CN118165901A - 一种超声调控的工程化细菌及其构建和应用 - Google Patents

一种超声调控的工程化细菌及其构建和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种以鼠伤寒沙门氏菌为底盘细胞，基于超声调控蛋白表达和分泌，用于肿瘤治疗的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌，所述的工程化的鼠伤寒沙门氏菌具有良好的超声响应能力，在超声刺激下，具有高效的基因表达分泌水平。本发明所述超声调控的工程化VNP20009用于治疗肿瘤的方案，基因调控系统可以通过超声高效、精准调控微生物细胞基因的表达，具有组织穿透力强、诱导倍数高和绝缘性好的特点，同时与免疫细胞因子、抗肿瘤蛋白、凋亡诱导因子联合使用，达到精准调控、联合治疗肿瘤的效果，为非侵入性、时空特异性的精确调控微生物基因表达提供一种新的工具。本发明在治疗肠道、脑部等深层次疾病方面具有巨大的应用潜力。

Description

一种超声调控的工程化细菌及其构建和应用
技术领域
本发明属于合成生物学、声遗传学等多学科交叉领域，具体涉及以减毒沙门氏菌VNP20009为底盘细胞，构建超声调控的基因表达分泌系统的方法，高效诱导功能蛋白的表达分泌，以及其在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
癌症作为最重要的健康问题之一，已成为仅次于心脏病的第二大致死原因。肿瘤细胞的特征是不受控制的增殖，导致肿瘤的形成。虽然传统的肿瘤治疗手段包括药物的放疗、化疗以及手术治疗在临床上得到广泛的应用，但它们通常会造成对机体的严重副作用，容易产生耐药性，并且具有较差的预后效果，尤其是针对转移性肿瘤。近些年，随着生命科学研究的不断深入和快速发展，推动了细胞免疫治疗的出现，包括CAR-T细胞治疗、NK细胞治疗、TCR-T细胞治疗等。作为一种肿瘤治疗的新兴方式，细胞免疫疗法在多种血液肿瘤中具有明显的治疗效果。然而，由于缺乏可控性，它们同样会产生免疫相关的不良副作用，如神经和肝脏毒性、内分泌紊乱和严重的细胞因子释放综合征，因此提高治疗过程的精准可控性成为了免疫细胞治疗中需要解决的关键问题。一些研究表明，由于肿瘤微环境通常是处于缺氧和偏酸状态，免疫细胞不易浸入产生免疫反应，因此，细菌对肿瘤微环境具有很强的偏好性。随着近些年来合成生物学发展，基于细菌的大量基因环路被构建，通过对细菌进行工程化改造，利用其本身靶向定植肿瘤微环境的特性，在肿瘤组织递送不同的治疗蛋白或与特定材料联合，进行癌症治疗。
目前，在对工程化细菌的调控方面，研究人员已经开发了包括化学小分子、光、群体感应等多种细菌调控机制，并且应用于疾病的诊断治疗中。但是，它们都存在着各自的局限性。化学小分子调控缺乏时空的特异性，而且由于化学小分子本身的代谢动力学特征，造成其不能够及时的打开或关闭系统。而光调控系统受到了光的组织穿透力差的限制，对深部组织不能够有良好的调控作用。群体感应是细菌自己天然的调控系统，并不能够受到外界因素的调控，因此，缺乏可调性。针对这些问题，虽然科学家们已经开发出具有组织穿透力强、时空特应性好的超声调控系统，例如基于机械门口通道的超声调控系统或基于热休克蛋白启动子的超声调控系统。但是这两种超声调控的基因表达系统都是以哺乳动物细胞为底盘细胞开发的系统，并且它们都存在绝缘性差的问题。机械门控通道作为阳离子通道，会引起出Ca2+外的其他阳离子，如Na+、K+的进入，可能会对系统造成一定的干扰。而后者热休克蛋白启动子是一种应激反应的诱导元件，温度以外的其它应激反应，例如局部缺血、氧化应激、中毒等都可触发它的启动。最近研究人员基于细菌来源的温度敏感转录因子Tcl42，以大肠杆菌EcN1917为底盘细胞，开发了超声调控丝氨酸整合酶表达系统，进而引起免疫检查位点抑制剂持续表达。此外，最近研究人员利用温度敏感转录因子Tcl45，以大肠杆菌E.coliMG1655为底盘细胞，开发了超声调控免疫因子表达系统。然而这两个系统的诱导温度均较高(＞40℃)，会对健康组织造成损伤，不利于人体的应用。此外，前者持续性产生的免疫检查位点抑制剂可能会产生免疫相关的副作用。而后者用的底盘菌E.coliMG1655属于野生型K-12菌株，其免疫原性相对较高。这些导致它们在生物医学应用中受到了一定的限制。
综上所述，微生物生物学已经在多种疾病中得到了广泛的应用，而它的调控方式仍然存在不足之处，我们有必要开发出组织穿透力强、时空特异性好、组织相容性好以及绝缘性好的调控装置，解决目前微生物调控工具不足的问题。同时，以安全性更高的微生物为底盘细胞，用于肿瘤的治疗。
发明内容
本发明在原核细胞中开发了一种超声调控转基因表达分泌控制系统，实现了通过超声(超声强度0.5W/cm2，脉冲1:1)调控细胞内基因表达活动，为非侵入性、时空特异性的精确调控微生物基因表达提供一种新的工具，即工程化细菌(如基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009)。本发明将超声调控的工程化细菌与免疫细胞因子、抗肿瘤蛋白、凋亡诱导因子联合使用，达到精准调控、联合治疗肿瘤的效果，为精准医学提供了新的思路和方法，同时由于超声的安全性和强穿透性，从而在治疗肠道、脑部等深层次疾病方面具有巨大的潜力。
本发明所要解决的技术问题，是提供一种能够受到超声调控用于治疗肿瘤的工程化细菌，该细菌安全无毒，可以受超声调控表达分泌肿瘤杀伤蛋白，并且最终能够满足临床需求。
本发明提出了一种基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其以具有肿瘤靶向性的减毒微生物细胞VNP20009为底盘细胞，包含超声调控的蛋白分泌系统。
本发明所述的基因工程化的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009具有良好的超声响应能力，在超声刺激下，具有高效的基因表达分泌水平。
本发明中，所述超声调控的蛋白分泌系统包括：超声感受器和分泌效应器。
本发明中，所述超声感受器由温度敏感转录因子TlpA39和相对应的启动表达功能蛋白基因的启动子PTlpA构成。
其中，所述温度敏感转录因子TlpA39可响应温和高温(39℃)，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
其中，所述温度敏感转录因子TlpA39由组成型启动子启动表达。
其中，表达温度敏感转录因子TlpA39的组成型启动子包括PlacI、Pj23100、Pj23100和Pj23109，其相应的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5-8所示。
其中，所述启动子PTlpA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其中，用于启动表达功能蛋白基因的启动子PTlpA可包含不同拷贝数的转录因子结合位点。
进一步地，包含1-3拷贝数的转录因子结合位点的启动子PTlpA、PTlpA2、PTlpA3，其相应的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、9-10所示。
本发明中，所述分泌效应器为能够受到温度敏感蛋白TlpA39调控的报告基因环路，包括蛋白分泌信号肽和功能蛋白基因。其中，所述报告基因环路中的人工合成的启动子为PTlpA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述报告基因为生物自发光蛋白基因LuxCDABE或融合分泌信号肽段的功能蛋白基因。
其中，所述的分泌效应器中的蛋白分泌信号肽YopE1-15融合表达于功能蛋白N端。
其中，所述的分泌效应器中的蛋白分泌信号肽YopE1-15的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
其中，所述的分泌效应器中的功能蛋白包括单一表达的任意报告蛋白或功能型蛋白。
其中，所述的分泌效应器中的功能蛋白Azurin编码核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
其中，所述分泌效应器中的功能蛋白的表达可受不同强度的核糖体结合位点(RBS)调控。
其中，用于表达功能蛋白基因的不同核糖体结合位点包括RBS1(核苷酸序列为AAGGAG)、RBS2、RBS3、RBS4、RBS5、RBS6，其中RBS2、RBS3、RBS4、RBS5、RBS6相应的核苷酸序列如SEQ ID NO.11-15所示。
本发明中，所述超声调控的蛋白分泌系统，基因元件简单，且在多种微生物细胞系中均具有可调性。
其中，所述的微生物细胞系包括但不限于SalmonellaVNP20009、E.coliDH5α、E.coliTOP10、Salmonella3439、E.coliBL21(DE3)、E.colistrainNissle1917等。
本发明所述基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中超声调控基因表达的作用机理为，在低于诱导温度的条件下，TlpA39会以同源二聚体的形式存在，可以与其相对应的启动子为PTlpA结合，阻遏下游基因的表达。在温度达到或高于诱导温度时，同源二聚的TlpA会发生解聚，形成单体，同时从PTlpA解离，激活下游基因的表达。然而，超声刺激可以将声波能量转化为热能，改变组织温度，进而调控工程化VNP20009中基因环路的表达。
可通过基因工程技术将本发明提供的原核生物细胞中超声调控的基因表达元件构建在原核表达载体中，进而实现调控目的基因的转录表达。本发明提供的原核细胞中超声调控基因表达的系统，可利用具有优越的时空分辨率、组织穿透性、安全性、成本和易用性，已广泛应用于临床诊断和治疗中的超声特异性诱导基因在原核宿主细胞中的表达，所述宿主细胞可以是多种类型的原核细胞，如SalmonellaVNP20009、E.coliDH5α、E.coliTOP10、Salmonella3439、E.coli BL21(DE3)、E.colistrainNissle1917等。
本发明所述超声强度为0.5W/cm2，脉冲1:1；超声时间为0-2h。本发明通过控制不同的超声时间和超声强度，从而实现不同程度的基因诱导。
本发明还提供了一种基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009的制备方法，所述方法包括下述步骤：
(1)构建包括组成型表达温度敏感转录因子TlpA39和启动子PTlpA启动表达N端融合表达蛋白分泌信号肽的功能蛋白基因的载体；
(2)将步骤(1)构建的载体转化至VNP20009细胞中，以制备含有超声调控的蛋白分泌系统的基因工程化的VNP20009细胞；
(3)将步骤(2)制备的基因工程化的VNP20009细胞体外培养扩增，得到扩增的基因工程化的VNP20009细胞群体；
(4)收获所述基因工程化的VNP20009细胞群体。
本发明还提供了所述在减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP2000中，超声调控蛋白表达分泌的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建超声感受器。
构建组成型启动子Pconst驱动表达的超声响应转录因子TlpA39，作为超声感受器；
其中，所述的组成型启动子包括PlacI、Pj23100、Pj23100和Pj23109，其相应的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-8所示。
(2)构建分泌效应器。
构建响应DNA结合蛋白的诱导型启动子报告，作为分泌效应器。
其中响应DNA结合蛋白的诱导型启动子为PTlpA。
其中通过细菌III型分泌蛋白系统分泌功能蛋白的分泌信号肽为YopE1-15。
本发明用于启动表达功能蛋白基因的启动子PTlpA的不同拷贝数包括PTlpA、PTlpA2、PTlpA3，其相应的核苷酸序列如SEQ ID NO.2，9-10所示。
本发明用于表达功能蛋白基因的不同核糖体结合位点包括RBS1(核苷酸序列为AAGGAG)、RBS2、RBS3、RBS4、RBS5、RBS6，其中RBS2、RBS3、RBS4、RBS5、RBS6相应的核苷酸序列如SEQ ID NO.11-15所示。
本发明超声调控表达的功能蛋白为Azurin，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明功能蛋白N端融合表达分泌信号肽YopE1-15，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
将上述基因表达元件构建在原核表达载体中，得到表达质粒。电转化至减毒沙门氏菌VNP20009中。
其中，所述的电转化条件为电压2-3KV，电阻400Ω，电容25μF。
本发明还提供了所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009在肿瘤治疗中的应用。所述应用包括瘤内注射药物和静脉注射药物。所述应用包括通过超声调控释放Azurin杀伤肿瘤。
本发明提供的基因工程化细菌具有肿瘤靶向性，通过肿瘤原位或尾静脉注射，可以特异性的定殖于肿瘤组织中。利用超声刺激，可以在肿瘤组织产生Azurin蛋白，激活肿瘤细胞的凋亡信号通路，导致肿瘤细胞死亡。
所述肿瘤包括但不限于黑色素瘤(B16-F10)、结肠癌(CT26)、乳腺癌(4T1)、B淋巴细胞瘤(A20)和肝癌(H22)等。
本发明还提供了一种治疗肿瘤的方法，所述方法利用如上所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，和/或，利用如上所述的超声调控的蛋白分泌系统来治疗肿瘤。
所述方法包括：
(1)人工构建原核表达载体；所述原核表达载体含有超声调控的蛋白分泌系统；
(2)将步骤(1)构建的表达载体转化至微生物细胞中，制备含有超声调控的蛋白分泌系统的工程化细胞；
(3)将步骤(2)制备的所述工程化细胞以瘤内注射或静脉注射的形式注射至肿瘤模型鼠体内；
(4)每两天超声小鼠肿瘤部位，诱导所述工程化细胞表达并分泌Azurin激活肿瘤细胞的凋亡通路从而杀伤肿瘤。
本发明还提供了一种质粒，所述质粒为选自质粒pGT048、pGT052、pGT064、pGT065、pGT165、pGT166、pGT167、pGT168、pGT169、pGT198、pGT230、pGT233、pGT234、pGT240、pGT241、pGT242、pGT252之一种或几种。
本发明的有益效果在于：与传统的肿瘤治疗方案相比，本发明开发的用于治疗肿瘤的方案为一种生物药物。利用减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009肿瘤靶向性和超声的特性，在肿瘤组织特异性调控表达分泌肿瘤杀伤蛋白，起到治疗肿瘤的效果。制备方法简单，容易操作，安全性高，具有很好的临床应用潜力。
附图说明
图1为超声调控基因表达系统的示意图。
图2为超声调控基因表达系统的温度强度依赖性。
图3为超声调控基因表达系统的温度诱导时间依赖性。
图4为超声与温度的关系。
图5为优化温度依赖的超声调控系统的RBS。
图6为优化温度依赖的超声调控系统的PTlpA拷贝数。
图7为优化温度依赖的超声调控系统的TlpA39表达量。
图8为超声调控基因表达系统的超声诱导时间依赖性。
图9为超声调控的基因表达系统在不同细菌中的工作情况。
图10为超声对细菌增殖的影响。
图11为超声对细菌基因表达能力的影响。
图12为超声调控蛋白分泌系统的示意图。
图13为超声调控蛋白分泌系统的时间依赖性。
图14为超声调控功能蛋白Azurin分泌。
图15为CCK8检测Azurin蛋白对肿瘤细胞的杀伤效果。
图16为TUNEL分析检测Azurin蛋白对肿瘤细胞的杀伤效果。
图17为流式分析检测Azurin蛋白对肿瘤细胞的杀伤效果。
图18为活体成像监测黑色素肿瘤模型小鼠治疗效果。
图19为黑色素肿瘤模型小鼠肿瘤体积大小监测。
图20为黑色素肿瘤模型小鼠存活率监测。
图21为活体成像检测细菌的定植。
图22为检测各主要器官和肿瘤细菌的定植。
图23为Westernblot检测超声调控Azurin蛋白在肿瘤内表达。
图24为免疫荧光检测超声调控Azurin蛋白在肿瘤内表达。
图25为活体成像监测黑色素肿瘤模型小鼠治疗效果。
图26为黑色素肿瘤模型小鼠肿瘤体积大小监测。
图27为黑色素肿瘤模型小鼠存活率监测。
图28为尾静脉递送工程化细菌在CT26和A20小鼠肿瘤模型中的治疗效果。
图29为尾静脉递送工程化细菌在4T1和H22小鼠肿瘤模型中的治疗效果。
图30为血常规及血生化分析。
图31为小鼠脏器HE染色。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。这些实施例仅用于举例说明发明而不对本发明的范围构成任何限制。实施本发明的过程、条件、实验方法等除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。以下实施例中所用的试剂、仪器等，以及未注明具体条件的实验方法，按照常规或商品供货商所建议的条件进行。
材料与方法
本发明所有表达质粒的构建试剂、具体构建体系及步骤如下所示。
所有用于PCR的引物均由金唯智生物科技有限公司合成。本发明实施例中构建的表达质粒都经过序列测定，序列测定由金唯智生物科技有限公司完成。本发明实施例中所用的PhantaMaxSuper-FidelityDNA聚合酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司。核酸内切酶、T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司。同源重组酶购自和元生物技术(上海)股份有限公司。PhantaMaxSuper-FidelityDNA聚合酶购买时附带有相应的聚合酶缓冲液和dNTP。核酸内切酶、T4DNA连接酶、同源重组酶购买时附带有相应的缓冲液。酵母提取物(YeastExtract)、胰蛋白胨(Trypton)、琼脂粉、氨苄青酶素(Amp)购自上海生工生物工程技术有限公司。DNAMarkerDL5000、DNAMarkerDL2000(宝生物工程有限公司)；核酸染料EB(广东国奥生物技术公司)；质粒小抽提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)；DNA胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒均购自康为世纪生物科技有限公司；实施例中提及的无水乙醇、NaCl等其余试剂均为国产分析纯产品。
一、质粒构建
本发明中，主要的分子克隆技术用于构建合成基因环路所需的质粒载体，各个质粒构建所涉及的引物序列、酶切位点、使用载体以及构建方式详见表1。主要步骤如下：
(1)引物设计合成
利用SnapGene软件(4.1.9版本)按引物设计原则进行引物设计，然后引物由上海睿勉生物技术有限公司和中国苏州金唯智生物技术有限公司合成。
(2)目的基因PCR
本实施例中目的基因扩增根据PCR试剂盒(Takara)提供的方法进行，主要PCR反应体系和运用程序如下:
PCR反应体系(50μL体系)
PCR反应程序
注:①退火温度按照引物Tm值设定(Tm-5)；②延伸时间按照基因bp数设定
(3)载体或目的基因酶切
本实施例中主要使用Takara或NEB的限制性内切酶进行酶切反应，各自相应的酶切体系如下：
Takara酶切体系(50μL体系)
37℃，反应4-6h。
注：不同限制性内切酶组合所选用的buffer不同
NEB酶切体系(50μL体系)
37℃，反应1-2h
注：酶1和酶2选择中一定要注意同尾酶的问题。
(4)DNA片段回收
经琼脂糖胶电泳鉴定并分离目的条带，利用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR
或者酶切产物，具体步骤参照试剂盒说明书(Magon)。
琼脂糖凝胶电泳缓冲液(5xTAE1000ml)
(5)目的基因和载体的连接
本实施例中主要使用T4连接酶连接或无缝克隆试剂盒连接，各自相应的连接反应体系如下：
T4连接体系(15μL体系)
室温，反应2h或者16℃，反应12h。
无缝克隆试剂盒连接(10μL体系)
和元生物技术(上海)股份有限公司无缝克隆(组装)试剂盒
37℃，反应0.5h。
注：在同时插入多个目的基因片段(2-3个)时，也可利用多片段无缝克隆试剂盒进行连接
(6)转化和单克隆筛选
提前将-80℃保存的DH5α感受态置于冰上解冻，将连接好的产物加入感受态细胞中，冰浴30min后，将其混合物进行热激(时间:45s，温度：42℃)，再冰浴2min，然后在37℃复苏培养1h(转速：150r/min)，3000rpm离心3min，弃部分上清，然后将DH5α重悬，进行涂板培养(培养平板的抗性根据质粒抗性选择)，8-12h后挑取单克隆鉴定。
LB液体培养基(200ml)
LB固体培养基(200ml)
抗生素配制
氨苄青霉素浓度为100mg/ml,即称取5g的氨苄青霉素粉末至50ml离心管中，加入双蒸水溶解，定容至50ml，用0.45μm滤器过滤至新的50ml离心管中，4℃保存。
(7)菌落PCR鉴定
本实施例中主要使用Takara的PremixExTaqTM进行菌落PCR鉴定，反应体系如下：
菌落PCR鉴定(20μL体系)
PCR反应程序
(8)扩大培养
将鉴定正确的单克隆菌液转移至有相应抗性的LB培养基中，37℃摇床200rpm培养8-12h。
(9)甘油菌保存
扩大培养的菌液吸取部分至冻存管，加入适当体积甘油，甘油终浓度为10％-20％，保存于-80℃。
(10)质粒抽提
本实验中主要使用天根质粒抽提试剂盒，主要步骤根据试剂盒说明书进行。
(11)质粒鉴定
质粒抽取后，可采用酶切对质粒进行初步的鉴定，也可将质粒直接送测序公司进行测序鉴定。
二、微生物细胞培养和质粒转化
大肠杆菌Top10,DH5a,BL21(DE3)，Nissle1917(EcN)和减毒沙门氏菌VNP20009，Sal3934均在LB培养基中进行培养。上述微生物细胞系中大肠杆菌DH5a采用CaCl2介导的化学转化方法，其他细胞系均采用电穿孔转化方法。
化学转化感受态制备
(1)接菌。从-80℃冰箱中取出大肠杆菌DH5a菌种，接种至2ml无抗性LB液体培养基中于37℃，200rpm摇床中过夜。
(2)扩增。第二天，取过夜培养的菌液,接种至200ml无抗性LB液体培养基中，37℃，200rpm摇床中培养2h左右，然后间隔一段时间测定培养基的OD600值，当OOD600达到0.3-0.5时，取出锥形瓶放入冰盒中，冰浴20min。
(3)收菌。在无菌的超净工作台中将菌悬液分装至50ml离心管中，然后在4℃，5000rpm条件下离心5min，倒掉上清液。
(4)清洗。加入20ml0.1MCaCl2，重悬，冰上静置5min，四度7000转离心4min，弃上清。加入10ml氯化钙，重悬，冰上静置5min，四度7000转离心4min，弃上清。
(5)分装。加入2.5ml混合液/50ml管(2ml0.1M氯化钙+0.5ml50％甘油)，重悬，100ul/1.5mlEP管中。分装好的感受态可以用于转化或放入-80℃冰箱中长期保存。
电转化感受态制备
(1)接菌。从-80℃冰箱中取出相应的菌种，接种至2ml无抗性LB液体培养基中于37℃，200rpm摇床中过夜。
(2)扩增。第二天，取过夜培养的菌液,接种至200ml无抗性LB液体培养基中，37℃，200rpm摇床中培养2h左右，然后间隔一段时间测定培养基的OD600值，当OOD600达到0.3-0.5时，取出锥形瓶放入冰盒中，冰浴20min。
(3)收菌。在无菌的超净工作台中将菌悬液分装至50ml离心管中，然后在4℃，5000rpm条件下离心5min，倒掉上清液。
(4)清洗。加入20ml双蒸水，重悬，冰上静置5min，四度7000转离心4min，弃上清。加入10ml双蒸水，重悬，冰上静置5min，四度7000转离心4min，弃上清。
(5)分装。加入2.5ml10％甘油/50ml管，重悬，分装100ul/1.5mlEP管中。分装好的感受态可以用于转化或放入-80℃冰箱中长期保存。
电穿孔转化条件
注：不同感受态细胞系所需电转的电压强度不同
实施例1减毒沙门氏菌VNP20009中，超声调控基因表达系统的不同温度强度诱导检测
本实施例以LuxCDABE为报告基因，其相应的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。验证减毒沙门氏菌VNP20009中，超声调控基因表达系统的温度强度依赖性
具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。
第二步，电转化。
将pGT52(PTlpA-RBS1-LuxCDABE-PlacI-TlpA39-pA)转化进VNP20009。
第三步，阳性克隆的筛选。
质粒转化，于固体LB平板中过夜培养。挑取单克隆菌落进行菌落PCR鉴定。
第四步，温度诱导及基因表达检测。
将阳性单克隆菌落于37℃，200rpm摇床中进行扩大培养，同时监测OD600。当OD600＝0.25时，取160μl菌液转移至8联排PCR管中。
在PCR仪中以不同的诱导温度(35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃)诱导8联排PCR管中的工程化细菌2h。然后在37°培养箱，静置培养12h后，各组分别取三个平行样品转移至黑色96孔板中，立即置于酶标仪中，检测报告基因LuxCDABE的表达量。
结果显示，在温度低于39℃时，LuxCDABE的表达受到明显地抑制，当温度在≥39℃时，LuxCDABE的表达被激活，呈现出温度依赖效果，表明39℃为其恰当的激活温度。实验数据详见图2，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例2减毒沙门氏菌VNP20009中，超声调控基因表达系统的不同时间的温度诱导检测
本实施例以LuxCDABE为报告基因，验证减毒沙门氏菌VNP20009中，超声调控基因表达系统的温度时间依赖性。
具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。
第二步，电转化。
第三步，阳性克隆的筛选。(具体步骤同本发明实施例1)
第四步，温度诱导及基因表达检测。
在39℃温度下，以不同的诱导时间(0min，10min，20min，30min，60min，90min)诱导8联排PCR管中的工程化细菌。然后在37℃培养箱，静置培养12h后，各组分别取三个平行样品转移至黑色96孔板中，立即置于酶标仪中，检测报告基因LuxCDABE的表达量。
随着诱导时间的增加，LuxCDABE的表达量也随之增长。这些结果表明该系统具有良好的时间依赖性。实验数据详见图3，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例3不同的超声参数与温度之间关系的探究
分别用不同的超声参数(超声强度0.4W/cm2，持续超声；超声强度0.4W/cm2，脉冲1:1；超声强度0.5W/cm2，持续超声；超声强度0.5W/cm2，脉冲1:1)刺激菌液，同时用光纤温度计实时监测。
结果显示，当超声强度为0.5W/cm2，脉冲1:1时，菌液温度可以长时间稳定维持在39-40℃。实验数据详见说明书附图4，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例4超声调控基因表达系统中不同核糖体结合位点(RBS)对报告基因LuxCDABE诱导效率探究
本实施例以LuxCDABE为报告基因，探究超声调控基因表达系统中不同核糖体结合位点(RBS)对报告基因LuxCDABE诱导效率的影响
具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。
第二步，电转化。
分别将pGT52(PTlpA-RBS1-LuxCDABE)，pGT64(PTlpA-RBS3-LuxCDABE)，pGT65(PTlpA-RBS3-LuxCDABE)，pGT165(PTlpA-RBS4-LuxCDABE)，pGT166(PTlpA-RBS5-LuxCDABE)，pGT167(PTlpA-RBS6-LuxCDABE)转化进VNP20009。
第三步，阳性克隆的筛选。(具体步骤同本发明实施例1)
第四步，超声诱导及基因表达检测
将阳性单克隆菌落于37℃，200rpm摇床中进行扩大培养，同时监测OD600。当OD600＝0.25时，取15ml菌液转移至30ml细菌培养皿中。
在超声强度为0.5W/cm2，脉冲1:1的条件下，诱导细菌培养皿中的工程化细菌0.5h，同时用光纤温度计实时监测菌液温度。然后在37℃培养箱，静置培养12h后，各组分别取三个平行样品转移至黑色96孔板中，立即置于酶标仪中，检测报告基因LuxCDABE的表达量。
结果显示，相较于RBS1，替换为RBS3的系统诱导倍数提高了将近一倍，因此我们使用了RBS3作为最优的核糖体位点序列。实验数据详见图5，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例5超声调控基因表达系统中启动子中的操纵子元件PTlpA的拷贝数对报告基因LuxCDABE诱导效率探究
本实施例以LuxCDABE为报告基因，探究超声调控基因表达系统中启动子中的操纵子元件PTlpA的拷贝数对报告基因LuxCDABE诱导效率的影响
具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。
第二步，电转化。
分别将pGT65(PTlpA-RBS3-LuxCDABE)，pGT168(PTlpA2-RBS3-LuxCDABE)，pGT169(PTlpA3-RBS3-LuxCDABE)转化进VNP20009。
第三步，阳性克隆的筛选。(具体步骤同本发明实施例1)
第四步，超声诱导及基因表达检测(具体步骤同本发明实施例4)
结果显示，随着PTlpA拷贝数的增加，系统的诱导量迅速降低，其系统的诱导倍数也大大降低。实验数据详见图6，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例6超声调控基因表达系统中转录因子TlpA39表达量对报告基因LuxCDABE诱导效率探究
本实施例以LuxCDABE为报告基因，探究超声调控基因表达系统中转录因子TlpA39表达量对报告基因LuxCDABE诱导效率的影响
具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。
第二步，电转化。
分别将pGT65(PTlpA-RBS3-LuxCDABE-PLacI-TlpA39-pA)，pGT240(PTlpA-RBS3-LuxCDABE-Pj23100-TlpA39-pA)，pGT241(PTlpA-RBS3-LuxCDABE-Pj23106-TlpA39-pA)，pGT242(PTlpA-RBS3-LuxCDABE-Pj23109-TlpA39-pA)转化进VNP20009。
第三步，阳性克隆的筛选。(具体步骤同本发明实施例1)
第四步，超声诱导及基因表达检测(具体步骤同本发明实施例4)
结果显示，相较于pGT65，替换为Pj23100的pGT240系统诱导倍数提高到37倍。实验数据详见图7，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例7减毒沙门氏菌VNP20009中，超声调控基因表达系统的不同超声时间诱导检测
本实施例以LuxCDABE为报告基因，验证减毒沙门氏菌VNP20009中，超声调控基因表达系统的超声时间依赖性
具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。
第二步，电转化。
将pGT240(1×OTlpA-PTlpA-RBS3-LuxCDABE-Pj23100-TlpA39-pA)转化进VNP20009。
第三步，阳性克隆的筛选。(具体步骤同本发明实施例1)
第四步，超声诱导及基因表达检测
将阳性单克隆菌落于37℃，200rpm摇床中进行扩大培养，同时监测OD600。当OD600＝0.25时，取15ml菌液转移至30ml细菌培养皿中。
在超声强度为0.5W/cm2，脉冲1:1的条件下，以不同超声时间(0min，10min，20min，30min，60min，90min，120min)诱导细菌培养皿中的工程化细菌，同时用光纤温度计实时监测菌液温度。然后在37℃培养箱，静置培养12h后，各组分别取三个平行样品转移至黑色96孔板中，立即置于酶标仪中，检测报告基因LuxCDABE的表达量。
结果显示，随着诱导时间的增加，LuxCDABE的表达量也随之增长，表明该系统具有良好的时间依赖性。实验数据详见图8，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例8超声调控基因表达系统在不同细胞系中的工作情况
本实施例以LuxCDABE为报告基因，探究超声调控基因表达系统在不同细胞系中的工作情况
具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。
第二步，电转化。
将pGT240(PTlpA-RBS3-LuxCDABE-Pj23100-TlpA39-pA)分别转化进SalmonellaVNP20009、E.coliDH5α、E.coliTOP10、Salmonella3439、E.coliBL21(DE3)、E.colistrainNissle1917。
第三步，阳性克隆的筛选。(具体步骤同本发明实施例1)
第四步，超声诱导及基因表达检测(具体步骤同本发明实施例4)
结果显示，该系统在上述细菌中都具有良好的诱导效果，表明超声调控的基因表达系统在不同微生物细胞系中具有良好的适用性。实验数据详见图9，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例9超声对细菌的活性的影响
具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。
第二步，电转化。
将组成型表达LuxCDABE的质粒pGT48(Pcap-LuxCDABE-pA)转化进VNP20009中。
第三步，阳性克隆的筛选。(具体步骤同本发明实施例1)
第四步，超声刺激，细菌活性及基因表达检测
将阳性单克隆菌落于37℃，200rpm摇床中进行扩大培养，同时监测OD600。当OD600＝0.25时，取15ml菌液转移至30ml细菌培养皿中。对菌液进行不同强度的超声刺激，然后在37℃培养箱，静置培养12h后，各组分别取三个平行样品转移至黑色96孔板中，立即置于酶标仪中，检测OD600和报告基因LuxCDABE的表达量。
结果显示，超声刺激并不会影响细菌的增殖能力和基因表达能力。实验数据详见图10-11，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例10减毒沙门氏菌VNP20009中，超声调控基因表达系统的报告蛋白分泌检测
本实施例以Gluc为报告基因，其相应的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。验证减毒沙门氏菌VNP20009中，超声调控基因表达系统的温度依赖性
具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。
第二步，电转化。
将质粒pGT198(PTlpA-RBS1-YopE45bp-Gluc-Pj23100-TlpA39-pA)转化进VNP20009
第三步，阳性克隆的筛选。(具体步骤同本发明实施例1)
第四步，超声诱导Gluc分泌检测
按照本发明实施例3中的方式进行超声诱导。
收集样品。取1.5ml诱导后的菌液常温，6000rpm离心3min。吸取1ml上清用0.2μm滤器过滤。
配制检测工作液。避光条件下，按照检测Buffer：Gluc酶＝500：1的比例配置检测工作液。
检测。每组分别吸取10μl过滤后的细菌上清于384孔板中，然后每孔中快速加入10μl检测工作液，立即置于酶标仪中，检测分泌到上清中Gluc的量。
结果显示，随着诱导时间的增加，上清中报告基因Gluc的含量也随之增长，表明该该分泌信号具有良好的分泌效果，具有时间依赖性。实验数据详见图13，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例11减毒沙门氏菌VNP20009中，超声调控基因表达系统的功能蛋白分泌检测
具体步骤如下：
第一步，质粒构建。本实施例中的质粒构建详见表1。
第二步，电转化。
将pGT252(PTlpA-RBS1-YopE45bp-Azurin-Flag-Pj23100-TlpA39-pA)转化进VNP20009。
第三步，阳性克隆的筛选。(具体步骤同本发明实施例1)
第四步，Westernblot检测目的蛋白。
收集蛋白。将超声诱导后的细菌离心，过滤细菌上清；取2ml滤后的细菌上清与甲醇按照1：4的比例混合，再加入2ml的氯仿，然后加入6ml的双蒸水，涡旋震荡20s，样品变浑浊；4℃，10000rpm离心10min；样品分为三层，小心吸除上层；再加入8ml甲醇，涡旋震荡混匀；4℃，10000rpm离心10min；小心弃掉上清，防止破坏蛋白沉淀，并置于超净台，使残留液体挥发干净；用45μl双蒸水将蛋白沉淀重悬，转移至1.5mlEp管中。加入15μl4×Loadingbuffer，金属浴10min。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
封闭：将电转后的NC膜先用TBST溶液轻轻漂洗，然后放入5％脱脂奶粉中封闭1-2小时。
一抗孵育：根据相应抗体说明书的要求加入一抗，置于4℃摇床，过夜。
洗膜：用5％的脱脂牛奶洗三遍，每遍10min
二抗孵育：针对一抗配制相应二抗(浓度通常为1：2000-1：10000)，4℃孵育1-2小时。
洗膜：前两次用5％的脱脂牛奶洗，第三次用TBST，每次10min
发光分析：用Odyssey机器进行扫膜，灰度分析蛋白含量。
结果显示，超声调控表达的功能蛋白能够借助分泌信号YopE45bp通过细菌自身的分泌系统有效的分泌到胞外。实验数据详见图14，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例12CCK8验证超声调控表达分泌的蛋白功能
具体步骤如下：
第一步，接种细胞。
将生长状态良好的黑色素瘤细胞(B16F10)和结肠癌细胞(CT26)用0.25％的胰酶消化后分别种于96孔板中，每孔约接种104个细胞，分为两组，并加入150μL含10％FBS的DMEM培养基。
第二步，处理细胞。
接种到37℃培养箱中培养12h后，第一组每孔细胞加入20μl未经超声诱导的菌液上清，第二组每孔细胞加入20μl超声诱导后的菌液上清，放回37℃培养箱继续培养24h
第三步，CCK8分析。
将第二步的细胞换新鲜DMEM培养基，每孔加入10μlCCK8，37℃培养箱继续培养1.5h后，取出96孔板，置于酶标仪上读取OD450处的吸光值。
结果显示，加入超声诱导后培养基上清的细胞的OD450处的吸光值明显低于对照组细胞的OD450处的吸光值。实验数据详见图15，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例13TUNEL分析验证超声调控表达分泌的蛋白功能
第一步，接种细胞。
将生长状态良好的黑色素瘤细胞(B16F10)和结肠癌细胞(CT26)用0.25％的胰酶消化后分别接种到24孔板中，进行细胞爬片，每孔约接种4×104个细胞，分为两组。
第二步，处理细胞。
37℃培养箱中培养12h后，第一组每孔细胞加入100μl未经超声诱导的菌液上清，第二组每孔细胞加入100μl超声诱导后的菌液上清，放回37℃培养箱继续培养12h。
第三步，TUNEL分析。
将第二步的细胞用PBS清洗。然后用4％多聚甲醛固定细胞30分钟。PBS洗涤一次。加入含0.3％TritonX-100的PBS，室温孵育5分钟进行细胞通透。在样品上加50μlTUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。PBS洗涤3次。用含DAPI的抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。
结果显示，加入超声诱导后培养基上清的细胞会发生明显的TUNEL染色。实验数据详见图16，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
TUNEL检测液：
注：配制好的TUNEL检测液现配现用，不能冻存
实施例14Annexin V-FITC/Propidium Iodide(PI)分析验证超声调控表达分泌的蛋白功能
第一步，接种细胞。
将生长状态良好的黑色素瘤细胞(B16F10)和结肠癌细胞(CT26)用0.25％的胰酶消化后分别接种到6孔板中，每孔约接种2×105个细胞，分为两组。37℃培养箱中培养12h。
第二步，处理细胞。
第一组每孔细胞加入150μl未经超声诱导的菌液上清，第二组每孔细胞加入150μl超声诱导后的菌液上清，放回37℃培养箱继续培养12h。
第三步，收集细胞。
把细胞培养液吸出至15ml离心管内，PBS洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液消化细胞。把吸出至15ml离心管的培养基重新加入培养皿中，把细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，800rpm离心3分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。
第四步，流式检测。
取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。加入10μl碘化丙啶(PI)染色液，轻轻混匀。室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟。立即上机检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。用Flowjo软件分析检测结果。
结果显示，加入超声诱导后培养基上清的细胞会发生明显Annexin V-FITC标记染色。实验数据详见图17，所有的数据都以n＝3独立复制实验的方式呈现。
实施例15肿瘤动物模型的建立
第一步，细胞培养。
小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)、小鼠乳腺癌细胞(4T1)培养在含有10％FBS和1％双抗(青霉素/链霉素)的DMEM中，小鼠结肠癌细胞(CT26)、小鼠肝癌细胞(H22)培养在含有10％FBS和1％双抗(青霉素/链霉素)的RPMI 1640中，小鼠淋巴瘤细胞(A20)细胞培养在含有10％FBS、1％双抗(青霉素/链霉素)、β-巯基乙醇和HEPES的RPMI 1640中。以上细胞均置于37℃，5％CO2培养箱进行培养。
第二步，细胞准备。
细胞计数，接种到10cm细胞培养皿中，培养48h后，用1ml胰酶消化1～2min,吸除胰酶，加入4ml无血清的培养基，把细胞轻轻吹打下来，转移到15ml离心管内，800rpm离心3min，弃上清液。用灭菌的4ml PBS重悬细胞，800rpm离心3min,弃上清液。重复三次。最后用灭菌的PBS轻轻地充分重悬细胞，并进行细胞计数。
第三步，小鼠皮下荷瘤。
5％水合氯醛麻醉小鼠(0.15ml/20g)，然后给荷瘤部位进行脱毛处理。用1ml注射器吸取100μl肿瘤细胞，针头在皮下进针约1cm深，缓慢注射。注意针头扎入小鼠皮下后，针头稍微动一动，明确针头在皮下后方可注射，防止刺破皮肤或者肌肉层。注射速度不宜太快。注射结束后要停顿一下，不可马上抽出注射器。7-10d左右接种部位可见米粒状隆起,触手可及，各组移植瘤小鼠活动、饮食情况、大小便等反应均正常,未出现异常情况。提示荷瘤成功。
小鼠荷瘤参数：
实施例16肿瘤原位注射细菌，超声调控表达分泌Azurin治疗黑色素瘤(B16F10)
第一步，电转化。
将质粒pGT252(PTlpA-RBS1-YopE45bp-Azurin-Flag-Pj23100-TlpA39-pA)转化进VNP20009
第二步，阳性克隆的筛选。(具体步骤同本发明实施例1)
第三步，准备细菌。
将阳性单克隆菌落于37℃，200rpm摇床中进行扩大培养，然后用PBS清洗细菌3次，并用PBS重悬。
第四步，肿瘤原位注射。
荷瘤小鼠肿瘤体积达到100mm3后，随机分为四组(PBS组，VNP20009+超声组,VNP20009+Azurin-超声组，VNP20009+Azurin+超声组)，每组5只。原位注射5×105CFU/40μl工程化的减毒沙门氏菌。
第五步，超声刺激及肿瘤监测。
每隔1d，给予相应组超声一次，超声强度为0.5W/cm2，脉冲1:1，超声时间为1h。从0d起，每隔2d测量1次肿瘤长度(L)和宽度(W)，按V(mm3)＝L×(W/2)2记录肿瘤体积。同时，从0d起，每隔2d进行小鼠活体成像拍摄。
结果显示，相较于对照组，治疗组对肿瘤的生长具有明显的抑制效果，同时小鼠生存率明显提高。实验数据详见图18-20。
实施例17尾静脉注射细菌，细菌VNP20009体内定植检测
第一步，电转化。
将强表达LuxCDABE的质粒pGT48(Pcap-LuxCDABE-pA)转化进VNP20009中
第二步，阳性克隆的筛选。(具体步骤同本发明实施例1)
第三步，准备细菌。(具体步骤同本发明实施例15)
第四步，尾静脉注射细菌。
荷瘤小鼠肿瘤体积达到100mm3后，尾静脉注射5×105CFU/100μl工程化的减毒沙门氏菌。
第五步，在不同时间点进行活体成像观察细菌在肿瘤组织中的存活增殖情况。
第六步，在不同的时间点将小鼠处死，取出小鼠主要器官(心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤组织，进行组织匀浆研磨，将上清梯度倍比稀释后，在LB平板上培养，计数平板中细菌的生长个数。
结果显示，细菌VNP20009可以通过血液循环系统在尾静脉注射3d后富集到肿瘤组织，而对其他正常的组织器官没有感染。实验数据详见图21-22。
实施例18尾静脉注射细菌，Westernblot检测超声调控Azurin蛋白在肿瘤内表达
第一步，电转化。(具体步骤同本发明实施例15)
第二步，阳性克隆的筛选。(具体步骤同本发明实施例1)
第三步，准备细菌。(具体步骤同本发明实施例15)
第四步，尾静脉注射细菌。(具体步骤同本发明实施例16)
第五步，超声刺激
每隔1d，给予相应组超声一次，超声强度为0.5W/cm2，脉冲1:1，超声时间为1h。连续超声三次。
第六步，收集蛋白。
取小块肿瘤组织，在冰冷的PBS中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入组织研磨管中，在组织研磨仪中进行研磨。研磨结束后，4℃，12000rpm离心，取上清，进行Westernblot蛋白检测。
结果显示，与对照组相比，超声可以诱导Azurin蛋白在小鼠体内表达。实验数据详见图23。
实施例19尾静脉注射细菌，免疫荧光检测超声调控Azurin蛋白在肿瘤内表达
第一步，电转化。(具体步骤同本发明实施例15)
第二步，阳性克隆的筛选。(具体步骤同本发明实施例1)
第三步，准备细菌。(具体步骤同本发明实施例15)
第四步，尾静脉注射细菌。(具体步骤同本发明实施例16)
第五步，超声刺激。
每隔1d，给予相应组超声一次，超声强度为0.5W/cm2，脉冲1:1，超声时间为1h。连续超声三次。
第六步，免疫荧光检测。
固定：新鲜肿瘤组织取出直接放入4％多聚甲醛，室温过夜，PBS清洗三遍，每次五分钟；将固定后的组织放入30％蔗糖中4℃脱水过夜
包埋：将脱水后的组织放入冰冻切片包埋剂OCT中，摆好组织形状，-80℃中速冻过夜。
切片：将切片厚度调为10mm，切片完成之后室温放置4-6h，然后-80℃保存。
免疫反应
抗原修复：从-80℃中取出片子，室温干片1h左右，用柠檬酸热修复法修复抗原(称1.92g柠檬酸溶解于950mL去离子水，用10MNaOH调至pH6.0，加入500μLTween-20，1mLTriton-100混匀后定容至1L)。水浴煮98℃，将片子放入修复液中，水浴30min，修复完成后，放置室温。
清洗:冷却后载玻片用pbs清洗一遍，用阻水笔沿样品画圈，覆盖约250微升PBST，洗三遍，每次五分钟。
封闭:3％BSA封闭30min，37℃30min。
一抗孵育:在37℃孵育3h或4℃过夜。
二抗孵育:PBST清洗三遍每次五分钟，孵育二抗，37℃2h或4℃过夜。
封片拍照:PBST清洗三遍每次五分钟，加入抗淬灭剂，指甲油封片，晾干后荧光显微镜拍照。
结果显示，与对照组相比，超声可以诱导Azurin蛋白在小鼠体内表达，并且分泌到肿瘤微环境中。实验数据详见图24。
实施例20尾静脉注射细菌，超声调控表达分泌Azurin治疗黑色素瘤(B16F10)
第一步，电转化。(具体步骤同本发明实施例15)
第二步，阳性克隆的筛选。(具体步骤同本发明实施例1)
第三步，准备细菌。(具体步骤同本发明实施例15)
第四步，尾静脉注射细菌。荷瘤小鼠肿瘤体积达到100mm3后，随机分为四组(PBS组,VNP20009+超声组,VNP20009+Azurin-超声组,VNP20009+Azurin+超声组)，每组4只。尾静脉注射5×105CFU/100μl工程化的减毒沙门氏菌。
第五步，超声刺激及肿瘤监测。(具体步骤同本发明实施例15)
结果显示，相较于对照组，治疗组对肿瘤的生长具有明显的抑制效果，同时小鼠生存率明显提高。验数据详见图25-27。
实施例21尾静脉注射细菌，超声调控表达分泌Azurin治疗其他类型肿瘤
第一步，电转化。(具体步骤同本发明实施例15)
第二步，阳性克隆的筛选。(具体步骤同本发明实施例1)
第三步，准备细菌。(具体步骤同本发明实施例15)
第四步，尾静脉注射细菌。荷瘤小鼠肿瘤体积达到100mm3后，随机分为四组(PBS组，VNP20009+超声组，VNP20009+Azurin-超声组，VNP20009+Azurin+超声组)，每组5只。尾静脉注射5×105CFU/100μl工程化的减毒沙门氏菌。
第五步，超声刺激及肿瘤监测。(具体步骤同本发明实施例15)
结果显示，在多种其他肿瘤模型中，相较于对照组，治疗组对肿瘤的生长具有明显的抑制效果，同时小鼠生存率明显提高。实验数据详见图28-29。
实施例22系统安全性评价
第一步，电转化。(具体步骤同本发明实施例15)
第二步，阳性克隆的筛选。(具体步骤同本发明实施例1)
第三步，准备细菌。(具体步骤同本发明实施例15)
第四步，尾静脉注射细菌。荷瘤小鼠肿瘤体积达到100mm3后，随机分为三组(PBS组，VNP20009，VNP20009+Azurin+超声组)，每组4只。尾静脉注射5×105CFU/100μl工程化的减毒沙门氏菌。
第五步，超声刺激。(具体步骤同本发明实施例18)
第六步，血常规及生化指标检测。
小鼠血样收集：小鼠通过眼眶取血，将血液收集于1.5mL抗凝管中。收集的全血送南模生物公司进行检测。
第七步，组织HE染色。
固定：取小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)直接放入4％多聚甲醛，室温过夜
脱水：取组织器官置于4％PFA中，4℃，24h后，水洗6h。将组织依次经过30％，50％，75％，85％，95％，100％各1h。
透明：50％酒精+50％二甲苯通透1h，100％二甲苯5min，新的100％二甲苯5min。
浸蜡：50％二甲苯+50％蜡1h，100％蜡过夜，第二天转移到新的100％蜡1h。
包埋。
切片：将切片厚度调为6mm，切片完成之后，在42℃水浴中展片，37℃恒温箱中晾干。
烤片：65℃烤片1h，使石蜡融化。
脱蜡：切片依次经过二甲苯、无水乙醇、90％乙醇、75％乙醇。
染色：切片先后经过苏木精和伊红染色。
封片：滴加中性树脂进行封片。
显微镜下观察拍照。
结果显示，PBS组、VNP20009组，Siri+US组的心，肝，脾，肺，肾的石蜡切片HE染色无明显差异，各器官的生长状况良好。此外，这三组的血常规和血液生化指标基本趋于一致，并且处于正常值范围内。实验数据详见图30-31。
表1质粒构建表
SEQ ID NO.1：TlpA39的核苷酸序列
ATGCGTCCGGCGACATACGAACCAGAACAGATTATTGAAGCAGGGCTGGCCCTGCAGGCTGAAGGACGGAATATCACCGGGTTCGCACTACGTAACCAGGTGGGTGGCGGCAATCCGACACGTCTCCGCCAGATATGGGACGAATACCAGGCTTCACAGAGCACGGTCGTCACTGAACCCGTTGCCGAGCTGCCAGTGGAAGTGGCT
GAAGAAGTGAAGGCCGTCTCCGCCGCGCTGTCCGAACGCATCACCCAGCTGGCGACAGAACTGAATGAC
AAGGCGGTCCGGGCTGCAGAACGCCGGGTTGCGGAAGTCACGCGTGCTGCCGGTGAACAGACCGCACAG
GCAGAGCGGGAGCTGGCCGACGCCGCGCAGACAGTCGACGACCTGGAAGAAAAACTGGTTGAACTGCAG
GACAGATATGACAGTTTGACGCTGGCGCTGGAGTCAGAACGTTCACTGCGTCAGCAGCATGATGTGGAG
ATGGCCCAGCTGAAAGAGCGTCTTGCGGCCGCTGAAGAGAATACCCGTCAGCGAGAGGAACGGTATCAG
GAGCAGAAGACAGTGCTGCAGGATGCGCTTAATGCGGAGCAGGCACAGCACAAAAACACGCGGGAAGAC
CTGCAGAAACGACTGGAGCAAATTTCTGTCGAAGCTAATGCGCGTACAGAAGAACTGAAGTCTGAACGC
GATAAAGTCAATACTTTCCTTACCCGCCTTGAATCGCAGGAAAATGCGCTGGCCTCAGAACGTCAGCAG
CATCTGGCCACCCGCGAAACGCTGCAGCAACGCCTCGAGCAGGCCATCGCTGACACGCAGGCGCGCGCC
GGTGAGATTGCACTTGAACGTGACAGAGTCAGCAGCCTCACCGCAAGGCTGGAATCGCAGGAAAAGGCC
TCCTCGGAGCAACTGGTGCGTATGGGCAGTGAAATAGCCAGTCTGACAGAGCGTTGCACACAGCTGGAA
AACCAGCGTGATGATGCCCGTCTGGAGACGATGGGGGAGAAAGAAACGGTCGCGGCACTGCGTGGTGAG
GCTGAAGCCCTGAAGCGTCAGAACCAGTCACTGATGGCGGCGCTTTCAGGCAATAAACAGACCGGTGGC
CAGAATGCGTGA
SEQ ID NO.2：PTlpA的核苷酸序列
TTTAATTTGTTTGTTAGTTAGTTTATTTGTTGGTTTGTTTGTGTTATAATAT
SEQ ID NO.3：YopE45bp的核苷酸序列
ATGAAAATATCATCATTTATTTCTACATCACTGCCCCTGCCGACA
SEQ ID NO.4：Azurin的核苷酸序列
ATGCTACGTAAACTCGCTGCGGTATCCCTGCTGTCCCTGCTCAGTGCGCCACTGCTGGCTGCCGAGTGC
TCGGTGGACATCCAGGGTAACGACCAGATGCAGTTCAACACCAATGCCATCACCGTCGACAAGAGCTGC
AAGCAGTTCACCGTCAACCTGTCCCACCCCGGCAACCTGCCGAAGAACGTCATGGGCCACAACTGGGTA
CTGAGCACCGCCGCCGACATGCAGGGCGTGGTCACCGACGGCATGGCTTCCGGCCTGGACAAGGATTAC
CTGAAGCCCGACGACAGCCGTGTCATCGCCCACACCAAGCTGATCGGCTCGGGCGAGAAGGACTCGGTG
ACCTTCGACGTCTCCAAGCTGAAGGAAGGCGAGCAGTACATGTTCTTCTGCACCTTCCCGGGCCACTCC
GCGCTGATGAAGGGCACCCTGACCCTGAAG
SEQ ID NO.5：PLacI的核苷酸序列GACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGTGAAT
SEQ ID NO.6：Pj23100的核苷酸序列
TTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGC
SEQ ID NO.7：Pj23106的核苷酸序列
TTTACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAGTGCTAGC
SEQ ID NO.8：Pj23109的核苷酸序列
TTTACAGCTAGCTCAGTCCTAGGGACTGTGCTAGC
SEQ ID NO.9：PTlpA2的核苷酸序列
TTTAATTTGTTTGTTAGTTAGTTTATTTGTTGGTTTGTTTGTGTTATAATATCCTCTAGATTTAATTTGTTTGTTAGTTAGTTTATTTGTTGGTTTGTTTGTGTTATAATAT
SEQ ID NO.10：PTlpA3的核苷酸序列
TTTAATTTGTTTGTTAGTTAGTTTATTTGTTGGTTTGTTTGTGTTATAATATCCTCTAGATTTAATTTGTTTGTTAGTTAGTTTATTTGTTGGTTTGTTTGTGTTATAATATAATTTTAATTTGTTTGTTAGTTAGTTTATTTGTTGGTTTGTTTGTGTTATAATAT
SEQ ID NO.11：RBS2的核苷酸序列
ATTAAAGAGGAGAAA
SEQ ID NO.12：RBS3的核苷酸序列
AAAGAGGAGAAA
SEQ ID NO.13：RBS4的核苷酸序列
TCACACAGGAAACC
SEQ ID NO.14：RBS5的核苷酸序列
TCACACAGGAAAG
SEQ ID NO.15：RBS6的核苷酸序列
TCACACAGGAC
SEQ ID NO.16：LuxCDABE的核苷酸序列
ATGGCTAATATGACTAAAAAAATTTCATTCATTATTAACGGCCAGGTTGAAATTTTTCCCGAAAGTGAT
GATTTAGTGCAATCCATTAATTTTGGTGATAATAGTGTTTACCTGCCAATATTGAATAATTCTCATGTA
AAAAACATTATTGATTATAATGAAAATAATAAATTACGGTTGCATAATATTGTCAATTTTCTCTATACG
GTAGGGCAAAGATGGAAAAATGAAGAATATTCAAGACGCAGGACATACATTCGTGATTTAAAAAAATAT
ATGGGATATTCAGAAGCAATGGCCAAGTTAGAGGCCAACTGGATATCTATGATTTTATGTTCTAAAGGT
GGCCTTTATGATGTTGTAGAAAATGAACTTGGTTCTCGCCATATCATGGATGAATGGCTACCTCAGGAT
GAAAGTTATATTAAGGCTTTTCCGAAAGGTAAGTCTATACATCTGTTGGCAGGTAATGTTCCATTATCT
GTGATCATGTCTATATTACGCGCAATTTTAACCAAGAATCAGTGTATTATAAAAACATCGTCAACCGAT
CCCTTTACCGCTAATGCATTAGCGTTAAGCTTTATCGATGTAGACCCTAATCATCCGATAACGCGCTCT
TTGTCTGTTGTATATTGGCCACACCAAGGTGATACATCACTCGCAAAAGAAATTATGCAACATATGGAT
GTTATTGTCGCTTGGGGAGGGGAAGATGCGATTAATTGGGCTGTAGAACATGCACCACCCTATGCTGAC
GTGATTAAATTTGGCTCTAAAAAGAGTTTTTGCATTATTGATAATCCAGTTGATTTAACGTCAGCAGCT
ACCGGTGCGGCTCATGATATTTGTTTTTACGATCAGCGCGCTTGTTTTTCTGCCCAAAACATATATTAC
ATGGGAAATCAGTATGAGGAATTTAAGTTAGCGTTGATAGAAAAACTTAATCTATATGCGCATATATTA
CCAAACGCCAAAAAAGATTTTGATGAAAAGGCGGCCTATTCTTTAGTCCAAAAAGAGAGCTTATTTGCT
GGATTAAAAGTAGAGGTGGATGTTCATCAACGTTGGATGATTATTGAGTCAAATGCGGGTGTGGAATTT
AATCAACCACTTGGCAGATGTGTGTATCTTCATCACGTCGATAATATTGAGCAAGTATTGCCTTATGTT
CAAAAAAATAAGACACAAACCATATCTATTTTTCCTTGGGAATCCGCATTTAAGTATCGAGATGCGTTG
GCATTAAGAGGTGCGGAAAGGATTGTAGAAGCAGGAATGAATAATATATTTCGAGTTGGTGGATCTCAT
GACGGAATGAGGCCGTTACAACGATTAGTGACATATATTTCTCATGAGAGGCCATCTCATTATACTGCT
AAGGATGTTGCGGTTGAAATAGAACAGACTCGATTCCTGGAAGAAGATAAGTTCCTTGTATTTGTCCCG
TAATAGGTAAAAAGTATGGAAAATAAATCCAAATATAAAACCATCGACCATGTTCTTTGTGTTGAAGGA
AATAAAAAAATTCATGTTTGGGAAACGCTGCCAGAAGAAACCAGCCCAAAGAGAAAGAATCCCATTATT
ATTGCGTCGGGTTTTGCCCGAAGGATGGATCATTTTGCTGGTTTAGCGGAATATTTATCGCGGAATGGG
TTTCATGTGATTCGCTATGATTCACTTCACCACGTTGGGTTGAGTTCAGGGACAATTGATGAATTTACA
ATGTCTATAGGAAAACAGAGCCTATTAGCCGTGGTTGATTGGTTAAATACACGAAAAATAAATAACCGT
GGTATTTTGGCTTCAAGCTTATCTGCACGGATAGTTTATGCAAGTCTATCTGAAATTAATGTTTCATTT
TTAATCACCGCAGTCGGTGTTGTTAACTTAAGATATACGCTTGAAAGAGCTTTAGGATTTGATTATCTC
AGTTTACCCATTAATGAATTGCCGAATAATTTGGATTTTGAAGGCCATAAATTGGGTGCTGAAGTCTTT
GCGAGAGATTGCCTTGATTTTGGCTGGGAAGATTTAACTTCTACAATCAATAGCATGATGTATCTTGAT
ATACCGTTTATTGCTTTTACTGCAAATAACGACAATTGGGTAAAGCAAGATGAAGTTATCACATTGTTA
TCAAATATTCGTAGTAATCGATGCAAGATACATTCTTTGTTAGGAAGTTCGCATGACTTGTGTGTTTTC
TTAGTGGTCCTGCGCAATTTTTATCAATCGGTTACGAAGGCTGCTATCGCGATGGATAATGATCGTCTG
GATATTGATGTTGATATTATTGAACCATCATTCGAACATCTAACTATTGCGACAGTCAATGAACGTCGA
ATGAAAATTGAGATTGAAAATCAAGCGATTTCGCTGTCTTAAAACCTATTGGGATAGATATTACCCTAT
AGATTTCAAGATGGATCGCGACGGCAAGGGAGCGAATCCCGGGAGCATAGCAAACTATGTGACCGGGGT
GAGTGAGTGCAGCCAACAAAGAAGCAACTTGAAAGATAACGGGTATAGTTAATTCTATCACTCAAATAT
AAGGGCTCTCTATGAAATTTGGAAACTTTTTGCTTACATACCAACCCCCCCAATTTTCTCAAACAGAAG
TAATGAAACGTTTGGTTAAATTAGGTCGTATTTCTGAGGAGTGTGGTTTTGATACTGTATGGTTACTGG
AGCATCATTTCACGGAGTTTGGTTTGCTTGGTAACCCTTATGTCGCTGCTGCATATTTACTTGGTGCAA
CCAAAAAATTGAATGTAGGGACTGCGGCTATTGTTCTTCCCACCGCTCATCCAGTGCGCCAACTTGAAG
ATGTGAATTTATTGGATCAAATGTCAAAAGGACGATTTCGGTTTGGTATTTGTCGGGGGCTTTACAATA
AAGACTTTCGCGTATTTGGCACGGATATGAATAACAGTCGCGCTTTAACGGAGTGCTGGTACGGGTTGA
TAAAAAATGGCATGACAGAGGGATATATGGAAGCTGATAATGAACATATCAAGTTCCATAAGGTAAAAG
TAAACCCGACAGCATATAGTAAAGGTGGAGCCCCTGTTTATGTGGTTGCTGAATCAGCCTCGACAACTG
AATGGGCCGCTCAATTTGGTTTACCGATGATATTAAGTTGGATTATAAATACTAACGAAAAGAAAGCAC
AGCTTGAGCTTTATAACGAGGTGGCTCAAGAATATGGGCACGATATTCATAATATCGACCATTGCTTAT
CATATATAACATCTGTAAATTATGACTCAAATAAAGCGAAAGAGATTTGTCGGAAATTTCTAGGGCATT
GGTATGATTCTTATGTGAATGCCACGACCATTTTTGATGATTCAGACAAAACAAGAGGTTATGATTTCA
ATAAAGGGCAGTGGCGTGACTTTGTATTAAAGGGACATAGAGATACTAATCGCCGCATTGATTACAGTT
ACGAAATCAATCCCGTGGGAACCCCGCAGGAATGCATTGACATAATTCAAAAAGACATTGATGCCACGG
GAATATCAAATATCTGTTGTGGGTTTGAAGCGAATGGAACAGTAGACGAAATTATTGCTTCCATGAAGC
TCTTCCAGTCTGATGTCATGCCGTTTCTTAAAGAAAAACAACGTTCGCTATTATAGTAGCTAAGGAAAA
AGAAATGAAATTTGGATTGTTCTTCCTTAACTTCATCAATTCAACAACTGTTCAAGAACAAAGTATAGT
TCGCATGCAGGAAATAACGGAGTATGTTGATAAGTTGAATTTTGAACAGATTTTGGTGTATGAAAATCA
TTTTTCAGGTAATGGTGTTGTCGGTGCTCCTCTGACTGTTTCTGGTTTTTTGCTCGGTTTAACAGAAAA
AATTAAAATTGGCTCATTGAATCACATCATTACAACTCATCATCCTGTCCGAATAGCGGAGGAGGCTTG
CTTACTGGATCAATTAAGCGAAGGGAGATTTATTTTAGGGTTTAGTGATTGTGAAAAAAAAGATGAAAT
GCGTCTTTTTAATCGCCCTGTTGAATATCAACAGCAACTATTTGAAGAGTGTTATGAAATCATTAACGA
TGCTTTAACAACAGGCTATTGTAATCCCGATAATGATTTTTATAGTTTCCCTAAAATATCGGTAAACCC
CCACGCTTATACCCAAGGCGGGCCTCGGAGATATATTACAGCAACCAGTCATCATATTGTTGAATGGGC
GGCTAAAAAAGGCATTCCTCTCATCTTTAAGTGGGATGACTCCAATGATGTTAGATATGAATATGCTGA
AAGGTATAAAGCCGTTGCTGATAAATATGGCATTGACTTATCAGCGATAGATCATCAGTTAATGGTATT
GGTTAACTATAACGAAGATAGTCACAAAGCTAAACAAGAGACGCGTGCATTTATCCGTGATTATGTTCT
TGAAATGTATCCTAATGAAAATCTCGAAAATAAACTTGAAGAGATAATCACAGAAAACGCTGTCGGAGA
TTATACGGAATGTATAGCTGCGGCTAAGCTGGCAATTGAAAAGTGCGGTGCAAAAAGGGTATTATTATC
CTTTGAACCAATGAATGACTTGATGCACCAAAAAAATGTAATCAATATTGTTGATGATAATATTAAAAA
GTACCACATGTAGTAAAAGAATATGGCAGCAACGCTGCCATATTCTCTAAATTATTTGGAGGGGTAAAA
CAGGTATGACTTCATATGTTGATAAACAAGAGATCATAGCAAGCTCAGAAATTGATGATTTGATTTTTT
CCAGCGATCCATTAGCTTGGTCTTACGATGAACAGGAAAAAATCAGAAACAAATTTGTTCTTGATGCAT
TTCGTAATCACTATAAACATTGTCAAGAATACCGTCACTACTGTCAGGTACACAAAGTAGACGACAATA
TTACGGAAATTGATGACATACCTGTATTCCCAACATCAGTTTTTAAGTTTACTCGCTTATTAACTTCTC
AGGAGAACGAGATTGAAAGTTGGTTTACCAGCAGCGGCACGAGTGGTTTAAAAAGTCAGGTGGCGCGTG
ACAGACTAAGTATTGAGAGACTCTTAGGCTCTGTGAGTTATGGCATGAAATATGTTGGTAGTTGGTTTG
ATCATCAAATAGAGTTGGTCAACTTAGGGCCAGATAGATTTAATGCTCATAACATTTGGTTTAAATATG
TTATTAGTTTGGTAGAATTATTATATCCCACGACATTTACCGTAATGGAAGAACGAATAGATTTTGTTA
AGACATTGAATAGCCTTGAGCGAATAAAAAATCAAGGGAAAGATATTTGTCTTATCGGCTCACCATACT
TTATTTATTTGCTCTGCCAGTATATGAAAGATAAAAACATCTCATTTTATGGGGATAAAAACCTTTATA
TCATAACGGGGGGCGGCTGGAAAAGTTATGAAAAAGAGTCCCTAAAACGCGATGATTTCAATCATCTTT
TATTCGACACGTTCAACCTCAATAATATTAGTCAAATCCGCGATATATTTAATCAAGTTGAACTCAACA
CTTGTTTCTTTGAGGATGAAATGCAACGTAAACGTGTTCCGCCGTGGGTATATGCGCGAGCACTTGATC
CTGAAACATTGAAACCTGTACCTGATGGAATGCCGGGTTTGATGAGTTATATGGATGCGTCATCAACGA
GTTATCCGGCATTTATTGTTACCGATGATGTCGGGATAATGAGCAGAGAATATGGTCAATATCCTGGTG
TACTTGTTGAGATTTTACGTCGCGTCAATACGAGGGCACAGAAAGGGTGTGCTTTAAGCTTAAACCAAG
CATTTAATAGTTGA
SEQ ID NO.17：Gluc的核苷酸序列
ATGGGAGTCAAAGTTCTGTTTGCCCTGATCTGCATCGCTGTGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACAAC
GAAGACTTCAACATCGTGGCCGTGGCCAGCAACTTCGCGACCACGGATCTCGATGCTGACCGCGGGAAG
TTGCCCGGCAAGAAGCTGCCGCTGGAGGTGCTCAAAGAGATGGAAGCCAATGCCCGGAAAGCTGGCTGC
ACCAGGGGCTGTCTGATCTGCCTGTCCCACATCAAGTGCACGCCCAAGATGAAGAAGTTCATCCCAGGA
CGCTGCCACACCTACGAAGGCGACAAAGAGTCCGCACAGGGCGGCATAGGCGAGGCGATCGTCGACATT
CCTGAGATTCCTGGGTTCAAGGACTTGGAGCCCATGGAGCAGTTCATCGCACAGGTCGATCTGTGTGTG
GACTGCACAACTGGCTGCCTCAAAGGGCTTGCCAACGTGCAGTGTTCTGACCTGCTCAAGAAGTGGCTG
CCGCAACGCTGTGCGACCTTTGCCAGCAAGATCCAGGGCCAGGTGGACAAGATCAAGGGGGCCGGTGGT
GAC
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (26)

1.一种基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其特征在于，所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009包含超声调控的蛋白分泌系统。
2.如权利要求1所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其特征在于，所述的超声调控的蛋白分泌系统包括超声感受器及分泌效应器。
3.如权利要求2所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其特征在于，所述超声感受器由温度敏感转录因子TlpA39和相对应的启动表达功能蛋白基因的启动子PTlpA构成。
4.如权利要求3所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其特征在于，所述的温度敏感转录因子TlpA39的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
5.如权利要求4所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其特征在于，所述的温度敏感转录因子TlpA39由组成型启动子启动表达。
6.如权利要求5所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其特征在于，表达温度敏感转录因子TlpA39的组成型启动子包括PlacI、Pj23100、Pj23100和Pj23109，其相应的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5-8所示。
7.如权利要求3所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其特征在于，所述启动子PTlpA核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
8.如权利要求7所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其特征在于，用于启动表达功能蛋白基因的启动子PTlpA可包含不同拷贝数的转录因子结合位点。
9.如权利要求8所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其特征在于，包含1-3拷贝数的转录因子结合位点的启动子PTlpA、PTlpA2、PTlpA3，其相应的核苷酸序列分别如SEQID NO.2、9-10所示。
10.如权利要求2所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其特征在于，所述的分泌效应器包括蛋白分泌信号肽和功能蛋白基因。
11.如权利要求10所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其特征在于，所述的分泌效应器中的蛋白分泌信号肽YopE1-15融合表达于功能蛋白N端。
12.如权利要求10或11所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其特征在于，所述的分泌效应器中的蛋白分泌信号肽YopE1-15的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
13.如权利要求10所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其特征在于，所述的分泌效应器中的功能蛋白包括单一表达的任意报告蛋白或功能型蛋白。
14.如权利要求13所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其特征在于，所述的分泌效应器中的功能蛋白Azurin编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
15.如权利要求13所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其特征在于，所述分泌效应器中的功能蛋白的表达可受不同强度的核糖体结合位点(RBS)调控。
16.如权利要求15所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其特征在于，用于表达功能蛋白基因的不同核糖体结合位点包括RBS1、RBS2、RBS3、RBS4、RBS5、RBS6，其中RBS2、RBS3、RBS4、RBS5、RBS6相应的核苷酸序列如SEQ ID NO.11-15所示。
17.如权利要求1所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其特征在于，所述超声调控的蛋白分泌系统，基因元件简单，且在多种微生物细胞系中均具有可调性。
18.如权利要求17所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，其特征在于，所述的微生物细胞系包括Salmonella VNP20009、E.coli DH5α、E.coli TOP10、Salmonella3439、E.coliBL21(DE3)、E.coli strainNissle 1917。
19.一种如权利要求1-18中任一项所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009的制备方法，所述方法包括下述步骤：
(1)构建包括组成型表达温度敏感转录因子TlpA39和启动子PTlpA启动表达N端融合表达蛋白分泌信号肽的功能蛋白基因的载体；
(2)将步骤(1)构建的载体转化至VNP20009细胞中，以制备含有超声调控的蛋白分泌系统的基因工程化的VNP20009细胞；
(3)将步骤(2)制备的基因工程化的VNP20009细胞体外培养扩增，得到扩增的基因工程化的VNP20009细胞群体；
(4)收获所述基因工程化的VNP20009细胞群体。
20.如权利要求1-18之任一项所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009在肿瘤治疗中的应用。
21.如权利要求20所述的应用，其特征在于，所述应用包括瘤内注射药物和静脉注射药物。
22.如权利要求20所述的应用，其特征在于，所述应用包括通过超声调控释放Azurin杀伤肿瘤。
23.如权利要求22所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括黑色素瘤B16-F10、结肠癌CT26、乳腺癌4T1、B淋巴细胞瘤A20和肝癌H22。
24.一种治疗肿瘤的方法，其特征在于，所述方法利用如权利要求1所述的所述的基因工程化的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，和/或，利用如权利要求2中所述的超声调控的蛋白分泌系统来治疗肿瘤。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)人工构建原核表达载体；所述原核表达载体含有超声调控的蛋白分泌系统；
(2)将步骤(1)构建的表达载体转化至微生物细胞中，制备含有超声调控的蛋白分泌系统的工程化细胞；
(3)将步骤(2)制备的所述工程化细胞以瘤内注射或静脉注射的形式注射至肿瘤模型鼠体内；
(4)每两天超声小鼠肿瘤部位，诱导所述工程化细胞表达并分泌Azurin激活肿瘤细胞的凋亡通路从而杀伤肿瘤。
26.一种质粒，其特征在于，所述质粒为选自质粒pGT048、pGT052、pGT064、pGT065、pGT165、pGT166、pGT167、pGT168、pGT169、pGT198、pGT230、pGT233、pGT234、pGT240、pGT241、pGT242、pGT252之一种或几种。
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