CN118161619A - 过继细胞治疗产品和免疫检查点阻断剂的药物组合及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种过继细胞治疗产品和免疫检查点阻断剂的药物组合及应用，属于生物医药技术领域。本发明改善了免疫检查点阻断剂单药治疗肿瘤响应率较低，仅对部分患者有效，治疗耐药性及过继细胞治疗产品存在局限性的问题。所述药物组合包括含有效治疗剂量的CD160+CD8+T细胞群的过继细胞治疗产品和免疫检查点阻断剂PD‑1抗体。本发明构建小鼠MC38细胞皮下移植瘤和AOM/DSS诱导的自发结直肠癌模型，验证了过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群可以抑制结直肠肿瘤的发生发展。本发明所述的药物组合可有效抑制肿瘤生长，对于提高肿瘤治疗效果有重要临床意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种过继细胞治疗产品和免疫检查点阻断剂的药物组合及应用。
背景技术
肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤，恶性肿瘤中90%为癌症，还有10%为肉瘤、母细胞瘤和血液肿瘤，是威胁人类健康的首要因素。恶性肿瘤可发生在全身各个部位，正常情况下绝大多数癌变细胞会被免疫系统识别并清除，但是当免疫系统功能紊乱时，癌变细胞逃避免疫系统监视，发生免疫逃逸，不断生长，最后形成肿瘤，因此免疫系统在抗肿瘤过程中发挥关键的作用。肿瘤免疫治疗是继手术切除、放化疗等传统肿瘤治疗方法后新兴的肿瘤治疗方案，从免疫的角度主动或被动的使机体产生肿瘤特异性免疫应答，从而发挥抗肿瘤作用。其中免疫检查点阻断剂、过继细胞疗法在临床上已有广泛应用，肿瘤免疫疗法不仅可任意单独使用，还可联合使用增加抗肿瘤疗效。
免疫检查点阻断剂（Immune checkpoint blockade, ICB）是针对相应的免疫检查点研发的单抗类药物，目前临床研究较多的靶点为PD-1和CTLA-4。免疫检查点阻断剂主要是阻断表达免疫检查点的免疫细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，从而阻断肿瘤细胞对免疫细胞的功能抑制，恢复免疫细胞的抗肿瘤功能。但是临床研究发现免疫检查点阻断剂单药治疗肿瘤响应率较低，仅对部分患者有效，存在着治疗耐药性，因此免疫检查点阻断剂和其他疗法的组合已成为目前新的研发方向。
过继性细胞疗法是免疫治疗的一种形式，指将收集的患者自体免疫细胞在体外培养改造后，使其杀伤功能增加，再回输到患者体内，从而杀伤肿瘤细胞。然而由于瘤内免疫检查点的存在，过继性免疫细胞回输后，在肿瘤微环境内很快耗竭，杀伤能力下降，有效治疗时间短，因此过继细胞治疗产品在实体瘤治疗中还是有很大局限性。提高过继免疫细胞的杀伤功能和抗耗竭能力是提高过继细胞治疗产品抗肿瘤效果的重要方法。
综上，随着过继性细胞疗法与免疫检查点疗法的研究深入，亟需寻找新的靶点或治疗方式以弥补目前过继细胞产品的局限性，同时提高免疫检查点阻断剂在肿瘤治疗中的疗效，从而改善临床的肿瘤免疫治疗现状。
发明内容
本发明提供了一种过继细胞治疗产品和免疫检查点阻断剂的药物组合及应用，极大改善了免疫检查点阻断剂单药治疗肿瘤响应率较低，仅对部分患者有效，存在着治疗耐药性及过继细胞产品存在局限性的问题。
本发明的技术方案如下：
一种过继细胞治疗产品和免疫检查点阻断剂的药物组合，所述药物组合包括含有效治疗剂量的过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群和免疫检查点阻断剂PD-1抗体。
进一步的，所述过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群和免疫检查点阻断剂以任何次序依序或同时进行。
进一步的，所述过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群的获得方法为将脾脏或外周血单核细胞流式分选出CD160和CD8双阳性的细胞群，并在包括抗CD3和抗CD28组合物以及IL-2的培养物中进行离体扩增至少1周。
进一步的，所述过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群体外培养物中的抗CD3和抗CD28组合物浓度分别为10μg/ml和2μg/ml，IL-2浓度为100U/ml。
进一步的，所述过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群的小鼠给药量为1×106细胞/只，每周一次；所述免疫检查点阻断剂的小鼠给药量为100μg/只，每周2次。
进一步的，所述药物组合中过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群的给药方式为静脉注射，所述免疫检查点阻断剂的给药方式为腹腔注射。
所述过继细胞治疗产品和免疫检查点阻断剂的药物组合在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
本申请提供了一种过继细胞治疗产品和免疫检查点阻断剂的药物组合及应用，揭示了CD160+CD8+T细胞与CD160-CD8+T细胞相比具有增强的杀伤功能以及不易耗竭的特性，过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群浸润到肿瘤微环境后，有效促进肿瘤微环境中CD8+T细胞细胞毒颗粒B（Granzyme B, GzmB）的分泌，导致肿瘤细胞被杀伤。与单独使用过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群或单独使用PD-1抑制剂相比，联合治疗方案能够显著抑制肿瘤的生长，具有协同抗肿瘤的作用。因此将过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群与常规免疫检查点阻断剂药物PD-1抑制剂结合起来对于提高肿瘤治疗效果有广泛的临床应用前景。
附图说明
图1是本申请实施例1中CD160+CD8+T细胞与CD160-CD8+T细胞的杀伤功能和耗竭表型检测结果图，A、B为CD160+CD8+T细胞和CD160-CD8+T细胞中GzmB+细胞占比情况的代表性流式等高线图（A）及量化统计图（B）（n = 3）；A、C为PD-1+或LAG-3+的CD160+CD8+T细胞和CD160-CD8+T细胞在GzmB+细胞中占比情况的代表性流式等高线图（A）及量化统计图（C）（n = 3）；D为共培养系统示意图；E、F为GFP+MC38细胞中Zombie-NIR阳性细胞的代表性流式散点图（E)及量化统计图（F）；在CD160+CD8+T细胞和CD160-CD8+T细胞与GFP+MC38细胞共培养体系中，GFP+MC38群体中Zombie-NIR阳性细胞视为死亡或濒死细胞（n = 3）；数据用Mean ± SEM表示，Student’s-t检验用于比较两组之间统计学差异，***p<0.001; **p<0.01; *p<0.05；
图2是本申请实施例2中使用过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群与CD160-CD8+T细胞群对AOM/DSS化学诱导自发结直肠癌模型的肿瘤生长影响效果图，A为过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群与CD160-CD8+T细胞群治疗AOM/DSS化学诱导自发结直肠癌模型的流程示意图；B为实验结束时各组结肠肿瘤代表图像；C、D为实验结束时各组结肠肿瘤数量统计图（n = 10），数据用Mean ± SEM表示，Student’s-t检验用于比较两组之间统计学差异，***p<0.001; **p<0.01; *p<0.05；
图3是本申请实施例3中使用过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群与CD160-CD8+T细胞群对小鼠皮下MC38移植瘤生长影响的效果图，A为实验结束时各组MC38荷瘤小鼠的肿瘤大小图像（n = 5）；B为各组MC38荷瘤小鼠肿瘤生长曲线（n = 5）；C为实验结束时各组MC38荷瘤小鼠肿瘤体积统计图（n = 5）；数据用Mean ± SEM表示，Student’s-t检验用于比较两组之间统计学差异，***p<0.001; **p<0.01; *p<0.05；
图4是本申请实施例4中过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群与CD160-CD8+T细胞群联合PD-1抗体使用对小鼠皮下MC38移植瘤生长影响的效果图，A为实验结束时各组MC38荷瘤小鼠的肿瘤大小图像（n = 6）；B为各组MC38荷瘤小鼠肿瘤体积生长曲线（n = 5）；C为实验结束时各组MC38荷瘤小鼠肿瘤体积统计图（n = 6）；数据用Mean ± SEM表示，Student’s-t检验用于比较两组之间统计学差异，***p<0.001; **p<0.01; *p<0.05。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和更加清楚，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显然，所描述的实施例仅示出了本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，因此不应被看作是对范围的限定。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其他实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1
本实施例1提供了CD160+CD8+T细胞与CD160-CD8+T细胞的杀伤功能和耗竭表型水平对比。
1.1实验材料
（1）肿瘤细胞：小鼠结肠癌MC38-GFP细胞。
（2）小鼠品系：C57BL/6小鼠（6-8周龄，雄性，购自辽宁长生生物技术股份有限公司）。
（3）试剂与抗体：高尔基体阻断剂（货号：550583，公司：BD PharmingenTM），CD3抗体（货号：100340，公司：Biolegend）, CD28抗体（货号：102116，公司：Biolegend），红细胞裂解液（货号：130-094-183，公司：Miltenyi Biotec），Percp/cy5.5 anti-mouse CD8（货号：551162，公司：BD Biosciences），PE anti-mouse CD160 (货号：143004，公司：Biolegend)，Zombie-NIR（货号：423106，公司Biolegend）。
（4）实验仪器：BD Melody流式分选仪（BD PharmingenTM）。
1.2实验方法
（1）流式细胞术分选CD160+CD8+T细胞与CD160-CD8+T细胞并体外培养、扩增：正常C57BL/6小鼠处死后取出脾脏，制备成单细胞悬液，离心500g，5分钟，并使用红细胞裂解液去除红细胞，得到淋巴细胞团块。调整细胞密度为1×108个/ml，每107个细胞（100μl）加入1μg Zombie NIR抗体，1μg Percp/cy5.5 anti-mouse CD8抗体和1μg PE anti-mouse CD160抗体，冰上孵育30分钟，但是，这些试剂的精确浓度将取决于个别实验室测试。孵育结束后，加入500μl 5% FBS的PBS溶液，离心500g，5分钟。弃去上清液，细胞沉淀用1ml 5% FBS的PBS溶液重悬，通过流式细胞仪分选CD160+CD8+T细胞与CD160-CD8+T细胞。使用补充有CD3/CD28/IL-2的10% FBS RPMI-1640培养基，将分选出的CD160+CD8+T细胞与CD160-CD8+T细胞铺板在CD3包被的细胞板中，培养3天后，离心500g，5分钟，重新用补充有100U/ml IL-2的10% FBS RPMI-1640培养基重悬细胞，继续培养，每2天更换培养基，直至CD160+CD8+T细胞与CD160-CD8+T细胞数量扩增至满足实验需求。
（2）流式细胞术分别检测CD160+CD8+T细胞与CD160-CD8+T细胞的效应及耗竭特征，实验分组如下：①CD160+CD8+T组：只含CD160+CD8+T细胞；②CD160-CD8+T组：只含CD160-CD8+T细胞。
各组使用CD3/CD28抗体活化处理24小时，然后每1×106/ml T细胞加入2μl高尔基体阻断剂处理4小时后，流式细胞术检测CD160+CD8+T细胞与CD160-CD8+T细胞的效应指标GZMB、耗竭指标PD-1和LAG3的表达情况。
（3）流式细胞术分别检测共培养体系中CD160+CD8+T细胞与CD160-CD8+T细胞对自体肿瘤细胞杀伤功能的影响。实验分组如下：①CD160+CD8+T组：含CD160+CD8+T细胞和MC38-GFP细胞；②CD160-CD8+T组：含CD160-CD8+T细胞和MC38-GFP细胞。
从MC38-GFP荷瘤鼠脾脏中分选CD160+CD8+T细胞与CD160-CD8+T细胞，同时从皮下瘤分离自体肿瘤细胞，经体外扩增后，将1×105个自体肿瘤细胞加入12孔细胞培养板中，24小时后，分别与1×106个经CD3/CD28抗体活化后的CD160+CD8+T细胞与CD160-CD8+T细胞共培养48小时。培养结束后，通过流式细胞术检测CD160+CD8+T细胞与CD160-CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤情况，即MC38-GFP+Zombie-NIR+占比。
1.3实验结果
如图1所示，图1A、图1B和图1C结果显示与CD160-CD8+T细胞相比，CD160+CD8+T细胞的细胞毒颗粒GzmB占比更高，且高表达GzmB的细胞亚群中，免疫检查点PD-1和LAG-3占比更低，说明CD160+CD8+T细胞效应功能更强且不易于趋向耗竭。图1E和图1F流式结果表明CD160+CD8+T细胞组处理的肿瘤细胞MC38-GFP中Zombie-NIR+占比更高，说明肿瘤细胞死亡率更高，表明CD160+CD8+T细胞具有更强大的肿瘤杀伤能力。
实施例2
本实施例2 提供了过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群对AOM/DSS化学诱导自发结直肠癌的生长的影响。
2.1 实验材料
（1）小鼠品系：C57BL/6小鼠（6-8周龄，雄性，购自辽宁长生生物技术股份有限公司）
（2）试剂：氧化偶氮甲烷（AOM，货号：Cat# A5486，公司：Sigma-Aldrich)；葡聚糖硫酸钠（DSS，货号：Cat# 160110，公司：MP Biomedicals）
2.2 实验方法
采用实施例1中的流式细胞术分选CD160+CD8+T细胞与CD160-CD8+T细胞并体外培养、扩增的方法，在AOM/DSS化学诱导的原位结直肠癌小鼠模型观察静脉回输过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群与CD160-CD8+T细胞群后对结直肠肿瘤生长的影响：
（1）将30只6-8周龄的雄性C57BL/6随机分为3组（每组10只小鼠），分别为：①PBS组；②CD160-CD8+T细胞治疗组；③CD160+CD8+T细胞治疗组。
（2）然后对C57BL/6小鼠进行腹腔注射7.5mg/kg AOM溶液（按每只小鼠体重计算），7天后，小鼠开始自由饮用2% DSS溶液5天，5天后，进行自由饮水14天。随后，进行重复另外两轮DSS溶液饮水（即饮用5天2%DSS+14天纯水），最后直到第90天模型结束。过继细胞治疗产品从AOM给药后第7天开始进行第1次回输：PBS组每只小鼠给予每周尾静脉注射1次等体积的PBS溶液；CD160-CD8+T细胞治疗组每只小鼠给予每周尾静脉注射1次1×106个CD160-CD8+T细胞，100μl/只；CD160+CD8+T细胞治疗组每只小鼠给予每周尾静脉注射1次1×106个CD160+CD8+T细胞，100μl/只。每隔7天接受1次过继性细胞治疗，共计11次。
（3）90天后，处死小鼠并沿着肠道纵轴剖开结肠，统计每只小鼠结直肠肿瘤的生长数量以及使用游标卡尺测量每个肿瘤的最长径和最短径。
1.3 实验结果
如图2所示，图2A为AOM/DSS化学诱导自发结直肠癌模型过继细胞治疗的流程示意图，图2B为各实验组的结直肠肿瘤大体图，图2C和2D为各实验组的结直肠肿瘤数量统计，表明过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群能够明显地抑制结直肠原位肿瘤的生长。
实施例3
本实施例3提供了过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群与CD160-CD8+T细胞群对小鼠结肠癌皮下移植瘤生长的影响。
3.1 实验材料
（1）肿瘤细胞：小鼠结肠癌MC38细胞。
（2）小鼠品系：C57BL/6小鼠（6-8周龄，雄性，购自辽宁长生生物技术股份有限公司）。
3.2 实验方法
采用实施例1中的流式细胞术分选CD160+CD8+T细胞与CD160-CD8+T细胞并体外培养、扩增的方法，在MC38皮下移植瘤小鼠模型中观察静脉回输过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群与CD160-CD8+T细胞群后对皮下肿瘤生长的影响：
（1）分别将2.5×105个小鼠结肠癌MC38细胞接种于6-8周龄的雄性C57BL/6的右腋窝侧皮下。随机分为3组（每组5只小鼠）：①PBS组；②CD160-CD8+T组；③CD160+CD8+T组。
（2）当肿瘤体积达到100-150mm3大小，小鼠开始接受治疗：PBS组每只小鼠给予每周尾静脉注射1次等体积的PBS液体，共3次；CD160-CD8+T组每只小鼠给予每周尾静脉注射1次1×106个CD160-CD8+T细胞，100μl/只，共3次；CD160+CD8+T组每只小鼠给予每周尾静脉注射1次1×106个CD160-CD8+T细胞，100μl/只，共3次。
（3）每隔3天使用游标卡尺测量肿瘤大小，依照公式：Volume = (width2×length)/2计算肿瘤体积（Length：代表肿瘤最长直径；width：代表肿瘤最短直径），比较各组间肿瘤生长曲线的差异。
（4）第三次回输48小时后，处死小鼠并取出皮下肿瘤组织。
3.3 实验结果
如图3所示，图3A为各实验组的肿瘤，图3B和3C为各实验组肿瘤的生长曲线，图3结果一致地显示过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群能够明显抑制小鼠结肠癌MC38细胞皮下移植瘤的生长。
实施例4
本实施例4提供了过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群与PD-1单抗联合治疗对小鼠结肠癌皮下移植瘤生长的影响。
4.1 实验材料
（1）试剂：IgG抗体（货号BE0089，BioX-Cell公司）；PD-1单抗：anti-mouse-PD-1(CD279)（货号BE0146，BioX-Cell公司）。
（2）肿瘤细胞：小鼠结肠癌MC38细胞。
（3）小鼠品系：C57BL/6小鼠（6-8周龄，雄性，购自辽宁长生生物技术股份有限公司）。
4.2 实验方法
采用实施例1中的流式细胞术分选CD160+CD8+T细胞与CD160-CD8+T细胞并体外培养、扩增的方法，在MC38皮下移植瘤小鼠模型中观察静脉回输过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群与CD160-CD8+T细胞群，并联合PD-1单抗腹腔注射后对皮下肿瘤生长的影响：
（1）分别将2.5×105个小鼠结肠癌MC38细胞接种于6-8周龄的雄性C57BL/6的右腋窝侧皮下。随机分为6组（每组6只小鼠）：①IgG抗体组；②IgG抗体和CD160-CD8+T细胞联合治疗组；③IgG抗体和CD160+CD8+T细胞联合治疗组；④PD-1单抗治疗组；⑤PD-1单抗和CD160-CD8+T细胞联合治疗组；⑥PD-1单抗和CD160+CD8+T细胞联合治疗组。
（2）当肿瘤体积达到100-150mm3大小，小鼠开始接受治疗：IgG抗体组每只小鼠每周给予腹腔注射2次100μg IgG抗体和尾静脉注射1次等体积的PBS溶液；IgG抗体和CD160-CD8+T细胞联合治疗组每只小鼠每周给予腹腔注射2次100μg IgG抗体和尾静脉注射1次1×106个CD160-CD8+T细胞，100μl/只；IgG抗体和CD160+CD8+T细胞联合治疗组每只小鼠每周给予腹腔注射2次100μg IgG抗体和尾静脉注射1次1×106个CD160+CD8+T细胞，100μl/只；PD-1单抗治疗组每只小鼠每周给予腹腔注射2次100μg PD-1单抗和尾静脉注射1次等体积的PBS溶液；PD-1单抗和CD160-CD8+T细胞联合治疗组每只小鼠每周给予腹腔注射2次100μg PD-1单抗和尾静脉注射1次1×106个CD160-CD8+T细胞，100μl/只；PD-1单抗和CD160+CD8+T细胞联合治疗组每只小鼠每周给予腹腔注射2次100μg PD-1单抗和尾静脉注射1次1×106个CD160+CD8+T细胞，100μl/只。
（3）每隔3天使用游标卡尺测量肿瘤大小，依照公式：Volume = (width2×length)/2计算肿瘤体积（Length：代表肿瘤最长直径；width：代表肿瘤最短直径），比较各组间肿瘤生长曲线的差异。
（4）第三次回输48小时后，处死小鼠并取出皮下肿瘤组织。
4.3 实验结果
如图4所示，图4A为各实验组的肿瘤，图4B和4C为各实验组肿瘤的生长曲线，图4结果一致地显示过继细胞治疗产品CD160+CD8+T细胞群和PD-1单抗联合治疗能够明显抑制小鼠结肠癌MC38细胞皮下移植瘤的生长。
Claims (5)
1.一种过继细胞治疗产品和免疫检查点阻断剂的药物组合，其特征在于，所述药物组合包括含有效治疗剂量的过继细胞治疗产品CD160+CD8+ T细胞群和免疫检查点阻断剂PD-1抗体。
2.根据权利要求1所述的药物组合，其特征在于，所述过继细胞治疗产品CD160+CD8+ T细胞群的获得方法为将脾脏或外周血单核细胞流式分选出CD160和CD8双阳性的细胞群，并在包括抗CD3和抗CD28组合物以及IL-2的培养物中进行离体扩增至少1周。
3.根据权利要求2所述的药物组合，其特征在于，所述过继细胞治疗产品CD160+CD8+ T细胞群体外培养物中的抗CD3和抗CD28组合物浓度分别为10μg/ml和2μg/ml，IL-2浓度为100U/ml。
4.根据权利要求1所述的药物组合，其特征在于，所述药物组合中过继细胞治疗产品CD160+CD8+ T细胞群的给药方式为静脉注射，所述免疫检查点阻断剂PD-1抗体的给药方式为腹腔注射。
5.权利要求1所述的过继细胞治疗产品和免疫检查点阻断剂的药物组合在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
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