的未缀合的有效载荷也显示IRAK4的剂量依赖性降解。未缀合的抗体对照CD79b-A抗体对IRAK4水平没有影响。
实施例12：CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物的靶抗原特异性结合的确认
为了确认观察到的CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物对IRAK4的降解是由CD79b结合介导的，进行封闭实验，其中在治疗期间使CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物与CD79b-A抗体竞争结合CD79b。将Ramos细胞系接种在12孔细胞培养板中，并在RT下用0.05nM-5μM的CD79b-A抗体预孵育15分钟。在不改变培养基的情况下，在上面以10nM的浓度添加CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物。添加未处理的细胞、仅用CD79b-A抗体处理的细胞和仅用10nM的CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物处理的细胞作为对照。将细胞在37℃、5％CO2下孵育48小时。在处理结束时收获所有细胞，并且使用蛋白质印迹(如先前实施例中所述)以β-肌动蛋白作为负载对照来确定每种条件下的IRAK4水平。
如图27所示，通过在共处理条件下IRAK4条带强度随CD79b-A抗体浓度增加而增加来确认CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物的抗原特异性结合。在5μM的CD79b-A抗体下，CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物对IRAK4几乎没有影响，如通过与未处理的条件类似的条带强度所证实的。用10nM的CD79b-A抗体处理的细胞未显示IRAK4降解，仅用CD79b-A抗体-化合物(XLIII)缀合物处理的细胞显示最有效的降解。
应当了解，意在详述部分而非发明内容以及说明书摘要部分用于对权利要求书进行解释。发明内容和说明书摘要部分可以阐述发明人所设想的本公开的一个或多个但不是全部的示例性方面，并且因此不旨在以任何方式限制本公开和所附权利要求。
以上已借助于示出了指定功能及其关系的实现的功能构建块描述了本公开。为了便于描述，本文已任意定义了这些功能构建块的边界。只要合适执行特定功能和其关系，就可界定替代边界。
特定方面的前述描述将如此完全地揭示本公开的一般性质，以使他人可通过应用本领域的技术内的知识在不脱离本公开的一般概念的情况下容易地修改和/或改编此类特定方面以用于各种应用，而无需过度实验。因此，基于本文所呈现的教导内容和指导内容，此类改编和修改旨在处于所公开的方面的等同物的含义和范围内。应当理解，本文的措词或术语目的在于说明而非限制，因此技术人员将会根据教导内容以及指导内容来对本说明书的术语或措词进行解释。
本公开的广度和范围不应受任何上述示例性方面的限制，而应仅根据以下权利要求及其等同项来限定。

Claims (117)

1.一种式(XXXII)的缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
a为1至10；
A'为或/>其中
n为0或1；
每个Y独立地为S或O；
指示与R1的连接点；并且
指示与亚甲基基团的连接点；
R1与A'一起是诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物；
R2选自氢、为R1-A'提供稳定性的基团、为R1-A'提供溶解性的基团和为R1-A'提供稳定性和溶解性的基团；
L为可切割接头；并且
Bm为能够特异性结合蛋白质的结合部分。
2.一种式(XX)的缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
a为1至10；
n为0或1；
R1是诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物；
R2选自氢、-(CH2CH2O)v-CH3、C2-C6烯基、C1-C6烷基、C2-C6炔基、苄基、C3-C6环烷基和C3-C6环烷基(C1-C3烷基)，其中v为1至24；
每个Y独立地为S或O；
L为可切割接头；并且
Bm为能够特异性结合蛋白质的结合部分。
3.如权利要求1或2所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述结合部分为抗体、抗体片段或抗原结合片段。
4.如权利要求1至3中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中a为2至8。
5.如权利要求1至4中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述接头可被蛋白酶切割。
6.如权利要求5所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中L选自由以下组成的组
其中：
q为2至10；
Z1、Z2、Z3、Z4和Z5各自独立地不存在或为L-或D-构型的天然存在的氨基酸残基，前提是Z1、Z2、Z3、Z4和Z5中的至少两者为氨基酸残基；
为与母体分子部分的连接点；并且
为与所述结合部分的连接点。
7.如权利要求6所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中Z1、Z2、Z3、Z4和Z5独立地不存在或选自由以下组成的组：L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-瓜氨酸、D-瓜氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-谷氨酰胺、D-谷氨酰胺、L-谷氨酸、D-谷氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-天冬酰胺、D-天冬酰胺、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-赖氨酸、D-赖氨酸和甘氨酸；前提是Z1、Z2、Z3、Z4和Z5中的至少两者为氨基酸残基。
8.如权利要求7所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中：
Z1不存在或为甘氨酸；
Z2不存在或选自由以下组成的组：L-谷氨酰胺、D-谷氨酰胺、L-谷氨酸、D-谷氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸和甘氨酸；
Z3选自由以下组成的组：L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸和甘氨酸；
Z4选自由以下组成的组：L-瓜氨酸、D-瓜氨酸、L-天冬酰胺、D-天冬酰胺、L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸和甘氨酸；并且
Z5不存在或为甘氨酸。
9.如权利要求1至8中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中L为
10.如权利要求9所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中q为4。
11.如权利要求1至4中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中L为生物还原性接头。
12.如权利要求11所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中L选自由以下组成的组
其中：
q为2至10；
R、R'、R”和R”'各自独立地选自氢、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、(C1-C6)2NC1-C6烷基和C1-C6烷基，或者两个偕R基团与它们所连接的碳原子一起可形成环丁基或环丙基环；
为与母体分子部分的连接点；并且
为与所述结合部分的连接点。
13.如权利要求12所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中L为
14.如权利要求13所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中q为2。
15.如权利要求1至4中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中L为点击释放接头。
16.如权利要求15所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中L为
其中：
q为2至10；
为与母体分子部分的连接点；并且
为与所述结合部分的连接点。
17.如权利要求1至4中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中L为β-葡萄糖醛酸酶可切割接头。
18.如权利要求15所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中L为
其中：
q为2至10；
----不存在或为键；
为与母体分子部分的连接点；并且
为与所述结合部分的连接点。
19.如权利要求1至18中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中L连接至所述Bm中的半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸或谷氨酰胺。
20.如权利要求19所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述半胱氨酸或赖氨酸为工程化半胱氨酸或赖氨酸。
21.如权利要求19所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述半胱氨酸或赖氨酸对于所述Bm是内源的。
22.如权利要求1至21中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中Bm为抗体或其抗原结合部分。
23.如权利要求22所述的缀合物，其中根据EU编号，L连接至所述抗体或其抗原结合部分的重链位置S239和/或K334处的工程化半胱氨酸。
24.如权利要求22所述的缀合物，其中根据EU编号，L连接至所述抗体或其抗原结合部分的重链位置295处的谷氨酰胺。
25.如权利要求1至24中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述Bm结合的所述蛋白质是表面抗原，任选地其中所述Bm与所述表面抗原的结合引起所述缀合物或其药学上可接受的盐内化到细胞中。
26.如权利要求25所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述表面抗原包括5T4、ACE、ADRB3、AKAP-4、ALK、AOC3、APP、Axin1、AXL、B7H3、B7-H4、BCL2、BCMA、bcr-abl、BORIS、BST2、C242、C4.4a、CA 125、CA6、CA9、CAIX、CCL11、CCR5、CD123、CD133、CD138、CD142、CD15、CD15-3、CD171、CD179a、CD18、CD19、CD19-9、CD2、CD20、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27L、CD28、CD3、CD30、CD31、CD300LF、CD33、CD352、CD37、CD38、CD4、CD40、CD41、CD44、CD44v6、CD5、CD51、CD52、CD54、CD56、CD62E、CD62P、CD62L、CD70、CD71、CD72、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD90、CD97、CD125、CD138、CD141、CD147、CD152、CD154、CD326、CEA、CEACAM5、CFTR、凝集因子、cKit、闭合蛋白3、闭合蛋白18.2、CLDN6、CLEC12A、CLL-1、cll3、c-MET、Crypto 1生长因子、CS1、CTLA-4、CXCR2、CXORF61、细胞周期蛋白Bl、CYP1B1、钙粘蛋白-3、钙粘蛋白-6、DLL3、E7、EDNRB、EFNA4、EGFR、EGFRvIII、ELF2M、EMR2、ENPP3、EPCAM、EphA2、肝配蛋白A4、肝配蛋白B2、EPHB4、ERBB2(Her2/neu)、ErbB3、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、ETBR、ETV6-AML、FAP、FCAR、FCRL5、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT3、叶酸受体α、叶酸受体β、FOLR1、Fos相关抗原1、岩藻糖基GM1、GCC、GD2、GD3、GloboH、GM3、GPC1、GPC2、GPC3、gplOO、GPNMB、GPR20、GPRC5D、GUCY2C、HAVCR1、HER2、HER3、HGF、HMI.24、HMWMAA、HPV E6、hTERT、人端粒酶逆转录酶、ICAM、ICOS-L、IFN-α、IFN-γ、IGF-I受体、IGLL1、IL-2受体、IL-4受体、IL-13Ra2、IL-l lRa、IL-1受体、IL-12受体、IL-23受体、IL-13受体、IL-22受体、IL-4受体、IL-5受体、IL-6受体、干扰素受体、整联蛋白(包括α4、αvβ3、αvβ5、αvβ6、α1β4、α4β1、α4β7、α5β1、α6β4、αIIbβ3整联蛋白)、整联蛋白αV、肠羧基酯酶、KIT、LAGE-la、LAIR1、LAMP-1、LCK、豆荚蛋白、LewisY、LFA-1(CD11a)、L-选择素(CD62L)、LILRA2、LIV-1、LMP2、LRRC15、LY6E、LY6K、LY75、MAD-CT-1、MAD-CT-2、MAGE Al、MelanA/MARTl、间皮素、ML-IAP、MSLN、粘蛋白、MUC1、MUC16、mut hsp70-2、MYCN、肌肉生长抑制素、NA17、NaPi2b、NCA-90、NCAM、粘连蛋白-4、NGF、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、NY-BR-1、NY-ESO-1、邻乙酰基-GD2、OR51E2、OY-TES1、p53、p53突变体、PANX3、PAP、PAX3、PAX5、p-CAD、PCTA-1/半乳凝素8、PD-L1、PD-L2、PDGFR、PDGFR-β、磷脂酰丝氨酸、PIK3CA、PLAC1、聚唾液酸、前列腺酶、前列腺癌细胞、前列腺癌相关蛋白、铜绿假单胞菌、狂犬病毒、生存素和端粒酶、PD-1、PRSS21、PSCA、PSMA、PTK7、RAGE-1、RANKL、Ras突变体、呼吸道合胞病毒、恒河猴因子、RhoC、RON、ROR1、ROR2、RU1、RU2、肉瘤易位断点、SART3、SLAMF7、SLC44A4、sLe、SLITRK6、精子蛋白17、1-磷酸鞘氨醇、SSEA-4、SSX2、STEAP1、TAG72、TARP、TCRβ、TEM1/CD248、TEM7R、腱生蛋白C、TF、TGF-1、TGF-β2、TNF-α、TGS5、Tie 2、TIM-1、Tn Ag、TRAC、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TROP-2、TRP-2、TRPV1、TSHR、肿瘤抗原CTAA16.88、酪氨酸酶、UPK2、VEGF、VEGFR1、VEGFR2、波形蛋白、WTl、XAGE1或它们的组合，任选地其中结合CD33的所述Bm包含SEQ ID NO:1和2、3和4、5和6、22和23、24和25或27和28的氨基酸序列，其中结合PSMA的所述Bm包含SEQ ID NO:7和8、9和10、11和12或29和30的氨基酸序列，其中结合HER2的所述Bm包含SEQ ID NO:13和14、15和16或17和18的氨基酸序列，其中结合CD20的所述Bm包含SEQ ID NO:31和32的氨基酸序列，其中结合CD79b的所述Bm包含SEQ ID NO:33和34的氨基酸序列，或其中结合BCMA的所述Bm包含SEQ ID NO:35和36的氨基酸序列。
27.如权利要求25所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述表面抗原包括HER2、CD20、CD38、CD33、BCMA、CD138、EGFR、FGFR4、GD2、PDGFR或它们的组合。
28.如权利要求22所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述抗体选自由以下组成的组：利妥昔单抗、曲妥珠单抗、吉妥珠单抗、帕妥珠单抗、奥妥珠单抗、奥法木单抗、达雷木单抗、STI-6129、林妥珠单抗、huMy9-6、贝兰他单抗、英达妥昔单抗、西妥昔单抗、地妥昔单抗、抗CD38 A2抗体、huAT15/3抗体、阿仑单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗、贝伐单抗、帕尼单抗、曲美木单抗、替昔木单抗、卡妥索单抗、奥戈伏单抗、维妥珠单抗、泊洛妥珠单抗、J591、洛伏妥珠单抗和戈沙妥珠单抗。
29.如权利要求28所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述抗体为利妥昔单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、huMy9-6、林妥珠单抗、吉妥珠单抗或CD33-D。
30.如权利要求1或3至29中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R2是为所述缀合物提供稳定性的基团。
31.如权利要求1或3至30中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R2选自C2-C6烯基、C1-C6烷基、C2-C6炔基、苄基、C3-C6环烷基和C3-C6环烷基(C1-C3烷基)。
32.如权利要求1或3至31中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R2为C1-C6烷基。
33.如权利要求1或3至32中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R2为甲基。
34.如权利要求1或3至29中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R2是为所述缀合物提供溶解性的基团。
35.如权利要求1、3至29或34中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R2选自：
其中：
每个n独立地为1、2、3、4或5；
每个y独立地为1或2；并且
每个R独立地为氢、C6H11O5、C12H21O10、C18H31O15或C24H41O20。
36.如权利要求1至35中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中每个Y为O。
37.如权利要求1或3至36中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1-A'为PPI调节剂。
38.如权利要求1或3至36中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1-A'为靶向蛋白降解剂。
39.如权利要求1或3至38中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1-A'为分子胶。
40.如权利要求1或3至39中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1-A'为取代的异吲哚啉。
41.如权利要求1或3至40中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1-A'为5'-取代的异吲哚啉。
42.如权利要求1至41中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1为式(XXX)的化合物：
其中：
表示与母体分子部分的连接点；
A为苯基或C4-C10环烷基环；
R10独立地选自氢和卤代基；
U选自NH和CF2；并且
R20选自-CH3、-C(O)R3、-N(R4)2、-(CH2)nOH、-(CH2)nN(R4)2、-(CH2)nQ'(CH2)mOH、-(CH2)nQ'(CH2)mSH和-(CH2)nQ'(CH2)mN(R4)2；其中
R3为氢或C1-C6烷基；
每个R4独立地为氢或C1-C6烷基；
Q'为O、S或NR4；
n为1-6；并且
m为2-5。
43.如权利要求42所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中
A为苯基；
U为NH；
R10为卤代基；并且
R20为甲基。
44.如权利要求42所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中
A为苯基；
U为NH；
R10为卤代基；并且
R20为-(CH2)2O(CH2)2NHCH3。
45.如权利要求1或3至38中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1-A'为蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)。
46.如权利要求1至38或45中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1具有下式：
POI-L100-CBN；
其中：
POI是与所关注的蛋白质结合的化合物；
L100为PROTAC接头；并且
CBN为小脑蛋白结合部分。
47.如权利要求46所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述所关注的蛋白质是核激素受体、翻译终止因子、转录因子、细胞周期蛋白依赖性激酶、酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶或E3连接酶。
48.如权利要求46或47所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述所关注的蛋白质选自CD33、GSPT1、BRD4、AR、ER、IKZF1/3、CK1a、BCL-XL、IKZF2、IRAK4、BTK、STAT3、BTK和iMiD、BRD9、TRK、MDM2、CDK2/CDK9、CD97b和EGFR。
49.如权利要求46至48中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中L100包含一个或多个选自以下的官能团：二醇、烷基、炔基、三唑基、哌嗪基、哌啶基和它们的组合。
50.如权利要求46至49中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中CBN选自
指示与A'的连接点；并且
指示与L100的连接点。
51.如权利要求1至36、38或45至50中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R1选自
/>
/>
/>
其中表示与A'的连接点。
52.如权利要求1至51中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中(a)所述Bm结合的所述蛋白质是CD33并且R1结合小鼠双微体2同系物(MDM2)，(b)所述Bm结合的所述蛋白质是前列腺特异性膜抗原(PSMA)并且R1结合雄激素受体(AR)，(c)所述Bm结合的所述蛋白质是CD33并且R1结合含溴结构域的蛋白4(BRD4)，(d)所述Bm结合的所述蛋白质是HER2并且R1结合G1至S期转换蛋白1(GSPT1)，(e)所述Bm结合的所述蛋白质是CD33并且R1结合GSPT1，(f)所述Bm结合的所述蛋白质是CD79b并且R1结合IRAK4，(g)所述Bm结合的所述蛋白质是HER2并且R1结合BRD4，(h)所述Bm结合的所述蛋白质是BCMA并且R1结合BRD4，或(i)所述Bm结合的所述蛋白质是HER2并且R1结合ER。
53.一种药物组合物，其包含权利要求1至52中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载剂。
54.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用药学上可接受量的权利要求1至53中任一项所述的缀合物或组合物或其药学上可接受的盐。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、胃癌、淋巴瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、头颈癌、鳞状细胞癌、肝细胞癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、结肠癌、卵巢癌、神经调节蛋白-1(NRG1)阳性癌症、肺癌或非霍奇金淋巴瘤。
56.如权利要求54所述的方法，其中(a)所述Bm结合的所述蛋白质是CD33，R1结合MDM2，并且所述癌症是急性髓性白血病，(b)所述Bm结合的所述蛋白质是前列腺特异性膜抗原(PSMA)，R1结合雄激素受体(AR)，并且所述癌症是前列腺癌，(c)所述Bm结合的所述蛋白质是CD33，R1结合含溴结构域的蛋白4(BRD4)，并且所述癌症是急性髓性白血病，(d)所述Bm结合的所述蛋白质是HER2，R1结合G1至S期转换蛋白1(GSPT1)，并且所述癌症是乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、胆管癌、结肠癌、卵巢癌或神经调节蛋白-1(NRG1)阳性癌症，(e)所述Bm结合的所述蛋白质是CD79b，R1结合IRAK4，并且所述癌症是非霍奇金淋巴瘤，(f)所述Bm结合的所述蛋白质是HER2，R1结合BRD4，并且所述癌症是乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、胆管癌、结肠癌、卵巢癌或神经调节蛋白-1(NRG1)阳性癌症，或(g)所述Bm结合的所述蛋白质是BCMA，R1结合BRD4，并且所述癌症是多发性骨髓瘤。
57.如权利要求54至56中任一项所述的方法，其还包括在如权利要求1至53中任一项所述的缀合物或组合物或其药学上可接受的盐之前、之后或与其同时向所述受试者施用药学上可接受量的附加剂。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述附加剂为细胞毒性剂或免疫应答调节剂。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述免疫应答调节剂为检查点抑制剂。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述检查点抑制剂包括PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、TIM3抑制剂和/或LAG-3抑制剂。
61.一种式(XXII)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
n为0或1；
R1是诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物；
R2选自氢、-(CH2CH2O)v-CH3、C2-C6烯基、C1-C6烷基、C2-C6炔基、苄基、C3-C6环烷基和C3-C6环烷基(C1-C3烷基)，其中v为1至24；
每个Y独立地为S或O；并且
L*为与所述结合部分缀合的可切割接头前体。
62.一种式(XXXI)的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
A'为其中
n为0或1；
每个Y独立地为S或O；
指示与R1的连接点；并且
指示与亚甲基基团的连接点；
R1与A'一起是诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物；
R2选自氢、为R1-A'提供稳定性的基团、为R1-A'提供溶解性的基团和为R1-A'提供稳定性和溶解性的基团；并且
L为与所述结合部分缀合的可切割接头前体。
63.如权利要求61或62所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L*为蛋白酶可切割接头前体。
64.如权利要求61至63中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L*选自由以下组成的组
其中：
q为2至10；
Z1、Z2、Z3、Z4和Z5各自独立地不存在或为L-或D-构型的天然存在的氨基酸残基，前提是Z1、Z2、Z3、Z4和Z5中的至少两者为氨基酸残基；并且
为与母体分子部分的连接点。
65.如权利要求64所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Z1、Z2、Z3、Z4和Z5独立地不存在或选自由以下组成的组：L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-瓜氨酸、D-瓜氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-谷氨酰胺、D-谷氨酰胺、L-谷氨酸、D-谷氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-天冬酰胺、D-天冬酰胺、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-赖氨酸、D-赖氨酸和甘氨酸；前提是Z1、Z2、Z3、Z4和Z5中的至少两者为氨基酸残基。
66.如权利要求65所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
Z1不存在或为甘氨酸；
Z2不存在或选自由以下组成的组：L-谷氨酰胺、D-谷氨酰胺、L-谷氨酸、D-谷氨酸、L-天冬氨酸、D-天冬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸和甘氨酸；
Z3选自由以下组成的组：L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸和甘氨酸；
Z4选自由以下组成的组：L-瓜氨酸、D-瓜氨酸、L-天冬酰胺、D-天冬酰胺、L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸和甘氨酸；并且
Z5不存在或为甘氨酸。
67.如权利要求61至66中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L*为
其中为与母体分子部分的连接点。
68.如权利要求67所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中q为4。
69.如权利要求61或62所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L*为生物还原性接头前体。
70.如权利要求61、62或69中任一项所述的化合物或其药学上
可接受的盐，其中L*选自由以下组成的组
其中：
q为2至10；
R、R'、R”和R”'各自独立地选自氢、C1-C6烷氧基C1-C6烷基、(C1-C6)2NC1-C6烷基和C1-C6烷基，或者两个偕R基团与它们所连接的碳原子一起可形成环丁基或环丙基环；
为与母体分子部分的连接点。
71.如权利要求70所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L*为
72.如权利要求71所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中q为2。
73.如权利要求61或62所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L*为点击释放接头前体。
74.如权利要求73所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L*为
其中：
q为2至10；并且
为与母体分子部分的连接点。
75.如权利要求61或62所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L*为β-葡萄糖醛酸酶可切割接头前体。
76.如权利要求75所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L*为
其中：
q为2至10；
----不存在或为键；并且
为与母体分子部分的连接点。
77.如权利要求62至76中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2是为R1-A'提供稳定性的基团。
78.如权利要求62至77中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2选自C2-C6烯基、C1-C6烷基、C2-C6炔基、苄基、C3-C6环烷基和C3-C6环烷基(C1-C3烷基)。
79.如权利要求62至78中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2为C1-C6烷基。
80.如权利要求62至79中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2为甲基。
81.如权利要求62至76中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2是为R1-A'提供溶解性的基团。
82.如权利要求62至76或81中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中R2选自：
/>
其中：
每个n独立地为1、2、3、4或5；
每个y独立地为1或2；
每个R独立地为氢、C6H11O5、C12H21O10、C18H31O15或C24H41O20。
83.如权利要求61至82中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中每个Y为O。
84.如权利要求62至83中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1-A'为PPI调节剂。
85.如权利要求62至83中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1-A'为靶向蛋白降解剂。
86.如权利要求62至83中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1-A'为分子胶。
87.如权利要求62至86中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1-A'为取代的异吲哚啉。
88.如权利要求62至87中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1-A'为5'-取代的异吲哚啉。
89.如权利要求61至88中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1具有下式：
其中：
表示与母体分子部分的连接点；
A为苯基或C4-C10环烷基环；
R10独立地选自氢和卤代基；
U选自NH和CF2；并且
R20选自-CH3、-C(O)R3、-N(R4)2、-(CH2)nOH、-(CH2)nN(R4)2、-(CH2)nQ'(CH2)mOH、-(CH2)nQ'(CH2)mSH和-(CH2)nQ'(CH2)mN(R4)2；其中
R3为氢或C1-C6烷基；
每个R4独立地为氢或C1-C6烷基；
Q'为O、S或NR4；
n为1-6；并且
m为2-5。
90.如权利要求89所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
A为苯基；
U为NH；
R10为卤代基；并且
R20为甲基。
91.如权利要求89所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
A为苯基；
U为NH；
R10为卤代基；并且
R20为-(CH2)2O(CH2)2NHCH3。
92.如权利要求62至85中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1-A'为蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)。
93.如权利要求61至85或92中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1具有下式：
POI-L100-CBN；
其中：
POI是与所关注的蛋白质结合的化合物；
L100为PROTAC接头；并且
CBN为小脑蛋白结合部分。
94.如权利要求93所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述所关注的蛋白质是核激素受体、翻译终止因子、转录因子、细胞周期蛋白依赖性激酶、酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶或E3连接酶。
95.如权利要求93或94所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述所关注的蛋白质选自CD33、GSPT1、BRD4、AR、ER、IKZF1/3、CK1a、BCL-XL、IKZF2、IRAK4、BTK、STAT3、BTK和iMiD、BRD9、TRK、MDM2、CDK2/CDK9、CD97b和EGFR。
96.如权利要求93至95中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中L100包含一个或多个选自以下的官能团：二醇、烷基、炔基、三唑基、哌嗪基、哌啶基和它们的组合。
97.如权利要求93至96中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中CBN选自
其中
指示与A'的连接点；并且
指示与L100的连接点。
98.如权利要求62至85或92至97中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1选自
/>
/>
/>
其中表示与A'的连接点。
99.一种用于制备式(XXXII)的缀合物：
或其药学上可接受的盐的方法，其中：a为1至10；
A'为其中
n为0或1；
每个Y独立地为S或O；
指示与R1的连接点；并且
指示与亚甲基基团的连接点；
R1与A'一起是诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物；
R2选自氢、为R1-A'提供稳定性的基团、为R1-A'提供溶解性的基团和为R1-A'提供稳定性和溶解性的基团；
L为可切割接头；并且
Bm为能够特异性结合蛋白质的结合部分；
所述方法包括：
使(XXXI)的化合物
或其药学上可接受的盐与结合部分反应，其中：
A'、R1和R2如以上所定义并且
L*为可切割接头前体；
所述结合部分能够特异性结合蛋白质。
100.如权利要求99所述的方法，其还包括将L*连接至所述Bm中的半胱氨酸、赖氨酸、酪氨酸或谷氨酰胺。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述半胱氨酸或赖氨酸为工程化半胱氨酸或赖氨酸。
102.如权利要求100所述的方法，其中所述半胱氨酸或赖氨酸对于所述Bm是内源的。
103.如权利要求99所述的方法，其中所述结合部分为抗体或其抗原结合部分。
104.如权利要求103所述的方法，其中根据EU编号，L*连接至所述抗体或其抗原结合部分的重链位置S239和/或K334处的工程化半胱氨酸。
105.如权利要求103所述的方法，其中根据EU编号，L*连接至所述抗体或其抗原结合部分的重链位置295处的谷氨酰胺。
106.如权利要求100至105中任一项所述的方法，其中所述连接经由位点特异性缀合实现。
107.如权利要求100至106中任一项所述的方法，其中(a)所述Bm结合的所述蛋白质是CD33并且R1结合小鼠双微体2同系物(MDM2)，(b)所述Bm结合的所述蛋白质是前列腺特异性膜抗原(PSMA)并且R1结合雄激素受体(AR)，(c)所述Bm结合的所述蛋白质是CD33并且R1结合含溴结构域的蛋白4(BRD4)，(d)所述Bm结合的所述蛋白质是HER2并且R1结合G1至S期转换蛋白1(GSPT1)，(e)所述Bm结合的所述蛋白质是CD33并且R1结合GSPT1，(f)所述Bm结合的所述蛋白质是CD79b并且R1结合IRAK4，(g)所述Bm结合的所述蛋白质是HER2并且R1结合BRD4，(h)所述Bm结合的所述蛋白质是BCMA并且R1结合BRD4，或(i)所述Bm结合的所述蛋白质是HER2并且R1结合ER。
108.如权利要求99至107中任一项所述的方法，其中R1-A'为靶向蛋白降解剂。
109.如108所述的方法，其中R1具有下式：
POI-L100-CBN；
其中：
POI是与所关注的蛋白质结合的化合物；
L100为PROTAC接头；并且
CBN为小脑蛋白结合部分。
110.如权利要求109所述的方法，其中所述所关注的蛋白质是核激素受体、翻译终止因子、转录因子、细胞周期蛋白依赖性激酶、酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶或E3连接酶
111.如权利要求109或110所述的方法，其中所述所关注的蛋白质选自CD33、GSPT1、BRD4、AR、ER、IKZF1/3、CK1a、BCL-XL、IKZF2、IRAK4、BTK、STAT3、BTK和iMiD、BRD9、TRK、MDM2、CDK2/CDK9、CD97b和EGFR。
112.如权利要求109至111中任一项所述的缀合物或其药学上可接受的盐，其中L100包含一个或多个选自以下的官能团：二醇、烷基、炔基、三唑基、哌嗪基、哌啶基和它们的组合。
113.如权利要求109至112中任一项所述的方法或其药学上可接受的盐，其中CBN选自：
其中
指示与A'的连接点；并且/>指示与L100的连接点。
114.如权利要求109至113中任一项所述的方法，其中R1选自：
/>
/>
/>
/>
其中表示与A'的连接点。
115.一种缀合物，其通过权利要求99至114中任一项所述的方法制备。
116.一种将诱导蛋白质-蛋白质相互作用的缀合物递送至细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求1至53或115中任一项所述的缀合物或组合物或其药学上可接受的盐接触。
117.一种将式(XXXII)的缀合物：
或其药学上可接受的盐递送至细胞的方法，其中：
a为1至10；
A'为其中
n为0或1；
每个Y独立地为S或O；
指示与R1的连接点；并且
指示与亚甲基基团的连接点；
R1与A'一起是诱导蛋白质-蛋白质相互作用的化合物；
R2选自氢、为R1-A'提供稳定性的基团、为R1-'A提供溶解性的基团和为R1-A'提供稳定性和溶解性的基团；
L为可切割接头；并且
Bm为能够特异性结合蛋白质的结合部分；
所述方法包括使所述细胞与式(XXXII)的缀合物或其药学上可接受的盐接触。
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