CN118178686A - 一种功能分子探针及其制备方法与应用 - Google Patents

一种功能分子探针及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种功能分子探针及其制备方法与应用，功能分子探针包括单域抗体以及通过化学共价键结合到单域抗体上的功能分子；单域抗体上含有功能基团，功能分子上含有活性反应基团。基于酶介导和点击化学等生物偶联策略，开发具有血脑屏障穿透和肿瘤靶向能力的功能分子探针，实现了脑部肿瘤成像。在体内特性方面，该功能分子探针尺寸小，分子量仅有15‑17kDa左右，组织穿透深度深，循环速度快，可以通过肾脏快速代谢；在材料选择方面，单域抗体免疫原性低；在修饰策略方面，通过精确修饰策略可以将功能分子以共价键偶联到单域抗体的特定位点上，而不破坏抗体的靶向能力，有效避免了功能分子泄露的问题。

Description

一种功能分子探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种功能分子探针及其制备方法与应用。
背景技术
目前造成脑胶质瘤临床困境的主要原因包括：一是脑胶质瘤本身具有高度侵袭性和浸润性，极易渗入邻近组织，形状多变且无确定范围，因此很难通过外科手术根除；二是由于高限制性的血脑屏障(Blood-brain-barrier，BBB)的存在，大多数化合物如造影剂、药物、单克隆抗体等无法进入脑实质，因此难以利用影像学技术实现肿瘤早筛和术中导航，药物治疗效果并不理想。
为了实现成像探针和治疗药物的脑内递送，侵入性与非侵入性方案均被提出。侵入性方案包括脑部刺激、颅内注射等，可能给患者带来巨大痛苦和风险，因此人们更加关注非侵入性方案，包括受体介导的胞吞作用，使用病毒、外泌体等。其中，纳米粒子(Nanoparticles，NPs)由于其容易修饰、载药效率高以及可实现诊疗一体化等优点，被作为脑内递送的载体广泛开发。但目前仍没有纳米粒子被批准进入临床，原因在于：1)纳米粒子的尺寸通常较大，在十几纳米至几微米不等，组织穿透深度受限，且容易在肝脏富集，代谢排出速度慢；2)纳米粒子的合成材料大多未经FDA批准，其生物相容性和生物毒性仍有待考证；3)药物、造影剂等通常通过电荷相互作用或疏水相互作用负载在纳米粒子上，在体内循环过程中可能出现泄漏或过早释放的问题。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种功能分子探针及其制备方法与应用，旨在解决现有脑瘤探针尺寸较大，组织穿透深度受限以及代谢排出速度较慢等问题。
本发明的技术方案如下：
一种功能分子探针，包括单域抗体以及通过化学共价键结合到所述单域抗体上的功能分子；
其中，所述单域抗体上含有功能基团，所述功能基团包括伯氨基、巯基、醛基、羧基、光反应基团、蛋白标签、生物素、链霉亲和素、点击化学基团中的一种或多种；所述功能分子上含有活性反应基团，所述活性反应基团包括伯氨基、羧基、N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、生物素、链霉亲和素、点击化学基团中的一种或多种。
所述的功能分子探针，其中，所述点击化学基团包括叠氮、二苯并环辛炔、反式环辛烯、环丙烷环辛炔、1,2,4,5-四嗪中的一种。
所述的功能分子探针，其中，所述功能分子探针包括如下结构中的一种：
其中，n为3-50之间的自然数。
所述的功能分子探针，其中，所述功能分子探针还偶联有荧光染料、金属螯合剂、造影剂、药物、桥联分子、糖类、脂类、蛋白质、肽、肽类似物、核酸、聚乙二醇中的一种或多种。
一种功能分子探针的制备方法，包括：
将带有LLQS-tag的单域抗体分别与聚乙二醇-氨基、葡萄糖-聚乙二醇-氨基、桥联分子叠氮-聚乙二醇-氨基在缓冲液中混合，并分别加入谷氨酰胺转氨酶，分别得到第一混合液、第二混合液、第三混合液；
对所述第一混合液、所述第二混合液和所述第三混合液进行孵育处理，经尺寸排阻色谱分离，分别得到
所述的功能分子探针的制备方法，其中，所述功能分子探针的制备方法还包括步骤：
将与二苯并环辛炔-葡萄糖在缓冲液中进行混合，得到第四混合液；
对所述第四混合液进行孵育处理，得到
一种功能分子探针在制备用于靶向标记脑瘤组织、细胞或亚细胞结构的产品中的应用。
一种功能分子探针在制备用于对脑瘤进行辅助诊断和/或治疗的产品中的应用。
一种功能分子探针在制备穿透血脑屏障的产品中的应用。
所述的应用，所述产品为用于成像和/或治疗的产品。
有益效果：本发明提供一种功能分子探针及其制备方法与应用，所述功能分子探针包括单域抗体以及通过化学共价键结合到所述单域抗体上的功能分子；其中，所述单域抗体上含有功能基团，所述功能基团包括伯氨基、巯基、醛基、羧基、光反应基团、蛋白标签、生物素、链霉亲和素、点击化学基团中的一种或多种；所述功能分子上含有活性反应基团，所述活性反应基团包括伯氨基、羧基、N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、生物素、链霉亲和素、点击化学基团中的一种或多种。本发明基于酶介导和点击化学等生物偶联策略，开发一系列具有血脑屏障穿透和肿瘤靶向能力的功能分子探针，实现了脑部肿瘤成像。在体内特性方面，该功能分子探针尺寸小，分子量仅有15-17kDa左右，组织穿透深度深，循环速度快，可以通过肾脏快速代谢；在材料选择方面，单域抗体免疫原性低；在修饰策略方面，通过精确修饰策略可以将功能分子以共价键偶联到单域抗体的特定位点上，而不破坏抗体的靶向能力，有效避免了功能分子泄露的问题。
附图说明
图1为实施例1中功能化单域抗体探针的结构示意图；
图2为实施例1中Nb、Nb-L及Nb-L-Glu的蛋白质谱分析检测结果图；
图3为实施例1中Nb、Nb-PEG、Nb-PEG-Glu的SDS-PAGE凝胶电泳结果图；
图4为实施例1中Nb-FAM和Nb-L-Cy5的细胞标记结果图；
图5为实施例1中Nb、Nb-L-Glu、Nb-PEG、Nb-PEG-Glu标记U87MG细胞的共聚焦图像；
图6为实施例1中Nb、Nb-L-Glu、Nb-PEG、Nb-PEG-Glu标记U87MG细胞的流式分析结果图；
图7为实施例1中功能化单域抗体探针的体外血脑屏障穿透性测试数据图；
图8为实施例1中注射功能化单域抗体探针后转基因小鼠头部的荧光图像；
图9为实施例1中注射功能化单域抗体探针后转基因小鼠头部的荧光强度数据图；
图10为实施例1中注射功能化单域抗体探针24h后转基因小鼠脑部离体荧光图像；
图11为实施例1中注射功能化单域抗体探针24h后转基因小鼠脑部平均荧光强度数据图；
图12为实施例1中注射功能化单域抗体探针24h后转基因小鼠主要器官离体荧光图像；
图13为实施例1中注射功能化单域抗体探针24h后转基因小鼠主要器官平均荧光强度数据图；
图14为实施例1中注射功能化单域抗体探针后原位脑胶质瘤小鼠头部的荧光图像；
图15为实施例1中注射功能化单域抗体探针后原位脑胶质瘤小鼠头部的荧光强度数据图；
图16为实施例1中注射功能化单域抗体探针24h后原位脑胶质瘤小鼠脑部离体荧光图像；
图17为实施例1中注射功能化单域抗体探针24h后原位脑胶质瘤小鼠脑部平均荧光强度数据图；
图18为实施例1中注射功能化单域抗体探针24h后原位脑胶质瘤小鼠主要器官离体荧光图像；
图19为实施例1中注射功能化单域抗体探针24h后原位脑胶质瘤小鼠主要器官平均荧光强度数据图。
具体实施方式
本发明提供一种功能分子探针及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。
癌症作为长期困扰人类的健康难题，对经济社会造成了相当的影响。目前，已进入癌症高发期，2020年全球新发癌症病例1930万例左右，死亡近1000万例。其中，多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma，GBM)是成人中枢神经系统中最常见的肿瘤，其致死率极高，属世界卫生组织划定的最高级别(IV级)恶性肿瘤。统计显示，每10万人中就有超过3名脑胶质瘤患者，但目前仍未有可靠有效的治愈手段。现有临床治疗方案包括手术、放疗和替莫唑胺化疗等，均无法显著改善患者的生存结局，患者的生存中位期仅有15-18个月，即使接受治疗，5年生存率仍不足10％。
基于此，本发明提供一种功能分子探针，包括单域抗体以及通过化学共价键结合到所述单域抗体上的功能分子；
其中，所述单域抗体上含有功能基团，所述功能基团包括伯氨基、巯基、醛基、羧基、光反应基团、蛋白标签、生物素、链霉亲和素、点击化学基团中的一种或多种；所述功能分子上含有活性反应基团，所述活性反应基团包括伯氨基、羧基、N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、生物素、链霉亲和素、点击化学基团中的一种或多种。
本实施方式中，使用生物偶联策略将功能分子以化学共价键的方式结合到单域抗体上，开发了一系列具有血脑屏障穿透和肿瘤靶向能力的功能分子探针，实现了脑部肿瘤成像。在体内特性方面，该功能分子探针尺寸小，分子量仅有15-17kDa左右，组织穿透深度深，循环速度快，可以通过肾脏快速代谢；在材料选择方面，单域抗体免疫原性低；在修饰策略方面，通过精确修饰策略可以将功能分子以共价键偶联到单域抗体的特定位点上，而不破坏抗体的靶向能力，有效避免了功能分子泄露的问题。
具体地，所述功能分子探针以单域抗体作为靶向载体，相较于使用纳米粒子、单克隆抗体等，功能分子探针的尺寸更小，体内循环代谢时间短，可以通过肾脏排出，免疫原性低，生物相容性和安全性更高，更利于进入临床转化；此外，单域抗体的小尺寸、高亲和力和高组织穿透性也使得其更容易透过血脑屏障并靶向脑部肿瘤，成像效果更好。
在一些实施方式中，所述功能分子包括但不限于聚乙二醇、葡萄糖、桥联分子中的一种或多种，葡萄糖、聚乙二醇和桥联分子的生物相容性和安全性均已被证实，由此得到的探针更具临床转化前景。
在一些实施方式中，所述点击化学基团包括叠氮、二苯并环辛炔(DBCO)、反式环辛烯(TCO)、环丙烷环辛炔(BCN)、1，2，4，5-四嗪(Tetrazine)中的一种。
具体地，所述单域抗体上的功能基团可以是蛋白本身所具有的官能团，也可以是通过人为引入的可被识别的标签或活性反应基团等。
在一些实施方式中，所述功能分子探针包括如下结构中的一种：
其中，n为3-50之间的自然数。
在一些实施方式中，所述功能分子探针还偶联有荧光染料、金属螯合剂、造影剂、药物、桥联分子、糖类、脂类、蛋白质、肽、肽类似物、核酸、聚乙二醇中的一种或多种。
除此之外，本发明还提供一种功能分子探针的制备方法，包括：
步骤S10：将带有LLQS-tag的单域抗体分别与聚乙二醇-氨基、葡萄糖-聚乙二醇-氨基、桥联分子叠氮-聚乙二醇-氨基在缓冲液中混合，并分别加入谷氨酰胺转氨酶，分别得到第一混合液、第二混合液、第三混合液；
步骤S20：对所述第一混合液、所述第二混合液和所述第三混合液进行孵育处理，经尺寸排阻色谱分离，分别得到
本实施方式中，采用酶介导和点击化学修饰策略，可以在单域抗体特定位点偶联功能分子，有效保留了单域抗体的靶向能力和生理活性，相较于随机修饰(如NHS ester等)所得到的异质性产物，本实施方式制备的功能分子探针均一性好、稳定性高，更有利于临床转化。
具体地，大脑和肿瘤对能量的需求量很大，脑肿瘤和脑内皮细胞上均高表达葡萄糖转运体GLUT，因此通过葡萄糖修饰可以有效增强单域抗体通过主动运输进入细胞内的能力，由此提高了单域抗体的血脑屏障透过率和脑积累量。此外，由于单域抗体尺寸小，代谢速度快，修饰聚乙二醇可以有效改善单域抗体的体内血液循环动力学，进一步提高肿瘤积累量。并且，聚乙二醇和葡萄糖共同作用效果更好。
在一些实施方式中，所述功能分子探针的制备方法还包括步骤：
步骤S30：将与二苯并环辛炔-葡萄糖在缓冲液中进行混合，得到第四混合液；
步骤S40：对所述第四混合液进行孵育处理，得到
在一些实施方式中，所述带有LLQS-tag的单域抗体的浓度为0.1-1mg/mL；所述聚乙二醇-氨基、所述葡萄糖-聚乙二醇-氨基和所述桥联分子叠氮-聚乙二醇-氨基的添加量分别为所述带有LLQS-tag的单域抗体的10-50倍摩尔当量。
具体地，所述带有LLQS-tag的单域抗体中的LLQS-tag为单域抗体上的特定功能基团，是可以被谷氨酰胺转氨酶特异性识别的蛋白标签。谷氨酰胺转氨酶是酶介导策略中可被用于蛋白修饰的一种酶。
在一些实施方式中，所述步骤S10和所述步骤S30中的缓冲液为Tris-NaCl缓冲液；具体地，所述缓冲液为50mM Tris，400mM NaCl，pH 8.0的Tris-NaCl缓冲液。
在一些实施方式中，所述步骤S20中，所述孵育处理包括：将所述第一混合液、所述第二混合液和所述第三混合液置于旋转混匀仪上孵育2-24h，温度控制在4-37℃；或置于磁力搅拌器上，加入磁子以200-600转/min搅拌2-24h，温度控制在4-37℃。
在一些实施方式中，所述步骤S20中，所述尺寸排阻色谱分离包括：将所述第一混合液、所述第二混合液和所述第三混合液经孵育处理后的抗体与酶的混合物经AKTApure通过尺寸排阻色谱(SEC)分离，收集对应特征峰下的蛋白，分别得到功能化单域抗体探针Nb-PEGNb-PEG-Glu/>Nb-L
在一些实施方式中，所述步骤S30和所述步骤S40中，具体为：将Nb-L与5-20倍摩尔当量的二苯并环辛炔-葡萄糖(DBCO-Glucose)在PBS或Tris-NaCl缓冲液中混合，置于旋转混匀仪上孵育0.5-6h，得到Nb-L-Glu
在一些实施方式中，所述单域抗体可偶联不同分子量的聚乙二醇分子和/或不同结构的葡萄糖分子；还可使用不同结构的桥联分子偶联聚乙二醇和/或葡萄糖分子。
在一些实施方式中，可采用其他蛋白修饰方式，如NHS随机反应、sortase反应、点击化学等制备功能化单域抗体探针。
在一些实施方式中，所述单域抗体可使用其他具有靶向功能的小肽或抗体片段(Fab等)代替。
另外，本发明还提供一种所述的功能分子探针在制备用于靶向标记脑瘤组织、细胞、亚细胞结构的产品中的应用。
本发明还提供一种所述的功能分子探针在制备用于对脑瘤进行辅助诊断和/或治疗的产品中的应用。
本发明还提供一种所述的功能分子探针在制备穿透血脑屏障的产品中的应用。
在一些实施方式中，所述产品为用于成像和/或治疗的产品。
下面进一步举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供四种功能分子探针(即功能化单域抗体探针)，包括Nb-PEGNb-PEG-Glu/>Nb-LNb-L-Glu/>其制备步骤包括如下：
1)将0.1-1mg/mL带有LLQS-tag的单域抗体与10-50倍摩尔当量的mPEG2k-NH2、Glucose-PEG2k-NH2、N3-PEG3-NH2分别在Tris-NaCl缓冲液(50mM Tris,400mM NaCl,pH 8.0)中混合，加入1-5U/mL的谷氨酰胺转氨酶，定容至1mL，得到三种混合液；
2)将三种混合液分别置于旋转混匀仪上孵育2-24h，温度控制在4-37℃；或置于磁力搅拌器上，加入磁子以200-600转/min搅拌2-24h，温度控制在4-37℃；
3)将步骤2)得到的抗体与酶的混合物经AKTApure通过尺寸排阻色谱(SEC)分离，收集对应特征峰下的蛋白，得到功能化单域抗体探针Nb-PEG、Nb-PEG-Glu、Nb-L；
4)将Nb-L再与5-20倍摩尔当量的DBCO-Glucose在PBS或Tris-NaCl缓冲液中混合，置于旋转混匀仪上孵育0.5-6h，得到Nb-L-Glu。
以未经过处理的带有LLQS-tag的单域抗体(Nb)作为空白对照组，对本实施例制得的功能化单域抗体探针进行性能表征，具体如下：
1.对本实施例制得的功能化单域抗体探针进行表征
功能化单域抗体探针Nb、Nb-PEG、Nb-PEG-Glu、Nb-L、Nb-L-Glu的结构式如图1所示；Nb、Nb-L及Nb-L-Glu的蛋白质谱分析检测结果如图2所示；Nb、Nb-PEG、Nb-PEG-Glu的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳结果如图3所示。由此可以说明单域抗体与桥联分子、聚乙二醇分子以及葡萄糖分子的精确偶联。
2.对本实施例制得的功能化单域抗体探针进行体外测试
1)体外靶向性测试
用荧光染料FAM amine替换mPEG2k-NH2或Glucose-PEG2k-NH2，用DBCO-Cy5替换DBCO-Glucose重复上述单域抗体探针制备过程，经脱盐柱除去游离小分子染料，得到荧光探针Nb-FAM和Nb-L-Cy5。将其分别与脑胶质瘤细胞U87MG和非洲绿猴肾细胞BSC-1以同样的浓度共孵育，经过PBS清洗3次后，置于激光共聚焦显微镜(CLSM)下观察，得到的结果如图4，由此证明了本实施例采用的酶介导和点击化学方案不影响抗体的靶向性，单域抗体在修饰后仍能特异性识别肿瘤细胞。
将功能化单域抗体探针Nb、Nb-L-Glu、Nb-PEG、Nb-PEG-Glu分别与荧光染料FITC随机偶联，得到Nb@FITC、Nb-L-Glu@FITC、Nb-PEG@FITC以及Nb-PEG-Glu@FITC，以同样浓度标记U87MG细胞，共聚焦成像结果如图5，活细胞流式分析结果如图6。结果说明在单域抗体上修饰桥联分子、聚乙二醇、葡萄糖分子等不影响抗体的靶向能力，功能化单域抗体探针在体外仍能保持良好的生理活性和肿瘤识别能力。
2)体外血脑屏障穿透率测试
将105个小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3种植在transwell小室上层，每两天更换一次培养基，连续培养14天后，用跨膜电阻分析仪测试细胞跨内皮电阻(TEER)值。TEER值超过150Ω·cm2，则视为体外血脑屏障模型构建成功。将制备得到的Nb@FITC、Nb-L-Glu@FITC、Nb-PEG@FITC和Nb-PEG-Glu@FITC以同样浓度加入transwell上层培养基，在37℃恒温孵箱孵育4h、24h后，取下层培养基，使用酶标仪测试其中FITC染料的荧光强度，由此计算出4种探针的透过率，得到结果如图7。结果显示，葡萄糖修饰有效提高了单域抗体通过主动运输穿透血脑屏障的能力。
3.对本实施例制得的功能化单域抗体探针进行体内测试
1)转基因原发瘤模型
转基因脑瘤小鼠ND2：SmoA1在出现消瘦、行动不便、偏瘫等症状后即为发病，取发病小鼠提前一天麻醉脱毛后随机分组。将4种功能化单域抗体探针Nb、Nb-L-Glu、Nb-PEG、Nb-PEG-Glu分别与近红外荧光染料Sulfo-Cy7随机偶联，得到Nb@Cy7、Nb-L-Glu@Cy7、Nb-PEG@Cy7以及Nb-PEG-Glu@Cy7，以200μg/只(2mg/mL，100μL)的剂量通过尾静脉注射到转基因小鼠体内，通过IVIS Spectrum活体成像仪分别在注射后1h、3h、6h、12h、24h采集小鼠头部图像，见图8，统计数据见图9。注射24h后，安乐死小鼠，解剖心、肝、脾、肺、肾、脑等器官，观察探针在不同器官内的积累情况，脑部荧光图像如图10，统计数据见图11，主要器官的荧光离体图像如图12，统计数据见图13。结果显示，聚乙二醇修饰延长了单域抗体探针在小鼠体内的循环时间，提高了单域抗体在小鼠脑部的富集量。葡萄糖修饰增强了单域抗体探针穿透血脑屏障的能力，并且增加了探针的脑积累量。葡萄糖与聚乙二醇共同作用效果最佳。
2)原位脑胶质瘤模型
取4-6周龄BALB/c Nude裸鼠，以1-3％异氟烷-氧气麻醉，将其置于脑立体定位仪上固定，鼻对正中。沿中线剪开小鼠头皮，用3％过氧化氢溶液清洁头骨表面，暴露矢状缝和人字缝，找到前囟(Bregma)，进行调平。定位目标脑区：lateral 2mm；anterior 1mm；depth3mm，以1μL/min的速度缓慢注射5μL浓度为108/mL的U87MG-Luc细胞悬液，骨蜡涂抹头骨创口并缝合小鼠头部皮肤。手术结束后每日观察小鼠生命体征，腹腔注射浓度为15mg/mL的D-荧光素钾盐溶液，并置于IVIS Spectrum中进行生物发光检测，观察头部是否出现信号。如出现稳定信号则为小鼠原位脑胶质瘤造模成功。将造模成功且生命体征稳定的小鼠随机分组，分别通过尾静脉注射200μg功能化单域抗体探针Nb@Cy7、Nb-L-Glu@Cy7、Nb-PEG@Cy7和Nb-PEG-Glu@Cy7，利用小动物活体成像仪分别在注射后1h、3h、6h、12h、24h采集荧光图像，结果见图14，统计数据见图15。注射24h后，安乐死小鼠，解剖小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑等器官，采集荧光图像，脑部离体荧光图像见图16，统计数据见图17。其他主要器官荧光离体图像见图18，统计数据见图19。荧光成像结果同样说明葡萄糖修饰和聚乙二醇修饰均提高了单域抗体在胶质瘤小鼠脑部的富集量，且二者协同作用效果最佳。
综上所述，本发明提供的一种功能分子探针及其制备方法与应用，所述功能分子探针包括单域抗体以及通过化学共价键结合到所述单域抗体上的功能分子；其中，所述单域抗体上含有功能基团，所述功能基团包括伯氨基、巯基、醛基、羧基、光反应基团、蛋白标签、生物素、链霉亲和素、点击化学基团中的一种或多种；所述功能分子上含有活性反应基团，所述活性反应基团包括伯氨基、羧基、N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、生物素、链霉亲和素、点击化学基团中的一种或多种。本发明基于酶介导和点击化学等生物偶联策略，开发一系列具有血脑屏障穿透和肿瘤靶向能力的功能分子探针，实现了脑部肿瘤成像。在体内特性方面，该功能分子探针尺寸小，分子量仅有15-17kDa左右，组织穿透深度深，循环速度快，可以通过肾脏快速代谢；在材料选择方面，单域抗体免疫原性低；在修饰策略方面，通过精确修饰策略可以将功能分子以共价键偶联到单域抗体的特定位点上，而不破坏抗体的靶向能力，有效避免了功能分子泄露的问题。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种功能分子探针，其特征在于，包括单域抗体以及通过化学共价键结合到所述单域抗体上的功能分子；
其中，所述单域抗体上含有功能基团，所述功能基团包括伯氨基、巯基、醛基、羧基、光反应基团、蛋白标签、生物素、链霉亲和素、点击化学基团中的一种或多种；所述功能分子上含有活性反应基团，所述活性反应基团包括伯氨基、羧基、N-羟基琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺、生物素、链霉亲和素、点击化学基团中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的功能分子探针，其特征在于，所述点击化学基团包括叠氮、二苯并环辛炔、反式环辛烯、环丙烷环辛炔、1,2,4,5-四嗪中的一种。
3.根据权利要求1所述的功能分子探针，其特征在于，所述功能分子探针包括如下结构中的一种：
其中，n为3-50之间的自然数。
4.根据权利要求1所述的功能分子探针，其特征在于，所述功能分子探针还偶联有荧光染料、金属螯合剂、造影剂、药物、桥联分子、糖类、脂类、蛋白质、肽、肽类似物、核酸、聚乙二醇中的一种或多种。
5.一种功能分子探针的制备方法，其特征在于，包括：
将带有LLQS-tag的单域抗体分别与聚乙二醇-氨基、葡萄糖-聚乙二醇-氨基、桥联分子叠氮-聚乙二醇-氨基在缓冲液中混合，并分别加入谷氨酰胺转氨酶，分别得到第一混合液、第二混合液、第三混合液；
对所述第一混合液、所述第二混合液和所述第三混合液进行孵育处理，经尺寸排阻色谱分离，分别得到
6.根据权利要求5所述的功能分子探针的制备方法，其特征在于，所述功能分子探针的制备方法还包括步骤：
将与二苯并环辛炔-葡萄糖在缓冲液中进行混合，得到第四混合液；
对所述第四混合液进行孵育处理，得到
7.一种如权利要求1-4任一项所述的功能分子探针在制备用于靶向标记脑瘤组织、细胞、亚细胞结构的产品中的应用。
8.一种如权利要求1-4任一项所述的功能分子探针在制备用于对脑瘤进行辅助诊断和/或治疗的产品中的应用。
9.一种如权利要求1-4任一项所述的功能分子探针在制备穿透血脑屏障的产品中的应用。
10.根据权利要求7-9任一项所述的应用，所述产品为用于成像和/或治疗的产品。
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