CN118141995A - 复合组织修复材料及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本公开提供一种复合组织修复材料及其制备方法和用途。该复合组织修复材料包括:基体,所述基体具有纤维丝结构;以及,存在于所述基体至少一个表面的凝胶网络结构,所述凝胶网络结构通过所述基体的至少一个表面与凝胶前体接触而得到;其中,所述凝胶前体源自于凝胶组分,所述凝胶组分包括甲基丙烯酸酯化的天然高分子化合物。本公开的复合组织修复材料具有生物降解性、自粘附性和多重生物活性。本公开的复合组织修复材料可以与各种组织形成强有力的湿粘附性,清除过量的自由基(ROS),并在体内和体外杀死细菌。
Description
技术领域
本公开涉及一种复合组织修复材料及其制备方法和用途,属于医用材料领域。
背景技术
生物补片已在各种病理条件下使用,包括疝修补术,盆腔功能障碍治疗(例如,压力性尿失禁和盆腔器官脱垂),乳房切除后的乳房重建,组织/骨再生导向和伤口愈合。生物补片的应用可提供对手术区域薄弱部分的机械支持,作为引导组织再生的物理屏障。值得注意的是,由基于生物补片的手术程序引起的术后疼痛和复发比其他技术引起的疼痛和复发要少。
在大多数情况下,生物补片的固定通常在手术过程中通过缝合和/或钉合来实现,这是一个耗时的过程,具有术后并发症(例如,神经损伤和慢性疼痛)的很大风险。生物胶也可用于将生物补片固定到组织上。然而,目前的商业生物胶(例如TISSEEL,COSEAL和DURASEAL)表现出低的基质韧性和粘附能量(~10J·m-2),这导致粘合剂基质和界面都断裂。
在临床实践中,生物胶通常与缝合和/或钉合结合使用。因此,生物补片与组织之间具有强大的粘附性是至关重要的。最近,引用文献1报道了第一个水凝胶-网状物复合组织修复材料(HMC),其中包含聚对苯二甲酸乙二醇酯补片,聚(N-异丙基丙烯酰胺)水凝胶网络和壳聚糖链。这种HMC能够通过在偶联剂(即EDC/NHS)存在的条件下壳聚糖与组织之间形成共价键来实现与组织的强大粘附。自此以后,开发了几种粘性的水凝胶功能化的生物补片,并显示出在缺陷修复中的潜在应用。
目前,生物补片主要使用非吸收性合成材料制成。由于耐用和最佳的机械强度,非吸收性聚丙烯补片(PPM)是最广泛使用的生物补片。但与此同时,与非吸收性补片相关的并发症,包括过度免疫反应、伤口感染、疝复发以及需要第二次手术移除补片等被大量报道。生物可吸收合成聚合物(例如,聚乳酸(PLA)、聚乳酸-丙交酯共聚物(PLGA)和聚己内酯(PCL))和生物可吸收天然聚合物(例如,明胶、藻酸盐、壳聚糖和胶原蛋白)已被用于生产可吸收补片,以克服上述并发症,但其引导组织/骨再生和促进慢性伤口愈合的能力较差,且不能实现自我粘附。
因此,研究一种引导组织/骨再生和促进慢性伤口愈合的能力优异,且能够实现自我粘附的复合组织修复材料,成为亟待解决的技术问题。
引用文献:Y.Gao,X.Han,J.Chen,Y.Pan,M.Yang,L.Lu,J.Yang,Z.Suo,T.Lu,Hydrogel–mesh composite for wound closure,Proceedings of the National Academyof Sciences 118(28)(2021).
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术中存在的技术问题,本公开的首先提供一种具有生物降解性、自粘附性和多重生物活性的复合组织修复材料。本公开的复合组织修复材料可以与各种组织形成强有力的湿粘附,清除过量的自由基(ROS),并在体内和体外杀死细菌。
本公开还提供一种复合组织修复材料的制备方法,该制备方法简单易行,原料易于获取,适合大批量生产。
本公开还提供一种复合组织修复材料用于制备皮肤再生制品、医用植入制品的用途。
用于解决问题的方案
[1]、一种复合组织修复材料,其包括:
基体,所述基体具有纤维丝结构;以及,
存在于所述基体至少一个表面的凝胶网络结构,所述凝胶网络结构通过所述基体的至少一个表面与凝胶前体接触而得到;其中,
所述凝胶前体源自于凝胶组分,所述凝胶组分包括甲基丙烯酸酯化的天然高分子化合物。
[2]、根据上述[1]所述复合组织修复材料,其中,所述基体源自于生物可降解的生物材料,优选包含有胶原蛋白,更优选包含有动物小肠粘膜下层材料;和/或,
以所述基体的总质量为100%计,所述凝胶网络结构的含量为50%-500%,优选为100%-300%。
[3]、根据上述[1]或[2]所述复合组织修复材料,其中,所述甲基丙烯酸酯化的天然高分子化合物包括甲基丙烯酸酯化明胶、甲基丙烯酸酯化海藻酸或其盐、甲基丙烯酸酯化壳聚糖、甲基丙烯酸酯化透明质酸或其盐中的一种或两种以上的组合。
[4]、根据上述[1]-[3]任一项所述复合组织修复材料,其中,所述凝胶组分还包括未甲基丙烯酸酯化的天然高分子化合物;优选地,以所述凝胶组分的总质量为100%计,所述未甲基丙烯酸酯化的天然高分子化合物的含量为0-50%,优选为0-20%;更优选地,所述未甲基丙烯酸酯化的天然高分子化合物包括明胶、海藻酸或其盐、壳聚糖、透明质酸或其盐中的一种或两种以上的组合。
[5]、根据上述[1]-[4]任一项所述复合组织修复材料,其中,所述复合组织修复材料通过使用改性剂对所述凝胶网络结构进行改性得到;优选地,所述改性剂包括多酚类化合物;更优选地,所述多酚类化合物包括儿茶酚、邻苯二酚、邻苯三酚、鞣酸、茶多酚中的一种或两种以上的组合。
[6]、一种根据权利要求[1]-[5]任一项所述的复合组织修复材料的制备方法,其特征在于,包括将基体与凝胶网络结构复合成型的步骤;
优选地,所述制备方法包括以下步骤:
在引发剂的存在下,将凝胶组分溶于溶剂中以形成凝胶前体溶液;
使所述凝胶前体溶液在所述基体的至少一个表面形成凝胶网络结构,得到复合产物。
[7]、根据上述[6]所述的制备方法,其中,所述凝胶前体溶液中,所述凝胶组分的含量为2-20%,优选为5-15%(w/v);和/或,
所述凝胶前体溶液中,所述引发剂的浓度为4-8mg/mL;和/或,
所述形成凝胶网络结构的反应条件为在35-40℃的温度下,反应5分钟-20小时。
[8]、根据上述[6]或[7]所述的制备方法,其中,所述凝胶前体溶液中还包含有促凝剂;优选地,所述凝胶前体溶液中,所述促凝剂的浓度为1-5mg/mL。
[9]、根据上述[6]-[8]任一项所述的制备方法,其中,所述制备方法还包括利用改性剂对所述复合产物进行改性的步骤;
优选地,所述改性包括:将所述改性剂溶于溶剂中,得到改性剂溶液;将所述复合产物浸渍于所述改性剂溶液中进行改性,得到复合组织修复材料;
更优选地,所述改性剂溶液中,所述改性剂的含量为10-150%(w/v),优选为20-100%(w/v);和/或,所述改性的时间为12-72小时,优选为18-36小时。
[10]、一种根据上述[1]-[5]任一项所述的复合组织修复材料用于制备组织修复制品或医用植入制品的用途,特别是制备皮肤损伤修复制品中的用途。
发明的效果
本公开的复合组织修复材料具有生物降解性、自粘附性和多重生物活性。本公开的复合组织修复材料可以与各种组织形成强有力的湿粘附性,清除过量的自由基(ROS),并在体内和体外杀死细菌。
本公开的复合组织修复材料的制备方法简单易行,原料易于获取,适合大批量生产。
本公开的复合组织修复材料能够用于制备皮肤再生制品、医用植入制品的用途。
附图说明
图1示出了本公开的复合组织修复材料的合成以及在组织修复方面的潜在应用及功能。
图2示出了甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)和经TA处理的(G-TA)的含水量对比图。
图3示出了本公开的复合组织修复材料基本性能测试示意图;其中,
A示出了实施例1的G/SIS-TA复合组织修复材料的制备过程的示意图;
B示出了本公开的SIS补片、G/SIS复合组织修复材料、G/SIS-TA复合组织修复材料以及弯曲的G/SIS-TA复合组织修复材料的数字照片;
C示出了在PBS缓冲溶液中浸泡前后的SIS补片,G/SIS复合组织修复材料和G/SIS-TA复合组织修复材料的拉伸强度;
D示出了在2U/mL的胶原酶溶液中G/SIS复合组织修复材料和G/SIS-TA复合组织修复材料在72小时内的降解情况;
E示出了G/SIS-TA复合组织修复材料对组织的粘附机制的示意图;
F示出了G-TA水凝胶,G/SIS-TA复合组织修复材料和商业组织胶对湿态下的猪皮的拉伸剪切粘附强度;
G示出了G/SIS-TA复合组织修复材料对各种猪组织在湿态下的拉伸剪切粘附强度,包括心脏,小肠,胃,肝脏和肺。
图4示出了本公开的复合组织修复材料细胞相容性实验示意图;其中,
A示出了SIS补片提取物、G/SIS复合组织修复材料提取物、G/SIS-TA复合组织修复材料提取物的制备和后续细胞培养的示意图;
B示出了在SIS补片提取物、G/SIS复合组织修复材料提取物、G/SIS-TA复合组织修复材料提取物中培养72小时的L929成纤维细胞的活/死染色;
C示出了在SIS补片提取物、G/SIS复合组织修复材料提取物、G/SIS-TA复合组织修复材料提取物中培养的L929成纤维细胞的CCK-8分析OD值;
D示出了在SIS补片提取物、G/SIS复合组织修复材料提取物、G/SIS-TA复合组织修复材料提取物中培养的HACAT细胞的CCK-8分析OD值;
E示出了在SIS补片提取物、G/SIS复合组织修复材料提取物、G/SIS-TA复合组织修复材料提取物中培养的RAW264.7巨噬细胞的CCK-8分析OD值;
F示出了在SIS补片提取物、G/SIS复合组织修复材料提取物、G/SIS-TA复合组织修复材料提取物中培养的LPS处理的RAW264.7巨噬细胞的CCK-8分析OD值。
图5示出了TCPs对照组、SIS补片、G/SIS组和G/SIS-TA组的DPPH清除实验结果对比示意图。
图6示出了本公开的复合组织修复材料抗炎性能实验示意图;其中,
A示出了RAW246.7的形态受到LPS(LPS(+))或无LPS(LPS(-))的刺激,并且RAW246.7的形态在LPS刺激后用SIS补片提取物、G/SIS复合组织修复材料提取物、G/SIS-TP复合组织修复材料提取物培养24小时;
B示出了用SIS补片提取物、G/SIS复合组织修复材料提取物、G/SIS-TP复合组织修复材料提取物培养24小时后的LPS刺激的RAW246.7的M1表面标记iNOS的免疫荧光染色。
图7示出了本公开的复合组织修复材料的抗菌性实验示意图;其中,
A示出了制备G/SIS复合组织修复材料提取物、G/SIS-TA复合组织修复材料提取物以评估G/SIS-TA的抗菌潜力,用于体外和体内实验;
B示出了使用菌落计数技术统计S.aureus和E.coli的抑制率,以及琼脂板的插入照片;
C示出了CLSM图像显示IEC-6细胞内化的S.aureus(绿色荧光)(DAPI:蓝色荧光,细胞骨架:红色荧光);
D示出了小鼠腹膜炎感染模型的示意图;
E示出了处理后收获腹水的细菌负荷分析。
图8示出了金黄色葡萄球菌感染的大鼠全层皮肤伤口模型相关示意图;
A示出了金黄色葡萄球菌感染大鼠全层创伤愈合实验的时间表;
B示出了金黄色葡萄球菌感染大鼠全层创伤愈合图像;
C示出了14天内不同治疗后相应的剩余伤口百分比;
D示出了第3天和第14天伤口切片的H&E染色;
E示出了处理3天后的伤口细菌负荷分析;
F示出了IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、VEGF和TGF-β基因表达的RT-qPCR分析热图。
图9示出了不同治疗后伤口部位的DAPI和CD31的免疫荧光染色。
图10示出了伤口周围巨噬细胞的极化检测示意图;其中,
A示出了伤口切片中的细胞核(蓝色)、F4/80(黄色)、iNOS(红色)和CD206(绿色),在第3天和第14天的免疫荧光图像;
B示出了伤口切片中的细胞核(蓝色)、F4/80(黄色)、iNOS(红色)和CD206(绿色),在第3天和第14天与免疫荧光图像相对应的免疫荧光密度对比图;
C示出了火山图;
D示出了比较G/SIS-TA与GelMA水凝胶时的基因表达谱;
E示出了KEGG对差异基因的富集。
具体实施方式
以下将详细说明本公开的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
另外,为了更好地说明本公开,在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解,没有某些具体细节,本公开同样可以实施。在另外一些实例中,对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述,以便于凸显本公开的主旨。
如无特殊声明,本说明书中所使用的单位均为国际标准单位,并且本公开中出现的数值,数值范围,均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。
本说明书中,使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中,所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如,特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中,并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外,应理解,所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
本说明书中,如没有特别说明,则“%(m/v)”均表示质量浓度百分数。该质量浓度百分数是指单位体积的溶剂中某组分的质量。本说明书中的质量浓度百分数是以mL为体积单位,以g为质量单位计算得到。示例性的,将0.003g的物质组分加入1mL的溶剂中,则该物质组分的质量浓度百分数为(0.003g/1mL)*100%=0.3%(m/v)。
本说明书中,使用“数值A~数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中,使用“常温”、“室温”时,其温度可以是15-25℃。
<第一方面>
本公开的第一方面提供一种复合组织修复材料,其包括:
基体,所述基体具有纤维丝结构;以及,
存在于所述基体至少一个表面的凝胶网络结构,所述凝胶网络结构通过所述基体的至少一个表面与凝胶网络结构接触而得到;其中,
所述凝胶网络结构源自于凝胶组分,所述凝胶组分包括甲基丙烯酸酯化的天然高分子化合物。
本公开的复合组织修复材料具有生物降解性、自粘附性和多重生物活性。本公开的复合组织修复材料可以与各种组织形成强有力的湿粘附性,清除过量的自由基(ROS),并在体内和体外杀死细菌。
基体
本公开的基体为具有纤维丝结构的基体。本公开对基体不作特别限定,可以是本领域常用的一些基体。在本公开中,所述基体源自于生物可降解的生物材料,优选为主要含有胶原蛋白的生物材料,所述胶原蛋白可以是天然来源的、人工合成的、经过改性或交联处理的,包括但不限于粘膜下层、真皮层、心包层、胶原、明胶等。
在本公开的一些实施方式中,所述基体源自于小肠粘膜下层,优选源自于脱细胞的小肠粘膜下层,即可以使用小肠粘膜下层制备得到本公开的基体。在本公开的一些实施方式中,所述基体源自于真皮层,优选源自于脱细胞的真皮层,即可以使用真皮层制备得到本公开的基体。在本公开的一些实施方式中,所述基体源自于膀胱粘膜下层,优选源自于脱细胞的膀胱粘膜下层,即可以使用膀胱粘膜下层制备得到本公开的基体。在本公开的一些实施方式中,所述基体源自于心包层,优选源自于脱细胞的心包层,即可以使用心包层制备得到本公开的基体。所述粘膜下层(例如小肠粘膜下层)、真皮层和心包层等优选来源于哺乳动物,例如猪,牛,羊,狗,猫等。
在本公开的一个实施方式中,所述基体源自于脱细胞的猪小肠粘膜下层。该猪小肠粘膜下层,可以经市售购买得到。猪小肠粘膜下层的来源广泛,经济易得,加工方便,且脱细胞处理后的猪小肠粘膜下层具有优异的生物相容性,富含胶原蛋白和生长因子,能够诱导细胞向内扩散、粘附、生长、增殖,促进组织缺损处自身组织的修复和再生,其适用于作为制备本公开的伤口敷料的基体使用。因此,本公开优选使用猪小肠粘膜下层作为原料制备得到的猪小肠粘膜下层材料基体作为基体使用。
对于猪小肠粘膜下层材料基体的制备方法,本公开不作特别限定,可以是本领域常用的一些制备方法,当然,猪小肠粘膜下层材料基体也可以通过市售购买得到。作为优选,本公开的猪小肠粘膜下层材料基体可以按照CN107007886A中的制备方法进行制备得到。
在本公开的另一种实施方式中,所述基体也可以是采用含有胶原蛋白的化学物质制备得到的纤维膜。对于纤维膜,本公开不作特别限定,可以是本领域常用的纤维膜,例如:无纺纤维膜或纺丝纤维膜等。
本公开的无纺纤维膜可以使用含有胶原蛋白的化学物质以及任选存在的其它高分子聚合物或其衍生物中的一种或两种以上的组合通过无纺工艺处理得到。本公开的纺丝纤维膜可以使用含有胶原蛋白的化学物质以及任选存在的其它高分子聚合物或其衍生物中的一种或两种以上的组合通过静电纺丝技术、离心力纺丝技术、热熔喷丝技术、熔融电纺技术等工艺处理得到。
其它高分子聚合物或其衍生物可以是本领域中各种常用的高分子聚合物或其衍生物。如可以选自天然高分子聚合物中一种或两种以上的组合。举例而言,常用的高分子聚合物或其衍生物可以是纤维素、硫酸软骨素、壳聚糖、改性壳聚糖、纤维蛋白、丝蛋白、弹力蛋白拟态的肽聚合物、肝素、琼脂、葡聚糖、褐藻酸、纤维素、海藻酸、淀粉中一种或两种以上的组合。
作为优选,基于本公开的基体,使得本公开的所述伤口敷料包含有胶原纤维,由于胶原纤维的存在,使得本公开的伤口敷料的作用能够更好的发挥。
凝胶网络结构
本公开的凝胶网络结构存在于所述基体至少一个表面。所述凝胶网络结构通过所述基体的至少一个表面与凝胶网络结构接触而得到;其中,
所述凝胶网络结构源自于凝胶组分,所述凝胶组分包括甲基丙烯酸酯化的天然高分子化合物。
本公开通过使用甲基丙烯酸酯化的天然高分子化合物,以使得在基体至少一个表面形成凝胶网络结构,且至少部分所述凝胶网络结构浸渍于所述基体的内部。
在一些具体的实施方案中,以所述基体的总质量为100%计,所述凝胶网络结构的含量为50%-500%,优选为100%-300%,例如:80%、100%、120%、150%、180%、200%、220%、250%、280%、300%、320%、350%、380%、400%、420%、450%、480%等。当所述凝胶网络结构的含量为50%-500%时,其作用能够更有效的发挥。
在一些具体的实施方案中,所述甲基丙烯酸酯化的天然高分子化合物包括甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)、甲基丙烯酸酯化海藻酸或其盐(ALGMA)、甲基丙烯酸酯化壳聚糖(CSMA)、甲基丙烯酸酯化透明质酸或其盐(HAMA)中的一种或两种以上的组合。
在本公开中,优选使用甲基丙烯酸酯化明胶来形成凝胶网络结构。甲基丙烯酸酯化明胶由甲基丙烯酸酐与明胶制备获得,是一种生物水凝胶材料,该材料具有优异的生物相容性,且可由引发剂引发固化反应,形成适于细胞生长与分化且有较高强度的三维水凝胶结构。
进一步,在本公开中,所述甲基丙烯酸酯化明胶中甲基丙烯酸的取代率为20%以上,优选为40%以上,甲基丙烯酸的取代率越高,复合组织粘合剂的力学性能越强。
在一些具体的实施方案中,所述凝胶组分还包括未甲基丙烯酸酯化的天然高分子化合物;优选地,以所述凝胶组分的总质量为100%计,所述未甲基丙烯酸酯化的天然高分子化合物的含量为0-50%,优选为0-20%,例如:2%、5%、8%、10%、12%、15%、18%、20%、22%、25%、28%、30%、32%,35%、38%、40%、42%、45%、48%等;更优选地,所述未甲基丙烯酸酯化的天然高分子化合物包括明胶、海藻酸或其盐、壳聚糖、透明质酸或其盐中的一种或两种以上的组合。
在一些具体的实施方案中,所述复合组织修复材料通过使用改性剂对所述凝胶网络结构进行改性得到。本公开通过使用改性剂进一步对凝胶网络结构进行改性,可以提高复合组织修复材料的湿粘附性、抗氧化和抗菌能力。
优选地,所述改性剂包括多酚类化合物;多酚类化合物可以提供更多的氢键,可以使凝胶网络结构的湿粘附性、抗氧化和抗菌能力进一步增强。另外,经改性后,本公开的复合组织修复材料还具有出色的生物降解性、生物相容性和免疫调节活性,从而降低了细菌带来的负担,促进了感染性皮肤伤口的愈合。
具体地,所述多酚类化合物可以包括儿茶酚、邻苯二酚、邻苯三酚、鞣酸、茶多酚中的一种或两种以上的组合。
<第二方面>
本公开的第二方面提供一种根据本公开第一方面所述的复合组织修复材料的制备方法,其包括将基体与凝胶网络结构复合成型的步骤。
本公开的复合组织修复材料的制备方法简单易行,原料易于获取,适合大批量生产。
在一些具体的实施方案中,所述制备方法包括以下步骤:
在引发剂的存在下,将凝胶组分溶于溶剂中以形成凝胶前体溶液;
使所述凝胶前体溶液在所述基体的至少一个表面形成凝胶网络结构,得到复合产物。
具体地,可以通过平铺、涂覆、流延、浸渍、喷洒等中的一种或两种以上的组合来使所述凝胶前体溶液在所述基体的至少一个表面形成凝胶网络结构。
在一些具体的实施方案中,可以使用模具来辅助制备复合产物。具体地,将基体置于模具中,然后在模具中平铺凝胶前体溶液,从而形成凝胶网络结构。
具体地,为了获得所需的复合产物,所述凝胶前体溶液中,所述凝胶组分的含量为2-20%,优选为5-15%(w/v),例如:3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%等;所述凝胶前体溶液中,所述引发剂的浓度为4-8mg/mL,例如:4.5mg/mL、5mg/mL、5.5mg/mL、6mg/mL、6.5mg/mL、7mg/mL、7.5mg/mL等。
在一些具体的实施方案中,为了更好的形成凝胶网络结构,所述形成凝胶网络结构的反应条件为在35-40℃,例如:36℃、37℃、38℃、39℃等的温度下,反应5分钟-20小时,例如:10分钟、20分钟、40分钟、1小时、3小时、5小时、7小时、9小时、11小时、13小时、15小时、17小时、19小时等。具体地,可以将上述包含凝胶前体溶液和基体的模具置于35-40℃的温度下,反应5分钟-20小时,从形成凝胶网络结构。
进一步,在本公开中,所述引发剂包括选自过氧化物引发剂。由于无机过氧化合物溶于水,更有利于本公开的水凝胶的形成,因此,本公开优选使用无机过氧化物作为引发剂。具体地,所述无机过氧化合物主要为过硫酸盐类,如过硫酸钾、过硫酸钠、过硫酸铵、过氧化氢等,优选为过硫酸铵和过硫酸钾。
在一些具体的实施方案中,所述凝胶前体溶液中还包含有促凝剂。通过使用促凝剂,可以使引发剂的作用更有效的发挥。对于促凝剂,本公开不作特别限定,可以是本领域中常用的促凝剂,例如:四甲基乙二胺。四甲基乙二胺可以催化引发剂产生自由基,从而加速水凝胶的聚合。
进一步,为了有利于形成所需的凝胶网络结构,所述凝胶前体溶液中,所述促凝剂的浓度为1-5mg/mL,例如:1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL等。
在一些具体的实施方案中,所述制备方法还包括利用改性剂对所述复合产物进行改性的步骤。
具体地,所述改性包括:将所述改性剂溶于溶剂中,得到改性剂溶液;将所述复合产物浸渍于所述改性剂溶液中进行改性,得到复合组织修复材料。本公开通过使用改性剂进行改性,可以进一步赋予复合组织修复材料更优异的湿粘附性、抗氧化、抗炎以及抗菌能力。
本公开的发明人发现,经改性后,本公开的复合组织修复材料在调节巨噬细胞从M1表型向M2表型的极化以及促炎和促再生细胞因子的分泌方面显示出免疫调节能力。经改性后,在细菌感染的伤口模型中,本公开的复合组织修复材料处理后的伤口显示出显著降低的细菌负荷和明显促进的伤口愈合,皮肤结构良好。
进一步,所述改性剂溶液中,所述改性剂的含量为10-150%(w/v),优选为20-100%(w/v),例如:20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%等;和/或,所述改性的时间为12-72小时,优选为18-36小时,例如:15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、50小时、55小时、60小时、65小时、70小时等。当改性剂的含量为10-150%,和/或,所述改性的时间为12-72小时时,改性的效果能够最有效的发挥。
<第三方面>
本公开的第三方面提供一种根据本公开第一方面所述的复合组织修复材料用于制备组织修复制品或医用植入制品的用途,特别是制备皮肤损伤修复制品中的用途。
实施例
下面将结合实施例对本公开的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本公开,而不应视为限定本公开的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例中,甲基丙烯酸酯化明胶中甲基丙烯酸的取代率为80%。
在实施例和比较例中,猪小肠粘膜下层材料基体(SIS补片)按照下述的制备方法制备得到。
(1)原料的初处理:
分割猪小肠粘膜下层组织材料(猪小肠粘膜下层组织材料又称为猪小肠粘膜下层SIS),剔除无用组织(例如淋巴组织),用自来水冲洗,再用纯化水冲洗至表面无污渍,将冲洗后的猪小肠粘膜下层组织材料滤干。取用猪小肠粘膜下层组织材料时,将滤水后的猪小肠粘膜下层组织材料用量筒等量取体积的装置进行量取。
(2)病毒灭活:
采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡猪小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活,该过程可在不锈钢桶中进行。过氧乙酸-乙醇溶液中过氧乙酸的浓度为1%(体积百分比)、乙醇的浓度为24%(体积百分比),过氧乙酸-乙醇溶液与猪小肠粘膜下层组织材料的比例(体积比)为5:1,灭活时间2小时,灭活温度(即浸泡猪小肠粘膜下层组织材料的过氧乙酸-乙醇溶液的温度)范围为20℃。
(3)清洗过程:
采用清洗液清洗猪小肠粘膜下层组织材料,清洗液为pH值为7.2-7.4的PBS溶液,PBS溶液温度为20℃,PBS溶液与猪小肠粘膜下层组织材料的比例(体积比)为30:1,优选清洗3次,每次20分钟;然后采用纯化水清洗;清洗过程在超声波清洗机中进行。
(4)脱细胞:
脱细胞液为包括质量百分比浓度0.025%胰蛋白酶和浓度为0.5mmol/L的EDTA-2Na的PBS溶液;脱细胞液pH值为7.2-7.4;脱细胞液与猪小肠粘膜下层组织材料混合比例(体积比)为30:1,脱细胞过程在双频超声波装置中进行,包含低频和高频两个频率,其中低频频率为20KHz,高频频率为80KHz,超声功率为5KW,其中低频处理10min,高频处理10min,温度为30℃;超声功率5000W。
(5)清洗过程:
采用清洗液进行清洗,清洗过程在超声波清洗机中进行,超声波的功率为3000W。清洗液为pH7.2-7.4的PBS溶液,PBS溶液温度为20℃,PBS溶液与猪小肠粘膜下层组织材料的比例(体积比)为30:1,优选清洗3次,每次20分钟;然后采用20℃的降温的注射用水清洗,注射用水与猪小肠粘膜下层组织材料比例(体积比)为30:1,检测清洗注射用水与未清洗注射用水电导率之差小于1μS/cm终止,频率40kHz,功率为3000W。
(6)固定成型:
在模具上进行,所述模具包括带针底板与压框,需要根据不同的规格尺寸选择不同的模具,将步骤(5)制备的猪小肠粘膜下层基质材料平铺于带针底板上,将所述压框放置于猪小肠粘膜下层基质材料上,压框的尺寸可为最终裁剪的尺寸或更宽,将所述带针底板和所述压框相对固定。
(7)真空冷冻干燥:
在真空冷冻干燥机中进行,产品的冷冻干燥工艺需要根据不同的设备重新确认,将模具平铺于真空冷冻干燥机中,关闭冻干室的门,打开循环泵约1分钟,开启压缩机对冻干箱致冷,将步骤(6)的模具连同上面的猪小肠粘膜下层基质材料预冻至-45℃,保温1.5小时,然后开启真空泵,调节温度至-15℃,保温6小时,再调节温度至0℃,保温2小时,最后调节温度至25℃,保温4小时,真空冷冻干燥完成;冷冻干燥装置的腔室内的压强为20-25Pa。完成上述工艺后,得到作为猪小肠粘膜下层材料基体的SIS补片。
实施例1
将甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)粉末溶解在去离子水(DI)中,制成浓度为10%(w/v)的GelMA溶液,然后加入过硫酸铵(APS)(5.7mg·mL-1)和四甲基乙二胺(TEMED)(2.9mg·mL-1),在不断搅拌的条件下制备凝胶前体溶液。
将鞣酸(TA)粉末溶解在去离子水中,制成浓度为100%(w/v)的鞣酸溶液。
复合组织修复材料将0.1gSIS补片放置在玻璃模具中,然后将新鲜制备的凝胶前体溶液加入模具中。模具保持在37℃下10分钟以获得G/SIS复合组织修复材料。
将G/SIS复合组织修复材料浸入鞣酸溶液中24小时,然后用去离子水冲洗以去除游离的鞣酸,得到0.22g(干重)G/SIS-TA复合组织修复材料。所有合成过程都在GMP车间中进行。
对比例1
前述方法制备得到的猪小肠粘膜下层材料基体,记作:SIS补片。
对比例2
将甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)粉末溶解在去离子水(DI)中,制成浓度为10%(w/v)的GelMA溶液,然后加入过硫酸铵(APS)(5.7mg·mL-1)和四甲基乙二胺(TEMED)(2.9mg·mL-1),在不断搅拌的条件下制备凝胶前体溶液。
复合组织修复材料将0.1gSIS补片放置在玻璃模具中,然后将新鲜制备的凝胶前体溶液加入模具中。模具保持在37℃下10分钟以获得0.22g(干重)G/SIS复合组织修复材料。
对比例3
将甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)粉末溶解在去离子水(DI)中,制成浓度为10%(w/v)的GelMA溶液,然后加入过硫酸铵(APS)(5.7mg·mL-1)和四甲基乙二胺(TEMED)(2.9mg·mL-1),在不断搅拌的条件下制备凝胶前体溶液。
将鞣酸(TA)粉末溶解在去离子水中,制成浓度为100%的鞣酸溶液。
将新鲜制备的凝胶前体溶液加入模具中。模具保持在37℃下10分钟以获得GelMA水凝胶。
将GelMA水凝胶浸入TA溶液中24小时,然后用去离子水冲洗以去除游离的鞣酸,得到G-TA水凝胶。所有合成过程都在GMP车间中进行。
对比例4
将甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)粉末溶解在去离子水(DI)中,制成浓度为10%(w/v)的GelMA溶液,然后加入过硫酸铵(APS)(5.7mg·mL-1)和四甲基乙二胺(TEMED)(2.9mg·mL-1),在不断搅拌的条件下制备凝胶前体溶液,记作GelMA水凝胶。
实施例2
将甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)粉末溶解在去离子水(DI)中,制成浓度为10%(w/v)的GelMA溶液,然后加入过硫酸铵(APS)(5.7mg·mL-1)和四甲基乙二胺(TEMED)(2.9mg·mL-1),在不断搅拌的条件下制备凝胶前体溶液。
将鞣酸(TA)粉末溶解在去离子水中,制成浓度为80%(w/v)的鞣酸溶液。
复合组织修复材料将0.1gSIS补片放置在玻璃模具中,然后将新鲜制备的凝胶前体溶液加入模具中。模具保持在37℃下10分钟以获得G/SIS复合组织修复材料。
将G/SIS复合组织修复材料浸入鞣酸溶液中24小时,然后用去离子水冲洗以去除游离的鞣酸,得到0.22g(干重)G/SIS-TA-80复合组织修复材料。所有合成过程都在GMP车间中进行。
实施例3
实施例3与实施例2的区别仅在于,将鞣酸(TA)粉末溶解在去离子水中,制成浓度为120%(w/v)的鞣酸溶液。其于与实施例2完全相同,得到G/SIS-TA-120复合组织修复材料。
实施例4
将壳聚糖(CHI)和甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)粉末溶解在去离子水(DI)中,制成浓度为10%(w/v)的聚合物溶液(其中壳聚糖与甲基丙烯酸酐化明胶质量比为1:4),然后加入过硫酸铵(APS)(5.7mg·mL-1)和四甲基乙二胺(TEMED)(2.9mg·mL-1),在不断搅拌的条件下制备凝胶前体溶液。
将鞣酸(TA)粉末溶解在去离子水中,制成浓度为100%(w/v)的鞣酸溶液。
复合组织修复材料将0.1gSIS补片放置在玻璃模具中,然后将新鲜制备的凝胶前体溶液加入模具中。模具保持在37℃下10分钟以获得CG/SIS复合组织修复材料。
将CG/SIS复合组织修复材料浸入鞣酸溶液中24小时,然后用去离子水冲洗以去除游离的鞣酸,得到0.22g(干重)CG/SIS-TA复合组织修复材料。所有合成过程都在GMP车间中进行。
实施例5
将甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)粉末溶解在去离子水(DI)中,制成浓度为10%(w/v)的GelMA溶液,然后加入过硫酸铵(APS)(5.7mg·mL-1)和四甲基乙二胺(TEMED)(2.9mg·mL-1),在不断搅拌的条件下制备凝胶前体溶液。
将茶多酚(TP)粉末溶解在去离子水中,制成浓度为20%(w/v)的茶多酚溶液。
复合组织修复材料将0.1gSIS补片放置在玻璃模具中,然后将新鲜制备的凝胶前体溶液加入模具中。模具保持在37℃下10分钟以获得G/SIS复合组织修复材料。
将G/SIS复合组织修复材料浸入TP溶液中24小时,然后用去离子水冲洗以去除游离的茶多酚,得到0.22g(干重)G/SIS-TP复合组织修复材料。所有合成过程都在GMP车间中进行。
性能测试
1、基本性能测试
G/SIS-TA复合组织修复材料通过GelMA的原位自由基聚合和随后的鞣酸改性处理而制备。将SIS补片(北京博辉瑞进生物科技有限公司,中国)放置在透明玻璃模具中,将GelMA溶液与光引发剂一起添加到模具中。将透明模具暴露于UV光下后,GelMA聚合物链通过交联形成水凝胶网络,并与SIS补片实现宏观拓扑纠缠,形成非粘附性G/SIS复合组织修复材料。鞣酸具有天然的抗菌和抗氧化能力以及组织粘附性,在组织粘合剂中引起了极大的兴趣。接下来,将G/SIS复合组织修复材料浸泡在鞣酸水溶液中,以增强GelMA水凝胶并形成具有粘性的G/SIS-TA复合组织修复材料(图3A,B)。
拉力试验采用STS10N拉力仪(厦门东方仪器有限公司),配有10N称重传感器,十字头(crosshead)速度为100mm/min。测试样品长15毫米。将样品夹在夹具间,以100mm/min的速率拉伸样品,记录力-位移曲线,得到极限抗拉强度。
降解实验采用如下方法进行,首先称量样品(W0)浸入2U/mL胶原酶溶液中,在下连续孵育72h(37±1℃,60rpm)。然后在4小时、8小时、12小时、16小时、20小时、24小时、36小时、48小时、72小时的时间点,采用离心、去离子水洗涤样品并冷冻干燥后称重(Wt)。不同时间点的降解率均按公式(1-Wt/W0)×100%计算得到。
在STS10N拉力仪上进行了粘接试验。用复合组织修复材料将两片猪皮粘在一起,粘接面积为10×10mm2,在常温下加压10秒,然后立即去除外部压力。当拉力计以5mm/min的十字头速度(搭剪试验)施加剪切应力时,粘附的基材将受到剪切应力。剪切粘接试验期间的最大应力记录为粘附强度,该粘附强度用最大力除以初始粘接面积来计算。每次力学试验至少测试5个样品,以获得统计数据。
由于丰富的氢键作用,鞣酸可以在SIS和GelMA水凝胶中形成三维交联网络,因此经过鞣酸改性处理的G/SIS-TA复合组织修复材料显示出显著增强的机械性能、降低的降解速率和湿粘附性。将制备好的GelMA或G-TA称重后冷冻干燥48小时,再次称重,其中,含水量按照公式(1-干重/湿重)*100%进行计算,结果如图2所示。经鞣酸改性处理的GelMA(G-TA)水凝胶的含水量从80.0%降低到42.2%(图2)。
如图3C所示,干燥状态下纯SIS补片的极限抗拉强度为3.59±0.32MPa,使用GelMA溶液润湿后(即SIS-湿润)降至2.98±0.36MPa,而G/SIS复合组织修复材料的极限抗拉强度为3.00±0.28MPa,可见,GelMA水凝胶的交联并没有改善其机械性能。然而,在在使用鞣酸溶液改性后,G/SIS-TA复合组织修复材料的极限抗拉强度显著增强至3.93±0.59MPa。
如图3D所示,G/SIS-TA复合组织修复材料(66.20±5.91%)在72h内的降解速度比G/SIS复合组织修复材料(83.24±5.53%)慢得多。因此,G/SIS-TA复合组织修复材料可以通过儿茶酚/邻苯二酚型的鞣酸分子与组织之间的各种界面相互作用附着于组织。
如图3E所示,为了评估G/SIS-TA复合组织修复材料的粘附性能,我们使用两片新鲜湿润猪皮进行搭接试验,通过测量粘附强度来评估。在不到10秒的轻微压力下,G/SIS-TA复合组织修复材料可以在湿润的猪皮之间建立牢固的粘附,粘附强度约为60kPa。
如图3F所示,G/SIS-TA复合组织修复材料与商业急救带和现有组织粘合剂(即TISSEEL,COSEAL和DURASEAL)相比具有较高的粘附强度,值得注意的是,G/SIS-TA复合组织修复材料的粘附强度明显高于用鞣酸改性处理的GelMA(G-TA)水凝胶。
此外,除猪皮以外,本公开还针对心脏、肠道、胃、肝脏和肺进行粘附强度测试,结果如图3G所示。G/SIS-TA复合组织修复材料还在包括心脏(51.4kPa)、肠道(48.1kPa)、胃(56.0kPa)、肝脏(39.0kPa)和肺(42.1kPa)等各种组织上表现出良好的粘附性(图3G)。
另外,申请人也对本公开的实施例2-5进行相关粘附强度性能测试,结果如下表1所示:
表1
实施例 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 |
粘附强度 | 45kPa | 63kPa | 73kPa | 17kPa |
由表1可以看出,本公开的复合组织修复材料的粘附性能优异。并且,使用鞣酸作为改性剂制备得到的复合组织修复材料相比使用儿茶酚作为改性剂制备得到的复合组织修复材料的粘附强度更加优异。
2、细胞相容性实验
为了评估G/SIS-TA复合组织修复材料的细胞相容性,三种细胞(即L929成纤维细胞、HACAT细胞和RAW264.7巨噬细胞)在SIS补片、G/SIS复合组织修复材料和G/SIS-TA复合组织修复材料的提取物中培养,而正常DMEM对照组命名为TCPs(组织培养聚苯乙烯)。
将SIS补片、G/SIS复合组织修复材料以及G/SIS-TA复合组织修复材料浸入完全培养基中制备提取物,用0.2μm过滤装置对提取物进行灭菌。用胰蛋白酶-EDTA(Giboc)处理细胞,用提取物重悬细胞。细胞接种于96孔板的每个孔中,培养24和72小时(图4A)。采用细胞计数KIT-8(CCK-8)测定(Bimake)和活/死测定分析水凝胶的细胞相容性。
CCK-8测定方法为:96孔板孵育一定时间后,将CCK-8溶液用提取物稀释10倍。去除原始培养基后,每孔加入100μL CCK-8试剂,与细胞在5% CO2培养箱中37℃共培养2小时,用BIO RAD仪在450nm波长下测定吸光度。CCK-8实验结束后,进行细胞活/死测定。
将2μM钙调蛋白AM(在DPB中)和4μMETHD-1(Invitrogen)工作溶液加入孔中。然后将96孔板在37℃的5%CO2孵化器中孵育20分钟。使用激光扫描共聚焦显微镜(日本尼康)观察细胞的形态。对于每组,进行了4个平行实验。
首先,通过细胞活/死测定测试L929细胞的活力(图4B),所有三种提取物处理组的绿色荧光(活细胞)与TCPs相当,并且可以检测到很少的红色荧光死细胞。随后,使用CCK-8法检测持续的细胞生长。
由于SIS补片中保留了良好的内源生长因子,三种细胞类型的增殖在提取物处理后均得到促进,在72小时时观察到G/SIS-TA复合组织修复材料提取物组的最高光密度(O.D)值(图4C-E)。
特别是,G/SIS-TA复合组织修复材料提取物可以显著降低LPS诱导的巨噬细胞增殖抑制,表明含有多酚的G/SIS-TA复合组织修复材料具有抗炎潜力(图4F)。
3、抗氧化、抗炎性能测试
DPPH清除实验,将1mg DPPH溶于20mL PBS中,得到DPPH溶液。将1g样品与20mLDPPH溶液混合,并置于室温暗处保存5min。用紫外可见分光光度计在519nm处测量液体的吸光度(AM),并测量TCPs(组织培养聚苯乙烯)的吸光度(AB)作为对照。其中,清除效率(%)按照下式计算得到:
清除效率(%)=100×(AB-AM)/AB。
从DPPH清除实验可以看出,G/SIS-TA复合组织修复材料对表达ROS的清除效率约为80%,而TCPs对照组、SIS补片和G/SIS复合组织修复材料基本没有抗氧化活性(图5)。
将SIS补片、G/SIS复合组织修复材料以及G/SIS-TP复合组织修复材料浸入完全培养基中制备提取物,用0.2μm过滤装置对提取物进行灭菌。为了评估复合组织修复材料的抗炎潜力,处于静息状态(RAW264.7,M0)的巨噬细胞用脂多糖(LPS)预极化为M1表型24小时,然后培养在SIS补片提取物、G/SIS复合组织修复材料提取物、G/SIS-TP复合组织修复材料提取物中,使用免疫荧光染色以评估它们的表型。
如图6A所示,未刺激的M0巨噬细胞(LPS(-))呈正常圆形,而LPS刺激的巨噬细胞(LPS(+))表现出典型的促炎M1表型巨噬细胞,具有煎饼状形态。如图6B的共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像所示,在用SIS补片提取物、G/SIS复合组织修复材料提取物或者G/SIS-TP复合组织修复材料提取物处理后,煎饼状M1表型巨噬细胞的数量显著减少,并且M1巨噬细胞表面标记iNOS(红色荧光)的含量也显著降低。
4、抗菌性能测试
这里进行了一系列抗菌试验来评估G/SIS-TA复合组织修复材料的抗菌效果。将SIS补片、G/SIS复合组织修复材料以及G/SIS-TA复合组织修复材料浸入LB培养基中制备提取物,用0.2μm过滤装置对提取物进行灭菌。
体外抗菌活性试验,取108CFU/mL金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)和大肠杆菌(ATCC25922)分别在新鲜的Mueller-Hinton肉汤培养基、G/SIS复合组织修复材料提取物或G/SIS-TP复合组织修复材料提取物中以37℃培养24h,将菌液稀释104倍后包被在LB琼脂板上,37℃培养24h,用ImageJ软件(1.53版)捕获菌落图像进行分析。
对于小鼠腹膜炎感染模型,雌性BALB/C小鼠(每组n=6)被腹膜内感染,致死剂量为1.0×108CFUs S.金黄色葡萄球菌悬浮液。感染后1小时后,通过腹膜内注射G/SIS复合组织修复材料提取物或G/SIS-TP复合组织修复材料提取物进行治疗。感染后48小时,小鼠通过颈椎脱位法安乐死。收集腹腔积液,37℃孵育18h后,于LB琼脂平板上计数细菌数量。
如图7A所示,首先用LB培养基制备G/SIS复合组织修复材料和G/SIS-TA复合组织修复材料的提取物,以培养金黄色葡萄球菌(S.aureus)和大肠杆菌(E.coli),并将培养的细菌涂在LB平板上,用菌落计数技术定量细菌活力。
如图7B所示,G/SIS复合组织修复材料组的细菌抑制率分别为S.aureus 8.0%和E.coli2.9%,与对照组相比没有显著差异。相比之下,G/SIS-TA复合组织修复材料组对S.aureus(92.1%,p<0.0001)和E.coli(82.2%,p<0.0001)的抑制率显著更高。细菌内化是细菌感染宿主细胞的一个重要方面,被内化的细菌可以在非吞噬细胞中存活、增殖和扩散。随后,在IEC-6细胞中进一步测试了内化的细菌。
如图7C所示,在G/SIS-TA复合组织修复材料组中只能检测到少量的S.aureus(绿色荧光),而G/SIS复合组织修复材料组和TCPs对照组的绿色荧光数量显著更高。
本公开还构建了小鼠腹膜炎感染模型,通过腹腔注射非致死剂量的S.aureus感染小鼠。在感染后0.5小时,作为阴性对照的PBS、作为阳性对照的环丙沙星(CPFX)溶液以及G/SIS复合组织修复材料提取物和G/SIS-TA复合组织修复材料提取物(使用PBS作为对照)通过腹腔注射到小鼠腹膜炎中。在感染48小时后,分析了小鼠腹腔液中的细菌负荷。
如图7D和7E所示,与PBS对照相比,G/SIS-TA复合组织修复材料提取物的抗菌效率非常接近CPFX,显著降低了细菌负荷约97.3%CFU,而G/SIS复合组织修复材料提取物没有治疗潜力。
5、大鼠全层皮肤伤口模型检测
考虑到粘附性、生物相容性、免疫调节和抗菌性能,G/SIS-TA复合组织修复材料有望促进持续发炎的感染伤口的愈合。这里,建立了金黄色葡萄球菌感染的大鼠全层皮肤伤口模型。
16只健康SD大鼠脊柱两侧各造2个全层圆形创面(d=1cm)。创面注射金黄色葡萄球菌200μL(1×107CFU/mL),孵育1小时引起感染。治疗后,于第3、7、10、14天用数码相机拍摄伤口图像,并用ImageJ软件进行分析。第3天处死8只大鼠(每组4只创面),评价细菌活性。将再生的皮肤组织在Mueller-Hinton Broth培养基中匀浆,稀释10、100、1000倍后涂于LB琼脂板上,37℃培养24h,用Image J软件捕获菌落图像进行分析。同时,将再生皮肤组织在PBS中匀浆,采用定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)定量检测VEGF、TGF-β、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10的表达。皮肤创面切片按免疫荧光染色标准方案用苏木精-伊红(H&E)或相应抗体(包括F4/80、CD206、iNOS、CD31)染色,细胞核用DAPI染色。第14天处死8只大鼠(每组4只创面)进行组织学分析和RNA测序。
将伤口随机分为四组,即PBS组、GelMA组、G/SIS组和G/SIS-TA组(图8A)。宏观图像显示,经G/SIS-TA组治疗的感染伤口在手术后3天显著愈合(图8B)。14天后,PBS组、GelMA组和G/SIS组的伤口仍然明显,而G/SIS-TA组加速了伤口闭合,只有少数痂皮。统计上,14天后剩余的伤口分别为PBS组15.90%、GelMA组13.43%、G/SIS组8.64%和G/SIS-TA组2.19%(图8C)。
为了从组织学上证实G/SIS-TA组的治疗效果,进行了H&E染色。如图8D所示,手术后3天,G/SIS-TA组是所有组中炎症反应最低的。14天后,我们仍能观察到PBS处理的伤口组织不连续且存在明显的痂皮,这与宏观图像一致,而在G/SIS-TA组中观察到完整的表皮和整个真皮,结构良好。特别是,在G/SIS-TA组处理的伤口中发现了平行排列的致密胶原纤维、丰富的新生血管以及CD31的表达(图9),并且明显观察到毛囊再生。相反,尽管G/SIS组的再生皮肤优于GelMA组和PBS对照组,但其再生皮肤的成熟度不及G/SIS-TA组。
术后3天对伤口中的细菌负荷进行了计数。将组织匀浆涂在LB平板上,培养18小时后,PBS组的细菌负荷(CFU)为5431±1967,GelMA组为6104±2776,G/SIS组为3555±1647,G/SIS-TA组为331±124(图8E)。可见G/SIS-TA组处理过的伤口中的细菌负荷比其他3组低至少一个数量级。
细菌感染会导致促炎细胞因子(例如IL-1β和IL-6)的持续分泌以及低水平的抗炎细胞因子(例如IL-4和IL-10)和促再生细胞因子(例如VEGF和TGF-β)的分泌。在这里,为了进一步研究这些感染伤口中的炎症微环境,通过RT-qPCR检测了相应的细胞因子(图8F)。与没有任何生物活性的PBS对照组和GelMA组相比,G/SIS组和G/SIS-TA组均显著降低了促炎细胞因子IL-1β和IL-6的表达,而IL-4、IL-10、VEGF和TGF-β的表达上调。特别是,在数据归一化后,G/SIS-TA组显示出最高的相对表达量IL-4(2.96)、IL-10(1.92)、VEGF(1.78)和TGF-β(11.71),以及最低表达量IL-1β(0.55)和IL-6(0.31)。
6、伤口周围巨噬细胞的极化检测
利用免疫荧光染色F4/80(巨噬细胞标记物,黄色)、iNOS(M1型巨噬细胞标记物,红色)和CD206(M2型巨噬细胞标记物,绿色)评估伤口周围巨噬细胞的极化。
获取伤口及伤口周边组织,组织样品用4%多聚甲醛固定至少24h后包埋在石蜡中,制备5μm厚的切片用于组织学分析。根据免疫荧光染色的标准步骤,组织切片用相应的抗体(包括F4/80,iNOS,CD206)染色,同时细胞核则用DAPI染色。所有组织切片均使用CLSM下观察并获取图像,通过ImageJ定量。如图10A所示,M1表型巨噬细胞主要在伤口愈合的早期阶段检测到(手术后3天),而M2表型巨噬细胞可以在修复过程的后期检测到(手术后14天)。
如图10B所示,定量分析显示,手术后3天,PBS组、GelMA组、G/SIS组和G/SIS-TA组的相对iNOS免疫荧光密度分别为0.82、0.85、0.73和0.53,手术后14天分别为0.56、0.54、0.42和0.22。相反,手术后3天,PBS组、GelMA组、G/SIS组和G/SIS-TA组的相对CD206免疫荧光密度分别为0.12、0.15、0.27和0.30,手术后14天分别为0.17、0.23、0.44和0.56。这些结果表明,G/SIS-TA组可以通过抗菌和免疫调节有效促进感染伤口的愈合。
为了更好地理解G/SIS-TA组在加速感染伤口愈合中的机制,我们在G/SIS-TA组和经过良好研究的GelMA组处理的伤口上,在术后第14天进行RNA-seq基因测序。如图10C和图10D所示,G/SIS-TA组中上调了1735个基因,而在GelMA组中上调了1195个基因。对这些差异基因进行了基因本体(GO)和KEGG信号通路富集分析。基因本体(GO)有三个类别,即生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF),我们在图10E中列出了前20个差异。值得注意的是,几个生物过程(BP),包括37个与“伤口愈合(GO:0042060)”相关的基因、24个与“皮肤发育(GO:0043588)”相关的基因、21个与“上皮细胞增殖的正调节(GO:0050679)”相关的基因、20个与“毛囊发育(GO:0001942)”相关的基因、11个与“建立皮肤屏障(GO:0061436)”相关的基因和19个与表皮发育(GO:0008544)相关的基因在G/SIS-TA和GelMA组之间显示出显著差异。
需要说明的是,尽管以具体实例介绍了本公开的技术方案,但本领域技术人员能够理解,本公开应不限于此。
以上已经描述了本公开的各实施例,上述说明是示例性的,并非穷尽性的,并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下,对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择,旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进,或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。
Claims (10)
1.一种复合组织修复材料,其特征在于,包括:
基体,所述基体具有纤维丝结构;以及,
存在于所述基体至少一个表面的凝胶网络结构,所述凝胶网络结构通过所述基体的至少一个表面与凝胶前体接触而得到;其中,
所述凝胶前体源自于凝胶组分,所述凝胶组分包括甲基丙烯酸酯化的天然高分子化合物。
2.根据权利要求1所述的复合组织修复材料,其特征在于,所述基体源自于生物可降解的生物材料,优选包含有胶原蛋白,更优选包含有动物小肠粘膜下层材料;和/或,
以所述基体的总质量为100%计,所述凝胶网络结构的含量为50%-500%,优选为100%-300%。
3.根据权利要求1或2所述的复合组织修复材料,其特征在于,所述甲基丙烯酸酯化的天然高分子化合物包括甲基丙烯酸酯化明胶、甲基丙烯酸酯化海藻酸或其盐、甲基丙烯酸酯化壳聚糖、甲基丙烯酸酯化透明质酸或其盐中的一种或两种以上的组合。
4.根据权利要求1-3任一项所述的复合组织修复材料,其特征在于,所述凝胶组分还包括未甲基丙烯酸酯化的天然高分子化合物;优选地,以所述凝胶组分的总质量为100%计,所述未甲基丙烯酸酯化的天然高分子化合物的含量为0-50%,优选为0-20%;更优选地,所述未甲基丙烯酸酯化的天然高分子化合物包括明胶、海藻酸或其盐、壳聚糖、透明质酸或其盐中的一种或两种以上的组合。
5.根据权利要求1-4任一项所述的复合组织修复材料,其特征在于,所述复合组织修复材料通过使用改性剂对所述凝胶网络结构进行改性得到;优选地,所述改性剂包括多酚类化合物;更优选地,所述多酚类化合物包括儿茶酚、邻苯二酚、邻苯三酚、鞣酸、茶多酚中的一种或两种以上的组合。
6.一种根据权利要求1-5任一项所述的复合组织修复材料的制备方法,其特征在于,包括将基体与凝胶网络结构复合成型的步骤;
优选地,所述制备方法包括以下步骤:
在引发剂的存在下,将凝胶组分溶于溶剂中以形成凝胶前体溶液;
使所述凝胶前体溶液在所述基体的至少一个表面形成凝胶网络结构,得到复合产物。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述凝胶前体溶液中,所述凝胶组分的含量为2-20%,优选为5-15%(w/v);和/或,
所述凝胶前体溶液中,所述引发剂的浓度为4-8mg/mL;和/或,
所述形成凝胶网络结构的反应条件为在35-40℃的温度下,反应5分钟-20小时。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法,其特征在于,所述凝胶前体溶液中还包含有促凝剂;优选地,所述凝胶前体溶液中,所述促凝剂的浓度为1-5mg/mL。
9.根据权利要求6-8任一项所述的制备方法,其特征在于,所述制备方法还包括利用改性剂对所述复合产物进行改性的步骤;
优选地,所述改性包括:将所述改性剂溶于溶剂中,得到改性剂溶液;将所述复合产物浸渍于所述改性剂溶液中进行改性,得到复合组织修复材料;
更优选地,所述改性剂溶液中,所述改性剂的含量为10-150%(w/v),优选为20-100%(w/v);和/或,所述改性的时间为12-72小时,优选为18-36小时。
10.一种根据权利要求1-5任一项所述的复合组织修复材料用于制备组织修复制品或医用植入制品的用途,特别是制备皮肤损伤修复制品中的用途。
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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CN118141995A true CN118141995A (zh) | 2024-06-07 |
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Legal Events
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---|---|---|---|
PB01 | Publication |