CN118147134A - 靶向调控PCSK9基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及靶向调控PCSK9基因表达的siRNA及其应用。实验结果显示，一些交替修饰和特定模板修饰的寡核苷酸序列，能够显著抑制PCSK9表达，可用于开发治疗PCSK9相关疾病的药物。

Description

靶向调控PCSK9基因表达的siRNA及其应用
技术领域
本申请是中国专利申请号为 CN202311463375.7 的发明专利申请的分案申请，该发明专利申请的申请日为 2023 年11 月 6 日，发明名称为“靶向调控PCSK9基因表达的siRNA及其应用”。
本公开涉及核酸修饰技术领域，具体地说，涉及一种采用多种化学方式修饰的小干扰核糖核酸（siRNA）及其在制备与PCSK9基因表达相关疾病药物中的应用。
背景技术
核酸药物尤其是寡核苷酸药物，由于其合成简单、活性较高而得到广泛应用。寡核苷酸药物通常包括反义寡核苷酸（ASO）、小干扰RNA（siRNA）、微小RNA（miRNA）和核酸适配体等。
寡核苷酸是一类短的DNA或RNA分子、寡聚体，寡核苷酸很容易以序列特异性的方式与它们各自的互补寡核苷酸、DNA或RNA结合，形成双链体，或者更不常见的是更高阶的杂合体。这种基本特性使得寡核苷酸在基因检测、研究和医药学中具有广泛的应用。在自然界中，寡核苷酸通常是在基因表达调节中起作用的小RNA分子，或者是源自较大核酸分子降解的中间体。
RNA干涉（RNAi）是一种针对外源基因自然防御机制。siRNA能够通过对特定序列的识别并分解目标mRNA的方式敲除目标基因。
经典RNAi的有效分子由标志性的19 + 2核苷酸聚合结构组成（一个由21个核苷酸RNA分子与19个对应核碱基的核苷酸分子组成的双螺旋结构，包含有2个核苷酸的3'端悬垂）。siRNA的一条链（导引链或反义链）与目标基因的转录物mRNA互补，另一条链标定为乘客链（或正义链）。siRNAs（反义链）引导阿尔古蛋白（AGO2）与目标转录本互补，并成为RNA引导沉默复合体（RISC）的一部分。 siRNA（反义链）与目标的完全互补导致在AGO2蛋白的催化下导引链（反义链）10-11点位对面位置的目标转录本发生断裂。
siRNA与小分子和抗体药物相比具有天然的优势，因为siRNA通过对mRNA完成Watson–Crick碱基配对以执行其功能，而小分子和单克隆抗体药物需要识别特定蛋白质复杂的空间结构。因此，很多疾病由于其目标分子具有高活性，并无法识别与其具有亲和力与结合特异性的分子结构，因无法通过小分子及单克隆抗体治疗。siRNA药物的作用机制使其可从基因层面对靶标蛋白的表达进行调控，相比于小分子或抗体药，具有靶向特异性。其基于碱基互补配对原则的机理，也使得siRNA的治疗范围更宽、设计更加简单、研发周期更短。
寡核苷酸可序列特异性地与互补的RNA链结合，杂交后能够诱导RNase H裂解靶RNA。天然的寡核苷酸中核苷酸由磷酸二酯键连接，在生理条件下，它们对核酸酶特别敏感，因此天然的、未经结构改造的、未经修饰的寡核苷酸药物，在体内容易被核酸酶快速降解，活性较低，成药性较差。对寡核苷酸结构进行化学修饰是提高其活性的一种有效方式，可以提高其对核酸酶的稳定性、与RNA的亲和性，并能更好地促进细胞内吞和组织靶向，从而有效调控目的基因的表达。
依据寡核苷酸的基本结构碱基、糖环、磷酸骨架和末端，可以分四个部分进行化学修饰：
1）碱基的修饰：主要分为嘌呤修饰、嘧啶修饰以及碱基替换三种形式。嘌呤修饰包括N6-甲基腺苷、N1-甲基腺苷、7-甲基鸟苷酸修饰；嘧啶修饰包括3-甲基尿嘧啶核苷、5-甲基尿嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶核苷、N4 -乙酰胞苷、假尿苷、硫尿核苷、丙炔尿嘧啶核苷以及二氢尿嘧啶核苷等修饰。
2）糖环的修饰：主要分为糖环的修饰和替换。糖环的修饰包括2'-修饰、4'-修饰、5'-修饰、异构修饰，以及这些修饰的组合修饰。而siRNA的2'-修饰中最为常见的是2'-OMe（2'-甲氧基）及2'-F（2'-氟代）修饰。相比天然的siRNA，同时采用2'-OMe及2'-F修饰后的siRNA具有更高的Tm值、更强的血清稳定性和更好的活性。
3）磷酸骨架的修饰：主要的修饰方式有：硫代磷酸酯的修饰；经甲基磷酸酯、硒代磷酸酯、甲硼基磷酸酯、双硫代磷酸酯，以及用硫原子取代磷酸二酯键连接区的桥氧原子修饰；将核苷之间的磷酸酯基整个替换为不含磷原子的基团，如将P原子替换成C、S以及N原子，形成胍基、S-甲基硫脲等。
4）末端修饰：在正义链的5'端或/和3'端的末端共价缀合特殊的基团以及反义链5'端磷酸化修饰。
已经上市的寡核苷酸药物，都是经过化学修饰的。从1998年第一个核酸药物Fomivirsen(Vitravene)获批上市至今，核酸药物的化学修饰改造技术不断升级。迄今为止，全球已有18个核酸药物获批上市：
表1 全球已获批上市核酸药物
高胆固醇血症的治疗策略，主要是降低致动脉粥样硬化的低密度脂蛋白胆固醇（Low-Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-C）和升高有潜在心脏保护作用的高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）。来自近170,000例受试者的临床研究表明，LDL-C的水平每降低1.0 mmol/L，主要的心血管疾病事件的平均年发病率可相应降低20%左右。2019版《血脂异常基层诊疗指南》中推荐的降低LDL-C的药物主要有他汀类、胆固醇吸收抑制剂、罗布替考、PCSK9抑制剂等，其中他汀类是首选用药。2018版《家族性高胆固醇血症筛查与诊治中国专家共识》推荐他汀类以及与依折麦布以及PCSK9抑制剂的联合治疗方案。
PCSK9是由PCSK9基因编码的丝氨酸蛋白酶，主要由肝脏产生。PCSK9与肝细胞表面的LDL受体（LDL-R）结合，使LDL-R降解。由于LDL-R具有与血浆中的LDL-C结合并将其吸收进入肝脏（将其中的血脂处理并通过胆汁排出）的作用，LDL-R的降解将导致血浆的LDL-C水平升高。PCSK9抑制剂通过降低PCSK9的表达水平，使肝脏细胞表面的LDL-R水平升高，从而降低血浆中LDL-C水平，达到降低血脂的目的。
为了更好地对高胆固醇血症和血脂异常进行有效治疗，本领域有进一步开发调控PCSK9基因表达的药物的需求。
发明内容
本公开通过针对PCSK9 mRNA序列，设计出一系列独特的siRNA序列，并对其进行交替修饰和特定模板修饰。
通常情况下，siRNA采用2'-甲氧基（2'-OMe）与2'-氟代（2'-F）对单体进行修饰。但即使仅考虑采用上述两种单体修饰进行组合，对于siRNA来说，正义链和反义链共44个碱基，即存在244种可能的组合。并且，加上不同的末端硫代修饰布局，使可能的修饰方案数量更加庞大。
对于同一siRNA序列采用不同的修饰方式，活性具有非常大的差异，不同的siRNA采用相同的修饰方式，活性也具有非常大的差异。虽然对于siRNA修饰设计存在一些修饰原则，但已有研究表明，无法根据修饰方式准确推测出其活性，即修饰方式与活性之间无确定的关系。因此从无数种可能的修饰组合中，筛选出具有高活性的修饰方案非常困难。
本公开通过对设计的siRNA序列进行化学修饰，筛选出了一些对PCSK9基因表达具有显著抑制作用的交替修饰及特殊修饰序列。
在一方面，本公开提供了一种用于降低PCSK9的表达的双链RNAi剂，其包含选自由以下正义链和反义链配对组成的任一寡核苷酸双链体。
（1）所述正义链具有如SEQ ID NO. 1所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 13所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（2）所述正义链具有如SEQ ID NO. 2所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 14所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（3）所述正义链具有如SEQ ID NO. 3所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 15所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（4）所述正义链具有如SEQ ID NO. 4所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 16所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（5）所述正义链具有如SEQ ID NO. 5所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 17所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（6）所述正义链具有如SEQ ID NO. 6所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 18所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（7）所述正义链具有如SEQ ID NO. 7所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 19所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（8）所述正义链具有如SEQ ID NO. 8所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 20所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（9）所述正义链具有如SEQ ID NO. 9所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 21所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（10）所述正义链具有如SEQ ID NO. 10所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 22所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（11）所述正义链具有如SEQ ID NO. 11所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 23所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（12）所述正义链具有如SEQ ID NO. 12所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 24所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列。
在另一方面，本公开还提供了一种用于降低PCSK9的表达的缀合物，其包所述的双链RNAi剂，及与其缀合的配体。
在另一方面，本公开还提供了一种药物组合物，其包括所述的双链RNAi剂或缀合物，以及药学上可接受的载体。
在另一方面，本公开还提供了前述双链RNAi剂、缀合物或组合物在制备与PCSK9相关疾病中的应用。
在另一方面，本公开还提供了用于治疗或预防可通过下调PCSK9基因表达进行调节的疾病和病症的方法。
本公开所取得的有益效果至少如下：
（1）无修饰序列，包括基础序列5、51、81、82、84、3、8、9、21、31、73和83，对PCSK9均具有显著抑制作用，抑制率最高可超过60%。
（2）采用多重修饰序列，抑制率最高可达90%以上。并且，修饰序列与GalNAc化合物缀合，可以高效递送至动物肝脏，并显著抑制PCSK9基因表达，显著降低血清中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，显著降低血清中总胆固醇（TC）水平。
（3）本公开采用交替修饰和本公开修饰模板修饰的各序列，同现有技术公开的序列完全相同或差异很小的无修饰序列相比，对PCSK9抑制活性均显著提升，最多可提高40%。
（4）本公开发现，无论是无修饰序列，还是交替修饰序列，序列相近的siRNA，活性差异非常大。例如，无修饰基础序列5比基础序列4抑制率提高了51.2%，交替修饰序列P92-si5的抑制率比P92-si4提高了61.8%，显著提升。
（5）本公开还发现，不同序列经过交替修饰后，对活性影响并不一致。有的抑制率显著提升，例如基础序列5，交替修饰比无修饰序列抑制率提高了12.4%；有的不明显，例如基础序列4、22和52，交替修饰序列和无修饰序列抑制率基本无变化。
附图说明
为了更清楚地说明本公开实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅涉及本公开的一些实施例，而非对本公开的限制。
图1显示对PCSK9基因具有显著抑制作用的交替修饰序列，这些序列的抑制率均高于50%。
图2显示对PCSK9基因抑制率在30%-50%之间的交替修饰序列。
图3显示对PCSK9基因抑制率低于30%的交替修饰序列。
图4显示对PCSK9基因抑制率低于30%的交替修饰序列。
图5显示对PCSK9基因具有显著抑制作用的无修饰序列，这些序列的抑制率均高于50%。
图6显示对PCSK9基因抑制率低于40%的无修饰序列。
图7显示基础序列5采用不同模板修饰后对PCSK9基因的抑制率。
图8显示基础序列5、51、81和84采用模板修饰、防脱靶或/和5'-E-VP修饰序列对PCSK9基因的抑制率。
图9显示基础序列5、51、81、82和84采用不同修饰方案并与GalNAc化合物缀合后，对动物血清中PCSK9蛋白的抑制率。
图10显示基础序列5、51、81、82和84采用不同修饰方案并与GalNAc化合物缀合后，对动物血清中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）降低水平。
图11显示基础序列5、51、81、82和84采用不同修饰方案并与GalNAc化合物缀合后，对动物血清中总胆固醇（TC）降低水平。
具体实施方式
为了使本公开可更容易理解，首先定义某些术语。此外，应该注意的是，每当一个值或一个参数的取值范围是列举的，其目的是表明这些引用值的中间值与范围也意在成为本公开的部分。
如本文所用的冠词“一个”和“一种”(“a”和“an”)是指一个或超过一个(即，至少一个)该冠词的语法宾语。通过举例，“一个元素”是指一个元素或超过一个元素，例如多个元素。
术语“包括(including)”用在此处是指短语“包括但不限于”并且与之互换使用。
术语“或(or)”用在此处是指术语“和/或”并且与之互换使用，除非语境清楚的另外指明。
如本文所用，如应用于一种或多种目标值的术语“约”或“近似”是指与所述参考值类似的值。在某些实施方案中，除非另有说明或另外从上下文显而易见，否则术语“近似”或“约”是指落入所述参考值在任一方向(大于或小于)的20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少内的值的范围(除非这种数字将超过可能值的100%)。
如本文所用的，“PCSK9”是指前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin9基因或蛋白。
“G”、“C”、“A”以及“U”每一者通常分别代表包含鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤以及尿嘧啶作为碱基的核苷酸。“T”和“dT”在此可互换使用并且是指其中核碱基是胸腺嘧啶如脱氧核糖胸腺嘧啶(deoxyribothymine)、2'-脱氧胸苷或胸苷的脱氧核糖核苷酸。然而，应理解术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”或“脱氧核糖核苷酸”还可以指一种经修饰的核苷酸(如以下进一步详述)或一种替代性的置换部分。技术人员应很好地意识到，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤以及尿嘧啶可以被其他部分置换而基本上不改变一种寡核苷酸(包括一种具有这种置换部分的核苷酸)的碱基配对特性。例如，而不限于，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸发生碱基配对。因此，包含尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以在本公开的核苷酸序列中被一种包含例如肌苷的核苷酸所置换。包含此类置换部分的序列是本公开的实施例。
术语“RNAi剂”、“iRNA”、 “iRNA剂”、“RNA干扰剂”在此可互换使用，是指在此所定义的术语包含RNA剂，并且介导通过RNA诱导沉默复合物(RISC)途径的RNA转录本靶向切割。RNAi通过已知为RNA干扰(RNAi)的过程指导mRNA的序列特异性降解。RNAi调节，例如抑制，PCSK9在细胞如受试者(如哺乳动物受试者)体内的细胞中的表达。RNAi分子包括单链RNAi分子和双链siRNAs，以及短发夹RNAs(shRNAs)。
术语“小干扰核糖核酸”或“siRNA”是指小干扰核糖核酸RNAi分子。它是一类双链RNA分子，在本领域中也称为短干扰RNA或沉默RNA。siRNAs通常包含正义链(也称为过客链)和反义链(也称为前导链)，其中每条链的长度为17个至30个核苷酸，通常长度为19个至25个核苷，其中反义链与靶核酸互补(诸如至少95％互补、诸如完全互补)(合适地是成熟的mRNA序列)，并且正义链与反义链互补，使得正义链和反义链形成双链体或双链体区域。siRNA链可形成平末端双链体，或者优选地，正义和反义链的3′端可形成3′突出端，例如1个、2个或3个核苷，类似于Dicer生产的产物，可在体内形成RISC底物。Dicer底物的有效扩展形式已在US 8,349,809和US 8,513,207中进行了描述，在此通过引用并入。在一些实施例中，正义链和反义链均具有2nt 3′突出端。因此，双链体区域的长度可以是例如17个至25个核苷酸，诸如长度为21个至23个核苷酸。
术语“反义链”指RNAi (例如dsRNA)的包括与靶序列实质上互补的区域的链。在本文中使用时，术语“互补性区域”指反义链上与本文定义的序列(例如靶序列)实质上互补的区域。当互补性区域与靶序列不完全互补时，错配可以在分子的内部或末端区域。通常，最被容许的错配在末端区域，例如，在5’和/或3’末端的5、4、3或2个核苷酸内。
术语“正义链”在本文中使用时指RNAi的、包括与反义链(如该术语在本文中被定义的那样)的区域实质上互补的区域的链。
本文所用的术语“抑制”，可以与“减少”、“沉默”、“下调”、“压制”和其他类似术语交替使用，并且包括任何水平的抑制。
如本文所用的，短语“抑制PCSK9的表达”包括抑制任何PCSK9基因(如例如小鼠PCSK9基因、大鼠PCSK9基因、猴PCSK9基因、或人类PCSK9基因)以及PCSK9基因的变体(例如天然存在的变体)或突变体的表达。因此，该PCSK9基因可以是野生型PCSK9基因、突变PCSK9基因、或在遗传操作的细胞、细胞群组或生物体的情形下的转基因PCSK9基因。
“抑制PCSK9基因表达”包括任何水平的PCSK9基因的抑制，例如至少部分抑制PCSK9基因的表达，如抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％。
基于与PCSK9基因表达相关的任何变量水平，例如PCSK9mRNA水平、PCSK9蛋白水平、或血清脂质水平，可以评估PCSK9基因的表达。抑制可通过这些变量中的一个或多个与对照水平相比的绝对或相对水平的减少来评估。对照水平可以是本领域中利用的任何类型的对照水平，例如给药前基线水平或从类似的未经处理或经对照(例如仅缓冲液对照或惰性剂对照)处理的受试者、细胞、或样品确定的水平。
如本文所用的，“患者”或“受试者”旨在包括人类或者非人类动物，优选哺乳动物，例如猴。最优选地，该受试者或患者是人。
如本文所用的，“PCSK9相关疾病”旨在包括任何与PCSK9基因或蛋白相关的疾病。这种疾病可以例如由PCSK9蛋白的过量产生、由PCSK9基因突变、由PCSK9蛋白的异常裂解、由PCSK9与其他蛋白质或其他内源或外源物质之间的异常相互作用引起。示例性PCSK9相关疾病包括脂血症，例如高脂血症、以及其他形式的脂质失衡，如高胆固醇血症、高甘油三酯血症以及与这些失调相关的病理情况，如心脏和循环系统疾病。
如本文所用的，“治疗有效量”旨在包括当给予患者用于治疗一种PCSK9相关疾病时足以实现该疾病的治疗(例如通过削弱、改善或维持该现有疾病或一种或多种疾病症状)的RNAi剂的量。该“治疗有效量”可以取决于该RNAi剂、该试剂如何给予、该疾病及其严重程度、和病史、年龄、体重、家族史、遗传组成、由PCSK9表达介导的病理过程的阶段、先前或伴随治疗(如果有的话)的类型、以及待治疗的患者的其他个体特征而变化。
如本文所用的，“预防有效量”旨在包括当给予尚末经历过或显示出一种PCSK9相关疾病的症状但可能易患该疾病的受试者时足以预防或改善该疾病或该疾病的一种或多种症状的RNAi剂的量。改善疾病包括减缓疾病的进程或减少后发疾病的严重度。该“预防有效量”可以取决于该RNAi剂、该试剂如何给予、该疾病的风险程度、和病史、年龄、体重、家族史、遗传组成、先前或伴随治疗(如果有的话)的类型、以及待治疗的患者的其他个体特征而变化。
“治疗有效量”或“预防有效量”还包括在适用于任何治疗的合理利益/风险比下产生某种所希望的局部或全身效应的RNAi剂的量。本公开的方法中所用的RNAi剂可以按足以产生适用于这样的治疗的合理利益/风险比的量给予。
如此处使用的，术语“样品”包括从受试者体内分离的类似的流体、细胞、或组织，以及受试者体内存在的流体、细胞、或组织的一个集合。生物流体的实例包括血液、血清和浆膜液、血浆、脑脊髓液、眼内液(ocular fluid)、淋巴液、尿液、唾液等。组织样品可包括来自组织、器官或局部区域的样品。例如样品可以源自特定器官、器官部分、或这些器官内的流体或细胞。在某些实施例中，样品可源自肝脏(例如，整个肝脏或肝脏的某些段，或肝脏中的某些类型的细胞，例如，肝细胞)。在优选实施例中，“源自受试者的样品”是指从该受试者抽取的血液或血浆。在其他实施例中，“源自受试者的样品”是指源自该受试者的肝脏组织(或其亚成分)。
在一方面，本公开提供了一种用于降低PCSK9的表达的双链RNAi剂，其包含选自由以下正义链和反义链配对组成的任一寡核苷酸双链体：
（1）所述正义链具有如SEQ ID NO. 1所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 13所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（2）所述正义链具有如SEQ ID NO. 2所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 14所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（3）所述正义链具有如SEQ ID NO. 3所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 15所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（4）所述正义链具有如SEQ ID NO. 4所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 16所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（5）所述正义链具有如SEQ ID NO. 5所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 17所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（6）所述正义链具有如SEQ ID NO. 6所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 18所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（7）所述正义链具有如SEQ ID NO. 7所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 19所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（8）所述正义链具有如SEQ ID NO. 8所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 20所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（9）所述正义链具有如SEQ ID NO. 9所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 21所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（10）所述正义链具有如SEQ ID NO. 10所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 22所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（11）所述正义链具有如SEQ ID NO. 11所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 23所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（12）所述正义链具有如SEQ ID NO. 12所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 24所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列。
在一些实施方案中，正义链及反义链上所有核苷酸为经修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，双链RNAi剂为一种用于抑制PCSK9基因表达的RNAi剂。
在一些实施方案中，所述正义链与SEQ ID NO. 1-12中任一序列差异为1-3个核苷酸。
在一些实施方案中，所述反义链与SEQ ID NO. 13-24中任一序列差异为1-3个核苷酸。
在一些实施方案中，至少一个经修饰的核苷酸是选自下组，该组由以下各项组成：脱氧-核苷酸、3'-末端脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧-修饰的核苷酸、锁核苷酸、非锁核苷酸、构型限制性核苷酸、限制性乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基-修饰的核苷酸、2'-C-烷基-修饰的核苷酸、2'-羟基-修饰的核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基-修饰的核苷酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基的核苷酸、包含甲基磷酸酯基的核苷酸、包含5'-磷酸酯的核苷酸、及包含5'-磷酸酯模拟物的核苷酸。
在一些实施方案中，至少一个链包含至少1个核苷酸的3'突出端。
在一些实施方案中，至少一个链包含至少2个核苷酸的3'突出端。
在一些实施方案中，双链区为15-30对核苷酸的长度。
在一些实施方案中，双链区为17-25对核苷酸的长度。
在一些实施方案中，双链区为19-23对核苷酸的长度。
在一些实施方案中，双链区为21对核苷酸的长度。
在一些实施方案中，各链具有15-30个核苷酸。
在一些实施方案中，各链具有19-25个核苷酸。
在一些实施方案中，正义链具有21个核苷酸，反义链具有23个核苷酸。
在一些实施方案中，所述正义链及反义链上所有核苷酸修饰方式为核苷酸核糖的2'位的化学修饰。
在一些实施方案中，核苷酸核糖的2'位的化学修饰选自2'-甲氧基、2'-甲氧基乙基、2'-氟代、2'-苄氧基、2'-甲基羰基氨基和2'-吡啶甲氧基中的任意一种或者几种的组合。
在一些实施方案中，各核苷酸核糖的2'位的化学修饰，选自2'-甲氧基和2'-氟代的组合。
在一些实施方案中，各核苷酸核糖的2'位的化学修饰，选自2'-甲氧基和2'-氟代的交替组合。
在一些实施方案中，各核苷酸核糖的2'位的化学修饰方式为：正义链奇数位均为2'-氟代修饰，偶数位均为2'-甲氧基修饰；反义链奇数位均为2'-甲氧基修饰，偶数位均为2'-氟代修饰。
在一些实施方案中，核苷酸单体之间连接的3',5'-磷酸二酯键。
在一些实施方案中，核苷酸单体之间连接的3',5'-磷酸二酯键有硫代修饰。
在一些实施方案中，前述寡核苷酸具有以下修饰：
在一些实施方案中，反义链自5'端起第二至第八位中采用修饰基团，其中所述修饰基团选UNA、GNA或DNA，其中UNA和GNA结构如下：
；
其中，碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶以及尿嘧啶。
在一些实施方案中，修饰的反义链5'末端核苷酸糖苷的5'位碳原子的磷酸化，包括但不限于以下5'位磷酸化基团：5'-乙烯基膦酸酯基团(5'-E-VP)；5'-甲基膦酸酯基团(5'-MP)；5'-C-甲基磷酸酯基团；5'-硫代磷酸酯基团(5'-PS)；5'-磷酸酯基团(5'-P），其结构示意如下：
；
其中，R为氢、羟基、胺基、C1-4烷基、芳香基、C1-4烷氧基、C1-4烷基羰基氨基或卤素；
碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶以及尿嘧啶。
在一些实施方案中，所示序列末端中核苷酸单体之间连接的3',5'-磷酸二酯键，有硫代修饰，并形成手性纯的3',5'-硫代磷酸二酯键，其中正义链及反义链5'末端含有1-3个硫代连接，反义链3'末端含有1-3个硫代连接。
本公开的双链RNA(dsRNA)试剂可以任选地缀合至一个或多个配体。该配体可以在3'端、5'端或两端处附接到有义链、反义链或两条链。例如，该配体可以与该有义链缀合。在优选实施例中，该配体与该有义链的3'端结合。在一个优选实施例中，该配体是一个GalNAc配体。
在另一方面，本公开提供了一种用于降低PCSK9的表达的缀合物，其包所述的双链RNAi剂，及与其缀合的配体。
在一些实施方案中，配体缀合在寡核苷酸正义链的3'-末端或5'-末端。
在一些实施方案中，配体为一种或多种利用二价或三价的分支键联体附接的GalNAc衍生物。
在一些实施方案中，配体为：
，
其中，X是氢或一种羟基保护基或H，所述羟基保护基包括乙酰基、苯甲酰基或异丁酰基；Y是一种胺保护基或H，所述胺保护基为甲酰基、乙酰基、丙酰基、正丁酰基或异丁酰基；n是0-20之间的整数；q、r和s独立地是1-7之间的整数。
在一些实施方案中，配体为：
。
在一些实施方案中，配体为：
其中，X为氧、氮或硫；
Y为烷基或芳香基；
R1为氧或硫；
R2为氢、胺基、C1-4烷基、芳香基、C1-4烷氧基或卤素；
A为-(CH2)a-、-(CH2CH2O)b-、-((CH2)cNHCO)d-或-((CH2)cCONH)d-，其中，a是1-15的整数，b是1-7的整数，c为1-7的整数，d为1-5的整数；
B为-(CH2)e-，其中e为0-7的整数；
L为-CONH-或-NHCO-；
X1为-(CH2)f-或-(CH2CH2O)fCH2-，f是1-5的整数；
X2为-(CH2)g-，g是1-6的整数；
Y1为0或1；
Y2为0、1或2；
Y3为1、2或3；
m为0-4的整数；
n为0-4的整数。
在一些实施方案中，配体为G4、G5、G6或G7：
，
，
，
。
在一些实施方案中，缀合物具有如下所示的结构：
，
，
，
，或
。
在一些实施方案中，所述双链RNAi剂包含选自由以下正义链和反义链配对组成的任一寡核苷酸双链体：
（1）所述正义链具有如SEQ ID NO. 337所示的序列；和所述反义链具有如SEQ IDNO. 427所示的序列；
（2）所述正义链具有如SEQ ID NO. 337所示的序列；和所述反义链具有如SEQ IDNO. 428所示的序列；
（3）所述正义链具有如SEQ ID NO. 342所示的序列；和所述反义链具有如SEQ IDNO. 381所示的序列；
（4）所述正义链具有如SEQ ID NO. 342所示的序列；和所述反义链具有如SEQ IDNO. 430所示的序列；
（5）所述正义链具有如SEQ ID NO. 342所示的序列；和所述反义链具有如SEQ IDNO. 431所示的序列；
（6）所述正义链具有如SEQ ID NO. 347所示的序列；和所述反义链具有如SEQ IDNO. 384所示的序列；
（7）所述正义链具有如SEQ ID NO. 347所示的序列；和所述反义链具有如SEQ IDNO. 437所示的序列；
（8）所述正义链具有如SEQ ID NO. 347所示的序列；和所述反义链具有如SEQ IDNO. 438所示的序列；
（9）所述正义链具有如SEQ ID NO. 348所示的序列；和所述反义链具有如SEQ IDNO. 385所示的序列；
（10）所述正义链具有如SEQ ID NO. 352所示的序列；和所述反义链具有如SEQ IDNO. 448所示的序列；
（11）所述正义链具有如SEQ ID NO. 353所示的序列；和所述反义链具有如SEQ IDNO. 390所示的序列；
（12）所述正义链具有如SEQ ID NO. 353所示的序列；和所述反义链具有如SEQ IDNO. 448所示的序列；
（14）所述正义链具有如SEQ ID NO. 357所示的序列；和所述反义链具有如SEQ IDNO. 393所示的序列；
（15）所述正义链具有如SEQ ID NO. 357所示的序列；和所述反义链具有如SEQ IDNO. 446所示的序列；和
（16）所述正义链具有如SEQ ID NO. 357所示的序列；和所述反义链具有如SEQ IDNO. 447所示的序列；
其中，所述寡核苷酸双链体与配体G4、G5、G6或G7缀合。
在一些实施方案中，所述双链RNAi剂包含选自由以下正义链和反义链配对组成的任一寡核苷酸双链体：
（1）所述正义链具有如SEQ ID NO. 352所示的序列；和所述反义链具有如SEQ IDNO. 448所示的序列；
（2）所述正义链具有如SEQ ID NO. 353所示的序列；和所述反义链具有如SEQ IDNO. 390所示的序列；和
（3）所述正义链具有如SEQ ID NO. 353所示的序列；和所述反义链具有如SEQ IDNO. 448所示的序列；
其中，所述寡核苷酸双链体与配体G4、G5、G6或G7缀合。
在一些实施方案中，所述双链RNAi剂包含由SEQ ID NO. 353所示的正义链和SEQID NO. 448所示反义链配对组成的寡核苷酸双链体，所述寡核苷酸双链体与配体G5缀合。
在另一方面，本公开还提供了一种药物组合物，其包括所述的双链RNAi剂或缀合物，以及药学上可接受的载体。
在一些实施例中，本文中提供含有如此处所述的RNAi和药学上可接受的载体的药物组合物。含有RNAi的药物组合物可用于治疗与PCSK9基因的表达或活性相关的疾病或病症，如脂质失调。基于递送模型配制这类药物组合物。一个实例是经配制以便通过肠胃外递送，例如通过静脉内(IV)递送来全身性施用的组合物。另一个实例是以下组合物，该组合物被配制用于直接递送到脑实质，例如通过输注到脑，例如通过连续泵输注。
包含本公开的RNAi剂的药物组合物可以是例如具有或不具有一种缓冲液的溶液或含有药学上可接受的载体的组合物。这样的组合物包括例如水性或结晶组合物、脂质体配制品、胶束配制品、乳剂以及基因治疗载体。
在本公开的方法中，该RNAi剂可以在一种溶液中给予。一种游离RNAi剂可以在一种非缓冲溶液中、例如在生理盐水中或在水中给予。可替代地，该游离siRNA还可以在一种适合缓冲溶液中给予。该缓冲溶液可以包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐，或其任何组合。在一个优选实施例中，该缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。可以将包含该RNAi剂的缓冲液的pH与体积摩尔渗透压浓度进行调节，使得它适合于给予受试者。
在一些实施例中，该缓冲溶液进一步包含一种用于控制该溶液的克分子渗透压浓度的试剂，以使得克分子渗透压浓度被保持在一个所希望的值，例如在人血浆的生理值。可以加入到该缓冲溶液以控制克分子渗透压浓度的溶质包括(但不限于)蛋白质、肽、氨基酸、非代谢聚合物、维生素、离子、糖、代谢物、有机酸、脂质或盐。在一些实施例中，用于控制该溶液的克分子渗透压浓度的该试剂是一种盐。在某些实施例中，用于控制该溶液的克分子渗透压浓度的该试剂是氯化钠或氯化钾。
本公开的药物组合物可以按足以抑制PCSK9基因的表达的剂量给予。通常，本公开的RNAi的适合剂量处于每日受体每千克体重约0.001至约200.0毫克范围内，通常处于每日每千克体重约1至50mg范围内。例如RNAi剂(例如dsRNA)可以按每个单剂量约0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、31、32、33、34、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或约50mg/kg施用。
可以将该药物组合物一日给予一次，或者可以将该RNAi在一天内以适当的间隔给予两次、三次或更多次亚剂量，或者甚至可以通过控释配制品使用连续输注或递送而给予。在这种情况下，每个子剂量中所含的RNAi必须相应地更少，以便实现每日总剂量。也可以将剂量单位复配用于在几天内递送，例如使用在几天时间范围内提供持久RNAi释放的常规持续释放配制品。缓释配制品在本领域内是熟知的并且对于在特定位点递送试剂是特别有用的，由此可以与本公开的试剂使用。在这一实施例中，该剂量单位包含相应的多个每日剂量。
在其他实施例中，单一剂量的该药物组合物可以长久持续，从而后续剂量以不多于3、4或5天的间距或以不多于1、2、3、或4周的间距施用。在本公开的一些实施例中，每周给予一次单剂量的本公开的药物组合物。在本公开的其他实施例中，每两月给予一次单剂量的本公开的药物组合物。
本领域技术人员将理解，某些因子可以影响有效治疗一个受试者所需的剂量和时间安排，这些因子包括(但不局限于)疾病或病症的严重性、之前的治疗、该受试者的总体健康和/或年龄、以及其他存在的疾病。此外，用治疗有效剂量的组合物治疗一个受试者可以包括单一治疗或者一系列治疗。如本文中他处描述，使用常规方法或基于使用适宜动物模型的体内测试，可以估计本公开涵盖的各个RNAi的有效剂量和体内半寿期。
取决于希望局部还是全身性治疗以及取决于有待治疗的区域，可以将本公开的药物组合物按许多方式给予。给予可以是局部的(例如通过皮肤药贴)；肺的；例如通过粉末或气溶剂的吸入或吹入，包括通过喷雾器；气管内的；鼻内的；表皮的以及经皮的、经口的或肠胃外的。肠胃外给予包括静脉内的、动脉内的、皮下的、腹膜内的或肌内的注射或输注；真皮下的，例如，经由植入装置；或颅内的，例如脑实质内的、鞘内的或心室内的给予。
用于在本公开的组合物和方法中使用的RNAi可以被配制成用于在膜性分子集合体中递送例如脂质体或胶束。如此处使用的，术语“脂质体”是指由设置在至少一个双层(例如一个双层或多个双层)中的两亲性脂质构成的囊泡。脂质体包括单层的或多层的囊泡，其具有一个形成自亲脂材料的膜以及一个水性内部。水性部分包含该RNAi组合物。该亲脂性材料从典型地不包括RNAi组合物的水性外部(尽管在一些实例中，它可能包括)分离该水性内部。脂质体对于将活性成分转移以及递送至作用位点是有用的。因为脂质体膜与生物膜结构上类似，当脂质体被施用到一种组织时，该脂质体双层与细胞膜的双层融合。随着脂质体与细胞的融合进行，包括RNAi的内部水性内容物被递送到细胞中，其中该RNAi可以特异性结合到一种靶标RNA并且可以介导RNAi。在一些情况下，这些脂质体也是特异地靶向的，例如将该RNAi引导到特定的细胞类型。
包含RNAi剂的脂质体可以通过多种方法来制备。在一个实例中，脂质体的脂质组分溶解在洗涤剂中使得用脂质组分形成胶束。例如该脂质组分可以是两亲性阳离子脂质或脂质缀合物。该洗涤剂可具有高的临界胶束浓度并可以是非离子的。示例性的洗涤剂包括胆酸盐、CHAPS、辛基葡糖苷、脱氧胆酸盐和月桂酰肌氨酸。然后将该RNAi剂制剂添加到包括该脂质组分的胶束中。该脂质上的阳离子基团与RNAi剂相互作用并在RNAi剂周围缩合以形成脂质体。缩合后，例如通过透析将该洗涤剂除去以得到RNAi剂的脂质体制剂。
RNAi，例如本公开的dsRNA可以被完全封装在脂质配制品(例如LNP或其他核酸-脂质颗粒)中。
如在此使用的，术语“LNP”是指一种稳定的核酸-脂质颗粒。LNP含有一种阳离子脂质、一种非阳离子脂质以及一种阻止该颗粒聚集的脂质(例如一种PEG-脂质缀合物)。LNP对于合成应用是极其有用的，因为它们展示出在静脉内(i.v.)注射之后延长的循环寿命并且在远端位点积累(例如在与给予位点物理分开的位点)。
在一个实施例中，脂质与药物的比率(质量/质量比率)(例如脂质与dsRNA的比率)将处于从大约1:1至大约50:1，从大约1:1至大约25:1，从大约3:1至大约15:1，从大约4:1至大约10:1，从大约5:1至大约9:1，或大约6:1至大约9:1的范围内。
在一些优选地实施方式中，所述脂质纳米颗粒包括阳离子脂质、中性脂质、结构性脂质、聚合物共轭脂质。
在一些优选地实施方案中，所述阳离子脂质是式(I)结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中G1为C1～6亚烷基；G2为C2～8亚烷基；G3为C1～3亚烷基；L1为C6～15直链烷基；L2为C12～25支链烷基。例如，式(I-I)结构的YK-009（参见专利CN114044741B）。
(I)
(I-I)
在一些优选地实施方案中，所述阳离子脂质是式(II)结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中：G1为C2~8亚烷基；G2为C2~8亚烷基；L1为-C(O)O-或-OC(O)-；L2为-C(O)O-或-OC(O)-；R1为C6~25直链或支链烷基；R2为C6~25直链或支链烷基；G3为HO(CH2)2-或HO(CH2)3-；G4为HO(CH2)2-或HO(CH2)3-；L为(CH2)2-或-(CH2)3-或-(CH2)4-。例如，式(II-I)结构的YK-401，式(II-II)结构的YK-402（参见专利CN115784921B）。
(II)
(II-I)
(II-II)
在一些优选地实施方案中，所述阳离子脂质是式(III)结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中：G1为C1~6亚烷基；G2为C2~8亚烷基；R1为C6~20直链或支链烷基；R2为C12~25支链烷基；G3为：HO(CH2)2N(CH3)(CH2)2-，HO(CH2)2N(CH2CH3)(CH2)2-，(HO(CH2)2)2N(CH2)2-，CH3O(CH2)2N(CH3)(CH2)2-，(CH3)2N(CH2)3SC(O)O(CH2)2-，(CH3)2N(CH2)3SC(O)-，CH3NH(CH2)2N(CH3)(CH2)2-或CH3CH2NH(CH2)2-。例如，式(III-I)结构的YK-201，式(III-II)结构的YK-202（参见专利CN115677518B）。
(III)
(III-I)
(III-II)
在一些优选地实施方案中，所述阳离子脂质是式(IV)结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中G1为C1~8亚烷基；G2为C2~8亚烷基；R1为C6~25直链或支链烷基；R2为C12~25直链或支链烷基；G3为：HO(CH2)2N(R3)CH2CH(OH)CH2-，其中R3为-CH3或-CH2CH3或-CH2CH2OH。例如，式(IV-I)结构的YK-305，式(IV-II)结构的YK-310（参见专利CN115745820B）。
(IV)
(IV-I)
(IV-II)
在一些优选地实施方案中，所述阳离子脂质是式(V)结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中，G1和G2各自独立地为未取代的C6-C10亚烷基；G3为未取代的C1-C12亚烷基；R1和R2各自独立地为C6-C24烷基或C6-C24烯基；R3为OR5、N、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；R4为C1-C12烃基；并且R5为H或C1-C6烃基；例如，式(V-I)结构的ALC0315（参见专利CN108368028B）；
(V)
(V-I)
在一些优选地实施方案中，所述阳离子脂质是式(VI)结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中，R4选自-(CH2)nQ和-(CH2)nCHQR；Q选自由以下组成的组：-OR、-OH、-O(CH2)nN(R)2、-OC(O)R、-CX3、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)、-N(R)S(O)2R8和杂环；n是1、2或3；各R独立地选自由以下组成的组：C 1-3 烷基、C 2-3 烯基、(CH 2 ) q OR*和H，并且各q独立地选自1、2和3，各R*独立地选自由C 1-12 烷基和C 2-12 烯基组成的组；各X独立地选自由以下组成的组：F、Cl、Br和I；例如，式(VI-I)结构的SM102（参见专利CN110520409A）。
(VI)
(VI-I)
在一些优选地实施方案中，所述阳离子脂质是式(VII)结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体（参见CN102625696B， DLIN-MC3-DMA），
(VII)。
在一些更优选地实施方式中，所述阳离子脂质包括YK-009、YK-401、YK-305、ALC0315、SM102、DLIN-MC3-DMA。
在一些优选地实施方式中，所述阳离子脂质与所述中性脂质的摩尔比为1:1～10:1。
在一些优选地实施方式中，所述阳离子脂质与所述结构性脂质的摩尔比为1:1～5:1。
在一些优选地实施方式中，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构性脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为(25～65):(5～25):(25～70):(0.5～5)。
在一些优选地实施方式中，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构性脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为(25～65):(5～25):(25～45):(0.5～5)。
在一些更优选地实施方式中，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构性脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为50:10:38.5:1.5或49:10:39.5:1.5。
在一些优选地实施方式中，所述中性脂质包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、神经酰胺、甾醇及其衍生物中的一种或多种。
在一些更优选地实施方式中，所述中性脂质选自以下中的一种或多种：1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0 Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺(SOPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(SOPC)、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)以及其混合物。
在一些更优选地实施方式中，所述中性脂质是DOPE和/或DSPC。
在一些优选地实施方式中，所述结构性脂质选自以下中的一种或多种：胆固醇、非甾醇、谷固醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、皮质类固醇。
在一些更优选地实施方式中，所述结构性脂质是胆固醇。
在一些优选地实施方式中，所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油。
在一些更优选地实施方式中，所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)，二肉豆蔻酰甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)和甲氧基聚乙二醇双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)。
本公开的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂以及含脂质体配制品。这些组合物可以产生自多种组分，这些组分包括但不限于预成形的液体、自乳化固体以及自乳化半固体。特别优选的是当治疗肝脏病症(例如肝癌)时靶向肝脏的配制品。
本公开的药物配制品(可以方便地以单位剂型存在)可以根据医药工业内熟知的常规技术来制备。此类技术包括以下这样的步骤：将这些活性成分与该(这些)药物载体或赋形剂进行联合。总体而言，这些配制品是通过以下步骤来制备：使这些活性成分与液体载体或精细分散的固体载体或它们两者均匀地且精细地联合，并且如果需要，进而将产品成形。
本公开的组合物可以被配制为许多可能的剂型中的任一者，这些剂型例如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆剂、软胶囊、栓剂以及灌肠剂。本公开的组合物还可以被配制为在水性、非水性介质或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步包含增加该悬浮液的粘度的物质，这样的物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该悬浮液还可以包含稳定剂。
本公开的某些组合物还向配制品中并入了载体化合物。如在此所使用的，“载体化合物”或“载体”可以指核酸或其类似物，它是惰性的(即本身不具有生物活性)，但却在体内过程中被认为是核酸，例如通过降解生物活性的核酸或促进其从循环中的除去而减少具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和载体化合物的共施用(一般后一种物质过量)可以导致肝脏、肾脏或其他外循环储库中回收的核酸量大幅度缩减，假定归因于该载体化合物和该核酸之间对共同受体的竞争。例如与聚肌苷酸、硫酸葡聚糖、聚胞苷酸或4-乙酰胺基-4'异硫氰酸茋-2,2'-二磺酸共施用时，肝组织中部分硫代磷酸酯化的dsRNA的回收可以减少。
与载体化合物相比，“药物载体”或“赋形剂”是用于向动物递送一种或多种核酸的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或其他任意药学上惰性的媒介物。该赋形剂可以是液体或固体，并且当与核酸和特定药物组合物的其他组分组合时，参考意欲的给予方式，对赋形剂进行选择以提供希望的容积、稠度等。典型的药物载体包括但不限于、粘合剂(例如预糊化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填料(例如乳糖和其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶态二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如淀粉、淀粉羟乙酸钠等)；和润湿剂(例如月桂基硫酸钠等)。
适合于非肠胃外给予的、不与核酸发生有毒反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂也可以用来配制本公开的组合物。适当的药学上可接受载体包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于局部给予核酸的配制品可以包括在普通溶剂如醇中的无菌或非无菌的水溶液、非水溶液，或在液体或固体油基质中的核酸溶液。这些溶液还可以包括缓冲液、稀释液和其他合适的添加剂。可以使用适合于非肠胃外给予的、且不与核酸发生有毒反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂。
适当的药学上可接受赋形剂包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
上述组合物的剂型、载体化合物、药物载体、赋形剂等在美国专利US10125369B2中描述，所述专利通过引用方式结合在此。
本公开还提供了用于治疗或预防可通过下调PCSK9基因表达进行调节的疾病和病症的方法。例如，在此描述的RNAi剂可用来治疗脂血症，例如高脂血症、以及其他形式的脂质失衡，如高胆固醇血症、高甘油三酯血症以及与这些失调相关的病理情况，如心脏和循环系统疾病。可通过下调PCSK9基因表达进行调节的其他疾病和病症包括溶酶体贮积病，包括但不限于，尼曼-皮克病、泰-萨克斯病、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、和高雪病。在此描述的RNAi剂可用来治疗心血管疾病例如冠心病(CHD)，脑血管病(CVD)，主动脉瓣狭窄，外周血管病，动脉粥样硬化，动脉硬化，心肌梗死(心脏病发作)，脑血管病(中风)，短暂性缺血发作(TIA)，心绞痛(稳定型和不稳定型)，心房颤动，心律失常，瓣膜病和/或充血性心力衰竭或任何其他性状。这些方法包括给予该受试者一个治疗有效量或预防有效量的一种本公开的RNAi剂、缀合物或组合物。在一些实施例中，该方法包括向具有杂合LDLR基因型的患者给予治疗量的PCSK9 siRNA。
本公开的RNAi剂可以使用本领域中已知的任何给药模式给予给一名受试者，包括(但不限于)皮下、静脉内、肌肉内、眼内、支气管内、胸膜内、腹膜内、动脉内、经淋巴、经脑脊髓及其任何组合。在优选实施例中，这些试剂是皮下给予的。
在另外的实施例中，将siRNA与另外的治疗剂组合给予。siRNA以及另外的治疗剂可以在相同的组合物中组合地给予，例如，肠胃外给予,或该另外的治疗剂可以作为一个单独的组合物的一部分或通过在此描述的另一种方法给予。
另外的治疗剂的实例包括已知用来治疗脂质失调如高胆固醇血症、动脉粥样硬化、血脂异常或心脑血管疾病的药物。例如，另外的治疗高脂血症的药物选自贝特类、他汀类、胆汁酸隔离剂和烟酸类。另外的治疗心脑血管疾病的药物选自血管紧张素转化酶抑制剂（例如卡托普利、依那普利、贝那普利、培哚普利等）、血管紧张素II受体拮抗剂（例如氯沙坦、氯沙坦氢氯噻嗪、缬沙坦、缬沙坦氢氯噻嗪、替米沙坦、替米沙坦氢氯噻嗪、奥美沙坦酯等）、β受体阻滞剂（例如普萘洛尔、比索洛尔、酒石酸美托洛尔、琥珀酸美托洛尔等）。
在一些实施例中，将RNAi剂给予患者，并且随后将另外的治疗剂给予该患者(或反之亦然)。在另一些实施例中，将RNAi剂和另外的治疗剂同时给予。
在另一方面，本公开提供了前述双链RNAi剂、缀合物或组合物在制备与PCSK9相关疾病中的应用。
在另一方面，本公开提供了前述双链RNAi剂、缀合物或组合物在制备治疗高胆固醇血症、动脉粥样硬化、血脂异常或心脑血管疾病药物中的应用。
在一些实施方案中，所述PCSK9相关疾病选自高胆固醇血症、动脉粥样硬化、血脂异常或心脑血管疾病。
以下实施例用于说明本公开，但不用来限制本公开的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本文核苷酸缩写如下：
A=腺苷-3'-磷酸酯
Am=2'-O-甲氧基腺苷-3'-磷酸酯
Ams=2'-O-甲氧基腺苷-3'-硫代磷酸酯
Af=2'-氟腺苷-3'-磷酸酯
Afs=2'-氟腺苷-3'-硫代磷酸酯
G=鸟苷-3'-磷酸酯
Gm=2'-O-甲氧基鸟苷-3'-磷酸酯
Gms=2'-O-甲氧基鸟苷-3'-硫代磷酸酯
Gf=2'-氟鸟苷-3'-磷酸酯
Gfs=2'-氟鸟苷-3'-硫代磷酸酯
C=胞苷-3'-磷酸酯
Cm=2'-O-甲氧基胞苷-3'-磷酸酯
Cms=2'-O-甲氧基胞苷-3'-硫代磷酸酯
Cf=2'-氟胞苷-3'-磷酸酯
Cfs=2'-氟胞苷-3'-硫代磷酸酯
U=尿苷-3'-磷酸酯
Um=2'-O-甲氧基尿苷-3'-磷酸酯
Ums=2'-O-甲氧基尿苷-3'-硫代磷酸酯
Uf=2'-氟尿苷-3'-磷酸酯
Ufs=2'-氟尿苷-3'-硫代磷酸酯
AmsEVP=5'-乙烯基-(E)-膦酸酯-2'-甲氧基腺苷-3'-硫代磷酸酯
UmsEVP=5'-乙烯基-(E)-膦酸酯-2'-甲氧基尿苷-3'-硫代磷酸酯
Agna=腺苷-二醇核酸
Cgna=胞苷-二醇核酸
Ggna=鸟苷-二醇核酸
Tgna=胸苷-二醇核酸
Ugna=尿苷-二醇核酸
实施例
实施例1：交替修饰的小干扰寡核苷酸的合成
根据PCSK9 mRNA序列设计84条siRNA基础序列。为提升序列的抑制效率和稳定性，将基础序列采用2'-甲氧基（2'-OMe）与2'-氟代（2'-F）交替修饰，并且末端进行硫代。正义链奇数位均为2'-F修饰，偶数位均为2'-OMe修饰；反义链奇数位均为2'-OMe修饰，偶数位均为2'-F修饰。此外正义链5'端有两个硫代修饰；反义链5'与3'端各有两个硫代修饰。交替修饰的siRNA序列见表2。
1．交替修饰序列P92-si5的合成
表2中序列编号为P92-si5的小干扰核糖核酸的基础序列为：
正义链：5'- AAGAUCCUGCAUGUCUUCCAU-3'（SEQ ID NO. 1）
反义链：5'- AUGGAAGACAUGCAGGAUCUUGG-3'（SEQ ID NO. 13）
正义链奇数点位与反义链偶数点位均采用2'-F修饰，其它点位采用2'-OMe修饰。另外正义链5'端有两个硫代修饰；反义链5'与3'端各有两个硫代修饰。
仪器和试剂：擎科192 P型号DNA/RNA自动合成仪，其固相载体为交联聚苯乙烯珠的通用载体，型号为Primer support 5G Unylinker 350（cytiva厂家）。
制备方法：
依照单体浓度为0.15 M，用乙腈分别配制以下核苷酸单体溶液：DMT-A-OMe亚磷酰胺单体（式1）、DMT-C-OMe亚磷酰胺单体（式2）、DMT-G-OMe亚磷酰胺单体（式3）和DMT-U-OMe亚磷酰胺单体（式4）、DMT-A-F亚磷酰胺单体（式5）、DMT-C-F亚磷酰胺单体（式6）、DMT-G-F亚磷酰胺单体（式7）和DMT-U-F亚磷酰胺单体（式8）。
采用如下步骤制备：
（1）脱保护
使用3%二氯乙酸甲苯溶液作为脱保护试剂，脱掉DMT保护基，之后使用乙腈进行清洗。
（2）偶联
使用0.25 M 5-乙硫基四氮唑作为活化剂，对每个核苷酸单体的乙腈溶液进行偶联，之后使用乙腈进行冲洗。
（3）氧化/硫化
氧化：使用0.05 M碘的吡啶/水(90/10)溶液作为氧化剂，进行氧化，之后使用乙腈进行冲洗。
硫化：使用3%氢化黄原素的吡啶溶液作为硫化剂，进行硫化，之后使用乙腈进行冲洗。
（4）羟基保护
使用10%乙酸酐四氢呋喃溶液（CAP A）四氢呋喃/吡啶/氮甲基咪唑 74/10/16(v/v/v)（CAP B）为羟基保护试剂，进行羟基保护，之后使用乙腈进行冲洗。
重复以上操作，按照设定的序列循环进行，得到全保护的产物。
（5）使用3%二氯乙酸甲苯溶液为脱保护试剂，脱掉最后一个核苷酸的DMT保护基，之后使用乙腈进行清洗。
（6）氨解及纯化
将固相载体转移至反应器中，加入浓氨水（25-28%），在60℃保持氨解12 h后，体系降至室温，并将混合物转移至压滤罐中，用纯化水与乙醇的混合溶液进行淋洗，合并滤液，过层析柱，浓缩，冻干，得产品。
（7）退火
将纯化后的正义链及反义链按1: 1比例混合后，加热到95℃并保持3 min后，缓慢降温至室温，形成双链。
P92-si5纯度97.4%；实测分子量：14493.52
2．其它序列的合成
按照上述方法合成表2中所列其它各条序列。
实施例2：交替修饰序列对PCSK9基因的抑制作用
将实施例1中合成的2'-OMe与2'-F交替修饰siRNA序列通过脂质纳米颗粒（LNP）转染进入HELA细胞后，利用qPCR技术检测各序列对PCSK9基因的抑制作用。
1．实验材料
受试样品：表2中所列交替修饰小干扰核糖核酸序列P92-si1-84（实施例1中合成）。
细胞种类：海拉细胞系HELA细胞
药物溶媒：无菌无酶水、gibco Opti-MEM。
2．实验方法
采用qRT-PCR检测样品对HELA细胞系PCSK9基因mRNA表达的抑制情况。
2.1 细胞培养
取传代培养的HELA细胞株，将对数生长的细胞用10%胎牛血清RPMI 1640培养液（补充100×青、链霉素10 μL/mL），置于37℃含5% CO2的细胞培养箱中，每天换液一次。用0.25%胰酶消化传代，1000 r/min离心5 min后，弃上清液，加入新鲜培养基传代培养。
2.2 细胞转染
转染混合液配制：将Lipofectamine RNAiMAX和Opti-MEM按1.5:98.5比例混合后涡旋混匀。
转染试剂配制：按照1:1（v/v）的比例取60 μL Opti-MEM稀释的siRNA溶液加入60μL转染混合液，涡旋混匀后室温静置15 min，得到脂质纳米颗粒（LNP）。取12.5 μL用于包封率检测。
空白对照组转染试剂：在60μL Opti-MEM中加入制备好的转染混合液60 μL。涡旋混匀，室温静置15 min。
将配制好的转染试剂加入24孔细胞培养板中（每孔100 μL），使最终每孔siRNA浓度为1 nM。加入500 μL细胞悬液（每毫升含6×104个细胞）。使用十字法混匀后，放入37℃，5% CO2细胞培养箱，培养40 h。
2.3 PCSK9 mRNA检测
1）RNA抽提
a．吸去12孔板中的培养液，每孔加入0.5 mL 1 × PBS清洗细胞，吸去PBS。在孔中加入0.5 mL TRIzol试剂，枪头吹打细胞充分裂解，转移至1.5 mL无RNA酶的EP管中，室温静置5 min。
b．每管加入0.1 mL氯仿，剧烈振荡15 sec，室温静置5 min。4 ℃离心，12,000 ×g 15 min，取上清200 μL至新EP管中。
c．加入等体积异丙醇，将管中液体上下颠倒轻轻混匀，-20℃静置10 min，4 ℃ 离心，12,000 × g 15 min，弃上清。
d．加入0.5 mL 75% 乙醇，轻轻洗涤RNA沉淀，4 ℃ 12,000 × g离心5 min，吸去上清。重复漂洗一次，4 ℃ 12,000 × g 1 min，用微量枪头将残留乙醇去除干净。
e．室温晾干残留乙醇2-3 min，加入40 μL RNase-free ddH2O，溶解。
2）RNA浓度检测
使用nanodrop对RNA浓度进行检测。用2 μL RNase-free ddH2O作空白对照，每次用2 μL RNA样本进行检测。记录样本浓度。
3）PCSK9 mRNA定量检测
在15 mL离心管中，按7.5 × 84 = 630份加入除引物、模板之外的其余成分，标记为A。
标记好1.5 mL EP管（84个），按照每管7份加入A 77 μL和420 ng总RNA，混匀备用（标记为B）。
内参基因GAPDH和目的基因PCSK9的上下游引物混匀备用（标记为C）。
在PCR板每孔分别加入B 11 μL + C 1 μL。盖上封板膜，3000 rpm离心1 min，上机。
*本环节在冰上操作，保持低温条件。
将板放入qPCR仪，按照以下程序运行：
反转录：55℃，15 min；
预变性：95℃，30 sec；
循环反应：95℃，10 sec；60℃，35 sec；40个循环；
熔解曲线：95℃，15 sec；60℃，60 sec；95℃，15 sec。
运行时间约为2 h。分析实验结果，计算2-ΔΔCt。
2.4 数据处理
PCSK9 mRNA表达率（%）计算公式为：
表达率 =（PCSK9 mRNA表达量/空白对照组PCSK9 mRNA表达量）×100%；
PCSK9基因表达抑制率 = 1-表达率（%）。
3．实验结果
本实施例中抑制率为4次实验平均值，各序列对HELA细胞中PCSK9 mRNA的表达抑制率见表4-6。
实验结果表明，一些采用2'-OMe与2'-F交替修饰序列，包括P92-si5、P92-si51、P92-si81、P92-si82、P92-si84、P92-si3、P92-si8、P92-si9、P92-si21、P92-si31、P92-si73和P92-si83（具体序列见表3），对HELA细胞中PCSK9 mRNA的表达具有显著抑制作用，抑制率均超过50%。其中P92-si5、P92-si81、P92-si82、P92-si3、P92-si8和P92-si31抑制率超过了70%。
其它各序列对PCSK9 mRNA的表达抑制作用较差，抑制率均低于50%。
各序列对HELA细胞中PCSK9 mRNA的表达抑制率见表4-6。
（1）设计的84条序列中，有12条序列对PCSK9基因具有显著抑制作用，抑制率均超过50%，包括P92-si5、P92-si51、P92-si81、P92-si82、P92-si84、P92-si3、P92-si8、P92-si9、P92-si21、P92-si31、P92-si73和P92-si83。其中P92-si5、P92-si81、P92-si82、P92-si3、P92-si8和P92-si31的抑制率超过了70%。
表4 对PCSK9基因具有显著抑制作用（抑制率高于50%）的交替修饰序列
从表4中可以看出，交替修饰序列P92-si5、P92-si51、P92-si81、P92-si82、P92-si84、P92-si3、P92-si8、P92-si9、P92-si21、P92-si31、P92-si73和P92-si83（具体序列见表3），共12条序列，对PCSK9 mRNA的表达具有显著抑制作用，抑制率均在50%以上，其中P92-si5、P92-si81、P92-si82、P92-si3、P92-si8和P92-si31的抑制率超过了70%（图1）。这12条序列可作为候选序列。
（2）26条序列对PCSK9基因的抑制率在30%-50%。例如，P92-si6和P92-si7的抑制率分别为38.3%和35.7%。
表5中所列26条序列对PCSK9基因的抑制作用较差，抑制率均低于50%，在30%-50%之间。例如，P92-si6和P92-si7的抑制率分别为38.3%和35.7%（图2）。
（3）46条序列对PCSK9基因的抑制率在30%以下。例如，P92-si1和P92-si20的抑制率分别仅为9.2%和6.0%。
表6 对PCSK9基因抑制率在30%以下的交替修饰序列
表6中所列的46条序列，对PCSK9 mRNA的表达抑制作用很差，抑制率均低于30%。例如，P92-si1和P92-si20的抑制率分别仅为9.2%和6.0%（图3和图4）。
（4）序列相近的siRNA，活性差异非常大。例如P92-si5的抑制率比P92-si4提高了61.8%，显著提升。
一些序列相近的siRNA对PCSK9 mRNA的抑制作用对比见表7。
从表7中可以看出，一些序列相近的siRNA，对PCSK9 mRNA的表达抑制作用差异非常大。
基础序列4与基础序列5相比，仅末端1个碱基不同。正义链：基础序列4的5'末端多1个C，基础序列5的3'末端多1个U，其它序列完全相同；反义链：基础序列4的3'末端多1个U，基础序列5的5'末端多1个A，其它序列完全相同。但是交替修饰序列P92-si5的抑制率比P92-si4提高了61.8%，显著提升。
基础序列50与基础序列51相比，仅末端6个碱基不同。正义链：基础序列50的5'末端为GAUUAA，序列51的3'末端为CUGGAU，其它序列完全相同；反义链，基础序列50的3'末端为AAUCAG，基础序列51的5'末端为AUCCAG，其它序列完全相同。但是交替修饰序列P92-si51的抑制率比P92-si50提高了46.8%，显著提升。
基础序列2与基础序列3相比，仅末端6个碱基不同。正义链：基础序列2的5'末端为AUACCU，基础序列3的3'末端为UGUCUU，其它序列完全相同；反义链：基础序列2的3'末端为GUAUCC，基础序列3的5'末端为AAGACA，其它序列完全相同。但是交替修饰序列P92-si3的抑制率比P92-si2提高了45.9%，显著提升。
基础序列9与基础序列10相比，仅末端2个碱基不同。正义链：基础序列9的5'末端为GG，基础序列10的3'末端为AG，其它序列完全相同；反义链：基础序列9的3'末端为UA，基础序列10的5'末端为CU，其它序列完全相同。但是交替序列P92-si9的抑制率比序列P92-si10提高了53.1%，显著提升。
基础序列21与序列基础22相比，仅末端2个碱基不同。正义链：基础序列21的5'末端为CA，基础序列22的3'末端为GA，其它序列完全相同；反义链：基础序列21的3'末端为CA，基础序列22的5'末端为UC，其它序列完全相同。但是交替修饰序列P92-si21的抑制率比P92-si22提高了65.6%，显著提升。
基础序列30与基础序列31相比，仅末端1个碱基不同。正义链：基础序列30的5'末端为A，基础序列31的3'末端为G，其它序列完全相同；反义链：基础序列30的3'末端为G，基础序列31的5'末端为C，其它序列完全相同。但是交替修饰序列P92-si31的抑制率比P92-si30提高了39.4%，显著提升。
基础序列73与基础序列74相比，仅末端1个碱基不同。正义链：基础序列73的5'末端为G，基础序列74的3'末端为G，其它序列完全相同；反义链：基础序列73的3'末端为A，基础序列74的5'末端为C，其它序列完全相同。但是交替修饰序列P92-si73的抑制率比P92-si74提高了62.2%，显著提升。
因此，从针对PCSK9 mRNA序列设计的非常大量的寡核苷酸序列中筛选出具有显著抑制活性的序列并不容易，需要付出大量创造性劳动。
总结：
（1）设计的84条序列中，有12条序列对PCSK9基因具有显著抑制作用，抑制率均超过50%，包括P92-si5、P92-si51、P92-si81、P92-si82、P92-si84、P92-si3、P92-si8、P92-si9、P92-si21、P92-si31、P92-si73和P92-si83。其中P92-si5、P92-si81、P92-si82、P92-si3、P92-si8和P92-si31的抑制率超过了70%。
（2）26条序列对PCSK9基因的抑制率在30%-50%。例如，P92-si6和P92-si7的抑制率分别为38.3%和35.7%。
（3）46条序列对PCSK9基因的抑制率在30%以下。例如，P92-si1和P92-si20的抑制率分别仅为9.2%和6.0%。
（4）序列相近的siRNA，活性差异非常大。例如P92-si5的抑制率比P92-si4提高了61.8%，显著提升。因此，从针对PCSK9 mRNA序列设计的非常大量的寡核苷酸序列中筛选出具有显著抑制活性的序列并不容易，需要付出大量创造性劳动。
实施例3：无修饰序列对PCSK9基因的抑制作用
本实施例中合成一些实施例2中修饰序列对应的无修饰序列，并通过脂质纳米颗粒（LNP）转染进入HELA细胞，利用qPCR技术检测各无修饰序列对PCSK9基因的抑制作用，筛选出具有较好抑制效果的无修饰siRNA序列。
1．实验材料
受试样品：
表8中所列无修饰小干扰核糖核酸序列。所有序列按照实施例1中方法进行合成。
细胞种类：海拉细胞系HELA细胞
药物溶媒：无菌无酶水、gibco Opti-MEM。
2．实验方法
参照实施例2。
3．实验结果
各无修饰序列对PCSK9 mRNA表达抑制率见表9和表10。
无修饰序列si5、si51、si81、si82、si84、si3、si8、si9、si21、si31、si73和si83对HELA细胞中PCSK9 mRNA的表达具有显著抑制作用，抑制率均在50%以上，其中si5、si81、si82、si3和si8抑制率超过了60%。
（1）12条无修饰序列对PCSK9基因具有显著抑制作用，抑制率均超过50%，包括si5、si51、si81、si82、si84、si3、si8、si9、si21、si31、si73和si83。其中si5、si81、si82、si3和si8抑制超过了60%。
表9 对PCSK9基因具有显著抑制作用（抑制率高于50%）的无修饰序列
表9中所列各无修饰序列，包括si5、si51、si81、si82、si84、si3、si8、si9、si21、si31、si73和si83对PCSK9 mRNA的表达具有显著抑制作用，抑制率均在50%以上。其中si5、si81、si82、si3和si8抑制超过了60%（图5）。这12条序列可作为候选序列。
（2）其它无修饰序列对PCSK9基因的抑制率均低于40%。例如，si52和si74抑制率仅为0.5%和2.2%。
表10 对PCSK9基因抑制率低于40%的无修饰序列
表10中各序列对PCSK9 mRNA的表达抑制作用很差，抑制率均低于40%。例如si52和si74抑制率仅为0.5%和2.2%（图6）。
（3）序列相近的siRNA，活性差异非常大。例如基础序列5的抑制率比基础序列4提高了51.2%，显著提升。
一些序列相近的siRNA对PCSK9 mRNA的抑制作用对比见表11。
从表11中可以看出，一些序列相近的siRNA，对PCSK9 mRNA的表达抑制作用差异非常大。
基础序列4与基础序列5相比，仅末端1个碱基不同。正义链：基础序列4的5'末端多1个C，基础序列5的3'末端多1个U，其它序列完全相同；反义链：基础序列4的3'末端多1个U，基础序列5的5'末端多1个A，其它序列完全相同。但是基础序列5的抑制率比基础序列4提高了51.2%，显著提升。
基础序列50与基础序列51相比，仅末端6个碱基不同。正义链：基础序列50的5'末端为GAUUAA，基础序列51的3'末端为CUGGAU，其它序列完全相同；反义链，基础序列50的3'末端为AAUCAG，基础序列51的5'末端为AUCCAG，其它序列完全相同。但是基础序列51的抑制率比基础序列50提高了42.6%，显著提升。
基础序列2与基础序列3相比，仅末端6个碱基不同。正义链：基础序列2的5'末端为AUACCU，基础序列3的3'末端为UGUCUU，其它序列完全相同；反义链：基础序列2的3'末端为GUAUCC，基础序列3的5'末端为AAGACA，其它序列完全相同。但是基础序列3的抑制率比基础序列2提高了42.7%，显著提升。
基础序列9与基础序列10相比，仅末端2个碱基不同。正义链：基础序列9的5'末端为GG，基础序列10的3'末端为AG，其它序列完全相同；反义链：基础序列9的3'末端为UA，基础序列10的5'末端为CU，其它序列完全相同。但是基础序列9的抑制率比基础序列10提高了41.2%，显著提升。
基础序列21与基础序列22相比，仅末端2个碱基不同。正义链：基础序列21的5'末端为CA，基础序列22的3'末端为GA，其它序列完全相同；反义链：基础序列21的3'末端为CA，基础序列22的5'末端为UC，其它序列完全相同。但是基础序列21的抑制率比基础序列22提高了53.2%，显著提升。
基础序列30与基础序列31相比，仅末端1个碱基不同。正义链：基础序列30的5'末端为A，基础序列31的3'末端为G，其它序列完全相同；反义链：基础序列30的3'末端为G，基础序列31的5'末端为C，其它序列完全相同。但是基础序列31的抑制率比基础序列30提高了32.5%，显著提升。
基础序列73与基础序列74相比，仅末端1个碱基不同。正义链：基础序列73的5'末端为G，基础序列74的3'末端为G，其它序列完全相同；反义链：基础序列73的3'末端为A，基础序列74的5'末端为C，其它序列完全相同。但是基础序列73的抑制率比基础序列74提高了50.2%，显著提升。
因此，从针对PCSK9 mRNA序列设计的非常大量的寡核苷酸序列中筛选出具有显著抑制活性的序列并不容易，需要付出大量创造性劳动。
（4）不同序列经过交替修饰后，对活性影响并不一致。有的抑制率显著提升，例如基础序列5，交替修饰比无修饰序列抑制率提高了12.4%；有的不明显，例如基础序列4、22和52，交替修饰序列和无修饰序列抑制率基本无变化。
表12 交替修饰序列与无修饰序列对PCSK9基因的抑制率比较
从表12可以看出，不同序列经过交替修饰，对PCSK9 mRNA抑制率的影响不一致。有的显著提升，例如基础序列5交替修饰比无修饰序列抑制率提高了12.4%，基础序列82交替修饰比无修饰序列抑制率提高了12.2%；有的不明显，例如基础序列4、22和52，交替修饰序列和无修饰序列抑制率基本无变化。
因此，不是所有的无修饰序列经过交替修饰都能使活性提高，交替修饰对不同序列的活性影响并不一致。
总结：
（1）12条无修饰序列对PCSK9基因具有显著抑制作用，抑制率均超过50%，包括si5、si51、si81、si82、si84、si3、si8、si9、si21、si31、si73和si83。其中si5、si81、si82、si3和si8抑制超过了60%。
（2）其它无修饰序列对PCSK9基因的抑制率低于40%。例如，si52和si74抑制率仅为0.5%和2.2%。
（3）序列相近的siRNA，活性差异非常大。例如基础序列5的抑制率比基础序列4提高了51.2%，显著提升。
（4）不同序列经过交替修饰后，对活性影响并不一致。有的抑制率显著提升，例如基础序列5，交替修饰比无修饰序列抑制率提高了12.4%；有的不明显，例如基础序列4、22和52，交替修饰序列和无修饰序列抑制率基本无变化。
实施例4：采用模板修饰的序列对PCSK9基因的抑制作用
本实施例通过将实施例3中筛选出的序列，即无修饰序列si5、si51、si81、si82、si84、si3、si8、si9、si21、si31、si73和si83，共12条序列，采用修饰模板进行修饰。其中DV25、DV26、DV27、DV28、DV29、DV30和DV310是本公开设计的新修饰模板，DV21和DV22是已公开的Advanced ESC修饰模板。
1．实验材料
受试样品：
表13中所列采用不同模板（DV25、DV26、DV27、DV28、DV29、DV30、DV31、DV21和DV22）修饰的实施例3中序列si5、si51、si81、si82、si84、si3、si8、si9、si21、si31、si73和si83，以及这些序列对应的交替修饰序列P92-si5、P92-si51、P92-si81、P92-si82、P92-si84、P92-si3、P92-si8、P92-si9、P92-si21、P92-si31、P92-si73和P92-si83（实施例1中合成）。
本公开修饰模板修饰原则如下：
2．实验方法
采用qRT-PCR检测受试样品对HEP3B细胞系PCSK9基因mRNA表达的抑制情况。Hep3B细胞，由上海药明康德新药开发有限公司提供(ATCC-tings-1618164)。
2.1 细胞培养
取传代培养的HEP3B细胞株，将对数生长的细胞用10%胎牛血清RPMI 1640培养液（补充青、链霉素各100 μL/mL），置于37℃含5% CO2的细胞培养箱中，每天换液一次。用0.25%胰酶消化传代，1000 r/min离心5 min后，弃上清液，加入新鲜培养基传代培养。
2.2 细胞转染
转染混合液配制：将Lipofectamine RNAiMAX和Opti-MEM按1.5:98.5比例混合后涡旋混匀。
转染试剂配制：按照1:1（v/v）的比例取60 μL Opti-MEM稀释的siRNA溶液加入60μL转染混合液，涡旋混匀后室温静置15 min，得到脂质纳米颗粒（LNP）。取12.5 μL用于包封率检测。
空白对照组转染试剂：在60μL Opti-MEM中加入制备好的转染混合液60 μL。涡旋混匀，室温静置15 min。
将配制好的转染试剂加入24孔细胞培养板中（每孔100 μL），使最终每孔siRNA浓度为0.05 nM。加入500 μL细胞悬液（每毫升含6×104个细胞）。使用十字法混匀后，放入37℃，5% CO2细胞培养箱，培养40 h。
2.3 PCSK9 mRNA检测
步骤同实施例2中的“2.3 PCSK9 mRNA检测”。
2.4 数据处理
PCSK9 mRNA表达率（%）计算公式为：
表达率 =（PCSK9 mRNA表达量/空白对照组PCSK9 mRNA表达量）×100%；
PCSK9基因表达抑制率 = 1-表达率（%）。
2.5 EC50实验
本实验中各序列EC50实验的siRNA浓度选择从0.2 nM起始，4倍稀释，共8个浓度点（0.2 nM、0.05 nM、0.0125 nM、3.13 pM、0.78 pM、0.2 pM、0.05 pM和0.01 pM），并对各浓度下各序列的抑制率进行测定，并绘图，计算各序列EC50浓度。
3．实验结果
经过3次重复实验，各修饰序列对Hep3B细胞PCSK9基因的抑制率见表14-25。
活性检测实验结果表明，12条候选序列（无修饰序列si5、si51、si81、si82、si84、si3、si8、si9、si21、si31、si73和si83）采用本公开设计的修饰模板DV25-29进行修饰，对PCSK9基因具有显著抑制作用，抑制率均在70%以上。其中P92-si81-DV26、P92-si82-DV27和P92-si82-DV29抑制率达到了89.3%、89.3%和89.1%。
采用本公开修饰模板DV25-29修饰序列，与交替修饰序列相比，对PCSK9基因表达的抑制率显著提升。例如，基础序列51采用模板DV27修饰序列P92-si51-DV27抑制率比交替修饰序列提高了29.1%，基础序列81采用模板DV26修饰序列P92-si81-DV26抑制率比交替修饰序列提高了26.9%。
并且，同一siRNA序列采用不同修饰模板进行修饰后，活性差异非常大。例如，基础序列51采用本公开修饰模板DV27修饰序列，与采用本公开修饰模板DV31修饰序列相比，抑制率提高22.8%；与采用已公开Advanced ESC模板DV21修饰序列相比，抑制率提高21.3%。
EC50实验表明，采用本公开设计修饰模板修饰的序列，EC50值在0.0001-0.005nM。例如P92-si81-DV27、P92-si84-DV26和P92-si82-DV27的EC50值分别为0.0003 nM、0.0004 nM和0.0006 nM。这些序列在低浓度下即可有效抑制PCSK9基因的表达。
（i）各基础序列采用模板修饰后对PCSK9基因抑制作用
（1）基础序列5
表14 基础序列5采用模板修饰后对PCSK9基因抑制率
I．本公开DV25-29模板
基础序列5采用本公开设计的修饰模板DV25-29修饰，对PCSK9基因的抑制率均超过了80%，与2'位甲氧基和2'位氟代交替修饰相比，对PCSK9基因的抑制率显著提升。例如采用模板DV26和DV27修饰后，P92-si5-DV26和P92-si5-DV27抑制率分别提高了19.5%和16.6%（图7）。
II．本公开其它修饰模板
基础序列5采用模板DV30和DV31修饰后，P92-si5-DV30和P92-si5-DV31对PCSK9基因的抑制率分别为65.3%和62.4%，比对应的交替修饰序列分别降低了0.1%和3.0%。
采用本公开修饰模板DV26和DV27修饰序列，P92-si5-DV26和P92-si5-DV27抑制率分别比P92-si5-DV30提高了19.6%和16.7%，比P92-si5-DV31提高了22.5%和19.6%，显著提升。
III．现有技术已公开Advanced ESC模板DV21（氟代位点：反义链2、6、14和16位，正义链7、9、10、11、16和17）和DV22（氟代位点：反义链2、6、14和16位，正义链7、9、10和11位）
基础序列5采用模板DV21和DV22修饰后，P92-si5-DV21和P92-si5-DV22对PCSK9基因的抑制率分别为68.2%和69.1%，分别比交替修饰序列提高了2.8%和3.7%。
采用本公开修饰模板DV26和DV27修饰序列，P92-si5-DV26和P92-si5-DV27抑制率分别比P92-si5-DV21提高了16.7%和13.8%，比P92-si5-DV22提高了15.8%和12.9%，显著提升。
由此可知：
1）基础序列5采用本公开修饰模板DV25-29修饰序列，与交替修饰序列相比，对PCSK9基因抑制作用显著提升。例如，基础序列5采用DV26修饰序列，抑制率比交替修饰序列提高19.5%。
2）同一siRNA序列采用不同修饰模板进行修饰后，活性差异非常大。例如，基础序列5采用本公开修饰模板DV26和DV27修饰序列，与采用本公开修饰模板DV30和DV31修饰序列相比，抑制率最多可提高22.5%，显著提升；与采用已公开Advanced ESC模板DV21和DV22修饰序列相比，抑制率最多可提高16.7%，显著提升。
3）不同模板修饰的siRNA序列活性差异巨大，最多可相差20%。由此可知，siRNA序列采用哪种模板修饰能具有高活性是不确定的。
（2）基础序列51
表15 基础序列51采用模板修饰后对PCSK9基因抑制率
I．本公开DV25-29模板
基础序列51采用本公开设计的模板DV25-29修饰后，对PCSK9基因的抑制率均超过了75%，与采用2'位甲氧基和2'位氟代交替修饰相比，对PCSK9基因的抑制率均显著提升。例如采用模板DV26和DV27修饰后，P92-si51-DV26和P92-si51-DV27抑制率分别提高了27.7%和29.1%。
II．本公开其它修饰模板
基础序列51采用模板DV30和DV31修饰后，P92-si51-DV30和P92-si51-DV31对PCSK9基因的抑制率分别为63.5%和62.8%，比对应的交替修饰序列分别仅提高7.0%和6.3%。
采用本公开修饰模板DV26和DV27修饰序列，P92-si51-DV26和P92-si51-DV27抑制率分别比P92-si51-DV30提高了20.7%和22.1%，比P92-si51-DV31提高了21.4%和22.8%，显著提升。
III．现有技术已公开Advanced ESC模板DV21（氟代位点：反义链2、6、14和16位，正义链7、9、10、11、16和17）和DV22（氟代位点：反义链2、6、14和16位，正义链7、9、10和11位）
基础序列51采用已公开Advanced ESC模板DV21和DV22修饰后，P92-si51-DV21和P92-si51-DV22对PCSK9基因的抑制率分别为64.3%和65.1%，分别比交替修饰序列提高7.8%和8.6%。
采用本公开修饰模板DV26和DV27修饰序列，P92-si51-DV26和P92-si51-DV27抑制率分别比P92-si51-DV21提高了19.9%和21.3%，比P92-si5-DV22提高了19.1%和20.5%，显著提升。
由此可知：
1）基础序列51采用本公开修饰模板DV25-29修饰序列，与交替修饰序列相比，对PCSK9基因抑制作用显著提升。例如，基础序列51采用DV27修饰序列，抑制率比交替修饰序列提高29.1%。
2）同一siRNA序列采用不同修饰模板进行修饰后，活性差异非常大。例如，基础序列51采用本公开修饰模板DV26和DV27修饰序列，与采用本公开修饰模板DV30和DV31修饰序列相比，抑制率最多可提高22.8%，显著提升；与采用已公开Advanced ESC模板DV21和DV22修饰序列相比，抑制率最多可提高21.3%，显著提升。
3）不同模板修饰的siRNA序列活性差异巨大，最多可相差20%。由此可知，siRNA序列采用哪种模板修饰能具有高活性是不确定的。
（3）基础序列81
表16 基础序列81采用模板修饰后对PCSK9基因抑制率
I．采用本公开DV25-29模板修饰
基础序列81采用本公开设计的模板DV25-29修饰，对PCSK9基因的抑制率均超过了80%，与2'位甲氧基和2'位氟代交替修饰相比，对PCSK9基因的抑制率均显著提升。例如采用模板DV26和DV27修饰后，P92-si81-DV26和P92-si81-DV27抑制率分别提高了26.9%和24.7%。
II．本公开其它修饰模板
基础序列81采用模板DV30和DV31修饰后，P92-si81-DV30和P92-si81-DV31对PCSK9基因的抑制率分别为71.6%和73.5%，比对应的交替修饰序列分别提高了9.2%和11.1%。
采用本公开修饰模板DV26和DV27修饰序列，P92-si81-DV26和P92-si81-DV27抑制率分别比P92-si81-DV30提高了17.7%和15.5%，比P92-si81-DV31提高了15.8%和13.6%，显著提升。
III．现有技术已公开Advanced ESC模板DV21（氟代位点：反义链2、6、14和16位，正义链7、9、10、11、16和17）和DV22（氟代位点：反义链2、6、14和16位，正义链7、9、10和11位）
基础序列81采用模板DV21和DV22修饰后，P92-si81-DV21和P92-si81-DV22对PCSK9基因的抑制率分别为78.3%和75.1%，分别比交替修饰序列提高了15.9%和12.7%。
采用本公开修饰模板DV26和DV27修饰序列，P92-si81-DV26和P92-si81-DV27抑制率分别比P92-si81-DV21提高了11.0%和8.8%，比P92-si81-DV22提高了14.2%和12.0%，显著提升。
由此可知：
1）基础序列81采用本公开修饰模板DV25-29修饰序列，与交替修饰序列相比，对PCSK9基因抑制作用显著提升。例如，基础序列81采用DV26修饰序列，抑制率比交替修饰序列提高26.9%。
2）同一siRNA序列采用不同修饰模板进行修饰后，活性差异非常大。例如，基础序列81采用本公开修饰模板DV26和DV27修饰序列，与采用本公开修饰模板DV30和DV31修饰序列相比，抑制率最多可提高17.7%，显著提升；与采用已公开Advanced ESC模板DV21和DV22修饰序列相比，抑制率最多可提高14.2%，显著提升。
3）不同模板修饰的siRNA序列活性差异巨大，最多可相差近20%。由此可知，siRNA序列采用哪种模板修饰能具有高活性是不确定的。
（4）基础序列82
表17 基础序列82采用模板修饰后对PCSK9基因抑制率
I．本公开DV25-29模板
基础序列82采用本公开设计的修饰模板DV25-29修饰，对PCSK9基因的抑制率均超过了80%，与2'位甲氧基和2'位氟代交替修饰相比，对PCSK9基因的抑制率均显著提升。例如采用模板DV27和DV29修饰后，P92-si82-DV27和P92-si82-DV29抑制率分别提高了19.6%和19.4%。
II．本公开其它修饰模板
基础序列82采用模板DV30和DV31修饰后，P92-si82-DV30和P92-si82-DV31对PCSK9基因的抑制率分别为70.2%和69.7%，与对应的交替修饰序列相当。
采用本公开修饰模板DV27和DV29修饰序列，P92-si82-DV27和P92-si82-DV29抑制率分别比P92-si82-DV30提高了19.1%和18.9%，比P92-si82-DV31提高了19.6%和19.4%，显著提升。
III．现有技术已公开Advanced ESC模板DV21（氟代位点：反义链2、6、14和16位，正义链7、9、10、11、16和17）和DV22（氟代位点：反义链2、6、14和16位，正义链7、9、10和11位）
基础序列82采用模板DV21和DV22修饰后，P92-si82-DV21和P92-si82-DV22对PCSK9基因的抑制率分别为76.5%和75.4%，分别比交替修饰序列提高了6.8%和5.7%。
采用本公开修饰模板DV27和DV29修饰序列，P92-si82-DV27和P92-si82-DV29抑制率分别比P92-si82-DV21提高了12.8%和12.6%，比P92-si82-DV22提高了13.9%和13.7%，显著提升。
由此可知：
1）基础序列82采用本公开修饰模板DV25-29修饰序列，与交替修饰序列相比，对PCSK9基因抑制作用显著提升。例如，基础序列82采用DV27修饰序列，抑制率比交替修饰序列提高19.6%。
2）同一siRNA序列采用不同修饰模板进行修饰后，活性差异非常大。例如，基础序列82采用本公开修饰模板DV27和DV29修饰序列，与采用本公开修饰模板DV30和DV31修饰序列相比，抑制率最多可提高19.6%，显著提升；与采用已公开Advanced ESC模板DV21和DV22修饰序列相比，抑制率最多可提高13.9%，显著提升。
3）不同模板修饰的siRNA序列活性差异巨大，最多可相差近20%。由此可知，siRNA序列采用哪种模板修饰能具有高活性是不确定的。
（5）基础序列84
表18 基础序列84采用模板修饰后对PCSK9基因抑制率
I．本公开DV25-29模板
基础序列84采用本公开设计的修饰模板DV25-29修饰，对PCSK9基因的抑制率均超过了85%，与2'位甲氧基和2'位氟代交替修饰相比，对PCSK9基因的抑制率均显著提升。例如采用模板DV28和DV29修饰后，P92-si84-DV28和P92-si84-DV29抑制率分别提高了26.8%和25.9%。
II．本公开其它修饰模板
基础序列84采用模板DV30和DV31修饰后，P92-si84-DV30和P92-si84-DV31对PCSK9基因的抑制率分别为70.3%和72.4%，比对应的交替修饰序列分别提高了8.7%和10.8%。
采用本公开修饰模板DV28和DV29修饰序列，P92-si84-DV28和P92-si84-DV29抑制率分别比P92-si84-DV30提高了18.1%和17.2%，比P92-si84-DV31提高了16.0%和15.1%，显著提升。
III．现有技术已公开Advanced ESC模板DV21（氟代位点：反义链2、6、14和16位，正义链7、9、10、11、16和17）和DV22（氟代位点：反义链2、6、14和16位，正义链7、9、10和11位）
基础序列84采用模板DV21和DV22修饰后，P92-si84-DV21和P92-si84-DV22对PCSK9基因的抑制率分别为77.7%和75.1%，分别比交替修饰序列提高了16.1%和13.5%。
采用本公开修饰模板DV28和DV29修饰序列，P92-si84-DV28和P92-si84-DV29抑制率分别比P92-si84-DV21提高了10.7%和9.8%，比P92-si84-DV22提高了13.3%和12.4%，显著提升。
由此可知：
1）基础序列84采用本公开修饰模板DV25-29修饰序列，与交替修饰序列相比，对PCSK9基因抑制作用显著提升。例如，基础序列84采用DV28修饰序列，抑制率比交替修饰序列提高26.8%。
2）同一siRNA序列采用不同修饰模板进行修饰后，活性差异非常大。例如，基础序列84采用本公开修饰模板DV28和DV29修饰序列，与采用本公开修饰模板DV30和DV31修饰序列相比，抑制率最多可提高18.1%，显著提升；与采用已公开Advanced ESC模板DV21和DV22修饰序列相比，抑制率最多可提高13.3%，显著提升。
3）不同模板修饰的siRNA序列活性差异巨大，最多可相差近20%。由此可知，siRNA序列采用哪种模板修饰能具有高活性是不确定的。
（6）基础序列3
表19 基础序列3采用模板修饰后对PCSK9基因抑制率
1）基础序列3采用本公开设计的修饰模板DV25-29修饰，对PCSK9基因的抑制率均超过了75%，与2'位甲氧基和2'位氟代交替修饰相比，对PCSK9基因的抑制率均显著提升。例如采用模板DV28和DV29修饰后，P92-si3-DV28和P92-si3-DV29抑制率分别提高了24.0%和24.7%。
2）由此可知，基础序列3采用本公开修饰模板DV25-29修饰序列，与采用交替修饰相比，对PCSK9基因的抑制活性显著提升。
（7）基础序列8
表20 基础序列8采用模板修饰后对PCSK9基因抑制率
1）基础序列8采用本公开设计的修饰模板DV25-29修饰，对PCSK9基因的抑制率均超过了75%，与2'位甲氧基和2'位氟代交替修饰相比，对PCSK9基因的抑制率均显著提升。例如采用模板DV27和DV28修饰后，P92-si8-DV27和P92-si8-DV28抑制率分别提高了19.7%和20.2%。
2）由此可知，基础序列8采用本公开修饰模板DV25-29修饰序列，与采用交替修饰相比，对PCSK9基因的抑制活性显著提升。
（8）基础序列9
表21 基础序列9采用模板修饰后对PCSK9基因抑制率
1）基础序列9采用本公开设计的修饰模板DV25-29修饰，对PCSK9基因的抑制率均超过了70%，与2'位甲氧基和2'位氟代交替修饰相比，对PCSK9基因的抑制率均显著提升。例如采用模板DV27和DV28修饰后，P92-si9-DV27和P92-si9-DV28抑制率分别提高了27.2%和25.4%。
2）由此可知，基础序列9采用本公开修饰模板DV25-29修饰序列，与采用交替修饰相比，对PCSK9基因的抑制活性显著提升。
（9）基础序列21
表22 基础序列21采用模板修饰后对PCSK9基因抑制率
1）基础序列21采用本公开设计的修饰模板DV25-29修饰，对PCSK9基因的抑制率均超过了70%，与2'位甲氧基和2'位氟代交替修饰相比，对PCSK9基因的抑制率均显著提升。例如采用模板DV25和DV26修饰后，P92-si21-DV25和P92-si21-DV26抑制率分别提高了24.4%和26.5%。
2）由此可知，基础序列21采用本公开修饰模板DV25-29修饰序列，与采用交替修饰相比，对PCSK9基因的抑制活性显著提升。
（10）基础序列31
表23 基础序列31采用模板修饰后对PCSK9基因抑制率
1）基础序列31采用本公开设计的修饰模板DV25-29修饰，对PCSK9基因的抑制率均超过了70%，与2'位甲氧基和2'位氟代交替修饰相比，对PCSK9基因的抑制率均显著提升。例如采用模板DV25和DV26修饰后，P92-si31-DV25和P92-si31-DV26抑制率分别提高了22.9%和22.6%。
2）由此可知，基础序列31采用本公开修饰模板DV25-29修饰序列，与采用交替修饰相比，对PCSK9基因的抑制活性显著提升。
（11）基础序列73
表24 基础序列73采用模板修饰后对PCSK9基因抑制率
1）基础序列73采用本公开设计的修饰模板DV25-29修饰，对PCSK9基因的抑制率均超过了70%，与2'位甲氧基和2'位氟代交替修饰相比，对PCSK9基因的抑制率均显著提升。例如采用模板DV28和DV29修饰后，P92-si73-DV28和P92-si73-DV29抑制率分别提高了30.6%和32.7%。
2）由此可知，基础序列73采用本公开修饰模板DV25-29修饰序列，与采用交替修饰相比，对PCSK9基因的抑制活性显著提升。
（12）基础序列83
表25 基础序列83采用模板修饰后对PCSK9基因抑制率
1）基础序列83采用本公开设计的修饰模板DV25-29修饰，对PCSK9基因的抑制率均超过了75%，与2'位甲氧基和2'位氟代交替修饰相比，对PCSK9基因的抑制率均显著提升。例如采用模板DV27和DV29修饰后，P92-si83-DV27和P92-si83-DV29抑制率分别提高了30.9%和29.7%。
2）由此可知，基础序列83采用本公开修饰模板DV25-29修饰序列，与采用交替修饰相比，对PCSK9基因的抑制活性显著提升。
总结：
（1）筛选出的基础序列5、51、81、82、84、3、8、9、21、31、73和83，采用本公开设计的修饰模板DV25-29修饰后，对PCSK9基因表达具有显著抑制作用，抑制率均在70%以上。其中P92-si81-DV26、P92-si82-DV27和P92-si82-DV29抑制率达到了89.3%、89.3%和89.1%。
（2）上述12条序列采用本公开修饰模板DV25-29修饰序列，与交替修饰序列相比，对PCSK9基因表达的抑制率显著提升。例如，基础序列51采用模板DV27修饰序列P92-si51-DV27抑制率比交替修饰序列提高了29.1%，基础序列81采用模板DV26修饰序列P92-si81-DV26抑制率比交替修饰序列提高了26.9%。
（3）相同序列采用本公开修饰模板DV25-29修饰，与采用现有技术公开的修饰模板相比，对PCSK9基因表达的抑制率显著提升。例如，基础序列51采用本公开修饰模板DV27修饰序列，与采用已公开Advanced ESC模板DV21修饰序列相比，抑制率提高21.3%。
（4）相同序列采用本公开修饰模板DV25-29修饰，与采用本公开其它修饰模板DV30和DV31相比，对PCSK9基因表达的抑制率显著提升。例如，基础序列51采用本公开修饰模板DV27修饰序列，与采用本公开修饰模板DV31修饰序列相比，抑制率提高22.8%。
（5）不同模板修饰序列活性差异巨大，例如，基础序列5采用DV26修饰，比采用DV31修饰抑制率提高了22.5%；基础序列51采用DV27修饰，比采用DV22修饰抑制率提高了20.5%。由此可知，siRNA序列采用哪一种修饰模板进行修饰能够具有高活性是不确定的。
（ii）EC50实验
挑选了一些模板修饰序列，包括P92-si5-DV26、P92-si51-DV25、P92-si81-DV27、P92-si82-DV27、P92-si84-DV26、P92-si3-DV28、P92-si8-DV29、P92-si9-DV28、P92-si21-DV25、P92-si31-DV27、P92-si73-DV28和P92-si83-DV26，共12条序列，开展EC50实验，测定各序列的EC50浓度。实验结果见表26。
表26 各修饰序列EC50实验结果
从表26中可以看出，这12条序列的EC50值在0.0001 nM至0.005 nM之间。其中P92-si81-DV27、P92-si84-DV26和P92-si82-DV27的EC50值分别为0.0003 nM、0.0004 nM和0.0006 nM。表明在低浓度下，这些序列即可有效抑制PCSK9基因表达。
实施例5：与现有技术公开序列对PCSK9基因抑制作用对比
本实施例将现有技术公开的与本公开基础序列3、5、8、9、31、81、82、83和84相同或相近的无修饰序列，与本公开交替修饰序列和采用DV25-29模板修饰的序列，对PCSK9基因的抑制效率进行对比。
1．实验材料
受试样品：
（1）现有技术公开序列
细胞种类：Hep3B细胞，由上海药明康德新药开发有限公司提供(ATCC-tings-1618164)。
Hep3B细胞在含10%胎牛血清（FBS，ExCell Bio-FSP500）、1%青霉素-链霉素（HyClone-SV30010）、1%非必需氨基酸溶液（Gibco-11140-050）、1% GlutaMAX补充液（Gibco-35050-061）的EMEM培养基（ATCC-30-2003）中培养。
药物溶媒：无菌无酶水、gibco DMEM。
2．实验方法
采用qRT-PCR检测测受试样品对HEP3B细胞系PCSK9基因mRNA表达的抑制情况。
2.1 细胞培养
取传代培养的Hep3B细胞株，将对数生长的细胞用10%胎牛血清RPMI 1640培养液（补充青、链霉素各100 μL/mL），置于37℃含5% CO2的细胞培养箱中，每天换液一次。用0.25%胰酶消化传代，1000 r/min离心5 min后，弃上清液，加入新鲜培养基传代培养。
2.2 细胞转染
按照1:0.06（wt/wt）取 2 μL siRNA（1 μg/μL）加入18 μL无菌无酶水，混匀，再加入制备好的LNP 22 μL。混匀，室温静置15 min。取12.5 μL用于包封率检测，最终每孔转染量=（1 μg理论上样量/siRNA纯度）/载药浓度，最终siRNA浓度为0.05 nM。
阴性对照组：20 μL无菌无酶水中加入制备好的LNP 22 μL。混匀，室温静置15 min。
使用十字法混匀后，放入37℃，5% CO2细胞培养箱，培养40 h。
2.3 PCSK9 mRNA检测
1）RNA抽提
步骤同实施例2中的“2.3 PCSK9 mRNA检测”中的“1）RNA抽提”。
2）RNA浓度检测
步骤同实施例2中的“2.3 PCSK9 mRNA检测”中的“2）RNA浓度检测”。
3）PCSK9 mRNA定量检测
在15 mL离心管中，按7.5×48=360份加入除引物、模板之外的其余成分，标记为A。
标记好1.5mL EP管，按照每管7份加入A 77 μL和420 ng总RNA，混匀备用。
内参基因GAPDH和目的基因PCSK9的上下游引物混匀备用。
在PCR板上每孔分别加入B 11 μL+C 1 μL。盖上封板膜，3000 rpm离心1 min，上机。
*本环节在冰上操作，保持低温条件。
将板放入qPCR仪，按照以下程序运行：
反转录：55℃，15 min；
预变性：95℃，30 sec；
循环反应：95℃，10 sec；60℃，35 sec；40个循环；
熔解曲线：95℃，15 sec；60℃，60 sec；95℃，15 sec。
运行时间约为2h。分析实验结果，计算2-ΔΔCt。
2.4 数据处理
PCSK9 mRNA表达率（%）计算公式为：
表达率= (实验组PCSK9 mRNA表达量/空白对照组PCSK9 mRNA表达量) × 100%；
PCSK9基因表达抑制率=1-表达率（%）。
3．实验结果
具体实验结果见表29和表30。
实验结果表明，本公开中交替修饰序列和采用特定修饰模板修饰的序列，与现有技术中公开相同或相近的无修饰序列相比，对PCSK9抑制活性显著提升。例如，完全相同的无修饰序列si84抑制率为38.6%，交替修饰后抑制率为61.6%，比无修饰序列si84提高了23.0%，采用本公开修饰模板DV26修饰后，抑制率达到了86.8%，比无修饰序列提高了48.2%。
现有技术公开序列31P与本公开序列si31相比，仅是反义链3'末端少2个碱基UG，其它完全相同，但本公开无修饰序列si31抑制率比31P提高了10.4%，交替修饰序列抑制率为59.5%，比31P提高了21.2%，采用本公开修饰模板DV26修饰后，抑制率达到了80.2%，比31P提高了41.9%。
（1）与现有技术公开完全相同的无修饰序列相比，本公开交替修饰序列和采用特定修饰模板修饰序列，对PCSK9基因抑制率显著提升，最多可提高40%。
与现有技术公开的完全相同的序列相比，本公开中交替修饰序列和采用特定修饰模板修饰的序列，对PCSK9基因抑制率显著提升。例如，无修饰序列si84的抑制率为38.6%，交替修饰后抑制率为61.6%，比无修饰序列si84提高了23.0%，采用本公开修饰模板DV26修饰后，抑制率达到了86.8%，比无修饰序列提高了48.2 %。
表29 现有技术完全相同序列对PCSK9基因抑制率
表29中现有技术公开的无修饰序列si81、si84、si3、si8、si9和si83，与本公开序列完全相同，采用交替修饰和本公开修饰模板修饰后，对PCSK9抑制作用显著提升。例如，无修饰序列si84的抑制率为38.6%，交替修饰后，P92-si84抑制率为61.6%，比无修饰序列si84提高了23.0%，采用本公开修饰模板DV25-29修饰后，P92-si84-DV25、P92-si84-DV26、P92-si84-DV27、P92-si84-DV28和P92-si84-DV29抑制率分别达到了84.9%、86.8%、84.5%、86.2%和86.4%，均比无修饰序列si84提高了40%以上。
（2）与现有技术公开的仅有很小差异的无修饰序列相比，本公开无修饰序列、交替修饰序列和采用特定修饰模板修饰的序列，对PCSK9基因抑制率显著提升，最多可提高40%。
与现有技术公开的仅有很小差异的序列相比，本公开中无修饰序列、交替修饰序列和采用特定修饰模板修饰的序列，对PCSK9基因抑制率显著提升。例如，无修饰序列31P的抑制率为38.3%，本公开序列相近的无修饰序列si31抑制率为48.7%，比31P提高了10.4%，交替修饰序列抑制率为59.5%，比31P提高了21.2%，采用本公开修饰模板DV26修饰后，抑制率达到了80.2%，比31P提高了41.9%。
I．序列对比
表30中现有技术公开序列5P、31P和82P与本公开序列si5、si31和si82的序列非常接近，仅有很小差异，具体对比见下表：
表31 现有技术公开序列与本公开序列对比
表31中可以看出，现有技术公开序列5P与本公开序列si5相比，仅是反义链3'末端少2个碱基GG；序列31P与本公开序列si31相比，仅是反义链3'末端少2个碱基UG；序列82P与本公开序列si82相比，仅是反义链3'末端少2个碱基AA，其它序列完全相同。
II．活性比较
1）本公开中无修饰序列与现有技术公开相近无修饰序列相比，活性显著提升。例如，本公开无修饰序列si31比结构相近的31P相比，抑制率提高了10.4%。
本公开中无修饰序列si5对PCSK9基因抑制率为50.1%，比现有技术公开相近的序列5P（抑制率为41.8%）提高了8.3%，显著提升。
本公开中无修饰序列si82对PCSK9基因抑制率为53.8%，比现有技术公开相近的序列82P（抑制率为46.7%）提高了7.1%，显著提升。
本公开中无修饰序列si31对PCSK9基因抑制率为48.7%，比现有技术公开相近的序列31P（抑制率为38.3%）提高了10.4%，显著提升。
2）本公开中交替修饰序列与现有技术公开相近无修饰序列相比，活性显著提升。例如，与序列5P相比，本公开交替修饰序列P92-si5抑制率提高了22.0%。
本公开基础序列5采用交替修饰后，P92-si5对PCSK9基因抑制率为63.8%，比现有技术公开无修饰序列5P提高了22.0%，显著提升。
本公开基础序列82采用交替修饰后，P92-si82对PCSK9基因抑制率为68.3%，比现有技术公开无修饰序列82P提高了21.6%，显著提升。
本公开基础序列31采用交替修饰后，P92-si31对PCSK9基因抑制率为59.5%，比现有技术公开无修饰序列31P提高了21.2%，显著提升。
3）采用本公开修饰模板修饰的序列与现有技术公开相近无修饰序列相比，活性显著提升。例如，与序列82P相比，本公开交替修饰序列P92-si82-DV29抑制率提高了42.8%。
本公开基础序列5采用修饰模板25-29修饰后，与现有技术公开无修饰序列5P相比，抑制率均可提高30%以上。例如，P92-si5-DV27提高了40.8%，显著提升。
本公开基础序列82采用修饰模板25-29修饰后，与现有技术公开无修饰序列82P相比，抑制率均可提高30%以上。例如，P92-si82-DV29提高了42.8%，显著提升。
本公开基础序列31采用修饰模板25-29修饰后，与现有技术公开无修饰序列31P相比，抑制率均可提高30%以上。例如，P92-si31-DV26提高了41.9%，显著提升。
由此可知，与现有技术相近的无修饰序列相比，本公开无修饰序列、采用本公开交替修饰和模板修饰序列，均可显著增强对PCSK9的抑制活性，抑制率最多可提高40%。
总结：
（1）与现有技术公开的完全相同的序列相比，本公开中交替修饰序列和采用特定修饰模板修饰的序列，对PCSK9基因抑制作用显著提升。例如，无修饰序列si84的抑制率为38.6%，交替修饰后抑制率为61.6%，比无修饰序列si84提高了23.0%，采用本公开修饰模板DV26修饰后，抑制率达到了86.8%，比无修饰序列提高了48.2%。
（2）与现有技术公开相近的序列相比，本公开中无修饰序列、交替修饰序列和采用特定修饰模板修饰序列，对PCSK9基因抑制作用显著提升。例如，本公开无修饰序列si31与现有技术公开序列相近的31P相比，抑制率提高了10.4%。本公开序列si5交替修饰序列P92-si5，与现有技术公开的与si5序列相近的无修饰序列5P相比，抑制率提高了22.0%。本公开序列si82采用本公开修饰模板DV29修饰的序列P92-si82-DV29，与现有技术公开的与si82序列相近的无修饰序列82P相比，抑制率提高了42.8%。
实施例6：采用特定防脱靶设计的序列对PCSK9及脱靶基因的抑制作用
siRNA的实际应用中存在大量与导引链（反义链）仅有部分互补性的非目标mRNA表达被抑制的情况。阿尔尼拉姆公司的研究表明，n-乙酰半乳糖胺（GalNAc）偶联siRNA的肝细胞毒性，主要归咎于脱靶效应造成的通过类似微小RNA（miRNA）的识别机制对错误目标进行的基因抑制。
为解决这一问题，阿尔尼拉姆公司在最新的第五代模板设计中，采用了在siRNA反义链的点位7放置一个乙二醇核酸（GNA）修饰以扰乱反义链的种子区域，从而显著减轻脱靶效应，缓和肝细胞毒性。此类修饰能够影响siRNA与非设计目标通过种子区识别的方式结合，抑制脱靶效应。
自然的5'端磷酸化或简单直接的5'端磷酸化可能在细胞内发生去磷酸化，直接的5'端磷酸化寡核酸链可在血液中循环2小时后候出现90%的去磷酸化，并在24小时后全部消失。5'端磷酸化设计（5'-E-VP）利用E-乙烯基膦酸酯替代桥接氧，具有最好的磷酸化效果及较高稳定性。
综合以上，为了降低序列的脱靶效应，并检验5'末端磷酸化对脱靶效用的影响，本实施例中采用DV25-29修饰的基础序列5、51、81和84，在反义链的5'末端加入5'-E-VP修饰和7位GNA防脱靶修饰。
并且，将采用2'-甲氧基与2'-氟代交替修饰序列P92-si3、P92-si8、P92-si21、P92-si31、P92-si73和P92-si83，以及含有反义链7位GNA防脱靶修饰设计的上述序列P92-si3+、P92-si8+、P92-si21+、P92-si31+、P92-si73+和P92-si83+，进行比较，检测脱靶效应。
实验结果显示，在10 nM浓度下，采用防脱靶设计的序列，对靶基因PCSK9均具有显著抑制作用，对于脱靶基因的抑制效果显著降低。表明采用防脱靶设计，不会影响本公开交替修饰和模板修饰序列对PCSK9基因的抑制效果，却能够显著抑制脱靶效应。
1．实验材料
1）受试样品：
交替修饰序列：采用交替修饰的序列P92-si3、P92-si8、P92-si9、P92-si21、P92-si31、P92-si73和P92-si83。
交替修饰和防脱靶设计的序列：P92-si3+、P92-si8+、P92-si9+、P92-si21+、P92-si31+、P92-si73+和P92-si83+（表32）。
基础序列5、84、81和51采用模板修饰序列、采用模板修饰和5'-E-VP修饰序列、采用模板修饰和防脱靶设计的序列，以及采用模板修饰、5'-E-VP修饰和防脱靶设计的序列（表33）。
2）序列合成：
I．交替修饰序列和模板修饰序列
合成方法参照实施例1。
II．含5'-E-VP的siRNA序列
参照实施例1合成siRNA序列，在合成反义链5'端的碱基（最后一个碱基）时采用5'端含有膦酸基团的单体，例如，乙烯基-(E)-膦酸酯-A-OMe亚磷酰胺单体（式9），乙烯基-(E)-膦酸酯-U-OMe亚磷酰胺单体（式10），其结构示例如下：
III．含有防脱靶设计的siRNA序列
参照实施例1合成siRNA序列，在合成反义链5'端起第7个碱基时采用GNA单体合成序列，GNA单体结构如下：
细胞种类：Hep3B细胞，由上海药明康德新药开发有限公司提供(ATCC-tings-1618164)。
Hep3B细胞在含10%胎牛血清（FBS，ExCell Bio-FSP500）、1%青霉素-链霉素（HyClone-SV30010）、1%非必需氨基酸溶液（Gibco-11140-050）、1% GlutaMAX补充液（Gibco-35050-061）的EMEM培养基（ATCC-30-2003）中培养。
药物溶媒：无菌无酶水、gibco DMEM。
2．实验方法
1）化合物稀释
脱靶实验将受试样品稀释为10 nM浓度，3复孔检测。
Hep3B细胞消化计数：
取出密度达到80%的Hep3B细胞，用杜氏磷酸盐缓冲盐溶液DPBS润洗后，加0.05%胰蛋白酶进行消化3-10 min，收集细胞后用Countstar Rigel S2计数，并将细胞调整到2×105/mL密度。
2）转染试剂配制
配制RNAiMAX转染试剂，以RNAiMAX：Opti-MEM = 3：97比例按需配置适量体积于15mL离心管，涡旋15 sec，混匀，室温孵育15 min。向对应位置每孔加入40 μL RNAiMAX Opti-MEM，并取相应浓度40 μL稀释好的化合物加入稀释板相应的孔中，混匀并孵育15 min。
3）细胞铺板
接种Hep3B细胞（2 × 104细胞/孔）到96孔细胞板，铺板同时将siRNA化合物与RNAiMAX Opti-MEM转染试剂混合后加入各孔细胞中，同时设置含RNAiMAX Opti-MEM的无siRNA化合物对照组。
防脱靶实验：从稀释板取化合物和RNAiMAX Opti-MEM混合物加入96孔细胞培养板中（20 μL /孔），随后加100 µL/孔细胞到96孔板中，每孔终体积为120 μL。铺板后置于5%CO2、37 ℃培养箱中培养24 h。
4）RNA提取及反转录
转染24 h后，去除培养基并收集细胞用于RNA提取。根据试剂盒说明书使用RNeasy® 96 Kit（QIAGEN-74182）提取总RNA。随后根据说明书使用FastKing RT Kit（WithgDNase）（TIANGEN-KR116-02）合成cDNA。
5）RT-qPCR
靶标cDNA通过qPCR进行检测，同时GAPDH cDNA作为内部对照进行平行检测。在384孔中加入8 μL配置好的qPCR反应液和2 μL样本cDNA。TaqMan qPCR反应程序为：95 ℃加热10 min，然后进入循环模式，95 ℃加热15s ，随后60 ℃ 1 min，共40个循环。SYBR qPCR反应程序为：50 ℃加热2 min，95 ℃加热10 min，然后进入循环模式，95 ℃加热15 sec，随后60 ℃ 1 min，共40个循环；最后溶解曲线在95 °C下加热15 sec, 60 °C 下加热1 min, 95°C 下加热15 sec。
6）数据分析
依据各样品的Ct值计算样品中的目的基因 RNA表达水平，通过ΔΔCt 相对定量法进行计算。目的基因相对表达量使用2-ΔΔCT表示。
计算公式如下：
ΔCT = 目的基因平均Ct值 - 内参基因平均Ct值；
ΔΔCT = ΔCT（加药组） - ΔCT（RNAiMAX对照组）；
目的基因mRNA相对表达量 = 2-ΔΔCT
抑制率 =（1 –样品相对表达量 / RNAiMAX 对照平均表达量）×100%
3．实验结果
（1）不同修饰序列均对PCSK9基因具有显著抑制作用。例如，交替修饰P92-si3抑制率达到了75.6%，模板修饰和5'-E-VP修饰序列D84-DV27P的抑制率高达94.4%。
所有受试样品对PCSK9基因的抑制率见表34-36。
所有交替修饰序列在10 nM浓度下均对PCSK9具有显著抑制作用，例如，交替修饰序列P92-si3抑制率达到了75.6%。
I．交替修饰序列对PCSK9基因具有显著抑制作用，抑制率均超过了60%，其中P92-si3达到了75.6%。
表34 交替修饰序列PCSK9基因的抑制率
从上表可以看出，在10 nM浓度下，交替修饰序列P92-si3、P92-si8、P92-si9、P92-si21、P92-si31、P92-si51、P92-si73和P92-si83均对PCSK9基因具有显著抑制作用，抑制率均超过了60%，其中抑制率最高的P92-si3，达到了75.6%。
II．模板修饰序列采用防脱靶设计或/和5'-E-VP修饰，对PCSK9基因具有显著抑制作用。例如，模板修饰和5'-E-VP修饰序列D84-DV27P的抑制率高达94.4%。
表35 模板修饰及采用防脱靶或/和5'-E-VP修饰序列对PCSK9基因的抑制率
1）基础序列5、51、81和84采用本公开修饰模板修饰后，对PCSK9基因具有显著抑制作用，抑制率可超过90%。并且，相比于交替修饰序列抑制作用进一步增强。例如，基础序列51交替修饰后，P92-si51的抑制率为70.1%（见表34），采用模板DV26修饰后，D51-DV26抑制率达到了90.7%，比交替修饰序列提高了20.6%，显著提升（图8）。
2）采用模板修饰后，再进行防脱靶设计，对PCSK9基因表达具有显著抑制活性。例如，基础序列84采用模板DV26修饰再进行防脱靶设计，D84-DV26+抑制率高达90.1%。
3）采用模板修饰后，再进行5'-E-VP修饰，可提升对PCSK9基因的抑制作用。例如，基础序列84采用模板DV27修饰，D84-DV27抑制率为91.5%，再进行5'-E-VP修饰，D84-DV27P抑制率为94.4%，提高了2.9%。
4）采用模板修饰后，再进行防脱靶设计和5'-E-VP修饰，对PCSK9基因的抑制活性可达90%以上。例如，基础序列84采用模板DV27修饰，再进行防脱靶和5'-E-VP修饰，D84-DV27+P抑制率可达90.4%。
由此可知，采用本公开修饰模板DV25-29修饰序列，相比于交替修饰序列，可进一步增强抑制效果。并且，采用本公开修饰模板DV25-29修饰的序列，再进行防脱靶设计或/和5'-E-VP修饰，对PCSK9基因表达具有显著抑制作用，抑制率可达90%以上。
（2）采用本公开多种修饰方式中的任一种或多种修饰后，再进行防脱靶设计，对脱靶基因均具有显著的防脱靶效果，降低对脱靶基因的抑制作用。
实验结果表明：
1）本公开交替修饰或模板修饰序列，采用防脱靶设计，均可降低对脱靶基因的抑制作用，即具有显著的防脱靶效果；
2）采用模板修饰后的序列，同时采用防脱靶设计和5'-E-VP修饰，对脱靶基因的抑制率均显著降低，即具有显著的防脱靶效果。
I．本公开交替修饰序列采用防脱靶设计，具有显著的防脱靶效果，对脱靶基因的抑制率可降低20%。
表36 交替修饰及其防脱靶修饰序列对脱靶基因的抑制率
从表36中可以看出，本公开交替修饰序列采用防脱靶设计后，对脱靶基因的抑制率均降低，具有防脱靶效果。例如，采用防脱靶设计的交替修饰序列P92-si3+比无防脱靶设计序列P92-si3，对脱靶基因AARSD1的抑制率降低了20.0%，对脱靶基因ACAP2的抑制率降低了20.5%，显著降低。
II．采用本公开修饰模板修饰序列采用防脱靶设计，具有显著的防脱靶效果，对脱靶基因的抑制率最多可降低73.6%。
表37 模板修饰序列及其防脱靶或/和5'-E-VP修饰对脱靶基因的抑制率
1）只采用防脱靶设计（序列编号中用“+”表示）
将采用模板修饰后的序列经过防脱靶设计后，对脱靶基因的抑制作用显著降低，例如D84-DV26+对MXD1基因抑制率降低了39.9%， D81-DV25+对PCYOX1基因抑制率降低了54.1%，D51-DV26+对NEPRO基因抑制率降低了25.9%，D5-DV25+对DTWD1基因抑制率降低了10.9%。
表明基础序列5、51、81和84采用本公开设计的修饰模板修饰后，经过防脱靶设计，均具有显著的防脱靶效果。
2）同时采用防脱靶设计和5'-E-VP修饰（序列编号中用“+P”表示）
同时采用模板修饰和5'-E-VP修饰的序列，对脱靶基因的抑制率均显著降低，具有显著防脱靶效果。例如，D84-DV26+P对脱靶基因MXD1的抑制率降低了73.6%，D81-DV27+P对脱靶基因PCYOX1的抑制率降低了31.1%，D51-DV26+P对脱靶基因KIF1B抑制率降低了41.6%，显著降低。
表明基础序列5、51、81和84采用本公开设计的修饰模板修饰后，同时采用防脱靶设计和5'-E-VP修饰，具有显著脱靶效果。
总结：
1．不同修饰序列均对PCSK9基因具有显著抑制作用。例如，交替修饰P92-si3抑制率达到了75.6%，模板修饰和5'-E-VP修饰序列D84-DV27P的抑制率高达94.4%。
（1）交替修饰序列对PCSK9基因具有显著抑制作用，抑制率均超过了60%，其中P92-si3达到了75.6%。
（2）模板修饰序列采用防脱靶设计或/和5'-E-VP修饰，对PCSK9基因具有显著抑制作用。例如，模板修饰和5'-E-VP修饰序列D84-DV27P的抑制率高达94.4%。
2．采用本公开多种修饰方式中的任一种或多种修饰后，再进行防脱靶设计，对脱靶基因均具有显著的防脱靶效果，降低对脱靶基因的抑制作用。
（1）本公开交替修饰序列采用防脱靶设计，具有显著的防脱靶效果，对脱靶基因的抑制率可降低20%。
（2）采用本公开修饰模板修饰序列采用防脱靶设计，具有显著的防脱靶效果，对脱靶基因的抑制率最多可降低73.6%。
实施例7：采用本公开修饰模板修饰的序列对小鼠血清中PCSK9、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和总胆固醇（TC）的作用
本实施例示例性选择一些序列，包括基础序列5、51、81、82和84，对这些序列进行修饰，例如只采用模板修饰、同时采用模板修饰和防脱靶设计、同时采用模板修饰和5'-E-VP修饰，以及同时采用模板修饰、5'-E-VP和防脱靶设计。利用表达人源PCSK9基因的转基因小鼠，通过ELISA手段检测上述各序列在不同时间点对血清中PCSK9、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和总胆固醇（TC）的抑制作用。
1．实验材料
受试药品：
表38中各序列，包括只采用模板修饰序列、采用模板修饰和防脱靶设计序列、采用模板修饰和防脱靶设计序列，以及同时采用模板修饰、5'-E-VP和防脱靶设计的序列，这些序列正义链3'端偶联GalNAc配体G4、G5、G6或G7：
，
，
，
。
寡核苷酸与配体G4、G5、G6或G7的偶联方法同专利申请CN116854754A实施例3中缀合物4、缀合物5、缀合物6和缀合物7的制备方法，即将YK-GAL-304、YK-GAL-305、YK-GAL-306和YK-GAL-307与寡核苷酸偶联。YK-GAL-304、YK-GAL-305、YK-GAL-306和YK-GAL-307合成方法同此专利申请实施例1。
寡核苷酸与配体形成如下所示的缀合物：
，
，
。
各序列具体序列见表38，序列编号中G4、G5、G6和G7表示序列与GalNAc配体G4、G5、G6或G7偶联。
受试药品配制：
药物溶媒：PBS缓冲液
配制条件：无菌环境
标识方法：所配制的给药制剂用标签标识，外包装注明专题编号、名称、浓度、数量、配制日期、配制者、贮存条件；
保存条件：现用现配，剩余样品-80℃保存。
实验动物信息：
种属/品系：hPCSK9转基因小鼠
等级：SPF
性别：雄
数量：214只
年龄：4~7周
体重：18~20g
来源：江苏集萃药康生物科技股份有限公司
生产许可证号：SCXK(苏)2018-0008
实验动物伦理审查（IACUC）：
实验动物接收后饲养于有济（天津）医药科技有限公司，使用许可证编号：SYXK（津滨）2019-0002。本项目已经通过有济（天津）医药科技有限公司实验动物伦理委员会审查，试验过程严格按照IACUC要求进行，保证动物福利。
饲养及管理：
饲养条件：实验动物接收后饲养于有济（天津）医药科技有限公司，使用许可证编号：SYXK（津滨）2019-0002。饲养于饲养笼中，笼具规格为长 × 宽 × 高 = 29.0 cm ×18.5 cm ×13.0 cm；设定温度范围20 - 26℃，设定湿度范围40% ~ 70%，换风次数不少于15次全新风/小时，12小时明12小时暗交替人工照明。
饲养环境条件标准参照中华人民共和国国家标准GB14925-2010，由组合式空调机组控制环境。
动物自由采食，自由饮水。饮水瓶和瓶中动物饮用水应每周至少更换2次，使用后饮水瓶经脉动真空灭菌器高压消毒后再次使用。
动物饲养笼具和垫料每周至少更换1次，所有动物饲养笼具和垫料均通过脉动真空灭菌器高压消毒后进入屏障环境使用；动物饲养笼架每周至少清洁、消毒擦拭1次。
动物饲养观察室每天进行清洁消毒，包括平板架、地面、桌面等。
屏障环境使用的消毒液包括：6.67%新洁尔灭溶液、0.5% 84消毒液、75%消毒液、0.08%百毒杀，4种消毒液轮流使用，不可混合使用。
实验动物饲料：SPF大小鼠维持饲料：斯贝福（北京）生物技术有限公司生产，动物饲料生产许可证号为SCXK（京）2019-0010，北京市科学技术委员会签发。
饲料检测：每批饲料均有质量合格证，每季度由本公司进行一次微生物检测，每半年由饲料供应单位提供一份近期第三方饲料检测报告。饲料营养成分检测参照中华人民共和国国家标准GB14924.3-2010，污染物指标检测参照中华人民共和国国家标准GB14924.2-2001。
实验动物饮水：饮用水：过滤系统制备的无菌水，用饮水瓶直接灌装。
饮用水检测：每季度由本公司进行一次微生物检测，每年送第三方检测机构进行一次水质检测。饮用水检测参照中华人民共和国国家标准GB5749-2006。
动物垫料：玉米芯垫料：斯贝福（北京）生物技术有限公司生产，动物垫料生产许可证号为SCXK（京）2019-0004，北京市科学技术委员会签发。
垫料检测：每季度由本公司进行一次微生物检测，每半年由垫料供应单位至少提供一份第三方垫料检测报告。垫料检测参照中华人民共和国国家标准GB14924.2-2001。
2．实验方法
剂量设计及分组
试验日期定义：动物给药溶媒或受试药当天定义为第0天（day 0）。
分组及给药：于试验动物适应性饲养后，按血清PSCK9蛋白含量随机分为阴性对照组、受试药组，每组5只。通过皮下单次注射给药，给药剂量为6 mg/kg，给药体积为1 mL/kg，给药浓度为6 mg/mL，给药当天记为day 0。
动物标识采用耳标号进行个体标识。通过悬挂笼卡的方式对饲养笼进行识别。在实验室门口悬挂实验室标识牌。分组信息详见表39。
表39
检测指标
（1）一般观察
自给药前1周至试验结束，每天观察1次。
观察内容：笼旁观察动物的死亡或濒死、精神状态、行为活动、粪便性状、饲料和饮水的供应情况等。
检测动物：阴性对照组和受试药组所有动物。
（2）血清中PCSK9蛋白的表达
检测时间：day -3给药前（day -3）、day 7给药1周（1 w）、day 14给药2周（2 w）、day 21给药3周（3 w）、day 28给药4周（4 w）、day 35给药5周（5 w）。
PCSK9蛋白水平检测方法：采用ELISA试剂盒检测；血清样品避免反复冻融。
检测动物：阴性对照组和受试药组所有动物。
（3）血脂测定
检测时间：day -3给药前（day -3）、day 7给药1周（1 w）、day 14给药2周（2 w）、day 21给药3周（3 w）、day 28给药4周（4 w）、day 35给药5周（5 w），目内眦取血约200 μL。全血样品离心前冰盒中暂存，于2~8℃、离心力约3000 g离心10分钟，分为2管（其中1份约60μL，剩余血清存于另1管），-70~-86℃保存，用于血脂检测。
（4）数据处理与统计分析
试验数据以平均数±标准差（Mean±SD）表示，采用GraphPad Prism 8.3分析软件进行数据分析。方差齐性采用LSD检验，方差不齐采用Dunnett T3，P<0.05表示有统计学意义。
3．实验结果
具体实验结果见表40-42。
可以看出，这些序列可以持续显著抑制血清中PCSK9蛋白，并显著降低血清中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和血清总胆固醇（TC）水平。例如，D81-DV25G7组在第7天、第14天和第28天，对血清中PCSK9蛋白抑制率分别达到了83.1%、82.2%和70.3%；D82-DV27PG5组在第7天、第14天和第28天，血清中LDL-C水平分别降低了32.6%、35.8%和21.7%；D82-DV29PG7组在第7天、第14天和第28天血清中TC水平分别降低了32.2%、26.8%和19.6%。
（1）本公开的序列，例如基础序列5、51、81、82和84采用不同修饰，对血清中PCSK9蛋白表达具有显著抑制作用。例如，D81-DV25G7在第7天、第14天和第28天抑制率分别达到了83.1%、82.2%和70.3%。
表40 不同序列对血清中PCSK9蛋白抑制率
从表40中可以看出，各序列与GalNAc化合物缀合所形成的缀合物对血清中PCSK9蛋白表达具有显著抑制作用。例如，D81-DV25G7在第7天、第14天和第28天抑制率分别达到了83.1%、82.2%和70.3%（图9）。
表明本公开设计的基础序列，例如5、51、81、82和84，采用本公开的模板修饰，或同时再采用5'-E-VP修饰或/和防脱靶设计，与GalNAc化合物缀合，可以高效递送至动物肝脏，并显著抑制PCSK9基因表达。
（2）本公开的序列，例如基础序列5、51、81、82和84采用不同修饰，可显著降低血清中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。例如，D82-DV27PG5组在第7天、第14天和第28天分别降低了32.6%、35.8%和21.7%。
表41 不同序列对血清中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）降低水平
从表41中可以看出，各实验组中血清LDL-C均显著降低。例如，D82-DV27PG5组在第7天、第14天和第28天分别降低了32.6%、35.8%和21.7%（图10）。
表明本公开设计的基础序列，例如5、51、81、82和84，采用本公开的模板修饰，或同时再采用5'-E-VP修饰或/和防脱靶设计，与GalNAc化合物缀合，可以高效递送至动物肝脏，并显著降低血清中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。
（3）本公开的序列，例如基础序列5、51、81、82和84采用不同修饰，可显著降低血清中总胆固醇（TC）水平。例如，D82-DV29PG7，第7天、第14天和第28天分别降低了32.2%、26.8%和19.6%。
表42 不同序列对血清总胆固醇（TC）降低水平
从表42中可以看出，各实验组中血清总胆固醇（TC）均显著降低。例如，D82-DV29PG7组第7天、第14天和第28天分别降低了32.2%、26.8%和19.6%（图11）。
表明本公开设计的基础序列，例如5、51、81、82和84，采用本公开的模板修饰，或同时再采用5'-E-VP修饰或/和防脱靶设计，与GalNAc化合物缀合，可以高效递送至动物肝脏，并显著降低血清中总胆固醇（TC）水平。
总结：
本公开设计的基础序列，例如5、51、81、82和84，采用本公开的模板修饰，或同时再采用5'-E-VP修饰或/和防脱靶设计，与GalNAc化合物缀合，可以高效递送至动物肝脏，并可持续显著抑制血清中PCSK9蛋白表达，降低血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和血清总胆固醇（TC）水平。
例如，D81-DV25G7组血清中PCSK9蛋白表达抑制率，在第7天、第14天和第28天抑制率分别达到了83.1%、82.2%和70.3%；D82-DV27PG5组血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，在第7天、第14天和第28天分别降低了32.6%、35.8%和21.7%；D82-DV29PG7组血清总胆固醇（TC）水平，在第7天、第14天和第28天分别降低了32.2%、26.8%和19.6%。
结论：
本公开基于PCSK9 mRNA序列设计了一系列siRNA，对其进行交替修饰和利用一组特定的修饰模板进行修饰，并对其中一些序列进行防脱靶设计和5'-E-VP修饰。结果表明：
（1）无修饰序列，包括基础序列5、51、81、82、84、3、8、9、21、31、73和83，对PCSK9均具有显著抑制作用，抑制率最高可超过60%。
（2）采用多重修饰序列，抑制率最高可达90%以上。并且，修饰序列与GalNAc化合物缀合，可以高效递送至动物肝脏，并显著抑制PCSK9基因表达，显著降低血清中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，显著降低血清中总胆固醇（TC）水平。
具体如下：
1. 本公开交替修饰序列对PCSK9基因具有显著抑制作用
（1）设计的84条序列中，有12条序列对PCSK9基因具有显著抑制作用，抑制率均超过50%，包括P92-si5、P92-si51、P92-si81、P92-si82、P92-si84、P92-si3、P92-si8、P92-si9、P92-si21、P92-si31、P92-si73和P92-si83。其中P92-si5、P92-si81、P92-si82、P92-si3、P92-si8和P92-si31的抑制率超过了70%。
（2）26条序列对PCSK9基因的抑制率在30%-50%。例如，P92-si6和P92-si7的抑制率分别为38.3%和35.7%。
（3）46条序列对PCSK9基因的抑制率在30%以下。例如，P92-si1和P92-si20的抑制率分别仅为9.2%和6.0%。
（4）序列相近的siRNA，活性差异非常大。例如P92-si5的抑制率比P92-si4提高了61.8%，显著提升。
2. 本公开无修饰序列对PCSK9基因具有显著抑制作用
（1）12条无修饰序列对PCSK9基因具有显著抑制作用，抑制率均超过50%，包括si5、si51、si81、si82、si84、si3、si8、si9、si21、si31、si73和si83。其中si5、si81、si82、si3和si8抑制超过了60%。
（2）其它无修饰序列对PCSK9基因的抑制率均低于40%。例如，si52和si74抑制率仅为0.5%和2.2%。
（3）序列相近的siRNA，活性差异非常大。例如基础序列5的抑制率比基础序列4提高了51.2%，显著提升。
（4）不同序列经过交替修饰后，对活性影响并不一致。有的抑制率显著提升，例如基础序列5，交替修饰比无修饰序列抑制率提高了12.4%；有的不明显，例如基础序列4、22和52，交替修饰序列和无修饰序列抑制率基本无变化。
3. 采用本公开修饰模板修饰的序列对PCSK9基因具有显著抑制作用
（1）基础序列5、51、81、82、84、3、8、9、21、31、73和83，采用本公开设计的修饰模板DV25-29修饰后，对PCSK9基因表达具有显著抑制作用，抑制率均在70%以上。其中P92-si81-DV26、P92-si82-DV27和P92-si82-DV29抑制率达到了89.3%、89.3%和89.1%。
（2）上述12条序列采用本公开修饰模板DV25-29修饰序列，与交替修饰序列相比，对PCSK9基因表达的抑制率显著提升。例如，基础序列51采用模板DV27修饰序列P92-si51-DV27抑制率比交替修饰序列提高了29.1%，基础序列81采用模板DV26修饰序列P92-si81-DV26抑制率比交替修饰序列提高了26.9%。
（3）相同序列采用本公开修饰模板DV25-29修饰，与采用现有技术公开的修饰模板相比，对PCSK9基因表达的抑制率显著提升。例如，基础序列51采用本公开修饰模板DV27修饰序列，与采用已公开Advanced ESC模板DV21修饰序列相比，抑制率提高21.3%。
（4）相同序列采用本公开修饰模板DV25-29修饰，与采用本公开其它修饰模板DV30和DV31相比，对PCSK9基因表达的抑制率显著提升。例如，基础序列51采用本公开修饰模板DV27修饰序列，与采用本公开修饰模板DV31修饰序列相比，抑制率提高22.8%。
（5）上述12条序列的EC50值在0.0001 nM至0.005 nM之间。其中P92-si81-DV27、P92-si84-DV26和P92-si82-DV27的EC50值分别为0.0003 nM、0.0004 nM和0.0006 nM。表明在低浓度下，这些序列即可有效抑制PCSK9基因表达。
4. 本公开采用交替修饰和本公开修饰模板修饰的各序列，同现有技术公开的序列完全相同或差异很小的无修饰序列相比，对PCSK9抑制活性均显著提升。
（1）与现有技术公开完全相同的无修饰序列相比，本公开交替修饰序列和采用特定修饰模板修饰序列，对PCSK9基因抑制率显著提升，最多可提高40%。
（2）与现有技术公开的仅有很小差异的无修饰序列相比，本公开无修饰序列、交替修饰序列和采用特定修饰模板修饰的序列，对PCSK9基因抑制率显著提升，最多可提高40%。
I. 本公开中无修饰序列与现有技术公开相近无修饰序列相比，活性显著提升。例如，本公开无修饰序列si31比结构相近的31P相比，抑制率提高了10.4%。
II. 本公开中交替修饰序列与现有技术公开相近无修饰序列相比，活性显著提升。例如，与序列5P相比，本公开交替修饰序列P92-si5抑制率提高了22.0%。
III. 采用本公开修饰模板修饰的序列与现有技术公开相近无修饰序列相比，活性显著提升。例如，与序列82P相比，本公开交替修饰序列P92-si82-DV29抑制率提高了42.8%。
5. 本公开交替修饰序列和模板修饰序列，采用特定防脱靶设计，对PCSK9基因具有显著抑制作用，对脱靶基因的抑制作用显著降低。
（1）不同修饰序列均对PCSK9基因具有显著抑制作用。例如，交替修饰P92-si3抑制率达到了75.6%，模板修饰和5'-E-VP修饰序列D84-DV27P的抑制率高达94.4%。
I．交替修饰序列对PCSK9基因具有显著抑制作用，抑制率均超过了60%，其中P92-si3达到了75.6%。
II．模板修饰序列采用防脱靶设计或/和5'-E-VP修饰，对PCSK9基因具有显著抑制作用。例如，模板修饰和5'-E-VP修饰序列D84-DV27P的抑制率高达94.4%。
（2）采用本公开多种修饰方式中的任一种或多种修饰后，再进行防脱靶设计，对脱靶基因均具有显著的防脱靶效果，降低对脱靶基因的抑制作用。
I．本公开交替修饰序列采用防脱靶设计，具有显著的防脱靶效果，对脱靶基因的抑制率可降低20%。
II．采用本公开修饰模板修饰序列采用防脱靶设计，具有显著的防脱靶效果，对脱靶基因的抑制率最多可降低73.6%。
6. 采用本公开修饰模板修饰的序列或显著抑制小鼠血清中PCSK9表达，显著降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和总胆固醇（TC）水平
（1）本公开基础序列5、51、81、82和84采用不同修饰，对血清中PCSK9蛋白表达具有显著抑制作用。例如，D81-DV25G7在第7天、第14天和第28天抑制率分别达到了83.1%、82.2%和70.3%。
（2）本公开基础序列5、51、81、82和84采用不同修饰，可显著降低血清中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。例如，D82-DV27PG5组在第7天、第14天和第28天分别降低了32.6%、35.8%和21.7%。
（3）本公开基础序列5、51、81、82和84采用不同修饰，可显著降低血清中总胆固醇（TC）水平。例如，D82-DV29PG7，第7天、第14天和第28天分别降低了32.2%、26.8%和19.6%。

Claims (40)

1.用于降低PCSK9的表达的双链RNAi剂，其包含选自由以下正义链和反义链配对组成的任一寡核苷酸双链体：
（1）所述正义链具有如SEQ ID NO. 1所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 13所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（2）所述正义链具有如SEQ ID NO. 2所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 14所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（3）所述正义链具有如SEQ ID NO. 3所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 15所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（4）所述正义链具有如SEQ ID NO. 4所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 16所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（5）所述正义链具有如SEQ ID NO. 5所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 17所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（6）所述正义链具有如SEQ ID NO. 6所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 18所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（7）所述正义链具有如SEQ ID NO. 7所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 19所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（8）所述正义链具有如SEQ ID NO. 8所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 20所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（9）所述正义链具有如SEQ ID NO. 9所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 21所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（10）所述正义链具有如SEQ ID NO. 10所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 22所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（11）所述正义链具有如SEQ ID NO. 11所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 23所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；
（12）所述正义链具有如SEQ ID NO. 12所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO. 24所示的序列或其片段、或所述序列或其片段的修饰序列。
2.根据权利要求1所述的双链RNAi剂，其中正义链及反义链上所有核苷酸为经修饰的核苷酸。
3.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其为一种用于抑制PCSK9基因表达的RNAi剂。
4.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其中所述正义链与SEQ ID NO. 1-12中任一序列差异为1-3个核苷酸。
5.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其中所述反义链与SEQ ID NO. 13-24中任一序列差异为1-3个核苷酸。
6.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其中至少一个经修饰的核苷酸是选自下组，该组由以下各项组成：脱氧-核苷酸、3'-末端脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧-修饰的核苷酸、锁核苷酸、非锁核苷酸、构型限制性核苷酸、限制性乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基-修饰的核苷酸、2'-C-烷基-修饰的核苷酸、2'-羟基-修饰的核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基-修饰的核苷酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基的核苷酸、包含甲基磷酸酯基的核苷酸、包含5'-磷酸酯的核苷酸、及包含5'-磷酸酯模拟物的核苷酸。
7.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其中至少一个链包含至少1个核苷酸的3'突出端。
8.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其中至少一个链包含至少2个核苷酸的3'突出端。
9.根据前述权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其中双链区为15-30对核苷酸的长度。
10.根据前述权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其中双链区为17-25对核苷酸的长度。
11.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其中双链区为19-23对核苷酸的长度。
12.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其中双链区为21对核苷酸的长度。
13.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其中各链具有15-30个核苷酸。
14.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其中各链具有19-25个核苷酸。
15.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其中正义链具有21个核苷酸，反义链具有23个核苷酸。
16.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其中所述正义链及反义链上所有核苷酸修饰方式为核苷酸核糖的2'位的化学修饰。
17.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其中核苷酸核糖的2'位的化学修饰选自2'-甲氧基、2'-甲氧基乙基、2'-氟代、2'-苄氧基、2'-甲基羰基氨基和2'-吡啶甲氧基中的任意一种或者几种的组合。
18.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其中各核苷酸核糖的2'位的化学修饰，选自2'-甲氧基和2'-氟代的组合。
19.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其中各核苷酸核糖的2'位的化学修饰，选自2'-甲氧基和2'-氟代的交替组合。
20.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其中各核苷酸核糖的2'位的化学修饰方式为：正义链奇数位均为2'-氟代修饰，偶数位均为2'-甲氧基修饰；反义链奇数位均为2'-甲氧基修饰，偶数位均为2'-氟代修饰。
21.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其中核苷酸单体之间连接的3',5'-磷酸二酯键。
22.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其中核苷酸单体之间连接的3',5'-磷酸二酯键有硫代修饰。
23.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其进一步具有以下修饰：
上表中2'-OMe为2'-甲氧基；2'-F为2'-氟代；PS为硫代磷酸骨架；
其中反义链采用修饰A，正义链采用修饰方式a；
其中反义链采用修饰B，正义链采用修饰方式a；
其中反义链采用修饰C，正义链采用修饰方式a；
其中反义链采用修饰B，正义链采用修饰方式b；
其中反义链采用修饰C，正义链采用修饰方式b。
24.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其反义链自5'端起第二至第八位中采用修饰基团，其中所述修饰基团选UNA、GNA或DNA，其中UNA和GNA结构如下：
；
其中，碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶以及尿嘧啶。
25.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其中修饰的反义链5'末端核苷酸糖苷的5'位碳原子的磷酸化，包括但不限于以下5'位磷酸化基团：5'-乙烯基膦酸酯基团(5'-E-VP)；5'-甲基膦酸酯基团(5'-MP)；5'-C-甲基磷酸酯基团；5'-硫代磷酸酯基团(5'-PS)；5'-磷酸酯基团(5'-P），其结构示意如下：
；
其中，R为氢、羟基、胺基、C1-4烷基、芳香基、C1-4烷氧基、C1-4烷基羰基氨基或卤素；
碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶以及尿嘧啶。
26.根据权利要求1或2所述的双链RNAi剂，其中所示序列末端中核苷酸单体之间连接的3',5'-磷酸二酯键，有硫代修饰，并形成手性纯的3',5'-硫代磷酸二酯键，其中正义链及反义链5'末端含有1-3个硫代连接，反义链3'末端含有1-3个硫代连接。
27.一种用于降低PCSK9的表达的缀合物，其包括权利要求1-26中任一项所述的双链RNAi剂，及与其缀合的配体。
28.根据权利要求27所述的缀合物，其中配体缀合在寡核苷酸正义链的3'-末端或5'-末端。
29.根据权利要求27或28所述的缀合物，其中所述配体为一种或多种利用二价或三价的分支键联体附接的GalNAc衍生物。
30.根据权利要求27或28所述的缀合物，其中配体为：
，
其中，X是氢或一种羟基保护基或H，所述羟基保护基包括乙酰基、苯甲酰基或异丁酰基；Y是一种胺保护基或H，所述胺保护基为甲酰基、乙酰基、丙酰基、正丁酰基或异丁酰基；n是0-20之间的整数；q、r和s独立地是1-7之间的整数。
31.根据权利要求30所述的缀合物，其中配体为：
。
32.根据权利要求27或28所述的缀合物，其中配体为：
，
其中，X为氧、氮或硫；
Y为烷基或芳香基；
R1为氧或硫；
R2为氢、胺基、C1-4烷基、芳香基、C1-4烷氧基或卤素；
A为-(CH2)a-、-(CH2CH2O)b-、-((CH2)cNHCO)d-或-((CH2)cCONH)d-，其中，a是1-15的整数，b是1-7的整数，c为1-7的整数，d为1-5的整数；
B为-(CH2)e-，其中e为0-7的整数；
L为-CONH-或-NHCO-；
X1为-(CH2)f-或-(CH2CH2O)fCH2-，f是1-5的整数；
X2为-(CH2)g-，g是1-6的整数；
Y1为0或1；
Y2为0、1或2；
Y3为1、2或3；
m为0-4的整数；
n为0-4的整数。
33.根据权利要求32中的缀合物，其中配体为G4、G5、G6或G7：
，
，
，
。
34.根据权利要求27或28所述的缀合物，其具有如下所示的结构：
，
，
，
，或
。
35.根据权利要求27或28所述的缀合物，其中所述双链RNAi剂包含选自由以下正义链和反义链配对组成的任一寡核苷酸双链体：
（1）所述正义链具有如SEQ ID NO. 337所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.427所示的序列；
（2）所述正义链具有如SEQ ID NO. 337所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.428所示的序列；
（3）所述正义链具有如SEQ ID NO. 342所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.381所示的序列；
（4）所述正义链具有如SEQ ID NO. 342所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.430所示的序列；
（5）所述正义链具有如SEQ ID NO. 342所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.431所示的序列；
（6）所述正义链具有如SEQ ID NO. 347所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.384所示的序列；
（7）所述正义链具有如SEQ ID NO. 347所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.437所示的序列；
（8）所述正义链具有如SEQ ID NO. 347所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.438所示的序列；
（9）所述正义链具有如SEQ ID NO. 348所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.385所示的序列；
（10）所述正义链具有如SEQ ID NO. 352所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.448所示的序列；
（11）所述正义链具有如SEQ ID NO. 353所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.390所示的序列；
（12）所述正义链具有如SEQ ID NO. 353所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.448所示的序列；
（14）所述正义链具有如SEQ ID NO. 357所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.393所示的序列；
（15）所述正义链具有如SEQ ID NO. 357所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.446所示的序列；和
（16）所述正义链具有如SEQ ID NO. 357所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.447所示的序列；
其中，所述寡核苷酸双链体与配体G4、G5、G6或G7缀合。
36.根据权利要求27或28所述的缀合物，其中所述双链RNAi剂包含选自由以下正义链和反义链配对组成的任一寡核苷酸双链体：
（1）所述正义链具有如SEQ ID NO. 352所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.448所示的序列；
（2）所述正义链具有如SEQ ID NO. 353所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.390所示的序列；和
（3）所述正义链具有如SEQ ID NO. 353所示的序列；和所述反义链具有如SEQ ID NO.448所示的序列；
其中，所述寡核苷酸双链体与配体G4、G5、G6或G7缀合。
37.根据权利要求27或28所述的缀合物，其中所述双链RNAi剂包含由SEQ ID NO. 353所示的正义链和SEQ ID NO. 448所示反义链配对组成的寡核苷酸双链体，所述寡核苷酸双链体与配体G5缀合。
38.一种药物组合物，其包括如权利要求1-26中任一项所述的双链RNAi剂或权利要求27-37中任一项的缀合物，以及药学上可接受的载体。
39.权利要求1-26中任一项所述的双链RNAi剂、权利要求27-37中任一项的缀合物或权利要求38中的组合物在制备与PCSK9相关疾病中的应用。
40.权利要求39所述的应用，所述PCSK9相关疾病选自高胆固醇血症、动脉粥样硬化、血脂异常或心脑血管疾病。
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