CN118480552B - 一种靶向CEBPA基因表达的saRNA及其用途 - Google Patents

一种靶向CEBPA基因表达的saRNA及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种靶向CEBPA基因表达的saRNA及其用途，所述的saRNA包含正义链和反义链，其中，所述反义链为：mGfAmCfCmAfGmUfGmAmCmAfAmUfGmAfCmCfGmC *mU*mU；所述正义链为：fGmCmGmGfUmCfAfUfUm GfUmCfAmCfUmGfGmUfCmUmUiT。本发明提供的saRNA具有良好的稳定性、出色的CEBPA基因激活活性、令人满意的细胞毒性和低免疫刺激性。

Description

一种靶向CEBPA基因表达的saRNA及其用途
技术领域
本发明涉及一种激活转录因子CEBPA表达的的化合物和方法，所述化合物包含靶向CEBPA基因的saRNA。本发明提供的saRNA和方法可以治疗与CEBPA表达下调相关疾病。
背景技术
CCAAT/增强子结合蛋白α（CCAAT/enhancer-binding protein alpha，CEBPA）是CCAAT/增强子结合蛋白的成员之一，属于碱性亮氨酸拉链转录因子家族。CEBPA基因定位于19q13.1，无内含子，编码30 KD（P30）和42Kd（P42）大小的两个蛋白亚型，其中P30主要在造血相关的组织中表达。作为转录因子，CEBPA在肝脏、脂肪组织、骨髓、皮肤、肺、乳腺、小肠、结肠、胰腺等多种组织细胞类型中表达，参与调控特定组织中特定基因的表达；同时CEBPA参与调控细胞周期，控制细胞分化与增殖。CEBPA在造血细胞分化、脂肪代谢、肿瘤进展、炎症、免疫等过程起重要的调控作用，其基因功能失调是相关疾病的主要发病机制。
目前已有清晰的证据表明CEBPA属于抑制基因，与肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭有关。CEBPA过高表达可见于急性淋巴细胞白血病(ALL)，而失活突变常见于急性髓性白血病(AML)。在肝癌、肺癌、乳腺癌、皮肤癌等实体瘤中，CEBPA表达下调。
针对肝癌等实体瘤、血液瘤、炎症相关疾病的当前治疗包括手术、化疗、激酶抑制剂及免疫检查点抑制剂等靶向药物治疗。但存在药物耐受及受限于特定人群获益等问题，本领域中存在对患有肿瘤、血液瘤、炎症相关疾病的受试者的替代/改进治疗的需求。
一些生物激活剂和化学药物通过直接或间接靶向调控关键致病因子表达发挥有益作用。其中，小激活RNA（small activation RNA，saRNA）是一种新兴且极具潜力的候选研究对象，其可基于RNA激活基因表达机制，以序列特异性的方式激活目的基因表达，从而达到治疗或缓解疾病的目的。由于saRNA是通过碱基互补配对而序列特异性地识别靶基因，从而实现靶基因表达的启动或增强，达到激活靶基因表达、上调靶RNA水平的目的。因此，saRNA具有极广阔的应用前景。
然而，考虑到CEBPA的靶核酸存在种属间差异，增加了针对靶核酸的saRNA药物研发的困难；同时，相比传统药物，saRNA的稳定性较差，系统给药存在易被核酸酶降解的缺点；此外，还需要尝试在进一步提高活性的同时，避免引发脱靶效应、免疫刺激、细胞毒性等副作用。因此，开发出更多在血液中稳定、具有良好生物活性且细胞毒性较低的激活CEBPA基因表达的候选saRNA成为迫切需要解决的问题；同时，利用上述激活CEBPA基因表达的候选saRNA开发出能够有效治疗或缓解肿瘤、炎症相关疾病的药物存在临床研究的必要性和商业化的现实性。
发明内容
本发明首先提供了一种用于激活CEBPA基因表达的saRNA，其特征在于，所述saRNA包含正义链和反义链；其中，
所述反义链为：
mGfAmCfCmAfGmUfGmAmCmAfAmUfGmAfCmCfGmC*mU*mU（SEQ ID NO: 128）；
所述正义链为：
fGmCmGmGfUmCfAfUfUmGfUmCfAmCfUmGfGmUfCmUmUiT（SEQ ID NO: 62）。
本发明还提供了一种药物组合物，其特征在于：该药物组合物包含上述的saRNA和药学上可接受的载体。
本发明还提供了上述的saRNA和/或上述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防与转录因子CEBPA基因表达下调相关的病理状况或疾病的药物中的用途。
进一步地，所述病理状况或疾病为与癌症、肿瘤、纤维化、炎症相关的疾病。
进一步地，所述肿瘤、纤维化、炎症相关疾病选自于肝癌、胰腺癌、急性髓系白血病。
在本发明的一些实施方案中，提供了一种用于激活CEBPA基因表达的saRNA，所述saRNA包含正义链和反义链；其中，所述反义链包含与GACCAGUGACAAUGACCGCUU（SEQ ID NO:2）核苷酸序列差异不多于4个核苷酸的至少17个连续核苷酸，所述反义链长度为17~30个核苷酸；所述正义链长度为17~30个核苷酸，且与反义链至少部分互补。
在本发明的一些实施方案中，所述正义链包含与GCGGUCAUUGUCACUGGUCUU（SEQ IDNO: 1）核苷酸序列差异不多于4个核苷酸的至少17个连续核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，所述反义链长度为19~27个核苷酸；所述正义链长度为17~25个核苷酸；优选地，所述反义链长度为21~23个核苷酸；所述正义链长度为19~21个核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，所述反义链长度为21个核苷酸，所述正义链长度为21个核苷酸；或者，所述反义链长度为23个核苷酸，所述正义链长度为21个核苷酸；或者，所述反义链长度为21个核苷酸，所述正义链长度为22个核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，所述正义链与反义链有不超过3个核苷酸的错配；更优选地，所述正义链与反义链有不超过2个核苷酸的错配；进一步优选地，所述正义链与反义链有不超过1个核苷酸的错配；最优选地，所述正义链与反义链完全互补。
在本发明的一些实施方案中，所述saRNA序列选自：
saRNA序列1：
正义链：GCGGUCAUUGUCACUGGUCUU（SEQ ID NO: 1）；
反义链：GACCAGUGACAAUGACCGCUU（SEQ ID NO: 2）；
saRNA序列2：
正义链：GCGGUCAUUGUCACUGGUCAG（SEQ ID NO:3）；
反义链：CUGACCAGUGACAAUGACCGCCU（SEQ ID NO: 4）；
saRNA序列3：
正义链：GCGGUCAUUGUCACUGGUCUUT（SEQ ID NO:5）；
反义链：GACCAGUGACAAUGACCGCUU（SEQ ID NO: 6）。
在本发明的一些实施方案中，所述saRNA至少含有一个修饰核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，所述修饰的核苷酸选自2’-甲氧基核苷酸、2’-氟核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2’,3’-开环核苷酸类似物、2’-氟阿糖核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、2’-氨基修饰核苷酸、2’-烷基修饰核苷酸、3’-甲氧基核苷酸、2’-烯丙基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含甲基膦酸酯基团的核苷酸、包含5’-磷酸酯的核苷酸、包含5’-磷酸酯模拟物的核苷酸、二醇修饰的核苷酸、脱碱基核苷酸、吗啉代核苷酸、锁定核苷酸（LNA）、解锁核苷酸（UNA）、甘油核苷酸(GNA)或5’-甲基修饰的脱氧核糖核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，所述修饰的核苷酸选自：2’-甲氧基核苷酸、2’-氟核苷酸、2’-脱氧核苷酸或5’-甲基修饰的脱氧核糖核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，saRNA的正义链中全部核苷酸均为修饰的核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，saRNA的反义链中全部核苷酸均为修饰的核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，所述正义链5’末端和3’末端分别独立地包含1或2个硫代磷酸酯基连接；和/或所述反义链的5’末端和3’末端分别独立地包含1或2个硫代磷酸酯基连接。
在本发明的一些实施方案中，正义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、正义链的5'端的第2位和第3位的核苷酸之间、正义链的3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、正义链的3'端的第2位和第3位的核苷酸之间、反义链的3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、反义链的3'端的第2位和第3位的核苷酸之间、反义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、以及反义链的5'端的第2位和第3位的核苷酸之间，至少有一个为硫代磷酸酯基连接；优选为至少有四个为硫代磷酸酯基连接；在本发明的一些实施方式中，至少有六个为硫代磷酸酯基连接；在本发明的一些实施方式中，八个均为硫代磷酸酯基连接。
在本发明的一些实施方案中，正义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。
在本发明的一些实施方案中，正义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接，且3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。
在本发明的一些实施方案中，反义链的3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接，且5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、第2位和第3位的核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。
在本发明的一些实施方案中，正义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、正义链的5'端的第2位和第3位的核苷酸之间、正义链的3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、正义链的3'端的第2位和第3位的核苷酸之间、反义链的3'端的第1位和第2位的核苷酸之间、反义链的3'端的第2位和第3位的核苷酸之间、反义链的5'端的第1位和第2位的核苷酸之间、以及反义链的5'端的第2位和第3位的核苷酸之间均为硫代磷酸酯基连接。
在本发明一些实施方案中，正义链可包括一个或多个封端残基或部分，称为“封端残基”。“封端残基”是可以掺入saRNA的核苷酸序列的一个或多个末端的非核苷酸化合物或其他部分。在本发明一些实施方案中，封端残基存在于正义链的5'末端、3'末端或5'末端和3'末端两者处。
在本发明一些实施方案中，添加反向脱碱基糖帽（iab）作为封端残基。可参见F.Czauderna,Nucleic Acids Res.,2003,31(11),2705-16。在本发明一些实施方案中，正义链的5'端和/或3'端可以包含多于一个反向脱碱基糖帽作为封端残基。
在本发明的一些实施方案中，saRNA的正义链5’端含有反向脱碱基糖帽。反向脱碱基糖帽可以经由磷酸酯、硫代磷酸酯或其他核苷间键联连接。
在本发明的一些实施方案中，所述反义链5’端第一个核苷酸为(E)-乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，saRNA具有反向结构的核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，saRNA的正义链3’端具有一个反向结构的核苷酸。优选地，saRNA的正义链3’端具有一个反向结构的胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，所述saRNA选自：
本发明还提供了一种药物组合物，包含任一上述的saRNA和药学上可接受的载体。
本发明还提供了任一上述的saRNA和/或上述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防治疗和/或预防与转录因子CEBPA基因表达下调相关的病理状况或疾病的药物中的用途。
进一步地，所述病理状况或疾病为与癌症/肿瘤/纤维化/炎症相关的疾病。进一步优选地，所述肿瘤、纤维化、炎症相关疾病选自于肝癌、胰腺癌、急性髓系白血病。
本发明提供的saRNA及其药物组合物具有良好的稳定性、出色的CEBPA基因激活活性、令人满意的细胞毒性和免疫刺激性。
在本发明中，如无特别说明，大写字母C、G、U、A、T表示核苷酸的碱基组成；d表示表示与该标识d右侧相邻的一个核苷酸为脱氧核糖核苷酸；m表示与该标识m右侧相邻的一个核苷酸为2’-甲氧基修饰的核苷酸；f表示与该标识f右侧相邻的一个核苷酸为2’-氟修饰的核苷酸；*表示与该标识*左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；vp表示与该标识vp右侧相邻的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯修饰的核苷酸；i表示与该标识i右侧相邻的一个核苷酸具有反向结构；iab表示5’端反向脱碱基糖帽；i5Med表示与该标识i5Med右侧相邻的一个核苷酸为碱基5’-甲基修饰的脱氧核糖核苷酸。
在本发明中，如无特别说明，术语“互补”是指第一序列的寡核苷酸在一定条件下和第二序列的寡核苷酸杂交并形成双链结构的能力。“至少部分互补”是指两条序列可以是完全互补的，或者总体上不多于5个、4个、3个或2个错配碱基配对，同时保留了在相关条件下杂交的能力。另外在两个寡核苷酸设计成杂交时形成一个或多个单链突出端的情况下，就确定互补性而言，这类突出端不应当视作错配。在本发明中，就满足以上杂交能力的要求时，“互补”序列还可以包括或完全形成自非Watson(沃森)-Crick(克里克)碱基对和/或从非天然的以及经修饰的核苷酸形成的碱基对。此类非Watson(沃森)-Crick(克里克)碱基对包括但不局限于G：U摇摆碱基配对或Hoogstein(胡格斯腾)碱基配对。对应地，在本发明中，如无特别说明，“错配”是指在saRNA双链体分子中，对应位置的碱基并未以互补的形式配对存在。
在本发明中，如无特别说明，“核苷酸序列的差异”是指相比于原核苷酸序列，在相同或相对应位置处的核苷酸的碱基种类发生了改变。例如，在原核苷酸序列中的一个核苷酸碱基为A时，在相同或相对应位置处的核苷酸碱基改变为U、C、G或dT、dC、dG等的情况下，认为该位置处存在核苷酸序列的差异。此处需要说明的是，在相比于原核苷酸序列，在相同或相对应位置处的核苷酸仅在是否存在修饰或修饰类型方面存在区别的情况下，不认为该位置处存在核苷酸序列的差异。
在本发明中，如无特别说明，术语“药学上可接受的”是指载体、运载体、稀释剂、辅料和/或其所形成的盐/酯/水合物等通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。
在本发明中，如无特别说明，术语“激活”是指由于saRNA介导的靶基因的mRNA表达而使靶基因表达得以上调（up-regulation）的情况。所述“上调”是指相对于无saRNA处理时，靶基因表达水平上调10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%以上的情况。
本发明中，所述saRNA还可根据需要含有修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸不会导致所述saRNA激活CEBPA基因表达的功能明显削弱或丧失。在本发明的一些实施方式中，所述saRNA的正义链或反义链中的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，例如，所述修饰的核苷酸为核糖基团以及任选的磷酸基团被修饰的核苷酸基团，但不限于此。
本发明中，所述修饰的核苷酸选自：2’-甲氧基核苷酸、2’-氟核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2’,3’-裂环核苷酸类似物、2’-氟阿糖核苷酸、2’-甲氧基乙基核苷酸、2’-氨基修饰核苷酸、2’-烷基修饰核苷酸、3’-甲氧基核苷酸、5’-甲基修饰的脱氧核糖核苷酸，但本发明不限于此。
本发明中，所述修饰的核苷酸可以为磷酸基团被硫代磷酸酯基团修饰的核苷酸。即，用一个硫原子取代磷酸二酯键中的非桥氧原子，从而以硫代磷酸二酯键替换磷酸二酯键。
本公开还提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本公开所述的saRNA作为活性成分和药学上可接受的载体。
在本公开的一些实施方式中，所述药物组合物含有1种如第一方面所述的saRNA。在本公开的另一些实施方式中，所述药物组合物含有至少2种如第一方面所述的saRNA（例如但不限于2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种）作为活性成分。
在本公开的一些实施方式中，所述药学上可接受的载体例如但不限于磁性纳米粒（magnetic nanoparticles，如Fe3O4、Fe2O3）、碳纳米管（carbon nanotubes）、介孔硅（mesoporous silicon）、磷酸钙纳米粒（calcium phosphate nanoparticles）、聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）、聚酰胺胺型树形高分子（polyamidoamine (PAMAM)dendrimer）、聚L-赖氨酸（poly(L-lysine)，PLL）、壳聚糖（chitosan）、1,2-二油酰基-3-三甲铵丙烷（1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP）、聚D型或L型乳酸/羟基乙酸共聚物（poly(D&L-lactic/glycolic acid) copolymer，PLGA）、聚（2-氨乙基乙撑磷酸酯）（poly(2-aminoethyl ethylene phosphate)，PPEEA）和聚（甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯）（poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate)，PDMAEMA）以及它们衍生物中的一种或多种。在本公开的药物组合物中，对药学上可接受的载体的含量没有特别要求，一般地，本公开的药物组合物中所含saRNA的总重量与药学上可接受的载体的重量比可为1:(1~500)，优选为1:(1~50)。
在本公开的一些实施方式中，所述药物组合物还可以包含阳离子组分以协助药物的体内递送。所述阳离子组分可以是但不限于带正电的多肽或蛋白质、阳离子脂质、带正电的聚合物等。作为所述带正电的多肽或蛋白质，可列举寡聚精氨酸、寡聚赖氨酸、鱼精蛋白等。作为所述阳离子脂质，可以是选自二甲基二（十八烷基）溴化铵盐（DDAB）、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷甲基硫酸盐、1,2-二棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷、1,2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵（DOTMA）、二肉豆蔻酰基氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵盐（DMRIE）、二油酰氧基丙基二甲基羟基乙基溴化铵（DORIE）、二甲基二(十二烷基)溴化铵、N-(a-三甲基铵基乙酰基)-二(十二烷基)-D-谷氨酰胺盐酸盐、N-(a-三甲基铵基乙酰基)-O,O’-双-(1H,1H,2H,2H-全氟癸烷基)-L-谷氨酰胺盐酸盐、O,O’-二(十二烷酰基)-N-(a-三甲基铵基乙酰基)二乙醇胺盐酸盐、甲基烯丙基二(十二烷基)溴化铵、N-｛p-(w-三甲基铵基丁基氧基)-苯甲酰基}-二(十二烷基)-L-谷氨酰胺盐酸盐、9-(w-三甲基铵基丁基)-3,6-双(十二烷酰基)咔唑溴化物、二甲基二(十八烷基)铵盐酸盐、N-w-三甲基铵基癸酰基-二(十六烷基)-D-谷氨酰胺溴化物、N-｛p-(w-三甲基铵基己基氧基)-苯甲酰基}-二(十四烷基)-L-谷氨酰胺溴化物、p-(w-三甲基铵基癸基氧基)-p’-辛氧基偶氮苯溴化物盐（MC-1-0810）、p-{w-(b-羟基乙基)二甲基-铵基-癸基氧基}-p’-辛氧基偶氮苯溴化物盐（MC-3-0810）、O,O’,O”-三(十二烷酰基)-N-(w-三甲基-铵基癸酰基)-三(羟基甲基)氨基甲烷澳化物盐（TC-1-12）、1,2-二月桂基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二肉豆蔻酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二硬脂酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1,2-二油酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-乙基磷酸胆碱、N,N-二羟乙基-N-甲基-N-2-（胆固醇氧羰基氨基）乙基溴化铵（BHEM-Chol）、（2,3-二油氧基丙基）三甲基氯化铵（DOTAP）和N-（1-（2,3-二油酰氧基）丙基）-N,N,N-三甲基氯化铵中的至少一种阳离子脂质。作为所述带正电的聚合物，可以是选自聚乙烯亚胺、聚β-氨基酯、壳聚糖季铵盐中的至少一种正电性聚合物。
出于同样的目的，所述药物组合物还可以包含非阳离子组分。所述非阳离子组分可以是但不限于中性的膜融合脂质（fusogenic lipid）、阴离子脂质、两亲性聚合物等。作为所述膜融合脂质，可以列举二油酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰胆碱、反式磷脂酰基乙醇胺、1,2-双（10，12-二十三烷二酰基）-磷酸乙醇胺、1,2-二反油酰基磷酸乙醇胺、1,2-二（十六烷基）磷酸乙醇胺、1,2-二己酰基磷酸乙醇胺、1,2-二月桂酰基磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基磷酸乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺、1,2-二棕榈油酰基磷酸乙醇胺、1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、1,2-二植烷酰磷酸乙醇胺、1,2-二硬脂酰基磷酸乙醇胺、1-棕榈酰基-2-油酰基磷酸乙醇胺、1-棕榈酰基-2-（10,12-二十三烷二酰基）磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-己酰胺、1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-己酰胺、N,N-二甲基-1,2-二油酰基磷酸乙醇胺、N,N-二甲基-1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、N-十二烷酰基-1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、N-十二烷酰基-1,2-二油酰基磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-十二烷基胺、1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-十二烷基胺、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-戊二酰、1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-戊二酰、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-乳糖、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-[4（p-马来酰亚胺甲基）环己烷-羧酸盐]、二棕榈酰磷酸乙醇胺-N-[4-（p-马来酸亚胺甲基）环己烷-羧酸盐]、1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-[4-（p-马来酰亚胺苯基）丁酰胺]、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-[4-（p-马来酰亚胺苯基）丁酸盐]、N-甲基-1,2-二油酰基磷酸乙醇胺、N-甲基-二棕榈酰基磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基磷酸乙醇胺-N-[3-（2-吡啶二硫）丙酸盐、1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺-N-[3-（2-吡啶二硫）丙酸盐]、N-（琥珀酰）-1,2-二油酰基磷酸乙醇胺、N-（琥珀酰）-1,2-二棕榈酰基磷酸乙醇胺等。在本公开的药物组合物中，通过含有上述膜融合脂质，能够进一步提高所述药物组合物在哺乳动物体内的转运及输送效率。作为所述两亲性聚合物，可以列举聚乙二醇-聚乳酸两嵌段共聚物、聚乙二醇-聚乳酸三嵌段共聚物、聚乙二醇-聚（乳酸-乙醇酸）两嵌段共聚物、或聚乙二醇-聚（乳酸-乙醇酸）三嵌段共聚物、聚己内酯-聚磷酸酯两嵌段共聚物、聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物、聚乙二醇-聚己内酯两嵌段共聚物、聚乙二醇-聚己内酯三嵌段共聚物等。
在本公开的一些实施方式中，所述药物组合物还可以包含药学上可接受的其它辅料。所述药学上可接受的其它辅料可以包括pH值缓冲液、保护剂和渗透压调节剂中的至少一种。所述缓冲液可以为pH值7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液和/或pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，优选为pH值5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。所述保护剂可以为肌醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖和葡萄糖中的至少一种。以所述药物组合物的总重量为基准，所述保护剂的含量可以为0.01-30重量%。所述渗透压调节剂可以为氯化钠和/或氯化钾。所述渗透压调节剂的含量使所述药物组合物的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克。根据所需渗透压，本领域技术人员可以容易地确定所述渗透压调节剂的含量。
在本公开的一些实施方式中，所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过喷雾给药到肺脏、或通过喷雾经肺脏给药到其它脏器组织（如肝脏）。优选地，所述药物组合物用于静脉注射给药。
附图说明
图1为实施例3中CEBPA蛋白表达量检测结果图；
图2为实施例3中CEBPA蛋白表达量检测结果图。
具体实施方式
本领域技术人员知晓的是，通过本领域的常规saRNA制备方法（例如固相合成和液相合成）可以得到本发明所述的saRNA，其中，固相合成和液相合成均已有商业化订制服务。本领域技术人员也清楚知晓，通过使用具有相应修饰的核苷酸单体可以将修饰的核苷酸基团引入本发明所述的saRNA中。制备具有相应修饰的核苷酸单体的方法是本领域技术人员所熟知的，市场上也有商业化的单体供应。
实施例1：saRNA合成
对于本发明的saRNA序列的正义链和反义链，使用脱氧核苷CPG作为固相支持物；使用固相支持物合成正义链，使用通用CPG合成反义链。
48通道合成仪使用0.2μmol的规模进行序列合成。亚磷酰胺单体使用0.05M浓度，活化剂使用0.3M BTT。
在1.5ml管中进行序列的切割和脱保护，第一步使用AMA，第二步使用三乙胺三氟化氢脱二位保护基。对于包含二位全部修饰的序列，需要用氨水氨解。使用丙酮:乙醇（80:20）混合物对切割和脱保护之后的序列进行沉淀并用无RNA酶水溶解。将各序列通过LC-MS进行分析确定序列准确性、通过分光光度计定量并通过HPLC确定纯度。
在HPLC纯化、冻干并质检后，用醋酸钠醇沉换盐，用3 KD的超滤管脱盐，脱盐后通过分光光度计定量确定正义链和反义链，按1:1混合退火形成saRNA双链体。
表1、正义链序列和反义链序列
实施例2：体外mRNA水平活性检测
细胞培养和转染
HepG2细胞培养：将HepG2细胞（ATCC）在37℃，5% CO2的环境中使用MEM完全培养基（Gibco，添加10% FBS）培养至接近融合，然后使用胰酶消化细胞进行铺板，使用24孔板，每孔加入1.0×105个HepG2细胞及0.5 mL MEM完全培养基（Gibco，添加10% FBS）后立即进行转染。
BNL-LUC细胞培养：将BNL-LUC细胞在37℃，5% CO2的环境中使用DMEM完全培养基（Gibco，添加10% FBS）培养至接近融合，然后使用胰酶消化细胞进行铺板，使用24孔板，每孔加入5×104个BNL-LUC细胞及0.5 mL DMEM完全培养基（Gibco，添加10% FBS）后立即进行转染。
BNL细胞培养：将BNL细胞在37℃，5% CO2的环境中使用DMEM完全培养基（Gibco，添加10% FBS）培养至接近融合，然后使用胰酶消化细胞进行铺板，使用24孔板，每孔加入2.5×104个BNL细胞及0.5 mL DMEM完全培养基（Gibco，添加10% FBS）后立即进行转染。
细胞转染：按每孔1 μL lipofectamine 2000（Invitrogen）加入49 μL opti-MEM配制复合物1，再用opti-MEM将RNA稀释至实验所需浓度，配制成复合物2，将复合物1和2按照体积比1:1混合配制成saRNA混合物，在室温孵育15分钟后，将上诉saRNA混合物加入孔板的细胞中。继续培养24h后，更换新的完全培养基后按照上述步骤进行二次转染。第一次转染72 h或96h后进行RNA提取。单剂量实验以20 nM双链体浓度进行。多剂量测试实验以60nM、20nM、10 nM、5 nM、1 nM saRNA双链体浓度进行。
RNA提取
使用total RNA分离试剂盒（omega公司，cat:R6834-02）：收集细胞，1% PBS清洗，然后加入400 μL裂解液（含2% β-巯基乙醇）裂解细胞，后续步骤按照该RNA分离试剂盒说明书进行，最后加入30μL无RNA酶水，静置2分钟后14000g离心2分钟收集RNA即可。
cDNA合成
使用全式金的gDNA去除cDNA合成试剂盒（北京全式金生物技术有限公司，北京，中国Cat# AE311-03）进行cDNA合成。每个样品添加1μg总RNA，使用梯度热循环仪（LongGene，A600）按照说明书的步骤进行cDNA合成。
实时荧光定量PCR
将合成好的cDNA和混合母液（包含引物、qPCR预混液和超纯水）添加到384孔板（博康美华Cat# PC-0040-9U）中，使最终实时荧光定量PCR体系中含靶基因（CEBPA）或内参基因（GADPH）上下游引物各0.25μM、1×SYBR Green预混液（Applied Biosystem Cat #A25742）。
使用ΔΔCt测定法在ABI QuantStudio™ 6实时荧光PCR系统中进行实时荧光PCR。每种双链体进行3-4次独立的转染测试，每次转染进行一式3-4份测定。
本发明代表性saRNA双链体体外活性测试结果如表2-表9所示。其中，使用已知具有CEBPA基因激活效果的双链体-3，双链体-13，双链体-17，双链体-20作为阳性对照，使用无CEBPA基因激活效果的双链体-1，双链体-2为阴性对照。
表2. saRNA双链体单剂量测试结果
表3. saRNA双链体单剂量测试结果
表4. saRNA双链体单剂量测试结果
表5. saRNA双链体单剂量测试结果
表6. saRNA双链体单剂量测试结果
表7. saRNA双链体单剂量测试结果
表8. saRNA双链体单剂量测试结果
表9. saRNA双链体多剂量测试结果
实施例3: 体外蛋白水平活性检测
将HepG2细胞（ATCC）在37℃，5% CO2的环境中使用MEM完全培养基（Gibco，添加10%FBS）培养至接近融合，然后使用胰酶消化细胞进行铺板，使用24孔板，每孔加入1.0×105个HepG2细胞及0.5 mL MEM完全培养基（Gibco，添加10% FBS）后立即进行转染。
细胞转染：按每孔1 μL lipofectamine 2000（Invitrogen）加入49 μL opti-MEM配制复合物1，再用opti-MEM将RNA稀释至实验所需浓度，配制成复合物2，将复合物1和2按照体积比1:1混合配制成saRNA混合物，在室温孵育15min后，将上诉saRNA混合物加入孔板的细胞中。继续培养24 h后，更换新的完全培养基后按照上述步骤进行二次转染。以20 nM双链体浓度进行转染。
检测方式：saRNA第一次转染96 h后收集细胞，进行蛋白提取。使用RAPI裂解液（碧云天；cat: P0013B）冰上提取总蛋白。按照western blot的步骤检测CEBPA蛋白的表达水平，GAPDH蛋白作为内参蛋白。使用Image J软件对目标蛋白条带和GAPDH蛋白条带进行灰度定量，以GAPDH蛋白灰度定量数值进行归一化分析。检测结果如图1、图2所示，图中数值为相对定量值。本发明提供的saRNA双链体58、30、27、16、15、14等对于CEBPA蛋白表达具有显著的激活作用。
实施例4：大鼠肝匀浆稳定性
肝匀浆液的制备:称取200 mg肝组织于2 mL 离心管，加入 1mL 预冷的 100mM-Tris-HCL缓冲液(含 1M MgC2，pH-6.0)。使用组织匀浆机按照2000 rpm/min 的转速进行匀浆，每次匀浆 10s~15s，直至匀浆液无组织块。
大鼠肝匀浆稳定性测试：将saRNA双链体加入大鼠肝匀浆溶液中，saRNA双链体终浓度为1 uM，总体系为50 μL，每组3个重复，作为24h/72h稳定性样品。另取一组未加入saRNA双链体的大鼠肝匀浆溶液作为0h样品。将两组样品置于37℃孵育24/72h。孵育完成后，向24/72h稳定性样品中加入150 uL Loading Buffer（Phenomenex，货号AL0-8579）终止反应，向0h稳定性样品中加入150 uL Loading Buffer 后再加入saRNA双链体，saRNA双链体加入量与24h/72h样品组一致。混合均匀后向所有样品中加入50 uL 100nM的内标saRNA双链体，用Clarity OTX SPE柱纯化，最后用LC-MS检测各组样品正反义链的响应，通过比较24/72h与0 h样品响应的占比得出残留量。实验结果如表10所示。由表10可知：本发明saRNA双链体在大鼠肝匀浆体系中稳定性良好。
表10. saRNA双链体大鼠肝匀浆稳定性测试结果
实施例5：免疫原性
saRNA双链体转染前一天复苏人外周血细胞（PBMC），按1*106/孔的密度将PBMC接种到24孔板，适量saRNA双链体（终浓度为100nM）稀释至125µL opti-MEM中，4µL转染试剂GenePORTER reagent（Genlantis Cat#T202007）稀释至125µL opti-MEM中，将二者1:1混合，室温孵育15min，用250µL转染复合物重悬细胞，加到24孔板中，5% CO2浓度，37℃细胞培养箱培养4h后补加250µL 含10% FBS的1640培养基（Hyclone, Cat# SH30809.01），培养24h后分别收集上清和细胞，上清用于ELISA检测TypeⅠIFN相关蛋白：IL-6 （R&D Cat#41100）和INF-α（thermo Cat#BMS216INST）)的表达变化。细胞用于RNA提取，荧光定量PCR检测（参考实施例2）TypeⅠIFN基因（P56 和OSA1）的表达变化，P56 正向引物: 5'-GCCTCCTTGGGTTCGTCTATA-3'；P56 反向引物：5'-CTCAGGGCCCGCTCATAGTA-3'，OSA1 正向引物：5'-CGAGGGAGCATGAAAACACATTT-3'，OSA1 反向引物：5'-GCAGAGTTGCTGGTAGTTTATGAC-3'。
实验结果如表11和表12所示。阳性对照：2 μg/mL ploy IC，1 μM HG381。本发明saRNA双链体没有明显的免疫原性。
表11.saRNA双链体免疫原性测试结果
表12.saRNA双链体免疫原性测试结果
上述实验结果表明，本发明提供的saRNA具有良好的稳定性、显著的CEBPA基因激活活性，为开发新的CEBPA saRNA药物提供了新的可能。

Claims (3)

1.一种用于激活CEBPA基因表达的saRNA，其特征在于，所述saRNA包含正义链和反义链；其中，
所述反义链为：
mGfAmCfCmAfGmUfGmAmCmAfAmUfGmAfCmCfGmC*mU*mU；
所述正义链为：
fGmCmGmGfUmCfAfUfUmGfUmCfAmCfUmGfGmUfCmUmUiT；
其中，m表示与该标识m右侧相邻的一个核苷酸为2'-甲氧基修饰的核苷酸；f表示与该标识f右侧相邻的一个核苷酸为2'-氟修饰的核苷酸；*表示与该标识*左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接；i表示与该标识i右侧相邻的一个核苷酸具有反向结构。
2.一种药物组合物，其特征在于：该药物组合物包含权利要求1所述的saRNA和药学上可接受的载体。
3.权利要求1所述的saRNA和/或权利要求2所述的药物组合物在制备用于治疗肝癌、胰腺癌的药物中的用途。
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