CN118147229A - 一种新型Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具、构建方法及其应用 - Google Patents
一种新型Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具、构建方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了一种新型Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具、构建方法及其应用，将引导Cas13a核酸酶（Cas13a）至目的基因的两个规律成簇的间隔短回文重复序列RNAa（CRISPR‑Derived RNA,crRNAa）和规律成簇的间隔短回文重复序列RNAa（CRISPR‑Derived RNA,crRNAb）序列分别连接在初体miRNA（Primary miRNA,pri‑miRNA）的左、右侧翼，形成三重识别目的基因的cr:mi:crRNA引导RNA，构建Cas13a/cr:mi:crRNA。牛及小鼠肌肉细胞转染Cas13a/cr:mi:crRNA后，借助Drosha核酸内切酶对cr:mi:crRNA进行切割分离，产生彼此分离的crRNAa，crRNAb和前体miRNA（Previous miRNA,pre‑miRNA），从而对靶向信使RNA（Messenger RNA，mRNA）进行三重识别切割，显著提高RNAi效率，为生物育种提供高效的基因干扰系统。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种新型Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具、构建方法及其应用。
背景技术
基因敲除技术应用于动物时，由于动物本身的复杂性，可能会引起基因的代偿效应。相对于基因敲除，RNAi技术在保持DNA完整的情况下，能够使基因表达量下调，具有设计简单、特异性高的特点，已应用于动物基因功能的研究和基因治疗等领域。
目前CRISPR/Cas13a是常用的RNA干扰（RNA interference, RNAi）方法。CRISPR/Cas13a由于其特异性被广泛研究和应用，通过crRNA引导Cas13a蛋白定位于靶mRNA，从而对靶mRNA进行特异性敲减。miRNA是存在于真核生物的一类非编码单链RNA，其初体miRNA（primary miRNA, pri-miRNA）通过Drosha核酸内切酶将侧翼序列剪切，形成前体miRNA（precursor miRNA, pre-miRNA）。随后Dicer核酸内切酶将pre-miRNA的环剪切，形成双链成熟miRNA，从而与靶mRNA相互识别配对，引起靶mRNA的翻译抑制或特异性切割。这两种干扰系统虽然常用，但干扰效率还有待提高。
肌肉生长抑制素（Myostatin，MSTN）是肌肉发育的负调控因子，MSTN基因表达量的降低，能够促进肌肉量增加。甲基转移酶3（Methyltransferase like 3，METTL3）是N6-甲基腺苷（N6-Methyladenosine, m6A）甲基化转移酶的核心成分，以依赖m6A的方式抑制成肌细胞增殖，促进细胞分化。大肿瘤抑制基因2（Large tumor suppreressor2，Lats2）的表达受性别、生长阶段和不同肌肉组织的影响, 通过抑制Yes相关蛋白1（Yes-associatedprotein 1, YAP1）基因的表达而下调肌肉生长发育。目前经典CRISPR/Cas13a干扰系统在家畜动物中的应用存在干扰效率低的缺陷，本发明借助miRNA成熟过程中的Drosha内切酶，构建Cas13a/cr:mi:crRNA敲减工具，对目的 mRNA的不同位点进行联合RNAi，从而提高干扰效率，为生物育种提供更高效的基因干扰系统。
发明内容
本发明首先提供了一种新型Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具，所述工具包含crRNAa、初体miRNA和crRNAb的结构；所述crRNAa和crRNAb位于初体miRNA两翼。
优选地，所述工具为一段核苷酸序列。
优选地，所述工具为载体。
优选地，所述工具还包含1个U6启动子。
本发明还提供了上述的工具构建方法，包括以下步骤：
1)根据目的mRNA的同源序列，设计crRNA序列，得到靶向目的mRNA的crRNAa和crRNAb序列；
2)以pri-miRNA为基本骨架，设计靶向目的mRNA的pri-miRNA模拟物；
3)将crRNAa和crRNAb序列分别连接到pri-miRNA模拟物的左右两翼，得到cr:mi:crRNA序列；
4)采用BbsI限制性内切酶对LwaCas13a crRNA backbone载体进行单酶切，得到线性LwaCas13a crRNA backbone；
5)将cr:mi:crRNA序列连接到线性LwaCas13a crRNA backbone上得到cr:mi:crRNA载体。
优选地，包括以下步骤：
所述步骤4)的反应体系和条件：质粒1μg，BbsI 1μL，10×Buffer 2μL，补加ddH2O至10μL，混匀后在37℃下反应1 h；
优选地，包括以下步骤：
所述步骤5)的反应体系和条件：LwaCas13a crRNA backbone回收产物1μL，cr:mi:crRNA序列3μL，Solution I连接酶5μL，补加ddH2O至10μL，于16℃过夜连接。
本发明还提供了上述工具的应用，所述应用为进行目标生物的基因敲减，所述应用为非治疗目的的，任选地，所述目标生物包含非人哺乳动物、植物和微生物。
本发明还提供了一种基因敲减的方法，其包含使用上述工具的步骤，所述方法为非治疗目的的。
本发明与现有技术相比，至少具有如下有益效果：
与经典CRISPR/Cas13a和miRNA介导的目的mRNA最高干扰效率分别为54%和33%相比，本发明构建的Cas13a/cr:mi:crRNA敲减工具的干扰效率为97％；并且Cas13a/cr:mi:crRNA敲减工具对细胞活力和增殖没有影响。
附图说明
图1是Cas13a/cr:mi:crRNA作用机制；
图2是pri- miRNA设计原理；
图3是LwaCas13a crRNA backbone载体单酶切；
图4是cr:mi:crRNA载体测序结果；
图5是突变miRNA的cr:mi:crRNA载体测序结果；
图6是建立稳定表达Cas13a蛋白细胞系的示意图；
图7是流式细胞术分选；
图8是稳定表达Cas13a蛋白的牛SCs和小鼠C2C12的GFP观察；
图9是cr:mi:crRNA和突变miRNA的cr:mi:crRNA长转录本序列；
图10是Cas13a/cr:mi:crRNA有效产生彼此分离的crRNA和miRNA的电泳结果图，1、2、3分别为con、crRNA-1、miRNA。
图11是crRNA-1和miRNA测序结果。
图12是在牛Cas13a-SCs，qPCR检测Cas13a/cr:mi:crRNA介导的MSTN mRNA干扰效率；
图13是在小鼠Cas13a-C2C12，qPCR检测Cas13a/cr:mi:crRNA介导的MSTN mRNA干扰效率；
图14是在牛Cas13a-SCs，WB检测Cas13a/cr:mi:crRNA介导的MSTN蛋白干扰效率；
图15是在小鼠Cas13a-C2C12，WB检测Cas13a/cr:mi:crRNA介导的MSTN蛋白干扰效率；
图16是在牛Cas13a-SCs，qPCR检测Cas13a/cr:mi:crRNA介导的METTL3 mRNA干扰效率；
图17是在小鼠Cas13a-C2C12，qPCR检测Cas13a/cr:mi:crRNA介导的METTL3 mRNA干扰效率；
图18是在牛Cas13a-SCs，WB检测Cas13a/cr:mi:crRNA介导的METTL3蛋白干扰效率；
图19是在小鼠Cas13a-C2C12，WB检测Cas13a/cr:mi:crRNA介导的METTL3蛋白干扰效率；
图20是在牛Cas13a-SCs，qPCR检测Cas13a/cr:mi:crRNA介导的LATS2 mRNA干扰效率；
图21是在小鼠Cas13a-C2C12，qPCR检测Cas13a/cr:mi:crRNA介导的LATS2 mRNA干扰效率；
图22是在牛Cas13a-SCs，WB检测Cas13a/cr:mi:crRNA介导的LATS2蛋白干扰效率；
图23是在小鼠Cas13a-C2C12，WB检测Cas13a/cr:mi:crRNA介导的LATS2蛋白干扰效率；
图24是Cas13a/cr:mi:crRNA对牛SCs和小鼠C2C12细胞活力的影响；
图25是Cas13a/cr:mi:crRNA对牛SCs细胞增值的影响。
图26是Cas13a/cr:mi:crRNA对小鼠C2C12细胞增值的影响。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
本发明生物材料的来源：牛肌卫星细胞通过分离培养肉牛腓肠肌而获得；小鼠成肌细胞为实验室保存的C2C12成肌细胞。
实施例1如图1-5为本发明的cr:mi:crRNA载体和突变miRNA的cr:mi:crRNA载体构建过程。
以pri-miR-31为基本骨架，设计pri-miRNA模拟物（图2）。由宝生物工程（大连）有限公司合成cr:mi:crRNA序列，参见表1（连接在pMD-19T）。
表1 合成序列
| 合成序列CompositionSequence | 序列（5′ - 3′） sequence （5′ - 3′） |
| MSTN-crRNA-1 | SEQ ID NO:1：ATACCTTGTACCGTCTTTCATGGGTTTG |
| MSTN-crRNA-3 | SEQ ID NO:2：TGATTTCAATGCCTAAGTTGGATTCAGG |
| MSTN-miRNA | SEQ ID NO:3：TGCTCTGCCAAATACCAGTGC |
| MSTN-cr:mi:crRNA | SEQ ID NO:4：CTTAAGATACCTTGTACCGTCTTTCATGGGTTTGCTCGAGagggatggtattgctcctgtaactcggaactggagaggTGCTCTGCCAAATACCAGTGCgttgaactgggaacgGCACTGGTTTGGCAGAGCAtttcctgtctgacagcagcttggctacctccgtcctgttcGGATCCgaaacaccgatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacTGATTTCAATGCCTAAGTTGGATTCAGGAAGCTT |
| mutant MSTN-cr:mi:crRNA | SEQ ID NO:5：CTTAAGATACCTTGTACCGTCTTTCATGGGTTTGCTCGAGagggatggtattgctcctgtaactcggaactggagaggTGCTCTGCCAATAACTAGGTCgttgaactgggaacgGACCTAGATTGGCAGAGCAtttcctgtctgacagcagcttggctacctccgtcctgttcGGATCCgaaacaccgatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacTGATTTCAATGCCTAAGTTGGATTCAGGAAGCTT |
| METTL3-crRNA-1 | SEQ ID NO:6：CCTGGATAGAGCTCCACGTGTCCGACAT |
| METTL3-crRNA-3 | SEQ ID NO:7：CTTCTGATGCTGAAGAGGCCAGACCAGA |
| METTL3-miRNA | SEQ ID NO:8：AGGGTCTGTAGCTAGTTCAGG |
| METTL3-cr:mi:crRNA | SEQ ID NO:9：CTTAAGCCTGGATAGAGCTCCACGTGTCCGACATCTCGAGagggatggtattgctcctgtaactcggaactggagaggAGGGTCTGTAGCTAGTTCAGGgttgaactgggaacgCCTGAACTAGCTACAGACCCTtttcctgtctgacagcagcttggctacctccgtcctgttcGGATCCgaaacaccgatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacCTTCTGATGCTGAAGAGGCCAGACCAGAAAGCTT |
| mutant METTL3-cr:mi:crRNA | SEQ ID NO:10：CTTAAGCCTGGATAGAGCTCCACGTGTCCGACATCTCGAGagggatggtattgctcctgtaactcggaactggagaggAGGGTCTGTAGTCAGATCGAGgttgaactgggaacgCTCGATCTGACTACAGACCCTtttcctgtctgacagcagcttggctacctccgtcctgttcGGATCCgaaacaccgatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacCTTCTGATGCTGAAGAGGCCAGACCAGAAAGCTT |
| Lats2-crRNA-1 | SEQ ID NO:11：ATCTGCTCCTGCTCGGCCTCACAGAGCC |
| Lats2-crRNA-3 | SEQ ID NO:12：AGTACAGGCTGTCCTTGTCCTGGAAGGA |
| Lats2-miRNA | SEQ ID NO:13：GCGCCCTCTGCTCCAGGGTCT |
| Lats2-cr:mi:crRNA | SEQ ID NO:14：CTTAAGATCTGCTCCTGCTCGGCCTCACAGAGCCCTCGAGagggatggtattgctcctgtaactcggaactggagaggGCGCCCTCTGCTCCAGGGTCTgttgaactgggaacg AGACCCTGGAGCAGAGGGCGCtttcctgtctgacagcagcttggctacctccgtcctgttcGGATCCgaaacaccgatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacAGTACAGGCTGTCCTTGTCCTGGAAGGAAAGCTT |
| mutant Lats2-cr:mi:crRNA | SEQ ID NO:15：CTTAAGATCTGCTCCTGCTCGGCCTCACAGAGCCCTCGAGagggatggtattgctcctgtaactcggaactggagaggGCGCCCTCTGCCTCACGGCTTgttgaactgggaacg AAGCCGTGAGGCAGAGGGCGCtttcctgtctgacagcagcttggctacctccgtcctgttcAAGCCGTGAGGCAGAGGGCGCgaaacaccgatttagactaccccaaaaacgaaggggactaaaacAGTACAGGCTGTCCTTGTCCTGGAAGGAAAGCTT |
1）质粒提取。带有LwaCas13a crRNA backbone载体的大肠杆菌摇菌培养后，收集菌液。按照质粒小提试剂盒使用说明书提取质粒。提取完成的质粒于-20℃保存。
2）单酶切质粒。采用BbsI限制性内切酶对LwaCas13a crRNA backbone载体进行单酶切，反应组成：质粒1 μg，BbsI 1 μL，10×Buffer 2 μL，补加ddH2O至10 μL，混匀后在37℃下反应1 h。
3）电泳鉴定。对（2）中酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，分离得到2935 bp的线性LwaCas13a crRNA backbone载体，符合实验预期（图3）。
4）切胶回收。按照胶回收试剂盒使用说明书对目的片段进行纯化，纯化产物于-20℃保存。
5)同源重组。将线性LwaCas13a crRNA backbone载体与cr:mi:crRNA序列进行连接，反应组成：LwaCas13a crRNA backbone回收产物1μL，cr:mi:crRNA序列3μL，Solution I连接酶5μL，补加ddH2O至10μL，于16℃过夜连接。
6）转化。取10μL上述连接产物，加入到50μL冰冷的DH5α感受态细胞中，轻柔混匀。将转化体系冰上放置30 min后，于42℃热激60 sec，冰上放置2 min。在体系中加入1 mL无抗性LB培养液，于37℃摇菌培养1 h。摇菌培养结束后将转化产物涂于含相应抗生素的LB平板上，37℃过夜培养。
7）阳性克隆的筛选。挑取抗性平板上长出的大小均匀的单菌落，于37℃液体LB培养基中培养以进行后续测序验证。结果显示，本发明成功构建cr:mi:crRNA载体和突变miRNA的cr:mi:crRNA载体（图4-5）。
实施例2
如图6-8为表达Cas13a蛋白的LwaCas13a-msfGFP-NES载体转染至细胞过程，用于说明本发明成功获得稳定表达Cas13a蛋白的牛肌肉卫星细胞系（Cas13a-Satellitecells, Cas13a-SCs）和小鼠成肌细胞C2C12（Cas13a-C2C12）细胞系。
牛SCs和小鼠C2C12传代至六孔板，待细胞融合度达到70%~80%，使用转染试剂Lipfectamine 2000（Invitrogen, 美国）转染LwaCas13a-msfGFP-NES质粒7μg，6 h后换液，24 h后观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein , GFP）荧光，采用流式细胞荧光分选技术分选稳定表达GFP的细胞。结果显示，牛SCs中有6%Cas13a-SCs，小鼠C1C12中有2.5%Cas13a-C2C12（图7），从而得到稳定表达Cas13a蛋白的牛Cas13a-SCs和小鼠Cas13a-C2C12细胞系（图8）。
实施例3
如图9-11为poly（A）加尾，反转录和聚合酶链式反应（Polymerase ChainReaction, PCR）过程，用于说明本发明构建的cr:mi:crRNA载体可以产生彼此分离的crRNA和miRNA。
使用Lipfectamine 2000试剂转染cr:mi:crRNA载体3μg至小鼠C2C12细胞，6 h后换液，48 h后使用FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit（Vazyme, 中国）试剂盒进行细胞总RNA的提取，再通过E.coli Poly(A) Polymerase（Vazyme, 中国）试剂盒对总RNA进行poly（A）加尾。
使用HiScript II Q RT SuperMix（Vazyme, 中国）反转录试剂盒对已加poly（A）尾巴的RNA进行反转录得到互补脱氧核糖核酸（Complementary DNA, cDNA），对cDNA进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示条带大小符合实验预期（图10）。最后通过胶回收对PCR产物进行测序验证，结果显示，本发明构建的cr:mi:crRNA载体可以产生彼此分离的crRNA和miRNA（图11）。
实施例4
如图12-15、图16-19和图20-23为实时荧光定量（Real Time Quantitative, RT-qPCR）和蛋白免疫印迹（Western Blot）检测过程，用于说明与经典CRISPR/Cas13a和miRNA相比，本发明构建的Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具可以显著提高对MSTN、METTL3和LATS2基因的干扰效率。
使用RNAiso Plus试剂盒（TaKaRa, 大连）提取牛SCs和小鼠C2C12总 RNA，采用cDNA逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，利用Real-time PCR检测系统（ABI, 美国）进行qPCR。利用Primer Premier 5.0设计引物，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH ）为内参基因。RT-qPCR反应体系：cDNA 1μL，引物（10 μmol/L）各0.5μL, TB Green Supermix （Takara, 大连）10μL，补充ddH2O至20μL。反应程序为95℃变性30 s、95℃ 退火15 s、60℃ 延伸30 s，循环40次。采用2-ΔΔCt方法分析目的基因相对表达量。
结果显示，当靶向MSTN mRNA时，与经典CRISPR/Cas13a和miRNA介导的MSTN mRNA最高干扰效率分别为54%和33%相比，在牛Cas13a-SCs，Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具和突变miRNA的Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具介导的干扰效率分别提高到90％和85.5％。在小鼠Cas13a-C2C12中，Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具和突变miRNA的Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具介导的干扰效率分别提高到97％和90％（图12-13）。当靶向METTL3 mRNA时，与经典CRISPR/Cas13a和miRNA介导的METTL3 mRNA最高干扰效率分别为46%和33%相比，在牛Cas13a-SCs，Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具和突变miRNA的Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具介导的干扰效率分别提高到88％和84％。在小鼠Cas13a-C2C12中，Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具和突变miRNA的Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具介导的干扰效率分别提高到92％和87％（图16-17）。当靶向LATS2 mRNA时，与经典CRISPR/Cas13a和miRNA介导的LATS2 mRNA最高干扰效率分别为52%和31%相比，在牛Cas13a-SCs，Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具和突变miRNA的Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具介导的干扰效率分别提高到90％和83％。在小鼠Cas13a-C2C12中，Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具和突变miRNA的Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具介导的干扰效率分别提高到95％和89.5％（图20-21）。
将蛋白裂解液RIPA加入到含有待测细胞的离心管中（Beyotime, 上海），蛋白裂解液中含有蛋白酶抑制剂（Sigma, 美国），冰上孵育 30 min。13000 g、5 min离心取上清液。BCA试剂盒（Thermo, 美国）检测蛋白浓度。样品中加入蛋白上样缓冲液（Biosharp, 上海）煮沸10 min，-80 ℃保存。样本使用 10% SDS-PAGE 电泳进行分离，然后转印至NC 膜（Solarbio, 北京），200 mA 转膜 1 h。使用 5%脱脂牛奶封闭 1 h，后分别用 MSTN 抗体、METTL3抗体和LATS2抗体（Abcam, 美国）孵育过夜。二抗孵育 1 h （Proteintech, 武汉），显影后拍照成像。与RT-qPCR结果一致，即本发明构建的Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具能显著降低MSTN、METTL3和LATS2蛋白的表达（图14-15、图18-19、图22-23）。
实施例5
如图7和图8为细胞活力和增殖能力的检测过程，用于说明本发明构建的Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具对牛Cas13a-SCs和小鼠Cas13a-C2C12细胞的活力和增值能力没有影响。
将cr:mi:crRNA载体转染至牛Cas13a-SCs和小鼠Cas13a-C2C12中，48 h后，使用MTT细胞毒性检测试剂盒（Solarbio, 北京）和细胞增殖检测试剂盒（Solarbio, 北京）检测Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具对细胞活力和增殖能力的影响，结果显示，本发明构建的Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具对细胞活力（图24）和增值能力（图25-26）没有影响。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种新型Cas13a/cr:mi:crRNA基因敲减工具，其特征在于：所述工具包含crRNAa、初体miRNA和crRNAb的结构；所述crRNAa和crRNAb位于初体miRNA两翼。
2.根据权利要求1所述的工具，其特征在于，所述工具为一段核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的工具，其特征在于，所述工具为载体。
4.根据权利要求1所述的工具，其特征在于，所述工具还包含1个U6启动子。
5.一种构建权利要求1所述的工具构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）根据目的mRNA的同源序列，设计crRNA序列，得到靶向目的mRNA的crRNAa和crRNAb序列；
（2）以pri-miRNA为基本骨架，设计靶向目的mRNA的pri-miRNA模拟物；
（3）将crRNAa和crRNAb序列分别连接到pri-miRNA模拟物的左右两翼，得到cr:mi:crRNA序列；
（4）采用BbsI限制性内切酶对LwaCas13a crRNA backbone载体进行单酶切，得到线性LwaCas13a crRNA backbone；
（5）将cr:mi:crRNA序列连接到线性LwaCas13a crRNA backbone上得到cr:mi:crRNA载体。
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