CN118185905B

CN118185905B - 脂肪酶Lip1897-H106W及其应用

Info

Publication number: CN118185905B
Application number: CN202410619940.2A
Authority: CN
Inventors: 孙建安; 余可欣; 毛相朝; 高坤鹏
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2024-05-20
Filing date: 2024-05-20
Publication date: 2024-07-26
Anticipated expiration: 2044-05-20
Also published as: CN118185905A; CN118480529A

Abstract

本发明公开了脂肪酶Lip1897‑H106W及其应用，属于脂肪酶技术领域。所述脂肪酶Lip1897‑H106W的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。所述脂肪酶Lip1897‑H106W在制备DHAPG中的应用，具体应用时，采用脂肪酶Lip1897‑H106W催化DHAEE和甘油发生甘油解反应合成DHAPG。本发明的脂肪酶Lip1897‑H106W是对脂肪酶Lip1897进行改造后获得的，催化甘油解反应合成DHAPG时具有更优异的甘油解效率。本发明的脂肪酶Lip1897‑H106W在高效制备高纯度DHAPG方面具有重要应用价值。

Description

脂肪酶Lip1897-H106W及其应用

技术领域

本发明涉及脂肪酶Lip1897-H106W及其应用，属于脂肪酶技术领域。

背景技术

二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA，C22:6）是人体所必需的一种多不饱和脂肪酸。不同分子形式的DHA性质存在较大差异，DHA甘油酯相比于DHA乙酯（DHA ethylesters，DHAEE）具有更好的生物利用度和生物安全性。DHA甘油酯可细分为DHA甘油单酯（DHA monoglycerides，DHAMG）、DHA甘油二酯（DHA diglycerides，DHADG）和DHA甘油三酯（DHA triglycerides，DHATG），其中DHAMG和DHADG统称为DHA偏甘油酯（DHA partialglycerides，DHAPG）。研究表明，DHAPG的生物利用度与DHATG相当，同时表现出优异的乳化性能和预防体脂积累、肥胖的功效，具有较大的发展前景。

制备DHAPG可以通过生物酶法实现，生物酶法制备DHAPG是通过脂肪酶（E.C.3.1.1.3）的特异性催化反应实现的。现有技术中大多数脂肪酶无法高效合成高纯度DHAPG，因此，挖掘具有DHAPG高效催化合成活性的新型脂肪酶具有重要意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了脂肪酶Lip1897-H106W及其应用，属于脂肪酶技术领域。

本发明是通过以下技术方案实现的：

脂肪酶Lip1897-H106W，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

所述脂肪酶Lip1897-H106W在制备DHAPG中的应用。

进一步地，具体应用时，采用脂肪酶Lip1897-H106W催化DHAEE和甘油发生甘油解反应合成DHAPG。

更进一步地，具体操作为：在10 mL反应管中，将DHAEE与甘油按照摩尔比1:25的比例混合，总底物质量为500 mg，加入底物总质量的12%的水，加入30 U的脂肪酶Lip1897-H106W，充入氮气保护后用封口膜缠绕密封，在45℃、连续抽真空至真空度100 Pa、220 r/min恒温水浴摇床的条件下反应8 h。

本发明的脂肪酶Lip1897-H106W，是对脂肪酶Lip1897进行改造后获得的，催化甘油解反应合成DHAPG时具有更优异的甘油解效率，在优化的反应条件下催化甘油解反应8h，DHAPG产率可达70.85%，DHAEE转化率可达95.02%。本发明的脂肪酶Lip1897-H106W在高效制备高纯度DHAPG方面具有重要应用价值。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：脂肪酶Lip1897的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1表示蛋白标准品，泳道2表示纯酶液；图左侧的数字表示蛋白的分子量，“KDa”为分子量的单位“千道尔顿”。

图2：脂肪酶Lip1897对不同碳链长度的对硝基苯酚酯的水解活力示意图。

图3：脂肪酶Lip1897在不同温度时的相对酶活示意图。

图4：脂肪酶Lip1897在不同温度条件下孵育不同时间后的相对酶活示意图。

图5：脂肪酶Lip1897在不同pH时的相对酶活示意图，其中，“citrate buffer”表示柠檬酸盐缓冲液，“PBS”表示磷酸盐缓冲液，“Tris-HCl”表示Tris-HCl缓冲液，“Gly-NaOH”表示甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。

图6：脂肪酶Lip1897在不同pH条件下孵育不同时间后的相对酶活示意图，其中，“citrate buffer”表示柠檬酸盐缓冲液，“PBS”表示磷酸盐缓冲液，“Tris-HCl”表示Tris-HCl缓冲液。

图7：脂肪酶Lip1897在不同金属离子以及Na₂EDTA条件下的相对酶活示意图，其中，“control”表示空白对照。

图8：脂肪酶Lip1897在不同表面活性剂条件下的相对酶活示意图。

图9：脂肪酶Lip1897经不同有机试剂孵育后的相对酶活示意图。

图10：脂肪酶Lip1897的闭合结构模型。

图11：脂肪酶Lip1897的开放结构模型。

图12：脂肪酶Lip1897距离配体分子4Å距离以内的氨基酸残基示意图。

图13：野生型脂肪酶Lip1897及5种突变体酶的SDS-PAGE电泳图，其中，“marker”表示蛋白标准品；“WT”表示野生型脂肪酶Lip1897；“Lip1897-H106W”表示脂肪酶Lip1897-H106W，“Lip1897-H106F”表示脂肪酶Lip1897-H106F，“Lip1897-H106Y”表示脂肪酶Lip1897-H106Y，“Lip1897-H106A”表示脂肪酶Lip1897-H106A，“Lip1897-H106N”表示脂肪酶Lip1897-H106N。

图14：野生型脂肪酶Lip1897及5种突变体酶的比酶活测定结果示意图，其中，“WT”表示野生型脂肪酶Lip1897；“Lip1897-H106W”表示脂肪酶Lip1897-H106W，“Lip1897-H106F”表示脂肪酶Lip1897-H106F，“Lip1897-H106Y”表示脂肪酶Lip1897-H106Y，“Lip1897-H106A”表示脂肪酶Lip1897-H106A，“Lip1897-H106N”表示脂肪酶Lip1897-H106N；a、b、c、d、e、f表示比酶活在p≤0.05水平上存在显著差异。

图15：脂肪酶Lip1897及5种突变体酶催化甘油解反应效果比较示意图，其中，“WT”表示野生型脂肪酶Lip1897；“Lip1897-H106W”表示脂肪酶Lip1897-H106W，“Lip1897-H106F”表示脂肪酶Lip1897-H106F，“Lip1897-H106Y”表示脂肪酶Lip1897-H106Y，“Lip1897-H106A”表示脂肪酶Lip1897-H106A，“Lip1897-H106N”表示脂肪酶Lip1897-H106N；a、b、c、d、e、f表示DHAPG产率在p≤0.05水平上存在显著差异；A、B、C、D、E表示DHAEE转化率在p≤0.05水平上存在显著差异。

图16：脂肪酶Lip1897、脂肪酶Lip1897-H106W与底物DHAEE的对接结果示意图，其中，A：脂肪酶Lip1897与底物DHAEE的对接结果；B：脂肪酶Lip1897-H106W与底物DHAEE的对接结果。

图17：不同底物摩尔比对甘油解反应的影响示意图，其中，a、ab、bc、c、d表示DHAPG产率在p≤0.05水平上存在显著差异。

图18：不同初始水分添加量对甘油解反应的影响示意图，其中，a、b、bc、cd、d、e、f表示DHAPG产率在p≤0.05水平上存在显著差异。

图19：不同反应温度对甘油解反应的影响示意图，其中，a、b、ab、bc表示DHAPG产率在p≤0.05水平上存在显著差异。

图20：不同加酶量对甘油解反应的影响示意图，其中，a、b、ab表示DHAPG产率在p≤0.05水平上存在显著差异。

图21：不同反应时间对甘油解反应的影响示意图，其中，a、b、c、d表示DHAPG产率在p≤0.05水平上存在显著差异。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。

本发明所采用的pET-22b质粒，为发明人所在实验室保存；pET-22b质粒是本领域常用的基因表达载体，可常规市场购买得到。

本发明所采用的LB培养基的组分组成为：氯化钠10 g/L；胰蛋白胨10 g/L；酵母提取物5 g/L；琼脂粉15 g/L（配制固体培养基时加入）；余量为水；灭菌条件：115℃，30 min。

本发明所采用的ZYP-5052自诱导培养基的组分组成为：蛋白胨10 g/L；酵母提取物5 g/L；MgSO₄ 2 mM；Na₂HPO₄ 50 mM；KH₂PO₄ 50 mM；(NH₄)₂SO₄ 25 mM；5052母液2%（体积比）；余量为水；灭菌条件：115℃，30 min。所述5052母液的组分组成为：甘油25%（体积比），葡萄糖25 g/L，α-乳糖100 g/L；余量为水；灭菌条件：115℃，30 min。

本发明所采用的Taq DNA聚合酶，购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

本发明所采用的大肠杆菌Trelief ^TM5α感受态细胞，购自天根生化科技（北京）有限公司。

本发明所采用的大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，购自北京擎科生物科技有限公司。

本发明所采用的快速质粒小提试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司。

本发明所采用的葡萄糖、α-乳糖、咪唑、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、柠檬酸钠、甘油、乙醇、乙酸，均购自国药集团化学试剂有限公司；本发明所采用的琼脂粉、氯化钠、氨苄霉素，均购自北京索莱宝科技有限公司；本发明所采用的蛋白胨、酵母提取物，均购自OXOID公司；本发明所采用的异丙醇、正己烷、石油醚、乙醚，均购自上海麦克林生物科技有限公司。

本发明所采用的EE型DHA藻油，纯度≥90%，购自陕西海斯夫生物工程有限公司。

实施例1 脂肪酶Lip1897的挖掘

本发明从NCBI数据库中挖掘到了一个来源于热淀粉酶链霉菌（Streptomyces thermodiastaticus）的脂肪酶序列（WP_189797364.1），由291个氨基酸组成，删除N端由28个氨基酸残基组成的信号肽，剩余的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，对其编码基因进行大肠杆菌密码子优化，密码子优化后的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，人工合成该基因片段，以pET-22b质粒为表达载体构建重组质粒，在大肠杆菌（Escherichia coli）中高效表达。将该脂肪酶命名为脂肪酶Lip1897。

进化树分析结果表明，脂肪酶Lip1897属于脂类水解酶第Ⅰ家族中的第7亚家族。利用ExPaSy（https://web.expasy.org/protparam/）预测脂肪酶Lip1897的分子量、等电点，预测结果显示，脂肪酶Lip1897的分子量约29 kDa，等电点为5.51。

脂肪酶Lip1897的氨基酸序列如下所示，如SEQ ID NO.1所示：

HASDASAASAPSSGWNDYDCKPSAAHPRPVVLVHGTFGNSVDNWLSLAPYLQDRGYCVYSFDYGRLPGVPVFCGLGPIEKSAQELSAFVDKVLAATGAAEVDIVGHSQGGMMPRYYLKFLGGAAKVNALVGIAPSNHGTTLLGLTELLKYFPGASDLLDTATPAIADQIAGSDFLTKLNAGGDTVPGVHYTVIATRYDEVVTPWRSQFLSGPDVHNVLLQDLCPADVSEHLAIALSDRIAHHEVANALDPAHATPTTCASAVS。

脂肪酶Lip1897的编码基因的核苷酸序列（方向5’-3’）如下所示，如SEQ ID NO.2所示：

CATGCAAGCGATGCAAGCGCAGCAAGCGCACCGAGTAGTGGTTGGAATGATTATGATTGTAAACCGAGCGCAGCACATCCGCGTCCGGTTGTTTTAGTTCATGGTACCTTTGGTAATAGCGTGGACAATTGGCTGAGCCTGGCACCGTATCTGCAGGATCGTGGTTATTGTGTTTATAGCTTTGACTACGGTCGCCTGCCGGGTGTTCCGGTTTTTTGTGGTCTGGGTCCGATTGAAAAAAGCGCACAGGAACTGAGCGCATTTGTTGATAAAGTTCTGGCAGCAACCGGTGCAGCAGAAGTTGATATTGTTGGTCATAGCCAGGGTGGTATGATGCCGCGTTATTATCTGAAATTTCTGGGCGGTGCAGCAAAAGTTAATGCCCTGGTTGGTATTGCACCGAGCAATCATGGTACCACCCTGCTGGGTCTGACCGAACTGTTAAAATATTTTCCGGGTGCAAGCGATCTGCTGGATACCGCAACACCGGCAATTGCAGATCAGATTGCAGGTAGCGATTTTCTGACCAAACTGAATGCAGGTGGTGATACCGTTCCGGGTGTTCATTATACCGTTATTGCAACCCGTTATGACGAGGTTGTTACCCCGTGGCGTAGCCAGTTTCTGAGCGGTCCTGATGTTCATAATGTTCTGCTGCAGGATCTGTGTCCGGCAGATGTTAGCGAACATCTGGCAATTGCACTGAGCGATCGTATTGCACATCATGAAGTTGCAAATGCCCTGGATCCGGCACATGCAACCCCGACAACATGTGCAAGTGCAGTTAGC。

实施例2 脂肪酶Lip1897的异源表达

（1）目的基因片段的扩增

实施例1合成的基因片段，进行PCR扩增，扩增所用的特异性引物的核苷酸序列如下所示。

Lip1897-R（方向5’-3’）：GCTAACTGCACTTGCACATGTTGTCGG，如SEQ ID NO.3所示；

Lip1897-F（方向5’-3’）：CATGCAAGCGATGCAAGCGCAG，如SEQ ID NO.4所示。

（2）重组表达载体的构建

将目的基因片段与pET-22b质粒采用无缝克隆技术进行连接，将连接产物转入大肠杆菌Trelief ^TM5α感受态细胞。使用带有氨苄抗性的固体LB培养基（氨苄霉素浓度为100mg/mL）进行阳性转化子筛选。采用Taq DNA聚合酶进行阳性克隆验证。采用快速质粒小提试剂盒从阳性克隆中提取质粒，得pET22b-Lip1897质粒。

（3）重组工程菌的构建

将重组表达载体转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，构建好的重组工程菌在带有氨苄抗性的LB平板上长出。

（4）脂肪酶Lip1897的表达与纯化

重组工程菌以1%（体积百分数）的接种量接种于液体LB培养基中，37℃、220 r/min培养活化12小时；然后以1%（体积百分数）的接种量接种于ZYP-5052自诱导培养基中，18℃、220 r/min诱导培养48小时。

取培养液，4℃、8000 r/min离心2分钟，收集菌体，重悬于Tris-HCl缓冲液（20 mM，pH 8.0）中，超声破碎（工作总时间30分钟，超声间隔：3.0 s、3.0 s），8000 r/min离心30min以除去下层的细胞碎片，得到的上清液即为粗酶液。将粗酶液放置在-80℃冰箱内预冻4h，采用真空冷冻干燥机冻干成粗酶粉。

粗酶液使用Ni-NTA镍柱进行亲和层析纯化：使用10 mM咪唑溶液（10 mM咪唑，500mM NaCl，50 mM Tris-HCl，pH 8.0）平衡柱子，上样后依次使用10 mM、20 mM、40 mM、80 mM、100 mM、150 mM、200 mM、500 mM的咪唑溶液进行梯度洗脱，收集各梯度下的洗脱液，将40mM咪唑洗脱液和100 mM咪唑洗脱液合并，使用截留分子量为10 kDa的超滤离心管进行超滤浓缩，至蛋白浓度为4.6 mg/mL，即为纯酶液。对纯酶液进行SDS-PAGE检测，结果如图1所示，蛋白大小与预测分子量相近，表明纯化出的蛋白确为脂肪酶Lip1897，且观察到目标条带附近无明显杂蛋白，纯化出的蛋白纯度较高。将纯酶液转移到10 mL的EP管中，放置在-80℃冰箱内预冻4 h，采用真空冷冻干燥机冻干成纯酶粉，-20℃冷藏备用。

实施例3 脂肪酶Lip1897的酶学性质研究

以实施例2制备的纯酶液为样品，对脂肪酶Lip1897的酶学性质进行研究（研究过程中根据具体情况对纯酶液进行稀释），具体见下述，所有指标均进行三组平行实验，结果表示为平均值±标准差，采用origin 2018软件进行数据的处理和分析，并输出图片。

（1）脂肪酶水解酶活测定

吸取对应pH的缓冲液（20 mM）500 μL于2 mL EP管中，加入10 μL纯酶液和20 μL对硝基苯酚酯溶液（20 mM，溶剂为无水乙醇），于一定温度的水浴锅中反应5 min，加入470 μL的1% SDS（十二烷基磺酸钠）溶液终止反应。取200 μL反应液于96孔板中，利用酶标仪测定405 nm处吸光值。

脂肪酶酶活力（U）：在一定的反应条件下，每分钟水解底物释放1 μmol对硝基苯酚（p−nitrophenol，pNP）所需的酶量为一个酶活单位，即1 U。

所用缓冲液为：20 mM柠檬酸盐缓冲液（citrate buffer）（pH 3.0、4.0、5.0、6.0），20 mM磷酸盐缓冲液（PBS）（pH 6.0、7.0、8.0），20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0、9.0），20 mM甘氨酸-氢氧化钠（Gly-NaOH）缓冲液（pH 9.0、10.0）。

（2）对不同碳链长度的对硝基苯酚酯的水解活力

选择了9种不同碳链长度（C2～C18）的对硝基苯酚酯（分别为）进行研究，分别为：对硝基苯酚乙酸酯（C2）、对硝基苯酚丁酸酯（C4）、对硝基苯酚己酸酯（C6）、对硝基苯酚辛酸酯（C8）、对硝基苯酚癸酸酯（C10）、对硝基苯酚月桂酸酯（C12）、对硝基苯酚豆蔻酸酯（C14）、对硝基苯酚棕榈酸酯（C16）、对硝基苯酚硬脂酸酯（C18）。选择20 mM Tris-HCl缓冲液（pH8.0），固定温度40℃，以不同碳链长度的对硝基苯酯为底物（浓度为20 mM），测定酶活。测定的酶活最高值定义为100%，计算其他底物的相对酶活。

结果如图2所示，脂肪酶Lip1897可以水解不同碳链长度的对硝基苯酚酯，其中，活性最强的底物为对硝基苯酚己酸酯，对中短碳链对硝基苯酚酯C4、C6、C8、C10水解活性较强，而对于超短链的对硝基苯酚乙酸酯（C2）极弱，对于较长碳链的C12～C18水解活性较弱。

（3）最适温度及温度稳定性

以对硝基苯酚己酸酯为底物，选择20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0），分别测定40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃下的酶活，测定的酶活最高值定义为100%，计算其他温度下的相对酶活。结果如图3所示，随着温度的升高，脂肪酶Lip1897的酶活先升高后降低，并且在55℃时具有最高的活性，最适温度为55℃；当温度在40℃～75℃时，各个温度下的相对酶活均在50%以上，而当温度到达80℃时，酶活迅速降低。

将酶液在不同温度下（35℃、45℃、55℃、65℃、75℃）孵育，分别在1 h、2 h、3 h、6h、9 h、12 h、30 h、48 h定时取样，以对硝基苯酚己酸酯为底物，选择20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0），在55℃条件下测定酶活。将孵育前的原始酶活定义为100%，计算不同温度下各个孵育时间的相对酶活。结果如图4所示，脂肪酶Lip1897在较低温度下较为稳定，随着温度的升高，稳定性下降，当温度大于65℃时，仅孵育1 h，相对酶活就下降到25%以下。

（4）最适pH及pH稳定性

固定温度为55℃，以对硝基苯酚己酸酯为底物，分别测定不同pH（3.0～10.0）缓冲液条件下的酶活，所用缓冲液同（1）。测定的酶活最高值定义为100%，计算出其它pH下的相对酶活。结果如图5所示，脂肪酶Lip1897在pH 5.0的条件下表现出最佳活性，在pH 4.0～7.0区间内活性较为稳定，当pH大于8.0时，活性迅速下降，相对活性降低到50%以下。可见脂肪酶Lip1897是一个酸性脂肪酶。

将纯酶液与不同pH的缓冲液混合，于55℃水浴条件下孵育3 h、6 h、9 h、24 h、48h后取样，以对硝基苯酚己酸酯为底物，选择20 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 5.0），在55℃条件下测定酶活。将孵育前的原始酶活定义为100%，计算相应pH缓冲液条件下不同孵育时间的相对酶活。结果如图6所示，当pH为5.0～6.0时，在55℃条件下孵育24 h，活性保留率仍然在80%以上；而当pH为9.0时，在55℃条件下仅孵育3 h，酶活迅速降低到25.8%；可见脂肪酶Lip1897在酸性环境下的热稳定性强于在碱性环境下的热稳定性。

（5）金属离子对酶活的影响

以对硝基苯酚己酸酯为底物，选择20 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 5.0），在55℃条件下，以不添加金属离子以及Na₂EDTA为空白对照，通过向反应体系中加入终浓度为1 mM和10mM的各金属离子（Co²⁺，K⁺，Fe³⁺，Ca²⁺，Mg²⁺，Zn²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺）（阴离子为Cl^-）以及Na₂EDTA进行酶活测定，探究金属离子对酶活的影响。将未添加金属离子和Na₂EDTA的酶活定义为100%，计算添加各金属离子以及Na₂EDTA后的相对酶活。结果如图7所示，1 mM的Ni⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Li⁺、Zn²⁺对酶活有促进作用，Ca²⁺对酶激活作用最为明显，酶活为原来的123.99%，可能是因为Ca²⁺参与维持酶分子的蛋白构象；10 mM的金属离子对酶活均表现出抑制作用，Fe²⁺抑制作用最为明显；螯合剂Na₂EDTA对酶活也有一定的抑制作用。

（6）表面活性剂对酶活的影响

以对硝基苯酚己酸酯为底物，选择20 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 5.0），在55℃条件下，以不添加表面活性剂为空白对照，通过向反应体系中加入终浓度为0.5%（重量体积百分数，单位g/mL）的各表面活性剂（吐温20，吐温60，吐温80，曲拉通X-100，SDS）进行酶活测定，探究表面活性剂对酶活的影响。将未添加表面活性剂的酶活定义为100%，计算添加各表面活性剂后的相对酶活。结果如图8所示，表面活性剂均对酶活有抑制作用，吐温20和SDS对酶活的抑制作用最为强烈，酶活分别降低了80%和88%。酶活性下降的原因可能是因为表面活性剂在酶表面的过度吸附限制了反应的传质过程。

（7）有机试剂耐受性

选取了10种有机试剂：乙腈、丙酮、异丙醇、正己烷、异辛烷、环己烷、叔丁醇、正丙醇、二甲亚砜、甲醇。将这些有机试剂分别和酶液按照1:1的体积比混合（有机试剂的终浓度为50%），放置在55℃水浴锅中孵育1 h。以对硝基苯酚己酸酯为底物，选择20 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 5.0），在55℃条件下进行酶活测定。将对应有机试剂孵育前的酶活定义为100%，计算孵育后的残余酶活，以探究脂肪酶Lip1897对不同有机试剂的耐受性。结果如图9所示，脂肪酶Lip1897在乙腈、丙酮、异丙醇、正丙醇、二甲亚砜中不稳定，孵育后酶活分别为原来的11.55%、15.53%、9.21%、6.76%、6.59%；在正己烷、叔丁醇、环己烷等疏水性适中的有机试剂中的稳定性较好，孵育后相对酶活均在80%以上；这可能是因为，极性较强的有机试剂容易破坏酶蛋白周围的水分子保护层，从而损害酶的活性，而疏水性有机试剂对脂肪酶分子周围的水分子影响不大。异辛烷对脂肪酶Lip1897的酶活有一定的促进作用，孵育后相对酶活为原来的116%，这可能是因为高疏水性的有机试剂会与脂肪酶盖子疏水部分发生相互作用，使盖子打开，脂肪酶分子变成激活状态。

实施例4 脂肪酶的突变改造

脂肪酶Lip1897可以通过甘油解反应制备DHAPG，DHA不以游离的形式存在，不易氧化变质，但效率较低。为提升脂肪酶的甘油解活性，本实施例通过半理性设计对脂肪酶Lip1897进行改造，获得了甘油解活性更高的脂肪酶突变体，具体见下述。

（1）脂肪酶Lip1897的闭合结构模型、开放结构模型的建立

以与脂肪酶Lip1897同源性最接近并已知其闭合晶体结构的脂肪酶（PDB登录号：5H6B）为模板，使用modeller软件对Lip1897的闭合结构进行单模板同源建模。选择RMSD值最小的模型。利用PROCHECK（https://saves.mbi.ucla.edu/）生成模型的拉氏图，对模型进行评估。利用pymol软件将模型可视化。

由于脂肪酶在与底物结合时，是盖子打开的开放型结构。因此，还需构建脂肪酶Lip1897的开放结构模型。首先采用Dali服务网站查询与脂肪酶Lip1897闭合结构相似的模型。找到蛋白结构相似且已知开放结晶结构的模型BCL:5LIP、PAL:1EX9，结合删除盖子结构的脂肪酶（5H6B）模型，采用modeller软件进行多序列同源建模，选择RMSD值最小的模型作为脂肪酶Lip1897的开放模型。利用PROCHECK生成模型的拉氏图，对模型进行评估。利用pymol软件将模型可视化。

脂肪酶Lip1897的闭合结构模型如图10所示，脂肪酶Lip1897的开放结构模型如图11所示，PROCHECK分析结果显示，闭合结构模型和开放结构模型的氨基酸位于最适区的氨基酸数量占比分别为92.7%和91.4%，均大于90%，而位于不允许区的氨基酸数量占比分别为0%和0.5%，均低于5%。证明模型可信度高。

（2）突变位点的选择

使用Autodock Vina软件，将脂肪酶Lip1897开放模型结构与小分子受体DHAEE进行分子对接，利用pymol软件将分子对接的结果可视化，寻找距离配体分子4 Å距离以内的氨基酸，结果如图12所示，显示有13个氨基酸（Ile16、Gly35、Thr36、Phe37、His106、Ser107、Thr139、Leu141、Leu142、Gln168、Val200、His230、Leu231）在此范围内，其中的His106位于脂肪酶保守五肽序列G-X-S-X-G的第二个非保守氨基酸，在此处进行突变对脂肪酶的性质可能会产生较大影响，突变意义较大。因此选择His106位点作为饱和突变位点，以期寻找到甘油解效率有所提升的突变体。

（4）饱和突变体的设计

在SnapGene软件上进行饱和突变质粒的构建和相应引物的设计，以pET22b-Lip1897质粒（实施例2构建）为模板，利用重叠PCR技术获得19个突变体质粒。

以pET22b-Lip1897质粒为模板，采用各个突变体质粒对应的引物，通过同源重组PCR技术对19个突变体质粒进行PCR扩增。

（5）突变体酶的异源表达

对19个突变体质粒进行异源表达，实验过程同实施例2，制备得到了19种粗酶粉。

（6）粗酶粉甘油解活性初筛

为简化实验，对粗酶粉进行初筛：控制总底物质量为500 mg，DHAEE（EE型DHA藻油，纯度≥90%）与甘油的摩尔比为1:10，初始水分添加量为6%，添加粗酶粉10 mg，反应温度55℃，在220 r/min恒温水浴摇床中反应24 h。反应结束后取样进行HPLC检测。经HPLC分析，筛选出5个甘油解活性较为显著的突变体酶，分别为脂肪酶Lip1897-H106A、脂肪酶Lip1897-H106F、脂肪酶Lip1897-H106N、脂肪酶Lip1897-H106W、脂肪酶Lip1897-H106Y。

（7）突变体酶的纯化

对上述5种突变体酶的粗酶液进行纯化，得5种突变体酶的纯酶液及纯酶粉，实验过程同实施例2。

对5种突变体酶的纯酶液进行SDS-PAGE检测，以野生型脂肪酶Lip1897的纯酶液（实施例2制备）为对照，结果如图13所示，野生型脂肪酶Lip1897和各突变体酶的蛋白分子量大小一致，与理论分子量大小相近，且条带单一，说明蛋白较纯。

（8）突变体酶水解比酶活的比较

以对硝基苯酚棕榈酸酯为底物，选择20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0），在55℃条件下测定各突变体酶的水解酶活，测定方法同实施例3。根据加入纯酶的质量计算水解比酶活。

；

式中，A表示水解酶活（U）；M表示纯酶质量（mg），比酶活的单位为U/mg。

野生型脂肪酶Lip1897及5种突变体酶的比酶活测定结果如图14所示，野生型脂肪酶Lip1897的水解比酶活为127.63 U/mg，脂肪酶Lip1897-H106W、脂肪酶Lip1897-H106Y的水解比酶活有显著的升高，分别为154.97 U/mg、140.09 U/mg，其余3个突变体酶的水解活力显著降低。

（9）突变体酶甘油解活性的比较

10 mL反应管中，控制总底物质量为500 mg，DHAEE与甘油的摩尔比为1:10，初始水分添加量为6%，添加各突变体酶的纯酶粉0.1 mg，充入氮气保护后用封口膜缠绕密封，反应温度55℃，在220 r/min恒温水浴摇床中反应24 h。

反应结束后，先加入1 mL异丙醇，摇晃使体系混合均匀，再加入3 mL正己烷反复震荡萃取，静置分层，上层有机相即为萃取出的油相。吸取1 mL有机相于2 mL EP管中，加入500 mg硫酸钠除水，12000 r/min离心2 min。收集上清，过0.22 μm的有机滤膜，采用HPLC进行分析检测，分别计算和比较DHAPG产率和DHAEE转化率。

HPLC分析的具体条件为：

色谱柱：Phenomenex Luna silica column（飞诺美液相色谱柱）（250 mm×4.6mm，5 μm）；流动相：正己烷/异丙醇/乙酸=92:8:0.003；流速：1 mL/min；检测器：示差检测器（RID）；温度：30℃；上样量：20 μL。

各种脂质的出峰顺序为：TG、EE、DHA、1,3-DG、1,2-DG、1-MG、2-MG。各组分通过对应的标准品进行定性，各组分产率一律按照面积归一化法进行定量计算。

甘油解过程中DHAPG产率（%）和DHAEE转化率(%)的计算公式如下：

；

。

式中：A_TG代表TG的峰面积；A_1,3-DG代表1,3-DG的峰面积；A_1,2-DG代表1,2-DG的峰面积；A_1-MG代表1(3)-MG的峰面积；A_2-MG代表2-MG的峰面积；A_DHA代表DHA的峰面积；A_EE代表EE的峰面积。

脂肪酶Lip1897及5种突变体酶催化甘油解反应效果比较如图15所示，脂肪酶Lip1897-H106W的DHAEE转化率和DHAPG产率分别为野生型脂肪酶Lip1897的1.8倍和1.86倍，脂肪酶Lip1897-H106Y的DHAEE转化率和DHAPG产率分别为野生型脂肪酶Lip1897的1.22倍和1.34倍。脂肪酶Lip1897-H106W的甘油解效率提升更为显著。

（10）分子对接分析

分子对接有助于从结构层面解释蛋白的功能，本发明采用分子对接法解析突变体酶甘油解活性增强的机理。首先以建立的脂肪酶Lip1897开放模型为模板，利用modeller软件对脂肪酶Lip1897-H106W进行同源建模，选择RMSD值最小的模型作为突变体酶的开放模型。利用AutoDock Vina软件，以DHAEE作为配体小分子（从PubChem数据库中获得），分别以脂肪酶Lip1897和脂肪酶Lip1897-H106W的开放模型为受体进行分子对接。具体操作为：将相应蛋白受体和小分子导入AutoDock Vina，分别进行去结合水、加氢键处理，处理好的结构以PDBQT的文件形式导出。以酶的催化三联体为中心，设置一个将催化三联体包裹在中心的底物对接box。运行AutoDock Vina，单次运行获得9个对接结果。输出最优结果，采用pymol对对接结果进行可视化。根据对接后形成的氢键等作用力、结合能等因素分析对接结果。

脂肪酶Lip1897、脂肪酶Lip1897-H106W与底物DHAEE的对接结果如图16所示，脂肪酶Lip1897与底物DHAEE的对接结合能是-3.69 kcal/mol，脂肪酶Lip1897-H106W与底物DHAEE的对接结合能是-6.4 kcal/mol，这说明，脂肪酶Lip1897-H106W在与底物结合时能量更低，构象更加稳定。同时也可以看出，脂肪酶Lip1897与DHAEE进行对接时，底物分子与2个氨基酸残基分别形成2根氢键（虚线表示），而脂肪酶Lip1897-H106W与DHAEE进行对接时，蛋白结构中共3个氨基酸与DHAEE形成了4根氢键，这说明脂肪酶Lip1897-H106W与DHAEE的结合能力更强，形成了更强的范德华力，意味着脂肪酶Lip1897-H106W表现出更强的底物结合能力，从而对该底物表现出更强的催化活力。

综合上述分析，脂肪酶Lip1897-H106W的性能更优异，明显优于其他18种突变体酶。

脂肪酶Lip1897-H106W的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。脂肪酶Lip1897-H106Y的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

脂肪酶Lip1897-H106W的氨基酸序列如下所示，如SEQ ID NO.5所示：

HASDASAASAPSSGWNDYDCKPSAAHPRPVVLVHGTFGNSVDNWLSLAPYLQDRGYCVYSFDYGRLPGVPVFCGLGPIEKSAQELSAFVDKVLAATGAAEVDIVGWSQGGMMPRYYLKFLGGAAKVNALVGIAPSNHGTTLLGLTELLKYFPGASDLLDTATPAIADQIAGSDFLTKLNAGGDTVPGVHYTVIATRYDEVVTPWRSQFLSGPDVHNVLLQDLCPADVSEHLAIALSDRIAHHEVANALDPAHATPTTCASAVS。

脂肪酶Lip1897-H106W的编码基因的核苷酸序列（方向5’-3’）如下所示，如SEQ IDNO.6所示：

CATGCAAGCGATGCAAGCGCAGCAAGCGCACCGAGTAGTGGTTGGAATGATTATGATTGTAAACCGAGCGCAGCACATCCGCGTCCGGTTGTTTTAGTTCATGGTACCTTTGGTAATAGCGTGGACAATTGGCTGAGCCTGGCACCGTATCTGCAGGATCGTGGTTATTGTGTTTATAGCTTTGACTACGGTCGCCTGCCGGGTGTTCCGGTTTTTTGTGGTCTGGGTCCGATTGAAAAAAGCGCACAGGAACTGAGCGCATTTGTTGATAAAGTTCTGGCAGCAACCGGTGCAGCAGAAGTTGATATTGTTGGTTGGAGCCAGGGTGGTATGATGCCGCGTTATTATCTGAAATTTCTGGGCGGTGCAGCAAAAGTTAATGCCCTGGTTGGTATTGCACCGAGCAATCATGGTACCACCCTGCTGGGTCTGACCGAACTGTTAAAATATTTTCCGGGTGCAAGCGATCTGCTGGATACCGCAACACCGGCAATTGCAGATCAGATTGCAGGTAGCGATTTTCTGACCAAACTGAATGCAGGTGGTGATACCGTTCCGGGTGTTCATTATACCGTTATTGCAACCCGTTATGACGAGGTTGTTACCCCGTGGCGTAGCCAGTTTCTGAGCGGTCCTGATGTTCATAATGTTCTGCTGCAGGATCTGTGTCCGGCAGATGTTAGCGAACATCTGGCAATTGCACTGAGCGATCGTATTGCACATCATGAAGTTGCAAATGCCCTGGATCCGGCACATGCAACCCCGACAACATGTGCAAGTGCAGTTAGC。

脂肪酶Lip1897-H106Y的氨基酸序列如下所示，如SEQ ID NO.7所示：

HASDASAASAPSSGWNDYDCKPSAAHPRPVVLVHGTFGNSVDNWLSLAPYLQDRGYCVYSFDYGRLPGVPVFCGLGPIEKSAQELSAFVDKVLAATGAAEVDIVGYSQGGMMPRYYLKFLGGAAKVNALVGIAPSNHGTTLLGLTELLKYFPGASDLLDTATPAIADQIAGSDFLTKLNAGGDTVPGVHYTVIATRYDEVVTPWRSQFLSGPDVHNVLLQDLCPADVSEHLAIALSDRIAHHEVANALDPAHATPTTCASAVS。

脂肪酶Lip1897-H106Y的编码基因的核苷酸序列（方向5’-3’）如下所示，如SEQ IDNO.8所示：

CATGCAAGCGATGCAAGCGCAGCAAGCGCACCGAGTAGTGGTTGGAATGATTATGATTGTAAACCGAGCGCAGCACATCCGCGTCCGGTTGTTTTAGTTCATGGTACCTTTGGTAATAGCGTGGACAATTGGCTGAGCCTGGCACCGTATCTGCAGGATCGTGGTTATTGTGTTTATAGCTTTGACTACGGTCGCCTGCCGGGTGTTCCGGTTTTTTGTGGTCTGGGTCCGATTGAAAAAAGCGCACAGGAACTGAGCGCATTTGTTGATAAAGTTCTGGCAGCAACCGGTGCAGCAGAAGTTGATATTGTTGGTTATAGCCAGGGTGGTATGATGCCGCGTTATTATCTGAAATTTCTGGGCGGTGCAGCAAAAGTTAATGCCCTGGTTGGTATTGCACCGAGCAATCATGGTACCACCCTGCTGGGTCTGACCGAACTGTTAAAATATTTTCCGGGTGCAAGCGATCTGCTGGATACCGCAACACCGGCAATTGCAGATCAGATTGCAGGTAGCGATTTTCTGACCAAACTGAATGCAGGTGGTGATACCGTTCCGGGTGTTCATTATACCGTTATTGCAACCCGTTATGACGAGGTTGTTACCCCGTGGCGTAGCCAGTTTCTGAGCGGTCCTGATGTTCATAATGTTCTGCTGCAGGATCTGTGTCCGGCAGATGTTAGCGAACATCTGGCAATTGCACTGAGCGATCGTATTGCACATCATGAAGTTGCAAATGCCCTGGATCCGGCACATGCAACCCCGACAACATGTGCAAGTGCAGTTAGC。

实施例5 脂肪酶Lip1897-H106W催化甘油解反应制备DHAPG的研究

甘油解反应的初始反应条件：10 mL反应管中，控制总底物质量为500 mg，DHAEE与甘油的摩尔比为1:10，初始水分添加量为6%，添加45 U的脂肪酶Lip1897-H106W的纯酶粉（实施例2制备），充入氮气保护后用封口膜缠绕密封，反应温度55℃，在220 r/min恒温水浴摇床中反应24 h。反应结束后取样进行HPLC检测（同实施例4）。

纯酶粉的酶活的测定条件是：以对硝基苯酚棕榈酯为底物，选择20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0），在60℃条件下测定，测定方法同实施例3。

在常压下对甘油解过程中涉及的底物摩尔比、初始水分添加量、反应温度、加酶量等进行研究和优化，通过控制反应过程中的各个影响因素来调控产物中各类甘油酯的占比，在得到的最优条件下，将体系扩大10倍，将反应转到平行合成仪中，在磁力搅拌（220 r/min）和连续抽真空条件（真空度100 Pa）下催化反应，定时（1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h）取样进行HPLC检测，确定最优催化时间，实现DHAPG的高效甘油解合成。所有数据均进行两次及以上重复实验。数据以平均±标准差表示，部分数据采用SPSS软件对数据进行单因素ANOVA检验和沃勒-邓肯比较，显著性水平设置为0.05。采用Origin 2018软件统计数据并进行图片处理和输出。

（1）底物摩尔比对甘油解反应的影响

在初始反应条件的基础上，调整DHAEE与甘油的摩尔比分别为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，研究底物摩尔比对甘油解反应的影响。

不同底物摩尔比对甘油解反应的影响如图17所示，随着甘油摩尔比占比的增大，反应平衡朝正相进行，DHAEE转化率和DHAPG产率都在逐渐增加。当DHAEE与甘油摩尔比达到1:25时，DHAPG产率达到最高值，进一步增加甘油的摩尔占比，DHAEE转化率和DHAPG产率基本保持稳定。因此，DHAEE和甘油的最适摩尔比为1:25。

（2）初始水分添加量对甘油解反应的影响

酶分子需要通过结合微量水来满足活性构象的变化，但在甘油解反应中，加入水会引起副反应，即DHAEE水解成游离DHA，此时进一步会引发DHA的酯化反应。因此，此时的甘油解反应可能伴随着酯化反应的同步进行。

在已优化条件（摩尔比1:25）的基础上，调整初始水分添加量分别为2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%，研究初始水分添加量对甘油解反应的影响。

不同初始水分添加量对甘油解反应的影响如图18所示，当水分添加量为底物总质量的12%时，DHAPG产率达到最高。继续增加初始水分添加量可能会使得产物DHAPG发生水解反应，从而使产率降低。因此，最适初始水分添加量为12%。

（3）反应温度对甘油解反应的影响

在已优化条件（摩尔比1:25，初始水分添加量12%）的基础上，调整反应温度分别为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，研究反应温度对甘油解反应的影响。

不同反应温度对甘油解反应的影响如图19所示，反应温度从40℃上升到45℃时，DHAPG产率上升到最高值，继续提高温度，DHAPG产率及DHAEE转化率均出现轻微下降趋势，这可能是因为高温会影响脂肪酶Lip1897-H106W的活性和稳定性。因此甘油解反应的最适温度为45℃。

（4）加酶量对甘油解反应的影响

在已优化条件（摩尔比1:25，初始水分添加量12%，反应温度45℃）的基础上，调整加酶量分别为15 U、30 U、45 U、60 U、75 U、90 U，研究加酶量对甘油解反应的影响。

不同加酶量对甘油解反应的影响如图20所示，随着加酶量的增加，DHAEE转化率和DHAPG产率均提高，当加酶量达到30 U时，DHAPG产率基本达到平衡，继续升高加酶量至45U，DHAPG产率仅有微弱提升。这可能是因为此时脂肪酶与底物已经达到饱和，继续添加酶量，会导致部分酶与底物接触不够充分，传质受限。从经济角度考虑，选择30 U为最优加酶量。

（5）反应体系的扩大及DHAPG最优产率的确定

DHAEE在发生甘油解反应的过程中会生成副产物乙醇，限制了DHAEE的进一步转化，对反应体系进行抽真空处理，去除生成的乙醇，有利于使反应平衡朝正相进行。

在上述得到的最优条件（控制总底物质量为500 mg，DHAEE与甘油的摩尔比为1:25，初始水分添加量为12%，添加脂肪酶Lip1897-H106W的纯酶粉30 U，反应温度45℃）的基础上，将体系扩大10倍，将反应转到平行合成仪中，在磁力搅拌（220 r/min）和连续抽真空条件（真空度100 Pa）下催化反应，定时（1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h）取样，以确定最优催化时间。

不同反应时间对甘油解反应的影响如图21所示，真空条件有效提升了甘油解的转化效率，在最优条件下，随着反应时间的推进，DHAEE转化率和DHAPG产率持续上升，当反应时间达到8 h时，反应达到平衡，此时DHAEE转化率达到95.02%，DHAPG产率达到70.85%。

综合上述各因素的考察，确定了脂肪酶Lip1897-H106W催化DHAEE与甘油发生甘油解反应的最佳条件为：DHAEE与甘油摩尔比为1:25，初始水分添加量为底物总质量的12%，反应温度45℃，加酶量为30 U；在最佳反应条件下连续抽真空（真空度100 Pa）反应8 h后达到平衡，DHAPG产率达到70.85%，DHAEE转化率达到95.02%。这说明脂肪酶Lip1897-H106W在催化甘油解反应合成高纯度DHAPG领域具有较高的工业化潜力。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

Claims

1.脂肪酶Lip1897-H106W，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.权利要求1所述的脂肪酶Lip1897-H106W在制备DHAPG中的应用，其特征在于：所述DHAPG是指二十二碳六烯酸偏甘油酯，包括二十二碳六烯酸甘油单酯和二十二碳六烯酸甘油二酯。

3.根据权利要求2所述的脂肪酶Lip1897-H106W在制备DHAPG中的应用，其特征在于：具体应用时，采用脂肪酶Lip1897-H106W催化DHAEE和甘油发生甘油解反应合成DHAPG。

4.根据权利要求3所述的脂肪酶Lip1897-H106W在制备DHAPG中的应用，其特征在于，具体操作为：在10 mL反应管中，将DHAEE与甘油按照摩尔比1:25的比例混合，总底物质量为500 mg，加入底物总质量的12%的水，加入30 U的脂肪酶Lip1897-H106W，充入氮气保护后用封口膜缠绕密封，在45℃、连续抽真空至真空度100 Pa、220 r/min恒温水浴摇床的条件下反应8 h。