CN114807126A - 一种沉默长非编码rna表达的方法及其应用 - Google Patents
一种沉默长非编码rna表达的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种沉默长非编码RNA表达的方法及其应用。本发明提供了用于在真核细胞基因组中沉默长非编码RNA表达的成对sgRNA，其一靶向所述长链非编码RNA任一内含子的BPS位点上游的序列，另一靶向所述长链非编码RNA同一内含子的3’SS位点下游的序列。本发明克服了现有技术不得不采用的切除启动子区域或插入polyA序列或切除全长基因以沉默长非编码RNA表达带来的技术难度和对附近基因的干扰。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种沉默长非编码RNA表达的方法及其应用。
背景技术
长非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200nt的RNA，由于缺乏开放阅读框，因此绝大多数的此类RNA不进行翻译。之前对于此类RNA认识不足时，认为其是细胞内的“暗物质”，但随着对RNA功能研究，越来越多的证据表明此类RNA也发挥着特殊的生物学功能。调节基因表达是一种重用的研究基因功能的技术方法。相比siRNA和ASO，CRISPR方法是一种较为成熟且有效的调控基因的技术方法，特别是定位在核内的lncRNA。然而，由于基因间的位置的复杂性，因此极大的限制了CRISPR方法的应用。这些不可使用CRISPR方法编辑的lncRNA大多存在共用启动子现象或外显子存在重叠，例如天然反义转录物NAT等。
与编码基因不同，单一SgRNA造成的移码突变难以沉默lncRNA的表达。目前常用的CRISPR调控基因表达的策略主要有敲除lncRNA的启动子和部分外显子或敲除整个lncRNA基因组。以上方法存在较大的缺陷，一是操作难度大，二是启动子区域存在较多的转录调控原件，敲除该区域可能影响到邻近基因的表达，特别是NAT。其次，真核基因存在较多的内含子，全基因的敲除可能会影响基因附近基因的表达。因此，本领域存在寻找沉默lncRNA表达的新型策略和高效筛选方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于沉默长非编码RNA表达的特殊方法，称为前体RNA剪接干扰法(IE法)。
第一方面，本发明要求保护一种用于在真核细胞基因组中沉默长非编码RNA表达的成对sgRNA。
本发明要求保护的用于在真核细胞基因组中沉默长非编码RNA表达的成对sgRNA，分别记作sgRNA-1和sgRNA-2；所述sgRNA-1靶向靶序列1，所述靶序列1为表达所述长链非编码RNA的基因组序列中任一内含子的BPS位点(即branch point site，分支点序列)上游的序列；所述sgRNA-2靶向靶序列2，所述靶序列2为表达所述长链非编码RNA的基因组序列中同一内含子的3’SS位点下游的序列。
进一步地，所述靶序列1可为表达所述长链非编码RNA的基因组序列中任一内含子的BPS位点上游500-50bp的序列；所述靶序列2可为表达所述长链非编码RNA的基因组序列中同一内含子的3’SS位点下游75-500bp的序列。
第二方面，本发明要求保护如下任一生物材料：
P1、能够转录得到前文第一方面所述成对sgRNA的DNA分子。
所述DNA分子可为两段DNA分子，一段转录所述sgRNA-1，另一段转录所述sgRNA-2。所述DNA分子也可为一段DNA分子，该段DNA分子既能够转录得到所述sgRNA-1，也能够转录得到所述sgRNA-2。
P2、含有P1中所述DNA分子的表达构建体(病毒载体或质粒)。
所述表达载体可为两个表达载体，一个用于表达所述sgRNA-1，另一个用于表达所述sgRNA-2。所述表达载体也可以为一个表达载体，该表达载体能够同时表达所述sgRNA-1和所述sgRNA-2。
P3、含有P2中所述表达构建体的重组菌。
如大肠杆菌，用于保存或扩繁所述表达构建体(质粒)。
P4、含有P2中所述表达构建体的重组细胞或重组细胞群。
所述重组细胞可为向宿主细胞中导入所述表达构建体(病毒载体或质粒)后所得。所述重组细胞也可为向宿主细胞中导入后文第三方面中所述成套产品后所得。所述重组细胞中还可包括整合入基因组的报告基因构建体。
具体可通过递送系统实现向所述宿主细胞的引入，所述递送系统包括慢病毒颗粒、脂质体、电穿孔、显微注射、偶联、纳米颗粒、外来体、微泡或基因枪等。
所述宿主细胞为真核细胞。所述重组细胞群包括基因组中待沉默的所述长非编码RNA的所述内含子中所述靶序列1和所述靶序列2之间的部分缺失或有其他序列插入的纯合子和/或杂合子。
第三方面，本发明要求保护用于在真核细胞基因组中沉默长非编码RNA表达的成套产品。
本发明要求保护的用于在真核细胞基因组中沉默长非编码RNA表达的成套产品，可为如下任一：
Q1、由i)特定核酸酶或表达构建体1，和ii)前文第一方面中所述sgRNA-1或表达构建体2，和iii)前文第一方面中所述sgRNA-2或表达构建体3组成。
Q2、由i)特定核酸酶或表达构建体1，和ii)表达构建体4组成。
Q3、由i)表达构建体5，和ii)所述sgRNA-2或表达构建体3组成。
Q4、由i)表达构建体6，和ii)所述sgRNA-1或表达构建体2组成。
Q5、表达构建体7。
所述表达构建体1为能够表达所述特定核酸酶的表达构建体。
所述表达构建体2为能够同时表达所述sgRNA-1的表达构建体。
所述表达构建体3为能够表达所述sgRNA-2的表达构建体。
所述表达构建体4为能够表达所述sgRNA-1和所述sgRNA-2的表达构建体。
所述表达构建体5为能够同时表达所述特定核酸酶和所述sgRNA-1的表达构建体。
所述表达构建体6为能够同时表达所述特定核酸酶和所述sgRNA-2的表达构建体。
所述表达构建体7为能够同时表达所述特定核酸酶和所述sgRNA-1和所述sgRNA-2的表达构建体。
所述表达构建体可为病毒载体或质粒。
所述特定核酸酶为能够识别并切割所述sgRNA-1和所述sgRNA-2的靶序列的任意核酸酶，如CRISPR核酸酶，具体如Cas9核酸酶。
第四方面，本发明要求保护前文第一方面所述的成对sgRNA或前文第二方面所述的生物材料或前文第三方面所述的成套产品的用途。
本发明所要求保护的用途具体为前文第一方面所述的成对sgRNA或前文第二方面所述的生物材料或前文第三方面所述的成套产品用于在真核细胞基因组中沉默长非编码RNA的表达。
第五方面，本发明要求保护一种在真核细胞基因组中沉默长非编码RNA表达的方法。
本发明要求保护的在真核细胞基因组中沉默长非编码RNA表达的方法，是通过将真核靶细胞基因组中表达目的长非编码RNA的序列中任一内含子的BPS位点和3’SS位点以及这两个位点之间的部分敲除或替换为其他序列，从而实现所述目的长非编码RNA的表达沉默。
进一步地，所述方法可包括如下步骤：向所述真核靶细胞中导入前文第三方面所述的成套产品。
在所述真核靶细胞中同时表达所述sgRNA-1和所述sgRNA-2，并在所述特定核酸酶(如Cas9核酸酶)存在下，在表达所述目的长非编码RNA的序列中的所述内含子的BPS位点和3’SS位点(包含这两个位点)之间的片段发生缺失或被替换为其他序列，得到具有该表型的纯合子或杂合子。
第六方面，将前文第一至第五方面中的长非编码RNA替换为蛋白编码基因后得到的各技术方案也属于本发明的保护范围。具体如下：
M1、用于在真核细胞基因组中沉默蛋白编码基因表达的成对sgRNA，分别记作sgRNA-1和sgRNA-2；所述sgRNA-1靶向靶序列1，所述靶序列1为表达所述蛋白编码基因中任一内含子的BPS位点上游的序列；所述sgRNA-2靶向靶序列2，所述靶序列2为表达所述蛋白编码基因中同一内含子的3’SS位点下游的序列。
进一步地，所述靶序列1为表达所述蛋白编码基因中任一内含子的BPS位点上游500-50bp的序列；所述靶序列2为表达所述蛋白编码基因中同一内含子的3’SS位点下游75-500bp的序列。
M2、能够转录得到M1中所述成对sgRNA的DNA分子。
所述DNA分子可为两段DNA分子，一段转录所述sgRNA-1，另一段转录所述sgRNA-2。所述DNA分子也可为一段DNA分子，该段DNA分子能够同时转录得到所述sgRNA-1和所述sgRNA-2。
M3、含有M2中所述DNA分子的表达构建体(病毒载体或质粒)。
所述表达载体可为两个表达载体，一个用于表达所述sgRNA-1，另一个用于表达所述sgRNA-2。所述表达载体也可以为一个表达载体，该表达载体能够同时表达所述sgRNA-1和所述sgRNA-2。
M4、含有M3中所述表达构建体的重组菌。
如大肠杆菌，用于保存或扩繁所述表达构建体(质粒)。
M5、含有M3中所述表达构建体的重组细胞或重组细胞群；
所述重组细胞可为向宿主细胞中导入所述表达构建体(病毒载体或质粒)后所得。所述重组细胞也可为向宿主细胞中导入后文M6中所述成套产品后所得。所述重组细胞中还可包括整合入基因组的报告基因构建体。
具体可通过递送系统实现向所述宿主细胞的引入，所述递送系统包括慢病毒颗粒、脂质体、电穿孔、显微注射、偶联、纳米颗粒、外来体、微泡或基因枪等。
所述宿主细胞为真核细胞。所述重组细胞群包括基因组中待沉默的蛋白编码基因的所述内含子中所述靶序列1和所述靶序列2之间的部分缺失或有其他序列插入的纯合子和/或杂合子。
M6、用于在真核细胞基因组中沉默蛋白编码基因的成套产品，为如下任一：
m1、由i)特定核酸酶或表达构建体1，和ii)M1中所述sgRNA-1或表达构建体2，和iii)M1中所述sgRNA-2或表达构建体3组成。
m2、由i)特定核酸酶或表达构建体1，和ii)表达构建体4组成。
m3、由i)表达构建体5，和ii)所述sgRNA-2或表达构建体3组成。
m4、由i)表达构建体6，和ii)所述sgRNA-1或表达构建体2组成。
m5、表达构建体7。
所述表达构建体1为能够表达所述特定核酸酶的表达构建体。
所述表达构建体2为能够同时表达所述sgRNA-1的表达构建体。
所述表达构建体3为能够表达所述sgRNA-2的表达构建体。
所述表达构建体4为能够表达所述sgRNA-1和所述sgRNA-2的表达构建体。
所述表达构建体5为能够同时表达所述特定核酸酶和所述sgRNA-1的表达构建体。
所述表达构建体6为能够同时表达所述特定核酸酶和所述sgRNA-2的表达构建体；
所述表达构建体7为能够同时表达所述特定核酸酶和所述sgRNA-1和所述sgRNA-2的表达构建体。
所述表达构建体可为病毒载体或质粒。
所述特定核酸酶为能够识别并切割所述sgRNA-1和所述sgRNA-2的靶序列的任意核酸酶，如CRISPR核酸酶，具体如Cas9核酸酶。
M7、M1所述的成对sgRNA或M2所述DNA分子或M3所述表达构建体或M4所述重组菌或M5所述重组细胞或M6所述的成套产品的用途，为用于在真核细胞基因组中沉默蛋白编码基因的表达。
M8、一种在真核细胞基因组中沉默蛋白编码基因的方法，是通过将真核靶细胞基因组中表达目的蛋白编码基因序列中任一内含子的BPS位点和3’SS位点以及这两个位点之间的部分敲除或替换为其他序列，从而实现所述目的蛋白编码基因的表达沉默。
进一步地，所述方法可包括如下步骤：向所述真核靶细胞中导入M6所述的成套产品。
在所述真核靶细胞中同时表达所述sgRNA-1和所述sgRNA-2，并在所述特定核酸酶(如Cas9核酸酶)存在下，在表达所述目的蛋白编码基因序列中的所述内含子的BPS位点和3’SS位点(包含这两个位点)之间的片段发生缺失或被替换为其他序列，得到具有该表型的纯合子或杂合子。
在上述各方面中，所述真核细胞具体可为人或其他哺乳动物。
在上述各方面中，所述长非编码RNA为在所述真核细胞基因组中具有内含子且具有polyA尾巴的长非编码RNA；所述蛋白编码基因为在所述真核细胞基因组中具有内含子且具有polyA尾巴的蛋白编码基因。
在本发明的具体实施方式中，所述长非编码RNA具体以DHRS4-AS1、NPSR1-AS1、LOC646762或EMX2OS为代表。所述蛋白编码基因具体以B2M为代表。
在本发明的具体实施方式中，所述真核细胞具体为以HPDE6-C7细胞、293Cells，low passage细胞或Hela细胞为代表。
当所述长非编码RNA为DHRS4-AS1时(HPDE6-C7细胞)，所述sgRNA-1的间隔RNA(spacer RNA，用于识别靶标序列)的编码序列为SEQ ID No.13，所述sgRNA-2的间隔RNA(spacer RNA，用于识别靶标序列)的编码序列为SEQ ID No.14或SEQ ID No.15。
当所述长非编码RNA为NPSR1-AS1时(293Cells，low passage细胞)，所述sgRNA-1的间隔RNA(spacer RNA，用于识别靶标序列)的编码序列为SEQ ID No.5，所述sgRNA-2的间隔RNA(spacer RNA，用于识别靶标序列)的编码序列为SEQ ID No.6。
当所述长非编码RNA为LOC646762时(293Cells，low passage细胞)，所述sgRNA-1的间隔RNA(spacer RNA，用于识别靶标序列)的编码序列为SEQ ID No.3，所述sgRNA-2的间隔RNA(spacer RNA，用于识别靶标序列)的编码序列为SEQ ID No.4。
当所述长非编码RNA为EMX2OS时(293Cells，low passage细胞)，所述sgRNA-1的间隔RNA(spacer RNA，用于识别靶标序列)的编码序列为SEQ ID No.1，所述sgRNA-2的间隔RNA(spacer RNA，用于识别靶标序列)的编码序列为SEQ ID No.2。
当所述蛋白编码基因为B2M时(Hela细胞)，所述sgRNA-1的间隔RNA(spacer RNA，用于识别靶标序列)的编码序列为SEQ ID No.9，所述sgRNA-2的间隔RNA(spacer RNA，用于识别靶标序列)的编码序列为SEQ ID No.10；或者，所述sgRNA-1的间隔RNA(spacer RNA，用于识别靶标序列)的编码序列为SEQ ID No.11，所述sgRNA-2的间隔RNA(spacer RNA，用于识别靶标序列)的编码序列为SEQ ID No.12。
本发明提供的用于沉默长非编码RNA表达的特殊方法，即前体RNA剪接干扰法(IE法)，靶向lncRNABPS至3’SS的区域被切割并通过宿主细胞中的非同源末端连接(NHEJ)机制修复，导致两个切割位点间BPS-3’SS片段的缺失或其它序列的插入，从而干扰了相关基因的前体RNA剪接，并造成有剪接障碍的前体RNA的降解，同时又能减少或避免对对侧或邻近基因的干扰。本发明提供的用于沉默长非编码RNA表达的特殊方法，即前体RNA剪接干扰法(IE法)可克服现有技术不得不采用的切除启动子区域切除全长基因以沉默长非编码RNA表达带来的技术难度和对附近基因的干扰。同时本发明方法也可用于蛋白编码基因的沉默。
附图说明
图1为PCR方法鉴定IE法和Promoter-Exon(PE)法是否成功敲除了HPDE6-C7细胞中DHRS4-AS1基因的BPS-3’SS片段，及其对该基因和对侧基因表达的影响。
图2为PCR方法鉴定IE法是否成功敲除了293Cells，low passage细胞中NPSR1-AS1、LOC646762和EMX2OS基因的BPS-3’SS片段，及其对该基因和对侧基因表达的影响。
图3为PCR和Western blotting方法鉴定IE法是否成功敲除了Hela细胞中蛋白编码基因B2M的BPS-3’SS片段，及其对该基因各外显子表达和蛋白表达的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、在真核细胞基因组中沉默长非编码RNA和蛋白编码基因的新策略
本发明提供了一种用于沉默长非编码RNA表达的特殊方法，称之为前体RNA剪接干扰法(IE法)。该方法靶向lncRNA BPS至3’SS的区域(基于CRISPR/Cas9技术，设计成对的sgRNA)被切割并通过宿主细胞中的非同源末端连接(NHEJ)机制修复，导致两个切割位点间BPS-3’SS片段的缺失或其它序列的插入，从而干扰了相关基因的前体RNA剪接，并造成有剪接障碍的前体RNA的降解，同时又能减少或避免对对侧或邻近基因的干扰。同时该方法也适用于蛋白编码基因的沉默。
供试的真核细胞：HPDE6-C7细胞、293Cells，low passage细胞和Hela细胞。
目的长非编码RNA：DHRS4-AS1、NPSR1-AS1、LOC646762和EMX2OS。
目的蛋白编码基因：B2M。
上述目的长非编码RNA和目的蛋白编码基因在真核细胞基因组中均具有内含子且具有polyA尾巴。
一、sgRNA设计与质粒构建
本发明使用CRISPR在线设计工具(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)，选择脱靶少的sgRNA。NC以GFP序列为模板设计。sgRNA具体如表1所示。
表1、本发明所设计的sgRNA
注：表中的SgRNA-1靶向表达相应长链非编码RNA或蛋白编码基因的基因组序列中任一内含子的BPS位点上游500-50bp的序列；SgRNA-2靶向表达相应长链非编码RNA或蛋白编码基因的基因组序列中同一内含子的3’SS位点下游75-500bp的序列。
所述寡核苷酸序列合成和CRISPR/Cas9 sgRNA构建体的合成均委托海吉玛(GenePharma)制药技术有限公司合成。质粒pU6gRNACas9puro(GenePharma,C051005；在“PZhang et al.w09,a novel autophagy enhancer,induces autophagy-dependent cellapoptosis via activation of the EGFR-mediated RAS-RAF1-MAP2K-MAPK1/3pathway.Autophagy.2017Jul 3；13(7):1093-1112.”一文也有记载)使用BbsⅠ酶切开并连接上述SgRNA的space对应的DNA寡核苷酸序列(一个sgRNA制备一个构建体)，每个构建体(经测序验证正确)可以同时表达一个特定的SgRNA和Cas9核酸酶，并具备puromycin的筛选能力。
二、构建稳定细胞株
1、基于5％CO2，37℃恒温条件下，分别用含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养基培养293Cells，low passage(来自上海细胞库)和Hela(来自美国ATCC细胞库)，用含有10％胎牛血清的1640培养基培养HPDE6-C7(来自华拓生物科技有限公司)。取对数生长期的细胞以3×105/孔接种到6孔板培养。待细胞融合度达到90％时待用。
2、含有所述寡核苷酸序列的CRISPR/Cas9 SgRNA构建体(步骤一制备)用无菌ddH2O溶解，配成终浓度500ng/μl的溶液。转染时，将各1μl质粒溶液和2μl p3000溶液(Invitrogen)和2μl lipofectamine 3000(Invitrogen)分别稀释于125μl无血清培养液(Opti-MEM)(来自GIBCO)中，并在室温下孵育5分钟，然后将上述质粒溶液与lipofectamine3000溶液混合，复合物于室温静置20分钟后，将250μl的混合溶液加到6孔板中的2ml培养液中。在5％CO2，37℃恒温条件下培养6小时后换成新的培养基。24小时后，加入终浓度1μg/mlpuromycin，继续培养48-72小时后更换成新的培养基。
3、当细胞融合度达到90％时，用含EDTA的0.25％胰酶(Gibco)消化，取一半细胞用试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取细胞基因组。
4、PCR鉴定基因组
PCR反应体系如下：
PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1.5min，38个循环后72℃延伸10min，最后4℃维持。
引物序列如表2所示。
表2、本发明所涉及的基因组鉴定PCR引物
| 基因名称 | 引物序列(5’-3’) |
| EMX2OS-gDF | GGGGTGCAGAGGGAATGTAAG |
| EMX2OS-gDR | CTTCTGGAACCCAAAGGGCA |
| LOC646762-gDF | CCAGTCTGACTTAGGGCCAG |
| LOC646762-gDR | AAAAGCGTGGCAAGAATCGC |
| NPSR1-AS1-gDF | AACCTGGTTGTTCCCTGTCC |
| NPSR1-AS1-gDR | AGCCTGGAAGCAGGTTTCAT |
| hB2M-In1EX2-gDF | CTTGTTGGGAAGGTGGAAGC |
| hB2M-In1EX2-gDR | TCACATGGTTCACACGGCAG |
| hB2M-In3Ex4-gDF | TAGAGGTTCCCAGGCCACTA |
| hB2M-In3Ex4-gDR | GCTCCCCACCTCTAAGTTGC |
| DHRS4-AS1-E3-gD-F | AGGAGTGGGGCAACAACTCT |
| DHRS4-AS1-E3-gD-R | ACCAGCAAATTCCTAGCCCT |
| DHRS4-AS1-Prom-gDF | GAAGCCGATCCTGTGAGCAG |
| DHRS4-AS1-Prom-gDR | TTGGAATTCGGTGCGGATGG |
产物经琼脂糖凝胶电泳检测，当显示双带(野生型和KO型)时，即细胞群含有KO型细胞。
5、KO单克隆细胞筛选
用胰酶消化，细胞计数约100个细胞加入到含有15ml培养基的10cm培养皿中，在5％CO2，37℃恒温条件下培养10-14天。当在显微镜下可以明显观察到单克隆后用胰酶消化，将单克隆转移到96孔板中继续培养。扩大培养单克隆后，提取细胞基因组并进行PCR检测(具体操作见步骤3和4)，选择具有单一条带的KO细胞系，双带或多带可作为备用。
三、RT-qPCR方法检测单克隆细胞系
1、提取细胞RNA
当单克隆细胞系达到90％聚合度时，胰酶消化细胞取约一半细胞用于提取RNA。10000rpm离心1min后，去除上清，加入1ml Trizol(艾科瑞生物)；加入200μl氯仿后剧烈振动30s，静置10min。4℃13000rpm离心10min，转移上清340μl到一新的EP管，并加入等体积的异丙醇后上下颠倒7次后，冰上静置10min。4℃13000rpm离心10min，去上清。加入1ml 75％无水乙醇(DEPC水配制)，再次4℃13000rpm离心10min，去上清，再次瞬离。吸去液体，在室温下晾干15min。加入DEPC水，测浓度。
2、RNA反转录
反转录依照东洋纺FSQ-301说明书操作，将含500ng总RNA的6μl溶液在65℃下变性5min，立即放在冰上降温2min。加入2μl 4×DN Master Mix涡旋混匀后离心，在37℃下维持5min去除基因组DNA。加入2μl 5×RT Master Mix II后涡旋后离心，37℃15min，50℃5min，98℃5min，4℃维持。用40μl ddH2O稀释10μl cDNA，待用。
3、RT-qPCR
反应体系如下：
RT-PCR扩增程序：95℃预变性1min；95℃变性15s，60℃退火45s，40个循环。RT-PCR引物序列如表3所示。
表3、本发明所涉及的RT-qPCR引物序列
4、RT-PCR
PCR反应体系如下：
PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min10s，39个循环后72℃延伸10min，最后4℃维持。
引物序列如表4所示。
表4、本发明所涉及的基因组鉴定PCR引物
| 基因名称 | 引物序列(5’-3’) |
| DHRS4-AS1-Exon3-test1F | GGATGGTCTCCCAGAGGGTC |
| DHRS4-AS1-Exon3-test1R | TTGTCCTTTGGTGAGGCTTGT |
| DHRS4-AS1-Exon3-test2F | ACCAGACTAGCCTCACTGGA |
| DHRS4-AS1-Exon3-test2R | AGGTAAGGGCAATCCTTGTTT |
| DHRS4-AS1-Exon23-test3F | AGGGCCACCTTATTTGCGAG |
| DHRS4-AS1-Exon23-test3R | TGCATTGTCCCTAAGAACTCAGA |
产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。
5、Western Blotting
(1)4×105个野生型或KO型Hela细胞铺在6孔板中，待聚合度达到90％时取出用1ml PBS清洗，加入含有蛋白酶抑制剂(MCE,HY-K0011)的蛋白裂解缓冲液(50mM Tris-HCL,pH 8.0,4M urea and 1％Triton X-100)裂解细胞并刮下，转移到一1.5ml离心管中，12000rpm在4℃离心10min，用10μl枪头去除基因组，用考马斯亮蓝G250测蛋白浓度(碧云天，P0006C)，以4：1加入5×的蛋白上样缓冲液，100℃，10min处理蛋白样品。
(2)分别配制12％的SDS聚丙烯酰胺胶浓缩胶和4％分离胶SDS聚丙烯酰胺胶，20μg蛋白上样，蛋白marker(Thermo，26616)，80V运行30min后转成120V，随后在冰上用280mA运行2.5h将蛋白转至硝酸纤维素膜(PALL,66485)。
(3)在慢速摇床上，用含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液，室温条件封闭2h。
(4)用含3％BSA的TBST缓冲液配制一抗B2M(CST，#12851,1:1000)和GAPDH(Proteintech,10494-1-AP,1:1000)，在慢速摇床上孵育1.5h，随后用TBST在快速摇床上洗3次。
(5)用含3％BSA的TBST缓冲液配制抗兔IgG二抗(KPL,074-1506,1:5000)和抗小鼠IgG二抗(KPL,074-1806,1:5000)，在慢速摇床上孵育45min，随后用TBST在快速摇床上洗3次。
(6)用化学发光液(Thermo,32106)浸泡2min后暗室下曝光。
四、结果与分析
1、采用本发明IE法和现有PE法沉默HPDE6-C7细胞中DHRS4-AS1
本发明IE法：将表达表1中DHRS4-AS1-In2-SgRNA-1(SEQ ID No.13)和DHRS4-AS1-Ex3-SgRNA-2-1(SEQ ID No.14)的两个sgRNA和Cas9的两个质粒导入HPDE6-C7细胞(对应图1中的KO-IE01#)；或者，将表达表1中DHRS4-AS1-In2-SgRNA-1(SEQ ID No.13)和DHRS4-AS1-Ex3-SgRNA-2-2(SEQ ID No.15)的两个sgRNA和Cas9的两个质粒导入HPDE6-C7细胞(对应图1中的KO-IE02#)。
现有PE法：将表达表1中DHRS4-AS1-Prom-SgRNA-1(SEQ ID No.16)和DHRS4-AS1-Ex1-SgRNA-2(SEQ ID No.17)的两个sgRNA和Cas9的两个质粒导入HPDE6-C7细胞(对应图1中的KO-PE)。
图1为PCR方法鉴定IE法和PE法是否成功敲除了HPDE6-C7细胞中DHRS4-AS1基因的BPS-3’SS片段，及其对该基因和对侧基因表达的影响。其中，A是DHRS4-AS1基因及对侧基因的结构示意图，垂直箭头为BPS-3’SS敲除区域，水平箭头为基因组引物PCR区域。B显示PCR法鉴定基因组，与对照组(KO-NC)比较，HPDE6-C7基因的启动子至外显子片段和BPS-3’SS片段分别被成功敲除，IE使用DHRS4-AS1-E3-gD-F和DHRS4-AS1-E3-gD-R引物检测，PE使用DHRS4-AS1-Prom-gDF和DHRS4-AS1-Prom-gDR引物检测(引物序列见表2)。C显示RT-qPCR法鉴定RNA表达量，前体RNA剪接干扰法使长非编码核酸DHRS4-AS1基因的表达明显受到抑制，而对侧基因DHRS4的表达不受干扰。虽然启动子片段敲除法也能沉默长非编码核酸DHRS4-AS1基因的表达，但对侧基因DHRS4的表达受到严重干扰，DHRS4-AS1使用DHRS4-AS1-qF和DHRS4-AS1-qR、Bact-qF和Bact-qR检测(Bact为内参)，DHRS4使用DHRS4-qF和DHRS4-qR、Bact-qF和Bact-qR检测(Bact为内参)(引物序列见表3)。D显示RT-PCR法鉴定长非编码RNA的各个外显子，结果显示IE法成功造成了DHRS4-AS1前体RNA的不同区域降解，分别使用DHRS4-AS1-Exon23-test3F和DHRS4-AS1-Exon23-test3R、DHRS4-AS1-Exon3-test1F和DHRS4-AS1-Exon3-test1R、DHRS4-AS1-Exon3-test2F和DHRS4-AS1-Exon3-test2R、Bact-qF和Bact-qR引物(Bact为内参)(引物序列见表4和表3)。E显示，IE法成功敲除的两个细胞株的测序结果比对。
2、采用本发明IE法沉默293Cells，low passage细胞中NPSR1-AS1、LOC646762和EMX2OS基因
将表达表1中NPSR1-AS1-SgRNA-1(SEQ ID No.5)和NPSR1-AS1-SgRNA-2(SEQ IDNo.6)的两个sgRNA和Cas9的两个质粒导入293Cells，lowpassage细胞，以沉默NPSR1-AS1。
将表达表1中LOC646762-SgRNA-1(SEQ ID No.3)和LOC646762-SgRNA-2(SEQ IDNo.4)的两个sgRNA和Cas9的两个质粒导入293Cells，low passage细胞，以沉默LOC646762。
将表达表1中EMX2OS-SgRNA-1(SEQ ID No.1)和EMX2OS-SgRNA-2(SEQ ID No.2)的两个sgRNA和Cas9的两个质粒导入293Cells，low passage细胞，以沉默EMX2OS。
图2为PCR方法鉴定IE法是否成功敲除了293Cells，low passage细胞中NPSR1-AS1、LOC646762和EMX2OS基因的BPS-3’SS片段，及其对该基因和对侧基因表达的影响。A，D和G是NPSR1-AS1、LOC646762和EMX2OS基因及其对侧基因NPSR1、DPY19L2P3和EMX2结构示意图，垂直箭头为BPS-3’SS敲除区域，水平箭头为基因组引物PCR区域。B，E和H显示PCR法鉴定基因组，与对照组(KO-NC)比较，NPSR1-AS1、LOC646762和EMX2OS基因的BPS-3’SS被成功敲除的两个单克隆(KO-EI1#和KO-IE2#)，分别使用NPSR1-AS1-gDF和NPSR1-AS1-gDR、LOC646762-gDF和LOC646762-gDR、EMX2OS-gDF和EMX2OS-gDR引物检测。C、F和I显示RT-qPCR法鉴定RNA表达量，前体RNA剪接干扰法使长非编码核酸NPSR1-AS1、LOC646762和EMX2OS基因的表达明显受到抑制，而对侧基因NPSR1、DPY19L2P3和EMX2的表达不受干扰，分别使用NPSR1-AS1-qF和NPSR1-AS1-qR、LOC646762-qF和LOC646762-qR、EMX2OS-qF和EMX2OS-qR、NPSR1-qF和NPSR1-qR、DPY19L2P3-qF和DPY19L2P3-qR、EMX2-qF和EMX2-qR、Bact-qF和Bact-qR引物检测(Bact为内参)(引物序列见表3)。
3、采用本发明IE法沉默Hela细胞中蛋白编码基因B2M
将表达表1中B2M-IN3-SgRNA-1(SEQ ID No.9)和B2M-EX4-SgRNA-2(SEQ IDNo.10)的两个sgRNA和Cas9的两个质粒导入Hela细胞(对应图3中的KO-IE34)，或者，将表达表1中B2M-IN1-SgRNA-1(SEQ ID No.11)和B2M-Ex2-SgRNA-2(SEQ ID No.12)的两个sgRNA和Cas9的两个质粒导入Hela细胞(对应图3中的KO-IE12)，以沉默B2M。
图3为PCR和Western blotting方法鉴定IE法是否成功敲除了Hela细胞中蛋白编码基因B2M的BPS-3’SS片段，及其对该基因各外显子表达和蛋白表达的影响。A是B2M基因的结构示意图，两组垂直箭头分别显示待敲除的不同内含子的2段BPS-3’SS片段，两个相对的水平箭头为基因组引物PCR区域，水平的左右箭头为不同外显子的qPCR引物。B显示PCR法鉴定基因组，与对照组(KO-NC)比较，B2M基因的2段BPS-3’SS片段都被成功敲除，分别使用hB2M-In1EX2-gDF和hB2M-In1EX2-gDR、hB2M-In3Ex4-gDF和hB2M-In3Ex4-gDR引物检测(引物序列见表2)。C显示RT-qPCR法鉴定B2M表达量，IE法使B2M基因的表达明显受到抑制，分别使用B2M-A-qF和B2M-A-qR、B2M-B-qF和B2M-B-qR、B2M-C-qF和B2M-C-qR、B2M-D-qF和B2M-D-qR、Bact-qF和Bact-qR引物检测(Bact为内参)(引物序列见表3)。D显示western blotting检测B2M蛋白表达，IE法可以明显敲除B2M蛋白，即使敲除区域不在蛋白编码区域。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 清华大学深圳国际研究生院
<120> 一种沉默长非编码RNA表达的方法及其应用
<130> GNCLN210366
<160> 17
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Claims (10)
1.用于在真核细胞基因组中沉默长非编码RNA表达的成对sgRNA，分别记作sgRNA-1和sgRNA-2；所述sgRNA-1靶向靶序列1，所述靶序列1为表达所述长链非编码RNA的基因组序列中任一内含子的BPS位点上游的序列；所述sgRNA-2靶向靶序列2，所述靶序列2为表达所述长链非编码RNA的基因组序列中同一内含子的3’SS位点下游的序列。
2.根据权利要求1所述的成对sgRNA，其特征在于：所述靶序列1为表达所述长链非编码RNA的基因组序列中任一内含子的BPS位点上游500-50bp的序列；所述靶序列2为表达所述长链非编码RNA的基因组序列中同一内含子的3’SS位点下游75-500bp的序列。
3.如下任一生物材料：
P1、能够转录得到权利要求1或2所述成对sgRNA的DNA分子；
P2、含有P1中所述DNA分子的表达构建体；
P3、含有P2中所述表达构建体的重组菌；
P4、含有P2中所述表达构建体的重组细胞。
4.用于在真核细胞基因组中沉默长非编码RNA表达的成套产品，为如下任一：
Q1、由i)特定核酸酶或表达构建体1，和ii)权利要求1或2中所述sgRNA-1或表达构建体2，和iii)权利要求1或2中所述sgRNA-2或表达构建体3组成；
Q2、由i)特定核酸酶或表达构建体1，和ii)表达构建体4组成；
Q3、由i)表达构建体5，和ii)所述sgRNA-2或表达构建体3组成；
Q4、由i)表达构建体6，和ii)所述sgRNA-1或表达构建体2组成；
Q5、表达构建体7；
所述表达构建体1为能够表达所述特定核酸酶的表达构建体；
所述表达构建体2为能够同时表达所述sgRNA-1的表达构建体；
所述表达构建体3为能够表达所述sgRNA-2的表达构建体；
所述表达构建体4为能够表达所述sgRNA-1和所述sgRNA-2的表达构建体；
所述表达构建体5为能够同时表达所述特定核酸酶和所述sgRNA-1的表达构建体；
所述表达构建体6为能够同时表达所述特定核酸酶和所述sgRNA-2的表达构建体；
所述表达构建体7为能够同时表达所述特定核酸酶和所述sgRNA-1和所述sgRNA-2的表达构建体；
所述特定核酸酶为能够识别并切割所述sgRNA-1和所述sgRNA-2的靶序列的任意核酸酶。
5.根据权利要求4所述的成套产品，其特征在于：所述特定核酸酶为CRISPR核酸酶；
进一步地，所述特定核酸酶为Cas9核酸酶。
6.权利要求1或2所述的成对sgRNA或权利要求3所述的生物材料或权利要求4或5所述的成套产品的用途，为用于在真核细胞基因组中沉默长非编码RNA的表达。
7.一种在真核细胞基因组中沉默长非编码RNA表达的方法，是通过将真核靶细胞基因组中表达目的长非编码RNA的序列中任一内含子的BPS位点和3’SS位点以及这两个位点之间的部分敲除或替换为其他序列，从而实现所述目的长非编码RNA的表达沉默。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：向所述真核靶细胞中导入权利要求4或5所述的成套产品。
9.如下任一：
M1、用于在真核细胞基因组中沉默蛋白编码基因表达的成对sgRNA，分别记作sgRNA-1和sgRNA-2；所述sgRNA-1靶向靶序列1，所述靶序列1为表达所述蛋白编码基因中任一内含子的BPS位点上游的序列；所述sgRNA-2靶向靶序列2，所述靶序列2为表达所述蛋白编码基因中同一内含子的3’SS位点下游的序列；
进一步地，所述靶序列1为表达所述蛋白编码基因中任一内含子的BPS位点上游500-50bp的序列；所述靶序列2为表达所述蛋白编码基因中同一内含子的3’SS位点下游75-500p的序列；
M2、能够转录得到M1中所述成对sgRNA的DNA分子；
M3、含有M2中所述DNA分子的表达构建体；
M4、含有M3中所述表达构建体的重组菌；
M5、含有M3中所述表达构建体的重组细胞；
M6、用于在真核细胞基因组中沉默蛋白编码基因的成套产品，为如下任一：
m1、由i)特定核酸酶或表达构建体1，和ii)M1中所述sgRNA-1或表达构建体2，和iii)M1中所述sgRNA-2或表达构建体3组成；
m2、由i)特定核酸酶或表达构建体1，和ii)表达构建体4组成；
m3、由i)表达构建体5，和ii)所述sgRNA-2或表达构建体3组成；
m4、由i)表达构建体6，和ii)所述sgRNA-1或表达构建体2组成；
m5、表达构建体7；
所述表达构建体1为能够表达所述特定核酸酶的表达构建体；
所述表达构建体2为能够同时表达所述sgRNA-1的表达构建体；
所述表达构建体3为能够表达所述sgRNA-2的表达构建体；
所述表达构建体4为能够表达所述sgRNA-1和所述sgRNA-2的表达构建体；
所述表达构建体5为能够同时表达所述特定核酸酶和所述sgRNA-1的表达构建体；
所述表达构建体6为能够同时表达所述特定核酸酶和所述sgRNA-2的表达构建体；
所述表达构建体7为能够同时表达所述特定核酸酶和所述sgRNA-1和所述sgRNA-2的表达构建体；
所述特定核酸酶为能够识别并切割所述sgRNA-1和所述sgRNA-2的靶序列的任意核酸酶；
进一步地，所述特定核酸酶为CRISPR核酸酶；
更进一步地，所述特定核酸酶为Cas9核酸酶；
M7、M1所述的成对sgRNA或M2所述DNA分子或M3所述表达构建体或M4所述重组菌或M5所述重组细胞或M6所述的成套产品的用途，为用于在真核细胞基因组中沉默蛋白编码基因的表达；
M8、一种在真核细胞基因组中沉默蛋白编码基因的方法，是通过将真核靶细胞基因组中表达目的蛋白编码基因序列中任一内含子的BPS位点和3’SS位点以及这两个位点之间的部分敲除或替换为其他序列，从而实现所述目的蛋白编码基因的表达沉默；
进一步地，所述方法包括如下步骤：向所述真核靶细胞中导入M6所述的成套产品。
10.根据权利要求1-9中任一所述的成对sgRNA或生物材料或成套产品或应用或方法，其特征在于：所述长非编码RNA在所述真核细胞基因组中具有内含子且具有polyA尾巴；所述蛋白编码基因在所述真核细胞基因组中具有内含子且具有polyA尾巴；和/或
所述真核细胞为人或其他哺乳动物。
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