CN1181750C - 一种对虾饲料免疫多糖 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对虾饲料免疫多糖，可由下述方法制备得到，依次包括以下步骤：(a)高压均质震碎：以啤酒酿造业的废弃酵母泥为原料，高压均质震碎细胞所用压力为200MPa～600MPa，均质次数为1～4次；(b)酶水解、板框压滤：在酶水解前加入食盐1%～5%(占固形物的重量百分数)、食用级乙醇1%～5%，酶水解温度为45℃～60℃，酸碱度在pH6.0～6.5；反应结束后，进行板框压滤，滤渣加水进行循环水洗涤后卸除，清洗板框滤机；(c)将步骤(b)中得到的滤渣输入贮罐；(d)液态超微粉碎：洗涤后的滤渣送入调配罐，加水调配，进行液态超微粉碎；再次压滤，粉碎后产品泵入中间罐进行酸化保温；(e)喷雾干燥。本发明不仅生产成本低，还可避免功能性成分β-1，3-葡聚糖的分子降解，可提高对虾免疫力与抗病力。
Description
技术领域
本发明涉及一种对虾饲料免疫多糖，特别是涉及一种含β-1，3-葡聚糖的对虾饲料免疫多糖。
背景技术
酵母细胞壁主要由下述组分组成：碱不溶性β-1，3-葡聚糖、碱溶性β-1，3-葡聚糖(含β-1，6键键合的葡聚糖支链)、酸溶性β-1，6-葡聚糖(含β-1，3键键合的葡聚糖支链)、与蛋白质相结合的碱溶性甘露聚糖等。其中，β-1，3-葡聚糖具有免疫刺激作用，其来源包括：啤酒酵母、脆壁克鲁维氏酵母、假丝酵母、真菌、单细胞藻类等，且以从啤酒酵母细胞壁分离的碱不溶性β-1，3-葡聚糖作用最强，除对人类外，水产动物免疫学研究已证实，对某些人工养殖鱼类(如：大西洋鲑、鲶鱼、虹鳟和大鲮鲆)以及对虾(斑节对虾、南美白对虾、中国对虾)具有显著的非特异性免疫作用，可提高动物机体抗病力。
现有分离β-1，3-葡聚糖的方法主要依据β-1，3-葡聚糖的溶解性特征，具有代表性的包括：有机溶剂萃取法(其中采用苯酚、异丙醇、丙酮、甲醇等有机溶剂)、高温碱-酸萃取法、酶法提取(其中采用蛋白酶、淀粉酶、葡聚糖酶等)。由上述方法获得的β-1，3-葡聚糖开发成对虾饲料免疫多糖饲料添加剂，主要存在以下缺陷：(1)投资高，需要大量专用设备；(2)生产成本高：有机溶剂萃取法中所用的有机溶剂费用高，碱-酸法中需要花费大量精力洗涤酸碱，并且需要在高温下反应，能源消耗大，酶法提取需要加入大量价格较高的酶制剂；(3)有机溶剂法与碱-酸法不环保，也会产生毒性，且有一定的腐蚀性；(4)已知β-1，3-葡聚糖具有最好免疫效果的分子量可以在10万道尔顿，而现有酶法提取方法中采用葡聚糖酶，不能确保产品具有发挥最好性能的分子量。因此现有分离β-1，3-葡聚糖的方法对于投入要求低，附加值不高的对虾水产饲料工业是完全不适用的，目前还没有适合于对虾饲料含β-1，3-葡聚糖的饲料添加剂的生产技术。
目前，对虾饲料质量与科技含量仍然滞后，对虾养殖过程中病害控制仍是首要问题，还普遍存在诸如为达到治病与促生长目的滥用抗生素、激素甚至使用一些易致癌、致突变的化学合成物等现实问题。提高对虾自身免疫力是解决对虾养殖病害，确保对虾养殖业可持续发展的有效途径。目前已有多种免疫增强剂运用在水产养殖业，但在对虾中以β-1，3-D-葡聚糖研究最多，其应用最广，功效最为确凿。对虾对微生物感染的抵抗主要依赖于非特异性的免疫反应，β-1，3-D-葡聚糖可与对虾体内巨噬细胞表面的特殊受体相结合，激活巨噬细胞的活性，诱发一系列免疫反应，使机体通过吞噬作用吸收、破坏和清除体内的病原微生物，增强对虾的非特异性免疫系统功能。
发明内容
本发明的目的是提供一种可提高对虾免疫力与抗病力的对虾饲料免疫多糖。
为了达到上述目的，本发明所述的对虾饲料免疫多糖，可由下述方法制备得到，依次包括以下步骤：
(a)高压均质震碎：以啤酒酿造业的废弃酵母泥为原料，该原料首先输入调配罐，由高压均质机自带输送泵抽入机器内加工，进行循环式操作处理，高压均质震碎细胞所用压力为200Mpa～600Mpa，均质次数为1～4次。
(b)酶水解、板框压滤：将步骤(a)中得到的破碎的酵母细胞泵入反应罐开始反应，在酶水解前加入食盐1％～5％(占固形物的重量百分数，下同)、食用级乙醇1％～5％，酶水解温度为45℃～60℃，酸碱度在pH6.0～6.5；反应结束后，泵入中间贮罐，开始板框压滤，废水回流于调配罐与反应罐，滤渣加水进行循环水洗涤后卸除，清洗板框滤机。
(c)将步骤(b)中得到的滤渣输入贮罐，。
(d)液态超微粉碎：洗涤后的滤渣送入调配罐，加水调配，进行液态超微粉碎；再次压滤，粉碎后产品泵入中间罐，将pH值调节为3左右进行酸化保温。
(e)喷雾干燥：将步骤(d)中保温好的浆料泵入喷雾干燥机进行喷雾干燥即可得到所需的对虾饲料免疫多糖。
为了得到稳定性更好的对虾饲料免疫多糖，在所述步骤(e)，还可进行密闭式去湿空气冷却处理，即：开启去湿机、循环风机，对喷雾干燥产品进行风冷，并收集产品。
在所述步骤(a)中，高压均质震碎细胞所用压力的优选范围为350Mpa～450Mpa，均质次数的优选值是2～3次。
在所述步骤(b)中，食盐的优选含量范围是2％～3％；食用级乙醇的优选含量范围是2％～3％；酶水解温度的优选值为55℃，其升温应在40～120分钟内完成。
在所述步骤(b)中，酶水解过程中可不添加外源酶制剂，也可添加外源酶制剂，优选的是添加50IU～200IU/克底物的蛋白酶，该蛋白酶可以是木瓜蛋白酶、中性蛋白酶。
在所述步骤(b)中，所用的酶制剂均为食品级，酶解时间可以是8～48小时，优选值是24小时。
在所述步骤(d)中，液态超微粉碎可用高压均质机进行，压力在350Mpa～450Mpa。
在所述步骤(e)中，喷雾干燥前浆料浓度应控制在20％～40％，其优选范围为25％～35％，喷雾干燥进风温度为160℃～210℃，出风温度为60℃～100℃，最优选的喷雾干燥进风温度为190℃～200℃，出风温度为80℃。
本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明利用价廉易得的啤酒酿造业的废弃酵母泥为原料，虽然这种酵母已没有发酵活力，但胞内仍具相当的蛋白酶活力，通过本发明中的高压均质处理以及反应条件可以最大限度发挥酶活力，去除不需要的蛋白质，采用超高压均质作为前处理工艺还可打碎采用普通方法难以降解的酵母细胞壁，避免使用葡聚糖酶，不仅节约成本，还可避免功能性成分β-1，3-葡聚糖的分子降解，同时也更有利于胞内蛋白质的降解与抽提；本发明在后道工艺上采用板框压滤机对提取物进行分离，避免现有技术中采用离心工艺引起的产品损失大、不易于实际控制的缺陷。
附图说明
图1是本发明实施例中的对虾免疫多糖的制备工艺流程示意图。
图2是本发明的对虾免疫多糖的添加量与斑节对虾成活率之间的折线回归关系曲线。
具体实施方式
本实施例中的对虾饲料免疫多糖的制备工艺流程如图1中所示，依次包括以下步骤：
(a)高压均质震碎：在5m3的调配罐内，加入2.5吨酵母泥，其中固形物为15％(重量)，由高压均质机自带输送泵抽入机器内加工，循环式均质处理两次，压力400Mpá。
(b)酶水解、板框压滤：将步骤(a)中得到的破碎的酵母细胞泵入反应罐，加入食盐12公斤，食品级乙醇10公斤，以氢氧化钠或盐酸调节pH6.0～6.5，开启蒸汽加热阀，将反应液温度由室温升至55℃，注意控制升温速度，在60分钟左右完成升温；加入木瓜蛋白酶，其用量为60IU/克底物，搅拌酶解反应24小时，搅拌速度60rpm。酶解物泵入板框压滤机，板框压滤，加水进行滤渣循环水洗涤。
(c)将步骤(b)中得到的滤渣输入贮罐。
(d)液态超微粉碎：洗涤后的滤渣送入调配罐再次高压均质。压力400Mpá，加水调配，调节浓度为25％，进行液态超微粉碎；再次压滤，粉碎后产品泵入中间罐，将pH调节为3左右进行酸化保温，间接蒸汽加热料温至60℃。
(e)喷雾干燥：将步骤(d)中保温好的浆料泵入喷雾干燥机进行喷雾干燥，其进风温度为195℃，出风温度为80℃。
(f)密闭式去湿空气冷却处理，即：开启去湿机、循环风机，对喷雾干燥产品进行风冷，并收集产品，进行打包、称重、包装。
本实施例产品中β-葡聚糖结构测定：首先纯化糖组分至含氮量小于0.3％，红外光谱测定采用Vector33红外光谱仪(德国Bruker公司)在400cm-1～4000cm-1内扫描。特征吸收与标准β-1，3-D-葡聚糖相比较，有效组分在890cm-1有β型糖苷键的特征吸收，2920cm-1、1370cm-1、1250cm-1附近有β-1，3键连接的特征吸收。1000-1200cm-1，3400cm-1附近有多糖糖苷键和羟基吸收。
核磁共振试验采用Avance Digatal Drx 400核磁共振仪(德国Bruker公司)，1H-NMR谱测定：将多糖悬浮于D2O中，搅拌15分钟，冷冻干燥，重复三次，再溶于Me2SO-d6，浓度10mg/ml，累加16次；13C-NMR谱测定：多糖溶于Me2SO-d6，50mg/ml，累加50000次。其特征频率归纳于表1、表2，并与文献报道的β-1，3-D-葡聚糖的测定值进行比较。
表1 1H-NMR特征频率
| 1H | 2H | 1H | 1H | 2H | 2H | 1H | |
| 文献值(1) | 5.3 | 4.7 | 4.6 | 3.7 | 3.46 | 3.26 | 3.22 |
| 有效组分 | 5.2 | 4.62 | 4.5 | 3.7 | 3.43 | 3.33 | 3.28 |
表2 13C-NMR特征频率
| C1 | C2 | C3 | C4 | C5 | C6 | |
| 文献值(1) | 102.7 | 72.6 | 86.0 | 68.2 | 76.1 | 60.7 |
| 文献值(2) | 103.0 | 72.8 | 86.2 | 68.4 | 76.3 | 60.9 |
| 文献值(3) | 103.6 | 72.3 | 85.0 | 69.4 | 76.8 | 62.0 |
| 有效组分 | 103.9 | 73.8 | 87.2 | 69.5 | 77.4 | 61.9 |
由上述红外光谱与核磁共振结果表明，本发明所获得的对虾免疫多糖的主要结构为β-1，3-D-葡聚糖。分子量测定采用Waters-991HPLC，液相色谱柱型号为μ-styraycl，柱温60℃，流动相：DMSO，流速：0.8ml/min，410检测器。以不同分子量聚苯乙烯制作标准曲线，实测产品中β-1，3-D-葡聚糖分子量为10万道尔顿左右。
产品中β-1，3-D-葡聚糖的含量测定采用高压液相色谱法，色谱仪：Waters-991，色谱柱：Sugar-park，柱温：75℃，流速0.6ml/min，流动相：EDTA-Ca(50mg/ml)。样品经三氟乙酸水解，β-1，3-D-葡聚糖水解成葡萄糖，按β-1，3-D-葡聚糖标准样品经同样方法水解后与葡萄糖形成量之间的标准曲线关系(y＝2.0192x-0.1102，x：葡萄糖，y：β-1，3-D-葡聚糖)测出样品中实际β-1，3-D-葡聚糖的含量。不同批次产品中β-1，3-D-葡聚糖的含量为22.1％～22.7％。以下是对上述实施例获得的对虾饲料免疫多糖的应用试验。
应用试验1：
一、试验设计
1、根据斑节对虾的营养需求设计饲料配方，本发明获得的免疫多糖产品添加量为10g/Kg饲料，(饲料配方见表3)。用双螺杆挤压机制成直径为1.2mm的颗粒，自然晒干，贮存于-15℃的冰箱中备用。
表3试验饲料的组成(重量百分数)
对照 试验组
秘鲁鱼粉 38.0 38.0
面粉 21.2 20.2
免疫多糖 / 1
其他组分 40.8 40.8
表3中的其他组分包括：花生粕10.0；大豆浓缩蛋白10.0；啤酒酵母5.0；虾头粉7.0；鱿鱼内脏粉3.0；复合无机盐2.4；复合维生素0.2；大豆磷脂1.0；氯化胆碱0.2；鱼油1.0；粟米油1.0
2、实验虾和饲养
体重为2～3克左右的斑节对虾苗70尾饲养在室外水泥池(2米×3米×1米)中。每天按体重5％分三次投喂饲料，每试验组设计两个重复，养殖期间每天充气8小时，不换水，饲养时间为30天，30天后检查每池的存活率和生长率，每池随机抽取3尾虾取血淋巴于5000转/分下离心10分钟，测定血细胞比重和血清蛋白质的含量。
3、抗病力测定方法
饲养结束后，彻底清洗消毒水泥池，将池水降至原来的1/3，每池取20尾虾，每尾虾注射50μL溶藻弧菌(10个/ml)；另取20尾虾放于另一池中，每尾注射50μl经斑节对虾白斑综合症病毒感染至濒死，出现典型白斑综合症状的病虾全虾匀浆病毒粒子滤过液；去除注射后24小时内可能由于操作机械损伤而非感染至死的虾，每组继续投喂原来的实验饲料饲养，记录7天内虾的累计死亡情况，计算累计死亡率(％)。
二、试验结果
1.斑节对虾的生长、存活和饲料转换
斑节对虾饲养30天后，其特定生长率、存活率和饲料系数见表4。由表4可知，添加本发明所得的免疫多糖组的特定生长、存活率显著高于对照组，而饲料系数则比对照组显著低。
表4 30天后斑节对虾的日特定生长率、存活率和饲料系数
对照 试验组
初始总重 170.2±13.2 171.1±10.7
初始尾数 70 70
末总重 327.8±6.2 485.2±4.4
末尾数 56.5 70
特定生长率 2.21±0.23a 3.35±0.71b
存活率 80.7±0.7a 100±0.0b
饲料系数 2.18±0.31a 1.10±0.09b
2. 30天后斑节对虾血清蛋白质含量和血淋巴比容
斑节对虾摄食本发明免疫多糖30天后，其血清蛋白质含量和血淋巴比容见表5。由表5可知，试验组的血清蛋白质含量显著高于对照组，而各处理间血淋巴比容没有显著差异。
表5 30天后斑节对虾血清蛋白质含量和血淋巴比容
对照 试验组
血清蛋白/100ml) 5.07±0.42a 7.14±0.28b
血淋巴比容* 13.36±1.52 14.55±2.11
*血淋巴比容＝(1-凝固后血清体积/凝固前体积)×100
3.斑节对虾摄食本发明免疫多糖对弧菌和白斑病毒的抵抗力
由表6可知，斑节对虾30天后注射50μl弧菌液(1×108CFU/ml)，对照组在12h内死亡率为100％，试验组的累计死亡率显著低于对照组，而存活率则显著高于对照组。
表6注射溶藻弧菌和白斑病毒后7天内的累计死亡率
| 对照组 | 试验组 | |
| 注射弧菌 | ||
| 12h | 100a | 68.3b |
| 24h | 100 | 100 |
| 注射病毒 | ||
| 12h | 0 | 0 |
| 24h | 0 | 0 |
| 48h | 61.7 | 0 |
| 72h | 100a | 0c |
| 96h | 100 | 6.7 |
| 120h | 100 | 21.7 |
| 144h | 100 | 43.3 |
| 168h | 100a | 71.7b |
应用试验2：
一、试验材料与方法
1.实验饲料
实验饲料配方接近斑节对虾商业饲料(见表7)，免疫多糖添加量分别为0，2，4，6，8和10g/Kg饲料。用双螺杆挤压机制成直径为1.2mm的颗粒，50℃烘干，贮存于-15℃的冰箱中备用。
2、动物饲养与管理
斑节对虾苗(初始体重0.70±0.1g)放置在循环系统中10-L容量的玻璃钢桶中饲养，每个桶中放入8只虾作为一个重复，每个处理设4个重复。每天按5％体重投饵，分早、中、晚三次投喂。每天早上投饵前观察蜕皮、死亡情况，并做好记录，接着用虹吸法吸出桶内的残饵和粪便。饲养实验期间水温17-24℃，盐度6‰左右(29℃)。饲养实验持续35天。
抗病力测定方法：饲养试验结束后，每组取2个重复进行抗病力实验。每尾注射50ul经斑节对虾白斑综合症病毒感染至濒死、出现典型白斑综合症状的病虾全虾匀浆病毒粒子滤过液。去除注射后24小时内可能由于操作机械损伤而非感染至死的虾，每组继续投喂原来的实验饲料饲养，记录10天内虾的累计死亡情况。
表7实验饲料成分
| 原料 | 成分(％) |
| 红鱼粉 | 40 |
| 豆粕 | 13 |
| 乌贼内脏粉 | 2.5 |
| 虾壳粉 | 5 |
| 玉米淀粉 | 15.5 |
| 面粉 | 15 |
| 啤酒酵母 | 3 |
| 豆油 | 1 |
| 鱼油 | 1 |
| 卵磷脂 | 1 |
| 对虾多维 | 0.5 |
| 对虾多矿 | 1.0 |
| 安定C | 0.02 |
| 氯化胆碱 | 0.25 |
| Ca(H2PO4)2 | 1.0 |
| 抗氧化剂 | 0.03 |
| Lys | 0.2 |
二、结果
1.斑节对虾的生长、存活和饲料转换
斑节对虾饲养35天后，其特定增重率、存活率和饲料系数见表8。由表8可知，添加免疫多糖组的特定生长、存活率显著高于对照组，而饲料系数则比对照组显著低。
表8 35天后斑节对虾的增重率、存活率和饲料系数
免疫多糖的添加量(g/kg饲料)
0 2 4 6 8 10
初始体重(g) 0.706 0.710 0.722 0.690 0.717 0.719
终末体重(g) 1.296 1.532 1.506 1.513 1.487 1.582
增重率(％)1 83.6 115.8 108.6 119.3 107.4 120.0
成活率(％)2 50.0 68.8 82.5 81.3 76.9 83.6
饲料系数3 2.21 1.76 1.78 1.70 1.75 1.72
1增重率％＝100×[终末体重(g)-初始体重(g)]/初始体重(g)；2存活率％＝(末尾数/初始尾数)×100；3饲料系数＝投饲总量/(末总重-初始总重)
为保证方差齐性，首先将成活率(％)进行反正弦角度变换，然后以成活率为判据，利用折线回归分析，斑节对虾商业饲料中免疫多糖的最适添加量为2.84g/kg，添加量与斑节对虾成活率之间的折线回归关系曲线如图2所示。
2.斑节对虾摄食免疫多糖后对白斑病毒的抵抗力
从表9可以看出，35天后注射斑节对虾白斑病毒离子匀浆液，96h内未添加组的死亡率达100％，显著高于摄食免疫多糖组。
表9注射白斑病毒匀浆液后10天内的累计死亡率
免疫多糖的添加量(g/kg)
0 2 4 6 8 10
24h 0％ 0％ 0％ 0％ 0％ 0％
48h 0％ 0％ 0％ 0％ 0％ 0％
72h 75％ 25％ 25％ 0％ 0％ 0％
96h 100％ 50％ 50％ 0％ 25％ 25％
120h 100％ 50％ 50％ 0％ 25％ 25％
144h 100％ 75％ 75％ 0％ 25％ 25％
168h 100％ 100％ 100％ 0％ 25％ 25％
192h 100％ 100％ 100％ 0％ 25％ 25％
216h 100％ 100％ 100％ 0％ 25％ 25％
240h 100％ 100％ 100％ 0％ 25％ 25％
本发明的免疫多糖可以缓解应激状态，显著提高成活率。以成活率为判据，根据折线回归分析法确定出在抗应激状态下，斑节对虾商业饲料中免疫多糖的适宜添加量为2.8g/kg。很显然，若处于正常生理状态下，该添加量还会进一步降低。
Claims (9)
1.一种对虾饲料免疫多糖，由下述方法制备获得，依次包括以下步骤：
(a)高压均质震碎：以啤酒酿造业的废弃酵母泥为原料，原料首先输入调配罐，由高压均质机自带输送泵抽入机器内加工，进行循环式操作处理，高压均质震碎细胞所用压力为200Mpa～600Mpa，均质次数为1～4次；
(b)采用木瓜蛋白酶水解、板框压滤：将步骤(a)中得到的破碎的酵母细胞泵入反应罐开始反应，在木瓜蛋白酶水解前加入食盐1％～5％(占固形物的重量百分数，下同)、食用级乙醇1％～5％，木瓜蛋白酶水解温度为45℃～60℃，酸碱度在pH6.0～6.5；反应结束后，泵入中间贮罐，开始板框压滤，废水回流于调配罐与反应罐，滤渣加水进行循环水洗涤，卸除滤渣，清洗板框滤机；
(c)将步骤(b)中得到的滤渣输入贮罐；
(d)液态超微粉碎：洗涤后的滤渣送入调配罐，加水调配，进行液态超微粉碎；再次压滤，粉碎后产品泵入中间罐，将pH值调节为3左右进行酸化保温；
(e)喷雾干燥：将步骤(d)中保温好的浆料泵入喷雾干燥机进行喷雾干燥。
2.根据权利要求1所述的对虾饲料免疫多糖，其特征是：在所述步骤(a)中，高压均质震碎细胞所用压力的优选范围为350Mpa～450Mpa，均质次数的优选值是2～3次。
3.根据权利要求1所述的对虾饲料免疫多糖，其特征是：在所述步骤(b)中，食盐的优选含量范围是2％～3％；食用级乙醇的优选含量范围是2％～3％；木瓜蛋白酶水解温度的优选值为55℃，其升温在40～120分钟内完成。
4.根据权利要求1所述的对虾饲料免疫多糖，其特征是：在所述步骤(b)中，酶水解过程中添加50IU～200IU/克底物的木瓜蛋白酶。
5.根据权利要求4所述的对虾饲料免疫多糖，其特征是：所述的木瓜蛋白酶制剂均为食品级，酶解时间是8～48小时。
6.根据权利要求1所述的对虾饲料免疫多糖，其特征是：β-1，3-D-葡聚糖的含量为22.1％～22.7％。
7.根据权利要求1所述的对虾饲料免疫多糖，其特征是：在所述步骤(d)中，液态超微粉碎采用高压均质机进行，压力在350Mpa～450Mpa。
8.根据权利要求1所述的对虾饲料免疫多糖，其特征是：在所述步骤(e)中，喷雾干燥前浆料浓度控制在20％～40％，进风温度为160℃～210℃，出风温度为60℃～100℃。
9.根据权利要求9所述的对虾饲料免疫多糖，其特征是：喷雾干燥前浆料浓度的优选范围为25％～35％，进风温度为190℃～200℃，出风温度为80℃。
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