CN118184991A - 一种体积排阻色谱填料及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及色谱填料领域，特别是涉及一种体积排阻色谱填料及其制备方法和用途。所述体积排阻色谱填料通过如下步骤制备获得：硅烷偶联剂与聚合物进行第三化学反应获得硅烷；所述聚合物的结构式为，所述聚合物的平均分子量为150~1100；所述硅烷偶联剂的末端具有氰酸酯官能团；所述硅烷与羟基化硅胶进行第四化学反应获得所述体积排阻色谱填料。本申请中所述色谱填料具有良好的稳定性和可调节的分离选择性，批次之间重现性的较好，制备方法简单可控。

Description

一种体积排阻色谱填料及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及色谱填料领域，特别是涉及一种体积排阻色谱填料及其制备方法和用途。
背景技术
蛋白质在材料表面的吸附一直以来都是科学界关注的问题，因为它与许多重要的科学和工业生产密切相关。蛋白吸附在蛋白质的纯化分离，药物传递以及食品加工过程都有着很重要的作用。现有的蛋白不吸附材料主要是以PEG为代表。PEG是一种中性的亲水高分子，由重复的氧乙烯基(-CH2CH2O-)组成，由于分子本身独特的结构,能够与水形成氢键，赋予PEG链高度的亲水性和良好的水溶性。围绕PEG链的氢键可以结合大量的水分子，同时分子链本身的高度流动以及具有很大的空间排斥力，防止了蛋白质分子的吸附，从而避免了进一步的生化反应。然而PEG目前也存在一定的问题，比如PEG的蛋白不吸附性对分子排列有一定要求，过于紧密或分子量太大都会失去效果。另外，PEG双端羟基结构的特殊性致使其在合成过程中不具有选择性通常无法保留端羟基，从而限制了其应用。目前市面上色谱填料对蛋白质有较强的非特异性吸附问题和批次间重现性不好的问题。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种体积排阻色谱填料及其制备方法和用途。本申请中所述色谱填料解决了现有技术中PEG的蛋白不吸附性对分子排列要求高，在合成过程中不具有选择性，对蛋白质有较强的非特异性吸附和批次间重现性不好的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明是通过以下技术方案获得的。
本发明第一方面公开了一种体积排阻色谱填料的制备方法，包括如下步骤：硅烷偶联剂与聚合物进行第三化学反应获得硅烷；所述聚合物的结构式为，所述聚合物平均分子量为150~1100；所述硅烷偶联剂的末端具有氰酸酯官能团；所述硅烷与羟基化硅胶进行第四化学反应获得所述体积排阻色谱填料。所述平均分子量为所述聚合物中所有分子的分子量之和与分子个数的比值。
所述聚合物上氨基与羟基不同的反应性保证了后续合成过程中不同的选择性，带来了良好的分离选择性。
优选地，所述羟基化硅胶表面的硅羟基浓度为2.5~3.0μmol/m2，如所述羟基化硅胶表面的硅羟基浓度可以为2.5μmol/m2、2.6μmol/m2、2.7μmol/m2、2.8μmol/m2、2.9μmol/m2、3.0μmol/m2。
优选地，所述羟基化硅胶粒径为3~6μm，如所述羟基化硅胶粒径可以为3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm。
优选地，所述羟基化硅胶比表面积为100~150m2/g，如所述所述羟基化硅胶比表面积可以为100m2/g、110m2/g、120m2/g、130m2/g、140m2/g、150m2/g。
优选地，所述羟基化硅胶平均孔径为20~40nm，如所述羟基化硅胶平均孔径可以为20nm、25nm、30nm、35nm、40nm。
优选地，所述聚合物的制备方法包括：
a1)聚乙二醇与甲苯磺酰氯溶于二氯甲烷在催化剂的催化下进行第一化学反应获得TsO-PEG-OH，所述第一化学反应的反应路线为：
；
a2)所述TsO-PEG-OH与氯化铵溶于氨水进行第二化学反应，所述第二化学反应的反应路线为：
。
更优选地，所述步骤a1）中聚乙二醇与对甲苯磺酰氯的摩尔比1：（0.9~1.1）如所述步骤a1）中聚乙二醇与对甲苯磺酰氯的摩尔比可以为1:0.9、1:0.95、1:1.0、1:1.05、1:1。
更优选地，所述催化剂为氧化银和/或碘化钾，进一步优选地，加入催化量的所述催化剂。
更优选地，所述聚乙二醇的羟值为100~600mgKOH/g，如所述聚乙二醇的羟值可以为100mgKOH/g、150mgKOH/g、200mgKOH/g、250mgKOH/g、300mgKOH/g、350mgKOH/g、400mgKOH/g、450mgKOH/g、500mgKOH/g、550mgKOH/g、600mgKOH/g。
所述聚乙二醇的不同羟值对应不同的聚合度，作为原料可以给所述色谱填料带来针对不同蛋白质的分离选择性。
更优选地，所述第一化学反应的时间为1~4h，如所述第一化学反应的时间可以为1h、2h、3h、4h。
更优选地，所述步骤2）中所述TsO-PEG-OH与氯化铵的摩尔比为1：（0.9~1.1），如所述TsO-PEG-OH与氯化铵的摩尔比可以为1:0.9、1:0.95、1:1.0、1:1.05、1:1。
更优选地，所述氨水的浓度为20~35wt%，如所述氨水的浓度可以为20wt%、23wt%、26wt%、29wt%、32wt%、35wt%。
更优选地，所述第二化学反应后进行分离提纯。
优选地，所述硅烷偶联剂为异氰酸丙基三甲氧基硅烷。
优选地，所述硅烷偶联剂与所述聚合物的摩尔比为1：（0.9~1.1），如所述硅烷偶联剂与所述聚合物的摩尔比可以为1:0.9、1:0.95、1:1.0、1:1.05、1:1。
优选地，所述第三化学反应在无水条件下进行。
优选地，所述第三化学反应在保护范围下进行。
优选地，所述第三化学反应的温度为70~80℃，如所述第三化学反应的温度可以为70℃、72℃、74℃、76℃、78℃、80℃。
优选地，所述第三化学反应的时间为12~48h，如所述第三化学反应的时间可以为12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h。
优选地，所述第四化学反应中还采用有反应介质，所述反应介质为乙醇。
优选地，所述第四化学反应在保护氛围下进行。
优选地，所述羟基化硅胶与硅烷的摩尔比为1：（0.9~1.1），如所述羟基化硅胶与硅烷的摩尔比可以为1:0.9、1:0.95、1:1.0、1:1.05、1:1。
优选地，所述第四化学反应的温度为70~80℃，如所述第四化学反应的温度可以为70℃、72℃、74℃、76℃、78℃、80℃。
优选地，所述第四化学反应的时间为20~72h，如所述第四化学反应的时间可以为20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h、56h、60h、64h、68h、72h。进一步优选地，所述第四化学反应的时间为24~48h。
更优选地，所述第四化学反应后进行后处理，所述后处理包括分离出所述色谱填料。
进一步优选地，所述后处理还包括对所述分离出的色谱填料进行洗涤和/或干燥的步骤，洗涤用溶液为THF。
更优选地，所述第三化学反应和第四化学反应四中的保护氛围为惰性气体填充无氧氛围。在一个具体实施例中，所述惰性气体为氮气。
本发明第二方面公开了如上文所述的制备方法获得的体积排阻色谱填料。
本发明第三方面还公开了如上文所述色谱填料在分离蛋白质中的用途。
优选地，所述蛋白质选自甲状腺蛋白、γ-球蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白、核糖核苷酶A、尿嘧啶、聚合血红蛋白、人促红素、人粒细胞刺激因子、III型胶原蛋白、溶菌酶、人血白蛋白中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明通过单端键合氨基，保留端羟基，氨基与羟基不同的反应性保证了后续合成过程中不同的选择性，从而达到保留端羟基的目的，保留PEG链端基的亲水能力，带来了良好的分离选择性。
2.本发明通过对聚乙二醇进行单边修饰，然后选用异氰酸丙基三甲氧基硅烷作为偶联剂制备硅烷，所述硅烷与羟基化硅胶桥连，从而在羟基化硅胶表面键合一层均匀纳米厚度的中性亲水层。独有的表面修饰技术，保证硅胶表面键合完全且均匀，确保了所述填料具有良好的稳定性和批次之间的较好重现性。
3.利用聚乙二醇链上的氧原子易于水分子形成氢键，再通过与水结合在其表面构筑水合层或者利用空间排斥的作用防止蛋白质、多肽等生物大分子在表面上的吸附。
4.本研究利用异氰酸酯引入适量的疏水基团，用简单可控的方法带来良好的分离选择性。
5.本研究可以通过调节聚乙二醇聚合度带来不同的分离选择性。
附图说明
图1为本发明应用例1中色谱柱1的色谱图。
图2为本发明应用例1中色谱柱2的色谱图。
图3为本发明应用例1中色谱柱3的色谱图。
图4为本发明应用例2中色谱柱4的色谱图。
图5为本发明应用例3中色谱柱5~7的色谱图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
本申请中，申请人针对传统蛋白质不吸附材料PEG在合成过程中不具有选择性，无法保留端羟基，非特异性吸附较强问题，批次间重现性不好的技术问题，申请人提供了一种体积排阻色谱填料及其制备方法和用途。本申请中所述色谱填料具有良好的稳定性和可调节的分离选择性，批次之间重现性的较好，制备方法简单可控。
在下述具体的实施方式中，所述色谱填料的制备方法为：
1）聚乙二醇与甲苯磺酰氯在催化剂的催化下进行第一化学反应获得TsO-PEG-OH；
2）所述TsO-PEG-OH与氨水进行第二化学反应获得聚合物；
3）硅烷偶联剂与所述聚合物在无氧氛围中进行第三化学反应得到硅烷；
4）羟基化硅胶与所述硅烷在无氧氛围中进行第四化学反应；
5）抽滤、洗涤并干燥。
实施例1
本实施例中色谱填料的具体的加工方法包括如下步骤：
1）在反应瓶中将100mmol的聚乙二醇溶于二氯甲烷，所述聚乙二醇为PEG200，其平均羟值为558KOH/g，所述PEG200是指在标准条件下，1mol的PEG200的质量约为200克。搅拌使其混合均匀，加入150mmol的氧化银催化剂，再加入100mmol的对甲苯磺酰氯，室温下搅拌反应2~3h，随后过滤洗涤得到TsO-PEG-OH;
2）将50mmol的TsO-PEG-OH溶于25%的氨水中，并加入50mmol的氯化铵，30℃下搅拌反应72h，用二氯甲烷萃取，收集到的有机层通过柱层析分离提纯得到NH2-PEG-OH。
3）往三口烧瓶中30mmol的NH2-PEG-OH和30mmol的异氰酸丙基三甲氧基硅烷，加热至75℃进行搅拌反应12h，此步骤确保无水条件下进行反应，需要用氮气进行保护，同时保持磁子不停搅拌，防止聚合反应的发生。反应12h后，关闭加热，保持搅拌备用。
4）在500mL三口烧瓶中加入20g烘干的羟基化硅胶，所述硅胶的粒径为5nm，比表面积为125m2/g，平均孔径为35nm，再加入300ml的无水乙醇。通入氮气，打开油浴锅电源，进行加热至60℃搅拌0.5h。0.5h后往三口烧瓶中滴加上一步反应得到的硅烷，用无水乙醇分三次洗涤烧瓶后都加入反应体系中，再加入15滴氨水。反应体系在75℃下搅拌24h。24h后关闭油浴锅，将反应温度降至室温，以4000rpm离心20min两次分离产物，离心两次后再加入乙醇，用4号砂芯漏斗进行抽滤，再用THF洗涤三次，在砂芯漏斗中搅拌5-10min，滤干，转移至干净干燥的结晶皿中，称重并放置通风橱中通风，通风好后放入55℃的真空烘箱中进行烘干得到色谱填料。
实施例2
与实施例1的不同之处在于，所述聚乙二醇为PEG600，其平均羟值为185KOH/g，所述PEG600是指在标准条件下，1mol的PEG600的质量约为600克。
实施例3
与实施例1的不同之处在于，所述聚乙二醇为PEG1000，其平均羟值为110KOH/g，所述PEG1000是指在标准条件下，1mol的PEG1000的质量约为1000克。
应用例1
分别采用实施例1~3得到的色谱填料通过高效液相色谱仪进行测试，包括如下步骤：
1）准备色谱柱：
分别采用实施例1~3得到的色谱填料制备成如下三个色谱柱：
所述色谱柱1的填料为实施例1中得到的色谱填料；
所述色谱柱2的填料为实施例2中得到的色谱填料；
所述色谱柱3的填料为实施例3中得到的色谱填料；
所述色谱柱1~3的粒径为5μm，孔径为300A，尺寸为4.6x300mm。
2）配置流动相
将8.99g无水磷酸二氢钠与10.65g无水磷酸氢二钠溶于1000ml水中，混匀并过滤，配置成流动相，所述流动相为150mmol/L的磷酸缓冲盐。
3）准备测试目标物：
以所述流动相为溶剂配置浓度为2.0mg/ml的甲状腺球蛋白；浓度为1.0mg/m的γ-球蛋白；浓度为1.0mg/m的卵清蛋白；浓度为1.5mg/m的核糖核酸酶A；浓度为0.1mg/m的尿嘧啶。
4）使用高效液相色谱仪，设置流速为0.35ml/min，检测波长为214nm，柱温为25℃，进样量为10μl。
经测试得到：如附图1~3所示，三款色谱柱都具有明显的体积排阻作用，其中使用PEG600硅胶作为原料的实施例2制备的色谱填料的测试表现分离效果最好。
应用例2
采用实施例2得到的色谱填料通过高效液相色谱仪进行测试，包括如下步骤：
1）准备色谱柱：
所述色谱柱4与所述应用例1中色谱柱2的不同之处在于，所述色谱柱4的尺寸为7.8x300mm。
2）配置流动相：
将8.99g无水磷酸二氢钠与10.65g无水磷酸氢二钠溶于1000ml水中，混匀并过滤，配置成流动相，所述流动相为150mmol/L的磷酸缓冲盐。
3）准备测试目标物：
以所述流动相为溶剂制备浓度为50ppm的卵清蛋白。
4）使用高效液相色谱仪，设置流速为1.0ml/min，检测波长为214nm，柱温为25℃，进样量为10μl。
经测试得到：如附图4所示，当卵清蛋白进样量为非常微量的50ppm时仍然能够非常出色的出峰表现，说明本款产品对蛋白质分子的非特异性吸附非常低。解决了目前市面上色谱填料对蛋白质有较强的非特异性吸附问题。
应用例3
分别采用实施例1~3得到的色谱填料通过高效液相色谱仪进行测试，包括如下步骤：
1）准备色谱柱5~7：
所述色谱柱5的色谱填料制备方法与实施例2相同；
所述色谱柱6的色谱填料制备方法与实施例2的不同之处在于，所述PEG600的羟值为178KOH/g；
所述色谱柱7的色谱填料制备方法与实施例2的不同之处在于，所述PEG600的羟值为196KOH/g；
所述色谱柱5~7的粒径为5μm，所述色谱柱5~7的孔径为300A，所述色谱柱5~7的尺寸为7.8x300mm；
2）配置流动相
将8.99g无水磷酸二氢钠与10.65g无水磷酸氢二钠溶于1000ml水中，混匀并过滤，配置成流动相，所述流动相为150mmol/L的磷酸缓冲盐。
3）准备测试目标物：
以所述流动相为溶剂准备浓度为2mg/ml的甲状腺球蛋白；浓度为1mg/ml的γ-球蛋白；浓度为1mg/ml的卵清蛋白；浓度为1.5mg/ml的核糖核酸酶A；浓度为0.1mg/ml的尿嘧啶。
4）使用高效液相色谱仪，设置流速为1.0ml/min，检测波长为214nm，柱温为25℃，进样量为10μl。
经测试得到：如附图5所示，黑色曲线为色谱柱5的色谱曲线，红色曲线为色谱柱6的色谱曲线，蓝色曲线为色谱柱7的色谱曲线，色谱柱5~7的出峰时间和峰高效果基本一致，说明了产品批次间重现性稳定。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种体积排阻色谱填料的制备方法，其特征在于，硅烷偶联剂与聚合物进行第三化学反应获得硅烷；所述聚合物的结构式为，所述聚合物平均分子量为150~1100；所述硅烷偶联剂的末端具有氰酸酯官能团；所述硅烷与羟基化硅胶进行第四化学反应获得所述体积排阻色谱填料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述羟基化硅胶表面的硅羟基浓度为2.5~3.0μmol/m2；和/或，所述羟基化硅胶粒径为3~6μm；和/或，所述羟基化硅胶比表面积为100~150m2/g；和/或，所述羟基化硅胶平均孔径为20~40nm。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚合物的制备方法包括：
a1)聚乙二醇与甲苯磺酰氯溶于二氯甲烷在催化剂的催化下进行第一化学反应获得TsO-PEG-OH，所述第一化学反应的反应路线为：
；
a2)所述TsO-PEG-OH与氯化铵溶于氨水进行第二化学反应，所述第二化学反应的反应路线为：
。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a1）中聚乙二醇与对甲苯磺酰氯的摩尔比为1：（0.9~1.1）；和/或，所述催化剂为氧化银和/或碘化钾；和/或，所述聚乙二醇的羟值为100~600mgKOH/g；和/或，所述第一化学反应的反应时间为1~4h；和/或，所述第一化学反应后对所述TsO-PEG-OH进行分离并洗涤；和/或，所述步骤a2）中所述TsO-PEG-OH与氯化铵的摩尔比为1：（0.9~1.1）；和/或，所述氨水的浓度为20~35wt%；和/或，所述第二化学反应后进行分离提纯。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述硅烷偶联剂为异氰酸丙基三甲氧基硅烷；和/或，所述硅烷偶联剂与所述聚合物的摩尔比为1：（0.9~1.1）；和/或，所述第三化学反应在无水条件下进行；和/或，所述第三化学反应在保护范围下进行；和/或，所述第三化学反应的温度为70~80℃；和/或，所述第三化学反应的时间为12~48h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第四化学反应中还采用有反应介质，所述反应介质为乙醇；和/或，所述第四化学反应保护氛围下进行；和/或，所述羟基化硅胶与硅烷的摩尔比为1：（0.9~1.1）；和/或，所述第四化学反应的温度为70~80℃；和/或，所述第四化学反应的时间为20~72h。
7.根据权利要求5~6任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述保护氛围为惰性气体填充的无氧氛围。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第四化学反应后进行后处理，所述后处理包括分离出所述色谱填料；优选地，所述后处理还包括对所述分离出的色谱填料进行洗涤和/或干燥的步骤，洗涤用溶液为THF。
9.一种根据权利要求1~8任一项所述的制备方法获得的体积排阻色谱填料。
10.一种根据权利要求9所述的色谱填料在分离蛋白质中的用途。
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