CN118147161A - 一种基于CRISPR/Cas9的叶用芥菜BjRCO基因编辑材料 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物基因工程和生物技术领域，特别涉及一种基于CRISPR/Cas9的叶用芥菜BjRCO基因编辑材料。本发明发现突变多拷贝的BjRCO基因可改变叶用芥菜叶形；本发明设计了两个可以同时敲除叶用芥菜BjRCO基因5个拷贝(BjRCO1，BjRCO2，BjRCO3，BjRCO4，BjRCO5)的特异性靶点，通过基因编辑载体构建和农杆菌介导的遗传转化获得了叶片形状从多回羽状全裂叶变为非裂叶、叶裂指数明显降低的叶用芥菜BjRCO基因编辑材料。所述基因编辑材料可作为适应不同环境的芥菜材料，为叶用芥菜育种和研究叶形变异提供宝贵的基因资源和种质资源。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程和生物技术领域，特别涉及一种基于CRISPR/Cas9的叶用芥菜BjRCO基因编辑材料。
背景技术
芥菜(Brassica juncea)属于十字花科芸薹属。芥菜是由二倍体白菜(AA)和黑芥(BB)远缘杂交，并经自然加倍形成的异源四倍体植物(AABB)(Nagaharu U,NagaharuN.Genome analysis in Brassica with special reference to the experimentalformation of B.napus and peculiar mode of fertilization[J].Jpn J Bot,1935,7(7):389-452)。芥菜作为蔬菜、油料作物和调料作物，在世界各地广泛种植。其中，用于蔬菜的芥菜类型根据其食用器官的不同可分为根用芥菜、茎用芥菜，叶用芥菜和薹用芥菜等。裂叶芥菜雪里蕻XC不仅可用于新鲜食用和加工，也可以煮食，油炸，腌制或晒干，是一种特别受欢迎的叶类蔬菜。
叶片是植物进行光合作用、气体交换、营养分配和水分运输的主要场所。植物叶片发育起始于顶端分生组织侧边，在发育过程中逐渐形成不同形态和大小的叶片。叶片发育主要受植物激素、转录调控和植物组织力学性能等方面的影响(Fei D,Chunmei G,YulingJ.Molecular Mechanisms of Leaf Morphogenesis[J].Molecular Plant,2018,11(S167420521830193X-)。叶形是植物重要的农艺性状之一，叶形对作物冠层和植物株型的影响是影响农业生产效率的重要因素。不同的叶片形态会影响植物蒸腾速率、光合效率以及害虫偏好性等，进而影响到作物的产量和品质。芥菜类蔬菜叶形变异丰富，根据叶缘缺刻的有无和深浅，主要分为全缘，锯齿和裂叶(Wu C,Cheng H,Li S,et al.Molecularcloning and characterization of GhERF105,a gene contributing to theregulation of gland formation in upland cotton(Gossypiumhirsutum L.)[J].BMCPlant Biol,2021,21(1):1-14)。根据裂刻的程度，又可细分为浅裂、大头羽裂、羽状深裂、全裂、多回羽状深裂、碎裂等。研究表明，裂叶与杂种优势、光合利用率和抗逆性有关(ZhuQ-H,Zhang J,Liu D,et al.Integrated mapping and characterization of the geneunderlying the okra leaf trait in Gossypiumhirsutum L[J].Journal ofExperimental Botany,2016,67(3):763-774)。对芥菜裂叶的研究将有助于揭示叶片形态变化的分子机制。十字花科植物叶形变异丰富。在碎米荠、白菜、甘蓝、芥菜、油菜等植物中得到了广泛的研究。在碎米芥中，ChRCO-A通过抑制叶片边缘的生长而形成很多小叶(VladD,Kierzkowski D,Rast M I,et al.Leaf shape evolution through duplication,regulatory diversification,and loss of a homeobox gene[J].Science,2014,343(6172):780-3)。但是，拟南芥中RCO基因缺失导致拟南芥的叶形简单化(HajheidariM.Autoregulation of RCO by Low-Affinity Binding Modulates Cytokinin Actionand Shapes Leaf Diversity[J].Current Biology,2019,29(4183-4192.e6)。芥菜控制叶形变异的候选基因BjRCO最早被定位在A10染色体上，BjRCO基因可能与裂叶形成相关(HengS,Huang H,Cui M,et al.Rapid identification of the BjRCO gene associated withlobed leaves in Brassica juncea via bulked segregant RNA-seq[J].MolecularBreeding,2020,40(4):42)。但是，通过基因克隆、序列比对等发现该基因在双亲中的DNA序列没有差异。基因组比较分析发现，T84-66参考基因组在该区段未测通，存在gap。在芥菜中仍没有直接的证据证明BjRCO基因是否调控裂叶形成。因此，利用CRISPR/Cas9对叶用芥菜自交系雪里蕻XC的5个BjRCO基因进行定点编辑，可以明确BjRCO的功能。
芥菜作为异源四倍体，其基因组包含大量的同源基因和重复序列，同源拷贝较多。利用基因编辑可以同时修饰目标性状基因多个拷贝，是作物育种改良的有效途径。CRISPR/Cas9基因编辑技术是通过人工设计的sgRNA(guide RNA)来识别目的基因组序列，并引导Cas9蛋白酶进行有效切割DNA双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等，最终达到对基因组DNA进行修饰的目的。CRISPR/Cas9技术在动植物基因组功能研究及作物遗传育种研究具有广泛的应用价值(Xing H L,Dong L,Wang Z P,et al.ACRISPR/Cas9toolkit for multiplex genome editing in plants[J].BMC Plant Biol,2014,14(327；Liu Y,Wang Y,Xu S,et al.Efficient genetic transformation and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in Lemnaaequinoctialis[J].Plant BiotechnologyJournal,2019,17(11):2143-2152)。
发明内容
本发明提供一种基于CRISPR/Cas9的叶用芥菜BjRCO基因编辑材料，进而发现BjRCO基因调控芥菜裂叶形成，为叶用芥菜遗传育种和研究叶形变异提供宝贵的资源。
本发明主要采取如下的技术方案：
本发明第一方面，提供BjRCO基因在调控芥菜叶形中的应用，BjRCO基因的5个拷贝如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示，所述芥菜为叶用芥菜。具体的，可通过突变BjRCO基因实现芥菜从多回羽状全裂叶变为非裂叶、叶裂指数降低。其中突变BjRCO基因通过敲除BjRCO基因来实现。
敲除芥菜BjRCO基因采用CRISPR/Cas9方法，包括以下步骤：
(1)设计能同时敲除叶用芥菜BjRCO基因的5个拷贝(BjRCO1，BjRCO2，BjRCO3，BjRCO4，BjRCO5)的两个特异性靶点，并构建CRISPR/Cas9表达载体，然后转化农杆菌；
(2)通过农杆菌介导的遗传转化获得叶片形状从多回羽状全裂叶变为非裂叶，叶裂指数明显降低的叶用芥菜BjRCO基因编辑材料。
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除叶用芥菜BjRCO基因的5个拷贝(BjRCO1，BjRCO2，BjRCO3，BjRCO4，BjRCO5)的具体步骤如下：
步骤一，叶用芥菜BjRCO基因编辑载体pKSE-BjRCO的构建：
1)sgRNA靶位点的选择：
针对叶用芥菜自交系雪里蕻XC中BjRCO基因5个不同拷贝的基因序列与基因结构，利用基因编辑网站(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)设计两个sgRNA序列，第一个sgRNA序列位于BjRCO基因第二个外显子，所选序列为5’-GTCCGGTTTGCGTAAGGAC-3’，命名为sgRNA1；第二个sgRNA序列位于BjRCO基因第三个外显子，所选序列为5’-GCTGTTGCGATGATAACGG-3’，命名为sgRNA2；
2)sgRNA引物设计：
1DT1(BjRCO)-BsF：
5’-ATATATGGTCTCGATTGGTCCGGTTTGCGTAAGGACGTT-3’；
1DT1(BjRCO)-F0：
5’-TGGTCCGGTTTGCGTAAGGACGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；
1DT2(BjRCO)-R0：
5’-AACCCGTTATCATCGCAACAGCCAATCTCTTAGTCGACTCTAC-3’；
1DT2(BjRCO)-BsR：
5’-ATTATTGGTCTCGAAACCCGTTATCATCGCAACAGCCAA-3’；
3)CRISPR/Cas9表达载体的构建与农杆菌转化：
以pCBC-DT1T2为模板进行四引物PCR扩增，对PCR产物进行纯化回收。提取pKSE401质粒。目的片段与pKSE401质粒经酶切连接后，将连接产物转化大肠杆菌，并经菌液PCR鉴定以及测序验证；利用电转法将验证含有两个sgRNA的载体转化农杆菌，通过菌检验证得到叶用芥菜BjRCO基因编辑载体pKSE-BjRCO的农杆菌菌株。
步骤二，叶用芥菜BjRCO基因编辑突变体的获得与鉴定：
1)利用农杆菌介导的芥菜遗传转化技术将步骤一构建的BjRCO基因编辑载体pKSE-BjRCO转基因叶用芥菜自交系雪里蕻XC，通过筛选获得基因编辑突变体植株；
2)提取叶片DNA，利用BjRCO基因序列全长的上下游引物，扩增转基因植株的BjRCO基因，根据扩增出的条带大小初步判断基因编辑类型。并分别克隆基因编辑突变体植株中两个靶点处的序列，经测序后，分析BjRCO基因编辑突变体植株中BjRCO基因的编辑状况；
步骤三，分析叶用芥菜BjRCO基因突变对叶形的影响：
比较叶用芥菜自交系雪里蕻XC和BjRCO基因编辑突变体叶形的差异并计算叶裂指数。
本发明还提供上述基于CRISPR/Cas9的叶用芥菜BjRCO基因编辑材料以及该材料在叶用芥菜育种中的应用。
另外，本发明还提供BjRCO基因突变剂在叶用芥菜叶形改变及其育种中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除叶用芥菜BjRCO基因的5个拷贝(BjRCO1，BjRCO2，BjRCO3，BjRCO4，BjRCO5)，获得了叶片形状从多回羽状全裂叶变为非裂叶，叶裂指数明显降低的叶用芥菜BjRCO基因编辑材料。证明了CRISPR/Cas9诱导的BjRCO基因突变是叶片形状从多回羽状全裂叶变为非裂叶的原因。BjRCO基因正向调控芥菜多回羽状全裂叶的形成。这些基因编辑材料可作为适应不同环境的芥菜材料，为叶用芥菜育种和研究叶形变异提供宝贵的资源。
附图说明
图1为BjRCO基因结构与靶点位置；A，由CRISPR/Cas9诱导的BjRCO基因的两个靶标位点示意图；B，两个靶标敲除5个BjRCO基因拷贝示意图。
图2为BjRCO基因编辑突变体的表型与裂叶指数；A，BjRCO编辑突变体(a、b、c、e、f、g)与野生型(d、h)整株与成熟叶图片；B，BjRCO编辑突变体植株(04，11，19)与野生型XC的叶裂指数。
图3为BjRCO基因编辑突变体的鉴定；A，三个转基因阳性植株中BjRCO基因的扩增；B，CRISPR/Cas9编辑BjRCO基因突变体靶标位点区域测序结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。
在以下的实施例中，所使用的试剂均来源于商业渠道。所涉及试验方法，按照常规实验方法如《分子克隆：实验室指南》中所述。
实施例中使用的pCBC-DT1T2、pKSE401均为市售质粒。
为了解析叶用芥菜BjRCO基因对叶形的影响，本实施例给出一种基于CRISPR/Cas9的叶用芥菜BjRCO基因编辑材料的构建方法，该方法利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除叶用芥菜BjRCO基因，获得叶形由多回羽状全裂变为非裂状，叶裂指数明显减小的叶用芥菜BjRCO基因编辑材料。
具体实施过程如下：
1.叶用芥菜BjRCO基因的基因编辑载体pKSE-BjRCO的构建
1.1叶用芥菜自交系雪里蕻XC中BjRCO基因全长序列：
为了进一步解析BjRCO基因的功能，我们利用Illumina、PacBio、Hi-C等技术测序并组装了叶用芥菜自交系雪里蕻XC的全基因组序列。在XC基因组A10候选区段共发现了5个BjRCO基因。而目前BjRCO基因5个拷贝是否调控裂叶形成仍不清楚。
经序列比对分析发现BjRCO基因5个拷贝的全长基因序列如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示。
1.2sgRNA靶位点的选择与引物的合成：
针对叶用芥菜自交系雪里蕻XC中BjRCO基因5个不同拷贝的基因序列与基因结构，利用基因编辑网站(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)设计两个sgRNA序列，如图1A、图1B所示。
第一个sgRNA序列位于BjRCO基因第二个外显子，所选序列为5’-GTCCGGTTTGCGTAAGGAC-3’，命名为sgRNA1；
第二个sgRNA序列位于BjRCO基因第三个外显子，所选序列为5’-GCTGTTGCGATGATAACGG-3’，命名为sgRNA2。
设计引物，用于构建包含两个不同靶标位点的BjRCO基因编辑载体pKSE-BjRCO。具体的，根据上述两个sgRNA序列，设计如表1所示的引物(分别命名为1DT1(BjRCO)-BsF、1DT1(BjRCO)-F0、1DT2(BjRCO)-R0、1DT2(BjRCO)-BsR)。
表1：引物序列表
1.3 PCR扩增：
以质粒pCBC-DT1T2为模板进行四引物(1DT1(BjRCO)-BsF、1DT1(BjRCO)-F0、1DT2(BjRCO)-R0、1DT2(BjRCO)-BsR)PCR扩增。1DT1(BjRCO)-BsF/1DT2(BjRCO)-BsR为正常引物浓度(10ng/μl)；1DT1(BjRCO)-F0/1DT2(BjRCO)-R0为正常引物浓度稀释20倍。通过四引物PCR得到U6启动子驱动gudie RNA的片段。PCR扩增体系如表2所示，PCR反应程序如表3所示。扩增后对PCR产物进行纯化回收，得到626bp的回收片段。
表2：四引物PCR扩增体系
| 成分 | 体积 |
| pCBC-DT1T2 | 2μL |
| 1DT1(BjRCO)-BsF | 1μL |
| 20×1DT1(BjRCO)-F0 | 1μL |
| 20×1DT2(BjRCO)-R0 | 1μL |
| 1DT2(BjRCO)-BsR | 1μL |
| Green Mix | 10μL |
| DDW | 4μL |
| Total | 20μL |
表3：PCR反应程序
1.4回收片段与pKSE401载体的连接：
将1.3得到的回收片段与pKSE401载体分别进行酶切，并连接。酶切-连接体系(restriction-ligation)如表4所示。
表4：酶切连接体系
1.5大肠杆菌的热激转化与表达载体的鉴定
将上述连接产物加入大肠杆菌感受态细胞DH5α，轻轻吸打混匀放置于冰上25min，42℃水浴45s，迅速置于冰上2min，加入700μL的LB培养液，放置于37℃摇床振荡培养60分钟后将菌液涂布于含卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃恒温培养箱倒置过夜。
挑取单克隆，加到含有卡那霉素的LB液体培养基中，吸打混匀之后放置于37℃/220rpm摇床过夜培养。之后利用表2所示的引物U626-IDF/U629-IDR进行菌液PCR验证。PCR扩增体系如表5所示，PCR反应程序如表6所示。
表5：PCR扩增体系
| 成分 | 体积 |
| PCR mix | 10μL |
| Forward Primer | 1μL |
| Reverse Primer | 1μL |
| DDW | 7μL |
| 单克隆菌液 | 1μL |
| Total | 20μL |
表6：PCR反应程序
PCR反应结束后将产物利用1％的琼脂糖凝胶电泳进行验证。将PCR检测条带大小正确的单克隆菌液送至安徽通用生物系统有限公司进行测序，将测序结果正确的单克隆菌液按照TIANGEN质粒提取试剂盒进行质粒提取，成功构建包含两个靶标位点的BjRCO基因编辑载体pKSE-BjRCO。
1.6农杆菌转化
吸取1.5μLpKSE-BjRCO质粒加入农杆菌感受态细胞GV3101，轻轻吸打混匀。将混合液加入电转杯中央缝隙处，用枪吹打混匀。盖上电转杯盖放入冰盒中，拿到电转仪处，将电转杯用纸擦干后放入电转槽中，打开开关，调节程序后开始电转。若听到“滴”声，正常完成工作，则证明电转成功。取新1.5ml离心管，在电转杯中加入500μL无抗LB，用枪吹打混匀，将混合液吸出加入1.5ml离心管中。混合液于28℃，220rpm振荡培养60min。将菌液涂布于含卡那霉素的LB固体培养基平板上，28℃恒温培养箱倒置过夜。挑取单克隆，加到含有卡那霉素的LB液体培养基中，吸打混匀之后放置于28℃/220rpm摇床振荡培养。使用表2所示的引物U626-IDF/U629-IDR进行菌液PCR验证，PCR反应体系如表5所示，PCR反应条件如表6所示。PCR反应结束后将产物利用1％的琼脂糖凝胶电泳进行验证。最后将阳性菌株的菌液保存在40％的甘油中放置于-80℃进行长期保存。
2、叶用芥菜BjRCO基因编辑突变体的获得与鉴定
对上述成功构建的基因编辑载体pKSE-BjRCO基于植物组织培养结合农杆菌介导的遗传转化方法进行芥菜遗传转化，获得多个卡那抗性的CRISPR/Cas9基因编辑突变体芥菜株系。在此基础上，提取每个突变体芥菜株系的基因组DNA，然后以基因组DNA为模板，以表2所示的BjRCO(SalI)-L和BjRCOq(SmaI)-R为扩增引物，对BjRCO基因进行PCR扩增。以表1所示的BjRCOintron2-Ljc和BjRCOq(SmaI)-R为扩增引物，对BjRCO基因sgRNA1处的序列进行PCR扩增；以表1所示的BjRCOexon3-Ljc和BjRCOq(SmaI)-R为扩增引物，对BjRCO基因sgRNA2处的序列进行PCR扩增。将扩增产物纯化回收，将回收片段与pMD19-T连接，转化大肠杆菌，挑菌菌检，测序，以检测基因编辑突变体中BjRCO基因的编辑情况。
3、验证叶用芥菜BjRCO基因对叶形的影响
表型分析显示，在T0代所有阳性植株都表现为非裂的叶片。接下来，选择三个具有代表性的转基因阳性植株(04，11，19)进行进一步的分析，它们的叶片形状相比野生型都发生了明显的变化，由多回羽状全裂变为非裂叶(图2A)。叶裂指数明显降低(图2B)。为了验证转基因植株叶形变化是由于BjRCO的基因突变。申请人首先通过PCR扩增三个转基因阳性植株的BjRCO基因序列，发现转基因系04中BjRCO基因长度与野生型XC基本一致，表明转基因系04中两个sgRNA之间没有大片段缺失(图3A)。而转基因系11和19中除了可以扩增出基因全长序列外，还存在一个小于1000bp的序列，表明转基因系11和19的BjRCO基因可能存在大片段缺失。为了验证BjRCO基因序列的变异，利用TA克隆分别对这三个阳性植株(04，11，19)的靶位点进行测序。Sanger测序显示，三个具有代表性的转基因阳性植株(04，11，19)BjRCO基因都在一个或两个sgRNA靶点上被诱导形成点突变，且在转基因系11和19的两个sgRNA之间产生大的缺失(图3B)，这导致BjRCO基因功能缺失突变。因此，CRISPR/Cas9介导的BjRCO基因突变是叶片形状从多回羽状全裂叶变为非裂叶的原因。BjRCO基因正向调控芥菜多回羽状全裂叶的形成。
综上所述，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得的叶片形状由多回羽状全裂叶变为非裂叶的叶用芥菜BjRCO基因突变体。以上基因编辑材料可作为适应不同环境的芥菜材料，为叶用芥菜育种和研究叶形变异提供宝贵的资源。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。
Claims (9)
1.BjRCO基因在调控芥菜叶形中的应用，其特征在于，BjRCO基因的5个拷贝如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示，所述芥菜为叶用芥菜。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过突变BjRCO基因实现芥菜叶从多回羽状全裂叶变为非裂叶、叶裂指数降低。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，突变BjRCO基因通过敲除BjRCO基因来实现。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，敲除BjRCO基因采用CRISPR/Cas9方法，包括以下步骤：
（1）设计能同时敲除叶用芥菜BjRCO基因的5个拷贝的两个特异性靶点，并构建CRISPR/Cas9表达载体，然后转化农杆菌；
（2）通过农杆菌介导的遗传转化获得叶片形状从多回羽状全裂叶变为非裂叶，叶裂指数降低的叶用芥菜BjRCO基因编辑材料。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，
步骤（1）具体包括：
1）sgRNA靶位点的选择：
针对叶用芥菜自交系雪里蕻XC中BjRCO基因5个拷贝，设计两个sgRNA序列，第一个sgRNA序列为5’-GTCCGGTTTGCGTAAGGAC-3’；第二个sgRNA序列为5’-GCTGTTGCGATGATAACGG-3’；
2）sgRNA引物设计：
1DT1(BjRCO)-BsF：
5’-ATATATGGTCTCGATTGGTCCGGTTTGCGTAAGGACGTT - 3’；
1DT1(BjRCO)-F0：
5’-TGGTCCGGTTTGCGTAAGGACGTTTTAGAGCTAGAAATAGC - 3’；
1DT2(BjRCO)-R0：
5’-AACCCGTTATCATCGCAACAGCCAATCTCTTAGTCGACTCTAC - 3’；
1DT2(BjRCO)-BsR：
5’-ATTATTGGTCTCGAAACCCGTTATCATCGCAACAGCCAA - 3’；
3）CRISPR/Cas9表达载体的构建：
以pCBC-DT1T2为模板，采用2）中四引物进行PCR扩增，将扩增得到的目的片段与pKSE401质粒经酶切连接后，将连接产物转化大肠杆菌，并经菌液PCR鉴定以及测序验证；
将验证含有两个sgRNA的载体转化农杆菌，通过菌检验证得到叶用芥菜BjRCO基因编辑载体的农杆菌菌株。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，
步骤（2）具体包括：
1）利用农杆菌介导的芥菜遗传转化技术将步骤（1）构建的BjRCO基因编辑载体转基因叶用芥菜，通过筛选获得基因编辑突变体植株；
2）提取叶片DNA，利用BjRCO基因序列全长的上下游引物，扩增转基因植株的BjRCO基因，根据扩增出的条带大小和测序结果鉴定BjRCO基因编辑突变体植株。
7.采用权利要求4～6中任一项中所述的敲除BjRCO基因采用CRISPR/Cas9方法构建的叶用芥菜BjRCO基因编辑材料。
8.权利要求7所述的叶用芥菜BjRCO基因编辑材料在叶用芥菜育种中的应用。
9.BjRCO基因突变剂在叶用芥菜叶形改变及叶用芥菜育种中的应用，BjRCO基因的5个拷贝如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示。
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