CN118146291A - 一种蛋白降解靶向嵌合体化合物及其组合物和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种蛋白降解靶向嵌合体化合物及其组合物和应用。所述化合物的结构如下式(I)所示。本发明的化合物具有X‑射线响应效果，可以解决现有PROTACs药物系统给药后的全身毒性以及在肿瘤治疗中效果不佳的问题。

Description

一种蛋白降解靶向嵌合体化合物及其组合物和应用
技术领域
本发明涉及制药领域，具体的说，本发明涉及一种蛋白降解靶向嵌合体化合物及其组合物和应用。
背景技术
蛋白水解靶向嵌合体(PROTACs)是一种新兴的蛋白质降解技术。PROTAC是一种双异质性分子，它包含两个主要的功能部分，其中一端与感兴趣的蛋白质(the protein ofinterest，POI)结合，另一端与E3泛素连接酶结合。PROTACs劫持E3泛素连接酶并和POI结合后，POI被泛素-蛋白酶体系统(UPS)多泛素化修饰并被降解。PROTACs独特的作用机制不仅为“不可成药”蛋白质的靶向降解提供了新方法，而且还展示出了优于传统小分子抑制剂的多重优势，例如其独特的催化性能、较低的给药剂量和潜在的克服耐药性。在过去的几十年中，大量研究致力于设计新的PROTACs以拓展目标蛋白范围，开发新的E3连接酶配体以扩宽PROTACs应用，并从多个角度去提高PROTACs的性能。
尽管PROTACs在靶向蛋白降解方面具有显著的优势，但由于PROTACs本身缺乏组织选择性，PROTACs系统给药后引起的全身毒性仍是一个亟待解决的问题。为了解决这个问题，目前研究者们已经提出了一系列条件激活PROTACs前药设计策略。其中，光依赖型PROTACs(photoPROTACs)前药是最具代表性的一类策略，并在体外验证了光调控蛋白降解的可行性。尽管光诱导的蛋白质降解可以通过不同的光响应化学设计在体外实现，但由于紫外可见光的组织渗透性较差，这些策略很难被用于较深的组织中。开发新的PROTACs前药激活策略以实现对组织的选择性，降低PROTACs的系统毒性，并拓宽其在活体的应用仍然是PROTACs药物研发的重难点。
X-射线和γ-射线的电离辐射已被广泛用于放射治疗。局部放射治疗可以引起肿瘤细胞的DNA损伤，从而促使癌细胞凋亡和肿瘤坏死。此外，放射治疗过程中的电离辐射，会在细胞和活体中引起一系列化学反应，进而可激活功能团修饰的化合物。基于上述背景，本发明首先开发了一种PROTAC药物，并将其用和放射治疗联用，从而达到更有效的抗肿瘤效果。进一步地，本发明设计了受辐照调控和具有增强放疗效果的PROTAC前药。本发明所述PROTAC前药，在辐照作用下可以在体外、肿瘤细胞和活体内被有效激活，从而精准、高时空分辨率地调控蛋白质的靶向降解活性，并且释放出的PROTAC药物与放射疗法协同杀伤肿瘤，有效抑制了小鼠肿瘤的生长。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种化合物，该化合物是一种PROTAC药物。
本发明的另一目的在于提供一种化合物，该化合物是一种前药成分，能够在辐照下释放活性成分。
为达上述目的，一方面，本发明提供了一种结构如式(I)所示的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物：
其中，POI选自任一感兴趣的目标蛋白配体；E3 ligand为E3泛素连接酶配体；linker为目标蛋白配体与E3泛素连接酶配体之间的连接官能团；X为任意对辐照响应的功能分子。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述目标蛋白的配体可以来自小分子、核酸适配体、各种形式的抗体等。
根据本发明一些具体实施方案，其中，X结构为如下式(II)所示：
其中，R31选自-N3或H；
R32和R34选自卤素或-R41-Y1-R42；
R33和R35选自F、Cl、Br、I或H；
Y1选自O或S；
R41选自C1-10亚烷基；R42选自C1-10烷基；
X1选自O、S或NH。
根据本发明一些具体实施方案，其中，X结构为如下式(II-1)或式(II-2)所示：
根据本发明一些具体实施方案，其中，POI ligand为BET家族蛋白配体JQ1衍生物。
根据本发明一些具体实施方案，其中，POI ligand结构如下式(III)所示：
根据本发明一些具体实施方案，其中，linker结构为如下所示：-R17-(C＝O)m-NH-R11-(R15)a-(NR21)b-X2-R12-(A)c-R13-(CH2-O-X3)d-Y-R14-(R16)e-
R11和R14各自独立的选自C1-10亚烷基；R12、R13和R17为C1-10的亚烷基或键；
R15和R16各自独立的为-(C＝O)-；
R21选自H或C1-10的烷基；
A选自C4-12的亚杂环基或C5-10的亚杂芳基，所述亚杂环基或亚杂芳基含有1-4个选自N、O或S的杂原子；
X2、Y各自独立的为-O-、-S-或键；
X3为键或-CH2-；
a、b、c、e为0或1；d为0、1、2、3、4、5、6或7；m和n各自独立的为0或1。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述亚杂芳基选自如下结构之一：
亚噻吩基、亚呋喃基、亚吡咯基、亚异噻唑基、亚异噁唑基、亚吡唑基、亚噻二唑基、亚噁二唑基、亚噻三唑基、亚噁三唑基、亚四氮唑基、亚三氮唑基、亚吡啶基、亚嘧啶基、亚哒嗪基、亚吡嗪基、亚三嗪基；
所述亚杂环基选自如下结构之一：
氮杂环丁烷、氮杂环戊烷、氮杂环己烷、氮杂环庚烷、氮杂环辛环、氧杂环丁烷、氧杂环戊烷、氧杂环己烷、氧杂环庚烷、氧杂环辛环、硫杂环丁烷、硫杂环戊烷、硫杂环己烷、硫杂环庚烷、硫杂环辛环、二氮杂环丁烷、二氮杂环戊烷、二氮杂环己烷、二氮杂环庚烷、二氮杂环辛环、二氧杂环丁烷、二氧杂环戊烷、二氧杂环己烷、二氧杂环庚烷、二氧杂环辛环、二硫杂环丁烷、二硫杂环戊烷、二硫杂环己烷、二硫杂环庚烷、二硫杂环辛环、以及
其中可以理解的是，上述的亚杂环基和亚杂环基，与POI和E3 ligand连接的位点，即可以是亚杂环基和亚杂环基上的C原子，也可以是杂原子；当C原子或杂原子作为连接位点时，该C原子或杂原子的H原子会被取代，譬如，当连接位点是N原子时，-NH-的H会被取代，而变成
根据本发明一些具体实施方案，其中，
所述亚杂环基选自如下结构之一：
所述亚杂环基选自如下结构之一：
根据本发明一些具体实施方案，其中，linker结构选自如下结构之一：
-(C＝O)-NH-R11-(CH2-O-CH2)d1-R14-、
-(C＝O)-NH-R11-(R15)a-(NR21)-R12-(CH2-O-CH2)d2-R14-、
-(C＝O)-NH-R11-X-R12-A-R13-(CH2-O-CH2)d2-Y-R14-(R16)e-、
-(C＝O)-NH-R11-R12-R13-R14-；或
-R17-(C＝O)-NH-R11-R14-NH-(C＝O)-
其中，R11、R12、R13和R14各自独立的选自C1-4的亚烷基；R21为H或C1-4的烷基；d1为1、2、3、4或5；d2为0、1、2、3或4。
根据本发明一些具体实施方案，其中，linker结构选自如下结构之一：
其中，p为1、2、3、4或5。
根据本发明一些具体实施方案，其中，E3 ligand选自VHL、CRBN、GID4、DCAF2、KLHL41、SPSB4、TRIM7、TRIM9、RNF43和RNF182的E3连接酶的配体。
根据本发明一些具体实施方案，其中，E3 ligand结构如下式(IV-1)或式(IV-2)所示：
其中，R1、R2和R3各自独立的选自C1-10的烷基；任选的，所述烷基进一步被H、卤素、羟基、羧基、氨基、氰基、羰基或C1-5的烷基所取代；
环B为C4-10的杂环烷基；所述杂环烷基任选被0、1、2、3或4个＝O所取代；所述杂环烷基含有1、2、3或4个选自N、O和S的杂原子，且至少含有一个N原子；
环C为C6-12的芳香环；所述芳香环任选被0、1、2、3、4、5或6个选自F、Cl、Br、I、C1-6烷基、羟基、氨基、氰基和硝基的取代基所取代；
R51选自-O-或-NH-。
根据本发明一些具体实施方案，其中，X连接在E3 ligand结构上或者linker上。
根据本发明一些具体实施方案，其中，X连接在E3 ligand或linker结构的羟基或氨基上。
其中可以理解的是，所述的连接X的氨基，也可以是E3 ligand或linker结构上的亚氨基(-NH-)。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述化合物结构如下式(V-1)、(V-2)、(V-3)和(V-4)所示：
根据本发明一些具体实施方案，其中，R1、R2和R3各自独立的选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2-乙基丁基或3-乙基丁基。
根据本发明一些具体实施方案，其中，环B为选自如下结构的杂环烷基：
所述杂环烷基任选被0、1、2、3或4个＝O所取代。
根据本发明一些具体实施方案，其中，环C为选自如下结构的芳香环：
所述芳香环任选被0、1、2、3、4、5或6个选自F、Cl、Br、I、C1-6烷基、羟基、氨基、氰基和硝基的取代基所取代。
根据本发明一些具体实施方案，其中，环B选自如下的杂环烷基：
根据本发明一些具体实施方案，其中，环C为选自如下结构的芳香环：
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述化合物选自如下所示的结构之一：
另一方面，本发明还提供了一种式(VI)所示的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物：
其中，X的结构如本发明前面所述。
根据本发明一些具体实施方案，其中，DRUG为任意PROTAC药物。
根据本发明一些具体实施方案，其中，DRUG为如下式(VII)
POI-linker-E3 ligand
(VII)
其中，POI、linker和E3 ligand结构如本发明前面任意所述。
根据本发明一些具体实施方案，其中，X的构如下所示：
又一方面，本发明还提供了一种含有本发明任意所述的化合物(包括式(I)、式(V-1)、(V-2)、(V-3)、(V-4)和式(VI)所示的化合物)或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物的药物组合物。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述组合物还含有药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物，可以以任意可行的方式对患者进行药物治疗。包括但不局限于：局部给药、口服、喷雾吸入、直肠给药、鼻腔给药、阴道给药、皮下注射、静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射、心室内注射、颅内注射或输入，或借助一种外植的储器用药，其中优选口服、肌肉注射或静脉内用药方式。
本明的化合物可以单独使用，也可以与其他应用于肿瘤治疗的药物或者载体协同使用。
当将本发明的化合物与其他治疗药物联合使用时，通常将合适剂量的本发明化合物以及药物载体或其他药物制成适当的药物形式。因此本发明还提供了药物协同用药形式，它包含了有效剂量的本发明所述化合物以及至少一种其它类型的可药用载体或治疗药物。
又一方面，本发明还提供了本发明前面任意所述的化合物(包括式(I)、式(V-1)、(V-2)、(V-3)、(V-4)和式(VI)所示的化合物)或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物、或所述的药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述的治疗肿瘤药物是配合肿瘤放射治疗的药物。
又一方面，本发明还提供了一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括给药本发明前面任意所述的化合物(包括式(I)、式(V-1)、(V-2)、(V-3)、(V-4)和式(VI)所示的化合物)或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物、或所述的药物组合物。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述方法包括在对肿瘤放射治疗时给予本发明前面任意所述的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物、或所述的药物组合物。
根据本发明一些具体实施方案，其中，所述的放射治疗的放射线选自α射线、β射线、γ射线或X射线。
其中可以理解的是，本发明所述的“对肿瘤放射治疗时”，可以包括在施以放射射线的过程中、以及在施以放射射线前的可接受的时间内。
本发明的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物、或所述的药物组合物可用于各种肿瘤的治疗。尤其适用于制备临床上以放射治疗为一线治疗手段的癌症的治疗药物。本发明的化合物，特别是式(I)的化合物，不仅可以与放射治疗联合使用，用于增强放射治疗的疗效，从而降低放射治疗的剂量和给药频率，也有望克服放疗耐药等问题。同时，这些放疗响应型的PROTAC分子在没有辐照时，因为关键的活性位点，尤其是靶蛋白结合配体和E3连接酶配体上的关键活性位点，被修饰上“化学笼”，因此在没有进行辐照时，化合物以前药形式存在。这些前药不会发挥蛋白降解功能，因此可以降低药物的全是毒性。但是，当对特定病灶，例如肿瘤部位，进行局部辐照后，辐照产生的活性物质会诱发辐照响应的“化学笼”经历特殊的化学反应，释放出具有蛋白降解活性的化合物。这些释放出的化合物对病灶部位的目标蛋白进行高效降解，从而增强放射治疗的效果。
其中可以理解的是，本发明所述的“任选的”，应当理解为该事件或情况可以发生、也可以不发生。譬如，所述的“任选的，所述烷基进一步被H、卤素、羟基、羧基、氨基、氰基、羰基或C1-5的烷基所取代”，应当理解为所述烷基可以被上述的H、卤素、羟基、羧基等的取代基所取代，也可以不被上述的H、卤素、羟基、羧基等的取代基所取代。
本发明所述的“异构体”，包括几何异构体(如手性异构、顺反异构等)和互变异构体。
附图说明
图1为PROTAC化合物AS2对BRD4降解效果。
图2为辐照响应PROTAC化合物A2未辐照前对BRD4降解效果。
图3为辐照响应PROTAC化合物A2与X-射线辐照共同处理细胞后BRD4降解效果。
图4为Annexin V/PI双染检测凋亡效果。
图5为AS2和A1分子在体内抗肿瘤活性研究时间轴。
图6为AS2和放疗联合作用后肿瘤生长曲线。
图7为AS2和放疗联合作用后肿瘤质量。
图8为A1和放疗联合作用后肿瘤生长曲线。
图9为A1和放疗联合作用后肿瘤质量。
具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明的实施过程和产生的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。
实施例1本发明X-射线响应型蛋白降解嵌合体前药及类似物的制备
在以上技术方案的基础上，本发明首先提供了上述一种化合物A1及其类似物B1、C1、D1的制备方法，包括下列步骤：
a)首先合成了一个X-射线响应的功能单元，S1。具体地：
向100mL圆底烧瓶中加入丙酮/H2O(30mL，2:1)的混合溶液。随后，向混合溶液中加入2,3,4,5,6-五氟苯甲醛(1.53g,1.0mL,7.77mmol,1.00eq.)和NaN3(0.532g,8.18mmol，1.06eq)。混合物在80℃下回流过夜。反应结束后，将反应混合物冷却至室温，除去丙酮。向混合物中添加30mL H2O，随后用Et2O(3×50mL)萃取混合物。萃取后的有机相用50mL盐水洗涤，并经MgSO4干燥、过滤、蒸发溶剂。残余物通过柱色谱法(PE/AcOEt＝40:1)纯化，得到淡黄色固体产物。
1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:10.26(s,1H)。
13C NMR(CDCl3,100MHz)δ:181.60,148.35,145.81,141.57,138.86,126.34,110.67。
19F NMR(CDCl3,376MHz)δ:-144.92,-150.97。
将得到的固体产物(1.00g,4.56mmol,1.0eq)溶解在乙酸(15mL)中，加入Me2NH·BH3(0.322g,5.47mmol,1.2eq)。将溶液在室温搅拌反应2小时。随后添加H2O(50mL)到溶液中，然后用Et2O(3×30mL)萃取混合物。萃取所得的有机相用15％ Na2CO3(2x 50mL)和盐水(50mL)洗涤，并经MgSO4干燥、过滤并蒸发溶剂。通过快速柱色谱法(PE/AcOEt＝5:1)纯化残余物，得到淡黄色固体(856.4mg，产率85％)。该固体即为化合物S1。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:4.53(s,1H)。
13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:176.39,146.30,143.98,141.85,139.14,115.78,51.13。
19F NMR(DMSO-d6,470MHz)δ:-145.39,-152.90。
b)合成感兴趣目标蛋白的配体S2。具体地：
(S)-(+)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑并[4,3-a][1,4]二氮杂卓-6-基)乙酸叔丁酯(1.0g，2.2mmol)溶解在CH2Cl2(20mL)中，并向溶液中缓慢加入CF3COOH(3mL)。将混合物在室温下搅拌12小时。TLC监测反应过程。反应完成后，真空蒸发溶剂并将其通过硅胶柱层析(CH2Cl2:MeOH＝100:6)纯化，得到白色固体即为化合物S2(771.8mg，88％产率)。
1H NMR(CDCl3,300MHz)δ:1.69(s,3H),2.41(s,3H),2.70(s,3H),3.56-3.76(m,2H),4.64(t,J＝6.9Hz,2H),7.35(d,J＝8.25Hz,2H),7.44(d,J＝8.22Hz,2H)。
13C NMR(CDCl3,75MHz)δ:173.74,164.20,155.29,150.02,137.00,136.30,131.87,131.29,131.03,130.62,129.96,128.76,77.46,77.04,76.61,53.70,36.73,14.43,13.14,11.69。
c)化合物AS1合成。具体地：
将HATU(2.5g，6.6mmol)、DIPEA(0.85g,6.6mmol)和5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷二酸-1-叔丁酯(1.0g，3.3mmol)溶解到DMF(12mL)中。缓慢向溶液中加入E3连接酶配体S3(1.47g,3.3mmol)。随后，将混合物在室温搅拌反应24小时。反应完成后，将混合物用EtOAc(100mL×3)稀释，用水(50mL)和饱和NaCl溶液(50mL)洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥、过滤、减压浓缩并通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2:MeOH＝100:5)纯化，得到油状液体即为化合物AS1(1.67g,产率69％)。
1H NMR(CDCl3,300MHz)δ:1.69(s,3H),2.41(s,3H),2.70(s,3H),3.56-3.76(m,2H),4.64(t,J＝6.9Hz,2H),7.35(d,J＝8.25Hz,2H),7.44(d,J＝8.22Hz,2H)。
13C NMR(CDCl3,75MHz)δ:173.74,164.20,155.29,150.02,137.00,136.30,131.87,131.29,131.03,130.62,129.96,128.76,77.46,77.04,76.61,53.70,36.73,14.43,13.14,11.69。
类似地，将上述反应中5,8,11-三氧杂-2-氮杂十三烷二酸-1-叔丁酯替换为2,2-二甲基-4-氧代-3,8,12-三氧杂-5-氮杂十四烷-14-油酸，或者11-((叔丁氧基羰基)氨基)十一烷酸，分别得到化合物BS1、CS1，分子结构如表1：
表1
d)化合物AS2合成。具体地：
缓慢将化合物AS1(1.0g，1.4mmol)加入到CH2Cl2(15mL)和CF3COOH(3mL)的混合溶液中，并将混合物在室温搅拌6小时。随后减压蒸发混合物中的溶剂。将上述产物、化合物S2(840mg，2.1mmol)、HATU(799mg，2.1mmol)和DIPEA(271mg，2.1mmol)缓慢加入到DMF(20mL)溶液中，并将混合物在室温搅拌24小时。反应完成后，用EtOAc(50mL×3)稀释反应后的混合物，并用水(100mL)和饱和NaCl溶液(50mL×3)进行洗涤。洗涤后所得有机层用无水Na2SO4干燥、过滤、减压浓缩并通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2:MeOH＝100:3)纯化，得到化合物AS2。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:0.95(s,3H),1.37(s,3H),1.76-1.82(m,1H),2.03-2.07(m,1H),2.46(s,3H),3.08(d,J＝5.68,2H),3.40(t,J＝5.80,2H),3.52-3.60(m,10H),3.96(s,2H),4.29(s,1H),4.45(t,J＝15.96,1H),4.56(d,J＝9.52,1H),4.91(t,J＝6.96,1H),5.11(d,J＝3.32,1H),6.72(s,1H),7.36-7.38(m,3H),7.42-7.44(m,2H),8.42(d,J＝7.56,1H),8.98(s,1H)。
13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:170.93,169.50,168.99,156.05,151.91,148.23,145.16,131.58,130.18,129.30,126.81,78.04,70.93,70.29,70.09,69.99,69.67,69.25,59.04,56.99,56.18,55.36,48.22,38.19,36.20,28.70,26.71,22.91,16.45。
类似地，将上述反应中AS1替换为BS1或CS1，分别得到化合物BS2、CS2，分子结构如表2：
表2
d)化合物DS1的合成。具体地：
将HATU(2.5g，6.6mmol)、DIPEA(0.85g,6.6mmol)和S2(1.0g，3.3mmol)溶解到DMF(12mL)中。缓慢向溶液中加入2-(2-叠氮基乙氧基)乙烷-1-胺(429.5mg,3.3mmol)。随后，将混合物在室温搅拌反应24小时。反应完成后，将混合物用EtOAc(100mL×3)稀释，用水(50mL)和饱和NaCl溶液(50mL)洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥、过滤、减压浓缩并通过硅胶柱色谱法(PE:EA＝1:1)纯化，得到白色固体即为化合物DS1(1.02g,产率61％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.29(t,J＝5.7Hz,1H),7.49(d,J＝8.4Hz,2H),7.42(d,J＝8.4Hz,2H),4.51(dd,J＝7.9,6.1Hz,1H),3.62(t,J＝4.9Hz,2H),3.50(t,J＝5.9Hz,2H),3.41(t,J＝4.9Hz,2H),3.35–3.16(m,4H),2.59(s,3H),2.41(s,3H),1.62(s,3H)。
13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ169.69,162.98,155.09,149.79,136.76,135.20,132.26,130.68,130.13,129.81,129.55,128.44,69.00,68.97,53.82,49.95,38.53,37.52,14.03,12.67,11.28。
f)化合物DS2的合成。具体地：
将HATU(2.5g，6.6mmol)、DIPEA(0.85g,6.6mmol)和3-(丙-2-炔-1-氧基)丙酸(422.8mg，3.3mmol)溶解到DMF(12mL)中。缓慢向溶液中加入E3连接酶配体S3(1.47g,3.3mmol)。随后，将混合物在室温搅拌反应24小时。反应完成后，将混合物用EtOAc(100mL×3)稀释，用水(50mL)和饱和NaCl溶液(50mL)洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥、过滤、减压浓缩并通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2:MeOH＝100:5)纯化，得到油状液体即为化合物DS2(1.32g,产率72％)。
1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.88(s,1H),7.51–7.38(m,4H),4.65(s,1H),4.60–4.48(m,4H),4.36(d,J＝15.5Hz,1H),4.16(dd,J＝2.4,0.8Hz,2H),3.90(dt,J＝11.1,1.7Hz,1H),3.84–3.72(m,3H),2.85(t,J＝2.4Hz,1H),2.60(ddd,J＝15.1,7.5,5.4Hz,1H),2.53–2.44(m,4H),2.22(ddt,J＝13.1,7.7,2.0Hz,1H),2.08(ddd,J＝13.3,9.1,4.6Hz,1H),1.04(s,9H)。
13C NMR(101MHz,Methanol-d4)δ174.46,173.49,172.20,152.84,149.05,140.28,133.35,131.53,130.38,128.98,80.42,76.05,71.09,66.92,60.82,59.03,58.91,57.99,43.71,38.91,37.12,36.72,27.02,15.79。
g)化合物DS3的合成。具体地：
将DS1(50mM DMSO溶液，2.3mL，0.12mmol)和DS2(50mM DMSO溶液，2.3mL，0.12mmol)混合，用4mL叔丁醇稀释，然后将预混合的三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(THPTA，50mM水溶液，4.7mL，0.23mmol)和硫酸铜(II)(100mM水溶液，1.2mL，0.12mmol)溶液加入上述溶液中。最后，向其中加入新鲜制备的L-抗坏血酸钠溶液(200mM在水中，3mL，0.59mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将该溶液用50mL水稀释，并用二氯甲烷和乙酸乙酯各50mL萃取两次。有机层用无水硫酸钠干燥、合并、减压浓缩并通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2:MeOH＝100:10)得到DS3，为白色固体(101.0mg，产率81％)。
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.71(s,1H),7.98(s,1H),7.63–7.55(m,2H),7.46–7.29(m,9H),4.76(t,J＝8.2Hz,1H),4.70–4.47(m,7H),4.46–4.41(m,1H),4.35(dd,J＝15.1,5.4Hz,1H),4.15(d,J＝11.4Hz,1H),3.89–3.71(m,3H),3.70–3.63(m,1H),3.59(dd,J＝11.3,3.3Hz,1H),3.54–3.22(m,6H),2.65(s,3H),2.59–2.47(m,4H),2.46–2.32(m,4H),2.19(dd,J＝13.4,7.9Hz,1H),1.65(s,3H),0.96(s,9H)。
h)化合物AS3合成。具体地：
缓慢将化合物AS2(200mg,0.2mmol)、4-硝基苯甲酰氯(201mg,1.0mmol)和DMAP(24mg,0.2mmol)加入无水CH2Cl2(8.0mL)中，并将混合物在室温搅拌12小时。反应完成后除去溶剂得到粗产物，随后将其通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2:MeOH＝100:3)纯化，得到白色固体状即为化合物S5(116mg,产率49％)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:1.00(s,9H),1.41(d,J＝6.96,3H),1.62(s,3H),2.07-2.14(m,1H),2.40(s,3H),2.46-2.48(m,4H),2.60(s,3H),3.25-3.31(m,4H),3.49(t,J＝5.96,2H),3.57-3.66(m,8H),3.85(dd,J＝12.08,3.12,1H),4.01(d,J＝1.36,2H),4.33(d,J＝8.16,1H),4.47(d,J＝8.84,1H),4.52-4.58(m,2H),4.92-4.99(m,1H),5.31(s,1H),7.39-7.52(m,9H),7.64-7.66(m,2H),8.27-8.34(m,3H),8.51(d,J＝7.64,1H),8.99(s,1H)。
13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:170.16,170.09,169.86,169.83,163.47,155.70,155.60,151.92,150.26,148.24,145.71,144.98,137.23,135.71,132.73,131.57,131.16,130.60,130.31,130.26,130.05,129.34,128.90,126.83,125.79,123.24,79.65,79.10,70.87,70.28,70.11,70.07,69.95,69.71,58.49,57.01,54.32,53.87,48.38,39.11,38.01,35.18,26.65,22.89,16.44,14.49,13.12,11.75。
类似地，将上述反应中AS2替换为BS2、CS2或DS3，分别得到化合物BS3、CS3、DS4，分子结构如表3：
表3
i)化合物A1合成。具体地：
缓慢将化合物AS3(100mg,0.08mmol)、化合物S1(66mg,0.3mmol)和DMAP(37mg,0.3mmol)溶解在无水DMF(5.0mL)中，并将混合物在50℃搅拌12小时。减压蒸发溶剂即可得到粗产物，并将其通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2:MeOH＝100：5)纯化，得到白色固体即为化合物A1(56mg，产率55％)。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:8.94(s,1H),8.52(d,J＝7.44,1H),8.29(t,J＝4.84,1H),7.46-7.36(m,7H),5.27-5.19(m,3H),4.91-4.88(m,1H),4.52-4.42(m,3H),4.00-3.96(m,16H),3.60-3.58(m,10H),3.39-3.19(m,6H),2.61(s,3H),2.45(s,3H),2.40(s,3H),2.04-1.99(m,1H),1.61(s,3H),1.39(d,J＝6.80,3H),0.94(s,9H)。
13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δ:170.14,170.05,169.62,169.34,163.46,155.60,153.72,151.94,150.25,148.25,144.97,137.25,135.69,132.74,131.56,131.16,130.61,130.30,130.24,130.05,129.33,128.91,126.80,109.37,77.95,70.91,70.28,70.07,69.96,69.71,58.47,57.02,56.53,54.32,48.33,39.11,37.99,35.58,34.98,26.61,22.89,16.44,14.50,13.14,11.75。
19F NMR(DMSO-d6,470MHz)δ:-143.03,-152.23。
HRMS(ESI)for C58H63ClF4N12O10S2[M+Na]+:calcd.:1285.37539；found:1285.37580。
类似地，将上述反应中AS3替换为BS3、CS3或DS4，分别得到化合物B1、C1、D1，分子结构如表4：
表4
/>
ii)化合物A2-D2合成。
A2，B2，C2，D2的合成操作与A1，B1，C1，D1操作一致。具体的，缓慢将化合物AS3(或BS3、CS3或DS4)以及3,5-二甲氧基苄醇和DMAP溶解在无水DMF中，并将混合物在50℃搅拌12小时。减压蒸发溶剂即可得到粗产物，并将其通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2:MeOH＝100：5)纯化，得到白色固体即为化合物A2(56mg，产率55％)(或B2、C2或D2)。
表5
/>
化合物ES3的合成。具体地：
将4-叠氮基四氟苯甲醛(ES1,5.5g,25.1mmol),N-(5-氨基戊基)氨基甲酸叔丁酯(4.7g,25.1mmol)，三乙酰氧基硼氢化钠(2.7g,12.6mmol)以及乙酸(7.6g,126mmol)溶于无水DCM中，升温至50℃反应8小时。反应完成后，将混合物用EtOAc(100mL 5×3)稀释，用水(50mL)和饱和NaCl溶液(50mL)洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥、过滤、减压浓缩并通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2:EA＝4:1)纯化得到化合物ES2(6.5g,产率66％)。
1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:1.36-1.39(m,2H),1.42(s,12H),1.49-1.52(m,2H),2.53-2.57(m,2H),3.17-3.20(m,2H),3.76(s,2H),4.16(s,1H),6.76(s,1H)。
13C NMR(DMSO-d6,75MHz)δ:155.9,146.8,135.6,114.2,103.8,79.5,49.2,40.8,35.8,28.4,27.3,25.0。
类似地，将上述反应中4-叠氮基四氟苯甲醛替换为3,5-二甲氧基苯甲醛，可得到化合物ES3，分子结构如表6：
表6
化合物S31的合成。具体地：
将HATU(2.5g，6.6mmol)、DIPEA(0.85g,6.6mmol)和S2(1.0g，3.3mmol)溶解到DMF(12mL)中。缓慢向溶液中ES2(1.3g,3.3mmol)。随后，将混合物在室温搅拌反应24小时。反应完成后，将混合物用EtOAc(100mL 5×3)稀释，用水(50mL)和饱和NaCl溶液(50mL)洗涤。有机层用无水Na2SO4干燥、过滤、减压浓缩并通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2:MeOH＝100:5)纯化，得到化合物S31(3.7g,产率72％)。
1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:1.42(s,12H),1.49-1.52(m,4H),2.14(s,3H),2.35(s,3H),2.36(s,3H),2.71-2.96(m,2H),3.18(t,J＝8.46Hz,2H),4.72(t,J＝9.64Hz,1H),4.91(s,1H),6.76(s,1H),7.51(d,J＝6.86Hz,2H),7.75(d,J＝6.96Hz,2H)。
13C NMR(DMSO-d6,75MHz)δ:172.0,168.6,155.9,155.6,149.3,146.8,137.1,136.6,136.0,135.6,133.9,131.4,130.6,128.9,120.8,114.2,103.8,79.5,55.4,48.9,39.9,38.7,35.8,28.4,27.3,26.7,25.0,12.2,10.4。
类似地，将上述反应中ES2替换为ES3，得到化合物S41，分子结构如表7:
表7
化合物A3的合成。具体地：
缓慢将化合物S31(1.0g，1.4mmol)加入到CH2Cl2(15mL)和CF3COOH(3mL)的混合溶液中，并将混合物在室温搅拌6小时。随后减压蒸发混合物中的溶剂。将上述产物、DIPEA(724mg，5.6mmol)和2-(2,6-二氧杂环哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮(387mg，1.4mmol)缓慢加入到DMF(20mL)溶液中，并将混合物在90℃搅拌24小时。反应完成后，用EtOAc(50mL×3)稀释反应后的混合物，并用水(100mL)和饱和NaCl溶液(50mL×3)进行洗涤。洗涤后所得有机层用无水Na2SO4干燥、过滤、减压浓缩并通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2:MeOH＝100:4)纯化，得到化合物A3。
1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:1.49-1.52(m,4H),2.02-2.11(m,2H),1.49-1.52(m,4H),2.14(s,3H),2.21-2.27(m,2H),2.35(s,3H),2.36(s,3H),2.71-2.96(m,2H),3.18(t,J＝8.46Hz,2H),3.29-3.31(m,2H),4.44(t,J＝11.96Hz,1H),4.72(t,J＝9.64Hz,1H),4.91(s,1H),6.79(s,1H),6.98(d,J＝7.56Hz,1H),7.25(d,J＝5.96Hz,1H),7.51(d,J＝6.86Hz,2H),7.59(t,J＝8.84Hz,1H)7.75(d,J＝6.96Hz,2H)。
13C NMR(DMSO-d6,75MHz)δ:173.8,172.0,168.9,168.6,167.9,155.6,149.3,147.4,146.8,137.3,137.1,136.6,136.0,135.6,133.9,132.8,131.4,130.6,128.9,120.3,117.0,116.1,114.2,112.1,103.8,62.8,55.4,50.6,48.9,39.9,38.7,29.4,27.0,26.4,21.3,12.2,10.4。
类似地，将上述反应中S31替换为S41，得到化合物B3，分子结构如表8：
表8
化合物S51的合成。具体地：
缓慢将化合物2-(2,6-二氧杂环哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮(1.0g，3.6mmol)加入到CH2Cl2(15mL)中，冷却到0℃，加入NaH(103mg，4.3mmol)，在0℃反应1小时，随后加入4-叠氮基四氟甲基碳酸酰氯(1.2g，4.3mmol)并将混合物在室温搅拌6小时。随后减压蒸发混合物中的溶剂。反应完成后，用EtOAc(50mL×3)稀释反应后的混合物，并用水(100mL)和饱和NaCl溶液(50mL×3)进行洗涤。洗涤后所得有机层用无水Na2SO4干燥、过滤、减压浓缩并通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2:PE＝1:3)纯化，得到化合物S51。
1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:2.02-2.27(m,4H),2.02-2.11(m,2H),4.44(t,J＝8.36Hz,1H),5.05(s,2H),7.61-7.63(m,2H),7.74-7.75(m,1H)。
13C NMR(DMSO-d6,75MHz)δ:174.2,167.9,158.0,154.2,147.2,134.8,133.8,133.6,119.3,119.0,117.9,104.4,60.0,51.7,26.6,21.3。
类似地，将上述反应中4-叠氮基四氟甲基碳酸酰氯替换为3,5-二甲氧基苄基碳酸酰氯，得到化合物S61，如表9：
表9：
化合物ES7的合成。具体地：
缓慢将化合物S2(1.0g，2.5mmol)、(4-氨基丁基)氨基甲酸叔丁酯(470mg，2.5mmol)、HATU(1.14g，3.0mmol)和DIPEA(388mg，3.0mmol)缓慢加入到DMF(20mL)溶液中，并将混合物在室温搅拌24小时。反应完成后，用EtOAc(50mL×3)稀释反应后的混合物，并用水(100mL)和饱和NaCl溶液(50mL×3)进行洗涤。洗涤后所得有机层用无水Na2SO4干燥、过滤、减压浓缩并通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2:MeOH＝100:3)纯化，得到化合物ES7。
1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:1.42(s,12H),1.51-1.53(m,4H),2.14(s,3H),2.35(s,3H),2.36(s,3H),2.71-3.10(m,4H),3.18(t,J＝9.56Hz,2H),4.72(t,J＝10.26Hz,1H),6.76(s,2H),7.51(d,J＝8.36Hz,2H),7.75(d,J＝8.68Hz,1H)。
13C NMR(DMSO-d6,75MHz)δ:173.3,168.6,155.9,155.6,149.3,137.1,136.6,136.0,133.9,131.4,130.6,128.9,120.3,79.5,55.1,42.1,38.9,35.8,28.4,27.1,27.0,12.2,10.5,10.4。
化合物C3的合成。具体地：
缓慢将化合物ES7(1.0g，1.8mmol)加入到CH2Cl2(15mL)和CF3COOH(3mL)的混合溶液中，并将混合物在室温搅拌6小时。随后减压蒸发混合物中的溶剂。将上述产物、化合物S51(941mg，1.8mmol)和DIPEA(931mg，7.2mmol)缓慢加入到DMF(20mL)溶液中，并将混合物在室温搅拌24小时。反应完成后，用EtOAc(50mL×3)稀释反应后的混合物，并用水(100mL)和饱和NaCl溶液(50mL×3)进行洗涤。洗涤后所得有机层用无水Na2SO4干燥、过滤、减压浓缩并通过硅胶柱色谱法(CH2Cl2:MeOH＝100:5)纯化，得到化合物C3。
1H NMR(DMSO-d6,300MHz)δ:1.49-1.52(m,4H),2.02-2.11(m,2H),2.14(s,3H),2.21-2.27(m,2H),2.35(s,3H),2.36(s,3H),2.71-3.03(m,4H),3.30(m,2H),4.44(t,J＝8.56Hz,1H),4.72(t,J＝10.96Hz,1H),5.05(s,2H),6.79(s,2H),6.98(d,J＝8.56Hz,1H),7.25(d,J＝9.12Hz,1H),7.51(d,J＝8.38Hz,2H),7.59(t,J＝12.02Hz,1H),7.75(d,J＝8.68Hz,1H)。
13C NMR(DMSO-d6,75MHz)δ:174.7,174.2,173.3,168.6,167.9,155.6,154.2,149.3,147.4,147.2,137.3,137.1,136.6,136.0,134.8,133.9,132.8,131.4,130.6,128.9,120.3,117.9,117.0,116.1,112.1,104.4,60.0,55.1,51.7,50.6,42.1,38.9,27.4,26.6,26.1,21.3,12.2,10.5,10.4。
类似地，将上述反应中S51替换为S61，得到化合物D3，如表10：
表10：
试验例
试验例1本发明所有实施例的蛋白降解嵌合体的体外抗肿瘤效果
实验流程：取对数期MCF-7细胞进行实验。将细胞以5000个细胞/每孔的密度接种在96孔板中，37℃贴壁24小时。使用实施例化合物A1-D3处理细胞3h，随后对辐照组采用10-30Gy的X-射线进行辐照，辐照完成后继续培养细胞至72小时。药物处理结束后，向每孔中加入20μL CellTiter溶液。将孔板在培养箱内孵育2-4小时后用酶标仪测定吸光度。利用GraphPad Prism软件计算各个化合物的IC50。
实验结果见表11
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由上表可知，本发明化合物A1-D3在未进行辐照时，均对MCF-7细胞无明显的抑制活性；但是当对加了药物的细胞进行辐照处理后，由于辐照引起X-射线响应基团的断裂，释放出PROTAC分子，从而具有显著的细胞毒性。
试验例2PROTAC药物AS2及辐照响应PROTAC前药A1蛋白降解活性测试
细胞处理：取对数期MCF-7细胞进行实验。将细胞以5.0×105个细胞/每孔的密度接种在六孔板中，37℃贴壁24小时。使用实施例化合物A1-D3处理细胞3h，随后采用10Gy或30Gy的X-射线进行辐照，辐照完成后继续培养细胞至24小时。
细胞全蛋白提取：
药物处理完成后，弃掉培养基并用冷PBS洗涤细胞3次。使用细胞刮刀将细胞刮下，小心吸取所得溶液，在4℃下以300g转速离心5分钟得到细胞，PBS洗涤后重悬并以相同条件离心。
细胞裂解：用预冷的PBS洗涤细胞，并在预冷的裂解缓冲液(含有1％蛋白酶和磷酸酶抑制剂)中对细胞裂解30分钟，裂解过程中多次剧烈涡旋细胞。裂解完成后，在4℃下以11000g离心15分钟，收集上清液即为细胞全蛋白。
蛋白变性：通过Bradford测定法测量蛋白质浓度。采用4X蛋白上样缓冲液对蛋白质进行稀释。随后，100℃金属浴加热15分钟对蛋白质做变性处理。
蛋白质免疫印迹实验(Western Blotting,WB)对BRD4蛋白进行定量：
1)蛋白质电泳：蛋白质在4-12％或4-20％ Bis-Tris SDS-PAGE凝胶中分离。将适当体积的上述细胞全蛋白提取物上样至上述SDS-PAGE凝胶的泳道中。接通电源，120V电泳15分钟后，将电压调整为180V，并继续电泳至凝胶的最低端时停止电泳。
2)转膜：电泳结束后取去凝胶，裁剪合适大小的PVDF膜(0.45μm)并用无水甲醇活化膜，从负极至正极按下列顺序安装转膜装置：海绵垫、凝胶，PVDF膜、海绵垫。安装好转膜装置后将其置于相应的转膜槽，检查转膜所需溶液的液面高度，接通电源，经3个转印循环后完成转膜。
3)封闭：将膜放置于QuickBlockTM Western封闭缓冲液，室温下摇床振荡20分钟。
4)一抗孵育：封闭结束后，弃掉封闭液，加入稀释至合适浓度的一抗，4℃摇床上轻轻振荡过夜。完成孵育后1 X TBST洗涤膜4次，5分钟/次。
5)二抗孵育：加入稀释至合适浓度的二抗，室温下，将PVDF膜在摇床上轻轻振荡1小时。成孵育后1 X TBST洗涤膜4次，5分钟/次。
6)显影：显影前配制ECL显影液。将PVDF膜平铺于洁净保鲜膜上，向膜上加入显影液并避光静置1分钟。随后，将PVDF膜在凝胶系统上成像。
本实施例的PROTAC药物AS2对BRD4的降解活性如下：在乳腺癌细胞系MCF-7中，在WB结果中可以观察到PROTAC药物AS2，在测试浓度下(0-300nM)有效的降解BRD4，DC50为31.23nM，结果如图1所示。
同样地，本实施例的X-射线响应型蛋白降解嵌合体前药A1对BRD4的降解活性如下：在乳腺癌细胞系MCF-7中，在WB结果中可以观察到PROTAC前药在激活前，在所有测试浓度下(0-300nM)均无法降解BRD4活性，结果如图2所示。相反的，当X-射线和实施例化合物共同处理MCF-7，BRD4蛋白显著被降解，10nM的前药即可降解半数以上的BRD4蛋白，结果如图3所示。
试验例3 Annexin V/PI双染检测凋亡
正常细胞的表面由不对称分布在质膜内叶和外叶上的脂质组成。其中，磷脂酰丝氨酸(PS)，通常仅分布于质膜的内叶，因此仅暴露于细胞质中。但是，当细胞发生凋亡时，PS会暴露在质膜的外部小叶上。Annexin V是一种能够与PS结合的磷脂结合蛋白。因此，荧光标记的Annexin V可用于检测暴露于早期凋亡细胞外部的PS。通过与碘化丙啶(PI)共染色，Annexin V-PI能够区分出正常活细胞，早期凋亡细胞，以及晚期凋亡的细胞。
细胞处理：取对数期MCF-7细胞进行实验。将细胞以5.0×105个细胞/每孔的密度接种在六孔板中，37℃贴壁24小时。使用实施例PROTAC药物AS2和PROTAC前药A1处理细胞3h，随后进行X-射线辐照，辐照完成后继续培养细胞至48小时。
细胞收集：收集培养基于1.5mL离心管中备用。预冷的PBS洗涤细胞3次，随后用0.25％不含EDTA的胰酶在37℃消化细胞并制成单个细胞的悬浮溶液。4℃下300g离心5min后丢弃上清液。使用收集的培养基重悬细胞，并再次以相同条件离心弃上清液。
细胞染色：根据Annexin V/PI双染试剂盒说明书进行染色操作。将1X 105个细胞重悬于200μL Binding Buffer中，加入4μL 0.5mg/mL PI和2μL Annexin V-FITC溶液；避光室温孵育15min；用流式细胞仪进行荧光检测。
试验结果如图4所示。
从图4可以看出，根据Annexin V/PI双染试剂作用原理，将散点图划分为4个象限，左下象限FITC/PI均为阴性，代表活细胞；右下象限则为FITC阳性，PI阴性，代表早期凋亡的细胞；右上象限FITC/PI均为阳性，代表坏死细胞或晚期凋亡细胞。从图中可以看出：化合物A1在辐照前后诱导MCF-7凋亡的能力发生了显著的变化。没有X-射线辐照的A1诱导细胞凋亡的能力与对照组DMSO相当，无明显的细胞杀伤能力。但是，当X-射线和A1协同处理MCF-7细胞时，在流式中检测到了显著提升的早期凋亡和晚期凋亡细胞。结果表明实施化合物A1可在细胞内被X-射线激活，进而诱导细胞发生凋亡。
试验例4AS2和A1分子在体内抗肿瘤活性研究
为了研究PROTAC化合物AS2和X-射线响应型PROTAC化合物A1在体内激活情况和抗肿瘤活性，我们对两者进行了体内抗肿瘤活性研究。选用了MCF-7细胞株，在BALB/c nude小鼠体内进行了实验。
实验动物：BALB/c nude小鼠(雌性；6-8周龄)全部购自北京维通利华实生物科技股份有限公司，饲养在清华大学实验动物中心。所有动物实验均经清华大学伦理委员会(Animal Ethics Committee of Tsinghua University)批准。
肿瘤模型建立：
取对数生长期的MCF-7细胞，加入预冷PBS缓冲液洗涤细胞3次后，0.25％胰酶消化细胞。消化后的细胞在1000rpm/min转速下离心5分钟,弃掉沉淀，用预冷PBS重悬细胞，小心吹打制成单细胞溶液。细胞经计数仪计数后，将细胞细胞密度调整为1X107 cells/mL并取10mL装入离心管中，冰上保存。接种癌细胞前，用喷有75％酒精的纸巾轻柔擦拭裸鼠右侧腋下皮下。1mL一次性注射器吸取200μL细胞悬液，排去针头内空气，从进针部位向前穿刺约1cm，进行单次皮下注射。注射完毕缓慢退出针头，避免漏液。每日观察肿瘤生长状况。
给药：
当肿瘤体积达到120mm3时，将肿瘤模型小鼠随机分组。实验设置六组，分别为PBS、PROTAC药物AS2、PROTAC前药A1、PBS+X-射线辐照、PROTAC药物AS2+X-射线辐照、PROTAC前药A1+X-射线辐照。各种药物均分散在下列溶液中：1.25％DMSO+20％ PEG+5％ Tween 80+73.75％dd H2O；给药剂量：10mg/kg；皮下注射。注射药物3小时后进行X-射线辐照。辐照剂量为5Gy。给药的时间轴如图5所示。
实验记录：
每隔一天测量一次肿瘤大小并监测体重。肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝长×宽2/2。监测16天后，对各组小鼠实施安乐死，收集肿瘤和主要器官。化合物AS2组小鼠肿瘤体积随给药时间变化见图6。
试验结果表明，实验期间小鼠健康状况良好，小鼠行动、进食、排泄均正常。从给药结果来看，与PBS组相比较，化合物AS2虽然可以抑制肿瘤生长，但抗肿瘤效果不佳，这主要是由于较低的给药剂量和给药频率引起的。相反地，当AS2与X-射线辐照联合使用时，肿瘤生长得到显著抑制，该结果表明AS2可以增强放射治疗的效果。
化合物AS2组小鼠在第16天肿瘤质量结果见图7。该结果同样表明，AS2可以显著增强放射治疗的效果。经两次AS2和放射治疗协同给药后，肿瘤基本没有生长。
化合物A1组小鼠肿瘤体积随给药时间变化见图8,化合物A1组小鼠在第16天肿瘤质量结果见图9。实验结果表明PROTAC响应型化合物A1基本不能抑制肿瘤生长，这主要是因为经化学修饰“加笼”后该前药的蛋白靶向降解能力丧失。但是当对小鼠的肿瘤部位进行X-射线辐照后，在肿瘤部位的前药响应X-射线，高效、原位地释放出辐照响应的“化学笼”和PROTAC分子。释放出的PROTAC分子以催化剂的形式降解肿瘤微环境中的靶点蛋白，并增强放射治疗的效果。

Claims (21)

1.一种式(I)所示的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物：
其中，POI选自任一感兴趣的目标蛋白配体；E3 ligand为E3泛素连接酶配体；linker为目标蛋白配体与E3泛素连接酶配体之间的连接官能团；X为任意对辐照响应的功能分子。
2.根据权利要求1所述的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物，其中，X结构为如下式(II)所示：
其中，R31选自-N3或H；
R32和R34选自卤素或-R41-Y1-R42；
R33和R35选自F、Cl、Br、I或H；
Y1选自O或S；
R41选自C1-10亚烷基；R42选自C1-10烷基；
X1选自O、S或NH。
3.根据权利要求2所述的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物，其中，X结构为如下式(II-1)或式(II-2)所示：
4.根据权利要求1～3任意一项所述的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物，其中，POI ligand为BET家族蛋白配体JQ1及其衍生物。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物，其中，POI ligand结构如下式(III)所示：
6.根据权利要求1～5任意一项所述的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物，其中，linker结构为：
-R17-(C＝O)m-NH-R11-(R15)a-(NR21)b-X2-R12-(A)c-R13-(CH2-O-X3)d-Y-R14-(R16)e-
R11和R14各自独立的选自C1-10亚烷基；R12、R13和R17为C1-10的亚烷基或键；
R15和R16各自独立的为-(C＝O)-；
R21选自H或C1-10的烷基；
A选自C4-12的亚杂环基或C5-10的亚杂芳基，所述亚杂环基或亚杂芳基含有1-4个选自N、O或S的杂原子；
X2、Y各自独立的为-O-、-S-或键；
X3为键或-CH2-；
a、b、c、e为0或1；d为0、1、2、3、4、5、6或7；m和n各自独立的为0或1；
优选亚杂芳基选自如下结构之一：
亚噻吩基、亚呋喃基、亚吡咯基、亚异噻唑基、亚异噁唑基、亚吡唑基、亚噻二唑基、亚噁二唑基、亚噻三唑基、亚噁三唑基、亚四氮唑基、亚三氮唑基、亚吡啶基、亚嘧啶基、亚哒嗪基、亚吡嗪基、亚三嗪基；
优选亚杂环基选自如下结构之一：
氮杂环丁烷、氮杂环戊烷、氮杂环己烷、氮杂环庚烷、氮杂环辛环、氧杂环丁烷、氧杂环戊烷、氧杂环己烷、氧杂环庚烷、氧杂环辛环、硫杂环丁烷、硫杂环戊烷、硫杂环己烷、硫杂环庚烷、硫杂环辛环、二氮杂环丁烷、二氮杂环戊烷、二氮杂环己烷、二氮杂环庚烷、二氮杂环辛环、二氧杂环丁烷、二氧杂环戊烷、二氧杂环己烷、二氧杂环庚烷、二氧杂环辛环、二硫杂环丁烷、二硫杂环戊烷、二硫杂环己烷、二硫杂环庚烷、二硫杂环辛环、以及
7.根据权利要求6所述的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物，其中，linker结构选自如下结构之一：
-(C＝O)-NH-R11-(CH2-O-CH2)d1-R14-、
-(C＝O)-NH-R11-(R15)a-(NR21)-R12-(CH2-O-CH2)d2-R14-、
-(C＝O)-NH-R11-X-R12-A-R13-(CH2-O-CH2)d2-Y-R14-(R16)e-、-(C＝O)-NH-R11-R12-R13-R14-；或
-R17-(C＝O)-NH-R11-R14-NH-(C＝O)-
其中，R11、R12、R13和R14各自独立的选自C1-4的亚烷基；R21为H或C1-4的烷基；d1为1、2、3、4或5；d2为0、1、2、3或4。
8.根据权利要求6所述的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物，其中，linker结构选自如下结构之一：
其中，p为1、2、3、4或5。
9.根据权利要求1～8任意一项所述的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物，其中，E3 ligand选自VHL、CRBN、GID4、DCAF2、KLHL41、SPSB4、TRIM7、TRIM9、RNF43和RNF182的E3连接酶的配体。
10.根据权利要求1～9任意一项所述的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物，其中，所述E3 ligand结构如下式(IV-1)或式(IV-2)所示：
其中，R1、R2和R3各自独立的选自C1-10的烷基；任选的，所述烷基进一步被H、卤素、羟基、羧基、氨基、氰基、羰基或C1-5的烷基所取代；
环B为C4-10的杂环烷基；所述杂环烷基任选被0、1、2、3或4个＝O所取代；所述杂环烷基含有1、2、3或4个选自N、O和S的杂原子，且至少含有一个N原子；
环C为C6-12的芳香环；所述芳香环任选被0、1、2、3、4、5或6个选自F、Cl、Br、I、C1-6烷基、羟基、氨基、氰基和硝基的取代基所取代；
R51选自-O-或-NH-。
11.根据权利要求1～10任意一项所述的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物，其中，X连接在E3 ligand结构上或者linker上。
12.根据权利要求1～11任意一项所述的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物，其中，X连接在E3 ligand或linker结构的羟基或氨基上。
13.根据权利要求1～12任意一项所述的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物，其中，所述化合物结构如下式(V-1)、(V-2)、(V-3)和(V-4)所示：
14.根据权利要求10～13任意一项所述的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物，其中，R1、R2和R3各自独立的选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2-乙基丁基或3-乙基丁基；
环B为选自如下结构的杂环烷基：
所述杂环烷基任选被0、1、2、3或4个＝O所取代；
环C为选自如下结构的芳香环：
所述芳香环任选被0、1、2、3、4、5或6个选自F、Cl、Br、I、C1-6烷基、羟基、氨基、氰基和硝基的取代基所取代；
优选的，
环B选自如下的杂环烷基：
环C为选自如下结构的芳香环：
15.根据权利要求1所述的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物，其中，所述化合物选自如下所示的结构之一：
16.一种式(VI)所示的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物：
其中，X的结构如权利要求1～3任意一项所示。
17.根据权利要求16所述的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物，其中，DRUG为任意PROTAC药物。
18.根据权利要求16或17所述的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物，其中，DRUG为如下式(VII)
POI-linker-E3ligand
(VII)
其中，POI、linker和E3 ligand结构如权利要求1～13任意一项所述。
19.一种含有权利要求1～18任意一项所述的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物的药物组合物。
20.权利要求1～18任意一项所述的化合物或其异构体或药学上可接受的盐或氘代物、或权利要求19所述的药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
21.根据权利要求20所述的应用，其中，所述的治疗肿瘤药物是配合肿瘤放射治疗的药物。
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