CN118141994A - 一种基于细胞外基质的双层结构神经导管及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于细胞外基质的双层结构神经导管及其制备方法和应用。所述双层结构神经导管由芯层和粘接在芯层外的皮层复合而成；所述芯层为具有多通道柱状结构的神经组织脱细胞外基质，所述皮层为神经组织脱细胞外基质与甲基丙烯酰化海藻酸钠交联的复合凝胶。本发明双层结构神经导管材料的皮层与芯层均为可降解材料，该复合材料具有合适的缝合强度和力学性能，并具有良好的体外降解效果，生物活性高，对细胞安全且能够促进雪旺细胞的增殖。具有较好的组织相容性，低免疫原性，植入体内可在一定时间内自然降解，可用于周围神经损伤修复。
Description
技术领域
本发明涉及神经修复材料技术领域，更具体地，涉及一种基于细胞外基质的双层结构神经导管及其制备方法和应用。
背景技术
周围神经损伤每年发病人数众多，一直是临床治疗难题。在发达国家，周围神经损伤的发病率约为每年13-23人/10万人。日常生活中的机械损伤、意外事故等极易造成周围神经系统损伤，从而导致身体信号系统的传达中断，进而导致身体运动神经及感觉神经功能部分或完全丧失。相比于软组织及皮肤等部位的损伤，神经损伤的自我修复能力差，影响因素较多。若神经断口未及时处理长合，在伤口处周围的结缔组织的分裂生长会破坏神经修复的微环境，导致在神经生长修复位置形成瘤状组织，造成不可逆的功能障碍，给患者造成极大不便。
目前，自体神经移植仍是治疗周围神经损伤的金标准，但是自体移植有很多局限性，例如供体来源有限且需要二次手术获取，存在供体部分神经功能丧失的风险，长度和粗细难以匹配导致预后不良的问题以及可能会形成神经瘤等等。随着材料科学以及生物学技术的发展，神经导管在周围神经修复领域受到越来越多的关注。为轴突再生提供理想的再生支架和通道，神经导管须具备以下特性：①选择渗透性：导管具有多孔结构，可以选择性地使营养物质和氧气扩散到损伤部位，保持细胞活性；同时排出代谢废物，保护神经轴突，防止瘢痕组织侵入。②合适的降解速率：理想的神经导管应在轴突从近端残端长出通过间隙重新支配神经通路之前保持其完整性，然后溶胀或随周围组织逐渐降解。③合适的机械强度：理想的神经导管应具有合适的弹性模量和刚度，太软容易塌陷从而阻碍神经再生，太硬易损伤周围神经组织。④可缝合性：理想的神经导管易于和神经外膜进行缝合，并且能承受手术缝合线引起的张力。因此，周围神经修复材料的构建不仅需要良好的细胞相容性，还需要考虑缝合性能、力学强度等因素。
目前市面上应用的生物神经修复材料多采用高分子复合材料及免疫反应较低的可降解类生物胶原蛋白类产品，但在临床应用中发现高分子材料较难降解，生物相容性差且有一定概率出现免疫排斥反应；胶原类神经导管在临床上神经修复效果明显，但存在降解速率较快，机械强度弱等问题，且目前市面上产品普遍存在缝合过程复杂、操作困难等问题。因此，亟需开发一款具有较好的缝合强度和力学性能，同时保证其生物相容性，低免疫原性，生物活性，可自然降解并具有合适的降解速率的神经修复材料。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种基于细胞外基质的双层结构神经导管。
本发明的第二个目的在于提供所述基于细胞外基质的双层结构神经导管的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供所述基于细胞外基质的双层结构神经导管的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种基于细胞外基质的双层结构神经导管，由芯层和粘接在芯层外的皮层复合而成；所述芯层为具有多通道柱状结构的神经组织脱细胞外基质，所述皮层为神经组织脱细胞外基质与甲基丙烯酰化海藻酸钠交联的复合凝胶。
本发明以天然神经组织脱细胞后的神经组织脱细胞外基质作为神经修复材料的芯层。然后以天然高分子材料甲基丙烯酰化海藻酸钠、神经组织脱细胞外基质为原料，制备成神经修复材料的皮层。其中，芯层材料具有良好的细胞相容性，可以发挥黏合识别作用，其天然多通道结构为神经细胞的生长提供空间，并起到导向作用。皮层材料具有良好的缝合性能、弹性及机械支撑性能，防止神经修复材料在体内微环境下结构的坍塌，同时阻挡成纤维细胞、炎症细胞、肌肉和血管组织细胞等入侵神经修复材料的芯层。同时芯层与皮层之间的孔隙有效防止结缔组织及分裂生长条件，避免影响正常细胞分化增殖的桥接过程。采用本发明的双层结构神经导管材料的缝合强度为6MPa～18MPa，抗拉强度为1MPa～3MPa，弹性模量为1MPa～5MPa，且柔韧性好、弹性好，能满足临床缝合的需求，且机械强度与人体天然神经相匹配。总之，本发明通过特定材料的皮层与芯层复合以提高整体材料的缝合性能和弹性模量。皮层与芯层均为可降解材料，该复合材料具有合适的缝合强度和力学性能，并具有良好的体外降解效果，生物活性高，对细胞安全且能够促进雪旺细胞的增殖。具有较好的组织相容性，低免疫原性，植入体内可在一定时间内自然降解。
进一步地，所述皮层的厚度为50～1000μm。
进一步地，所述双层结构神经导管的可变直径为0.1mm～10mm，可变长度为0.5mm～100mm。
另外，所述甲基丙烯酰化海藻酸钠(Alginate Methacryloyl，AlgMA)为烯烃双键改性海藻酸钠，其可通过紫外及可见光在光引发剂作用下交联固化成胶。相比传统二价离子(钙离子等)交联，AlgMA光固化交联方式便携化高，且凝胶内部均一性良好。AlgMA光固化水凝胶具有适于细胞生长和分化的三维(3D)结构，且结构单元中的-OH和-COOH均可以作为化学反应活性位点。
本发明还提供上述任一所述双层结构神经导管的制备方法，包括如下步骤：
S1.脱除神经组织中的细胞，获得神经组织脱细胞外基质，作为神经导管的芯层；
S2.将步骤S1的神经组织脱细胞外基质酶解，得到神经组织脱细胞外基质溶液；
S3.向步骤S2的神经组织脱细胞外基质溶液中加入光引发剂和甲基丙烯酰化海藻酸钠，通过溶解或溶胀制备成甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质溶液；
S4.将步骤S3的甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质溶液涂覆在步骤S1的芯层表面，然后紫外光交联，制备成甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质凝胶以作为神经导管的皮层；
S5.将步骤S4的材料依次在含有化学交联剂溶液、乙醇溶液和钙离子溶液中进行交联固化，使芯层和皮层复合粘接，即得双层结构神经导管。
进一步地，步骤S1所述神经组织为来源于鼠、兔、猪、牛或人体的坐骨神经。优选为来源于人体的坐骨神经。
进一步地，步骤S1所述脱除神经组织中的细胞包括如下步骤：先去除附着在神经组织上的筋膜、脂肪等，剪碎成小块，PBS溶液冲洗，换水，确保组织没有血液和碎片；再将预处理后的神经组织在含有脱氧胆酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的PBS溶液中进行脱细胞处理。具体为先在含有1％脱氧胆酸钠、1％聚乙二醇辛基苯基醚的PBS中搅拌24h，再将组织在含有2％脱氧胆酸钠、2％聚乙二醇辛基苯基醚的PBS中搅拌24h，然后将组织在含有3％脱氧胆酸钠、3％聚乙二醇辛基苯基醚的PBS中搅拌24h，最后将组织在去离子水中搅拌4h以上，获得神经组织脱细胞外基质。
进一步地，步骤S2所述神经组织脱细胞外基质酶解为将神经组织脱细胞外基质与胃蛋白酶、盐酸溶液混合、消化，制得神经组织脱细胞外基质溶液。
优选地，所述神经组织脱细胞外基质与胃蛋白酶的质量比为(6～15)：1，进一步优选为(8～14)：1，更优选为(9～12)：1，最优选为10：1。
优选地，所述盐酸溶液的浓度为0.01～1M，进一步优选为0.01M。
进一步地，所述步骤S2所述神经组织脱细胞外基质溶液的质量浓度为0.1～4wt％。
优选地，所述步骤S2所述神经组织脱细胞外基质溶液的质量浓度为2wt％。
进一步地，步骤S3所述甲基丙烯酰化海藻酸钠添加量为神经组织脱细胞外基质溶液的10～20％(m/v)。20wt％几乎是常温下溶解度的极限，超过20wt％的话，溶液粘度太高，难以均匀涂覆在芯层外。
优选地，步骤S3所述甲基丙烯酰化海藻酸钠添加量为神经组织脱细胞外基质溶液的15～20％(m/v)。
进一步优选地，步骤S3所述甲基丙烯酰化海藻酸钠添加量为神经组织脱细胞外基质溶液的17.5～20％(m/v)。
最优选地，步骤S3所述甲基丙烯酰化海藻酸钠添加量为神经组织脱细胞外基质溶液的20％(m/v)。该添加量下，该神经修复材料在缝合强度、弹性、延展性、韧性等方面均有显著提升，且具有良好的体外降解效果，生物活性高，对细胞安全且能够促进雪旺细胞的增殖。
进一步地，步骤S3所述光引发剂为水溶性、细胞相容性的光引发剂。例如：苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂、光引发剂2959等。
进一步地，步骤S4所述紫外光交联为365nm紫外光下室温下光交联5～10min。
进一步地，步骤S5所述化学交联剂包括1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺。
上述步骤S5中钙离子会和海藻酸钠羧基螯合的交联网络，钙离子随着材料的降解缓慢释放。适量的钙离子在神经修复中起重要作用，不但能够促进神经轴突生长，还参与体内其他代谢活动。
进一步地，所述钙离子溶液为氯化钙溶液。
进一步地，步骤S5中所述皮层的厚度为50～1000mm。
本发明提供的双层结构神经导管，皮层与芯层均为可降解材料，该复合材料具有合适的缝合强度和力学性能，并具有良好的体外降解效果，生物活性高，对细胞安全且能够促进雪旺细胞的增殖。具有较好的组织相容性，低免疫原性，植入体内可在一定时间内自然降解，可用于周围神经损伤修复。
本发明公开的神经修复材料可变直径为0.1mm～10mm，可变长度为0.5mm～100mm，适用范围更广。
因此，本发明还提供上述任一所述双层结构神经导管在制备周围神经修复产品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的双层结构神经导管材料以天然神经组织脱细胞后的神经组织脱细胞外基质作为神经修复材料的芯层。然后以天然高分子材料甲基丙烯酰化海藻酸钠、神经组织脱细胞外基质为原料，制备成神经修复材料的皮层。其中，芯层材料具有良好的细胞相容性，可以发挥黏合识别作用，其天然多通道结构为神经细胞的生长提供空间，并起到导向作用。皮层材料具有良好的缝合性能、弹性及机械支撑性能，防止神经修复材料在体内微环境下结构的坍塌，同时阻挡成纤维细胞、炎症细胞、肌肉和血管组织细胞等入侵神经修复材料的芯层。同时芯层与皮层之间的孔隙有效防止结缔组织及分裂生长条件，避免影响正常细胞分化增殖的桥接过程。采用本发明的双层结构神经导管材料的缝合强度高，且柔韧性好、弹性好，能满足临床缝合的需求，且机械强度与人体天然神经相匹配，并具有良好的体外降解效果，生物活性高，对细胞安全且能够促进雪旺细胞的增殖。具有较好的组织相容性，低免疫原性，植入体内可在一定时间内自然降解，可用于周围神经损伤修复。
附图说明
图1为实施例1神经修复材料的制作工艺示意图。
图2为实施例1神经修复材料的实物示意图。
图3为实施例1神经修复材料的扫描电镜图。(a)～(b)纵切面；(c)横切面。
图4为实施例1和实施例4～7神经修复材料的缝合性能和机械性能结果图。(a)缝合强度；(b)拉伸强度；(c)弹性模量；(d)断裂伸长率；(e)韧性；(f)应力-应变曲线。
图5为实施例1神经修复材料在37℃条件下，PBS溶液内的降解曲线图。
图6为实施例1和实施例4～7神经修复材料皮层的孔隙率测定结果图。
图7为实施例1和实施例4～7神经修复材料皮层的溶胀率测定结果图。
图8为实施例1神经修复材料的细胞相容性测试结果图。(a)雪旺细胞毒性测试结果；(b)雪旺细胞增殖测试结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明基于细胞外基质的神经修复材料的制备方法包括如下步骤：
S1.脱除神经组织中的细胞，获得神经组织脱细胞外基质，制备成神经修复材料的芯层；
S2.将所述神经组织脱细胞外基质与盐酸溶液、胃蛋白酶混合、消化，制得细胞外基质溶液；
S3.以甲基丙烯酰化海藻酸钠、光引发剂和所述细胞外基质溶液为原料，通过溶解或溶胀制备成甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质溶液；
S4.将甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质溶液涂覆在芯层表面；然后在室温下进行光交联，制备成甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质凝胶；
S5.将所述甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质凝胶依次采用含有1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和乙醇的溶液和氯化钙溶液在室温下进行交联，制备成基于神经组织脱细胞外基质的神经修复材料(即双层结构神经导管)。
实施例1一种基于细胞外基质的神经修复材料的制备方法
图1为实施例1神经修复材料的制作工艺示意图，具体包括如下步骤：
S1.取新鲜猪坐骨神经去除附着在神经组织上的筋膜、脂肪等，剪碎成小块，在2～8℃的PBS溶液中冲洗、搅拌24h，每天更换两次水，确保组织没有血液和碎片。第二天，将组织在含有1％脱氧胆酸钠、1％聚乙二醇辛基苯基醚的PBS中搅拌24h。第三天，将组织在含有2％脱氧胆酸钠、2％聚乙二醇辛基苯基醚的PBS中搅拌24h。第四天，将组织在含有3％脱氧胆酸钠、3％聚乙二醇辛基苯基醚的PBS中搅拌24h。第五天，将组织在去离子水中搅拌4h以上，制备成神经组织脱细胞外基质，作为神经修复材料的芯层；
S2.将步骤S1的神经组织脱细胞外基质、胃蛋白酶以10:1(w/w)的比例溶解在0.01M的盐酸溶液中，神经组织脱细胞外基质在盐酸溶液中的质量比为2wt％，在室温下搅拌2天，所得的溶液过40目筛网，制得2wt％神经组织脱细胞外基质溶液；
S3.往2wt％神经组织脱细胞外基质溶液中加入0.25％(w/v)的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂固体和20％(w/v)甲基丙烯酰化海藻酸钠固体，通过溶解或溶胀制备成甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质溶液；
S4.将甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质溶液涂覆在芯层表面；然后于365nm紫外光下室温交联5min，制备成甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质凝胶；
S5.将所述甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质凝胶依次采用含有50mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、25mM N-羟基琥珀酰亚胺和98％乙醇的溶液和10％氯化钙溶液在室温下交联12h，制备成所述基于细胞外基质的神经修复材料。
实施例2一种基于细胞外基质的神经修复材料的制备方法
S1.取新鲜人坐骨神经去除附着在神经组织上的筋膜、脂肪等，剪碎成小块，在2～8℃的PBS溶液中冲洗、搅拌24h，每天更换两次水，确保组织没有血液和碎片。第二天，将组织在含有1％脱氧胆酸钠、1％聚乙二醇辛基苯基醚的PBS中搅拌24h。第三天，将组织在含有2％脱氧胆酸钠、2％聚乙二醇辛基苯基醚的PBS中搅拌24h。第四天，将组织在含有3％脱氧胆酸钠、3％聚乙二醇辛基苯基醚的PBS中搅拌24h。第五天，将组织在去离子水中搅拌4h以上，制备成神经组织脱细胞外基质，作为神经修复材料的芯层；
S2.将步骤S1的神经组织脱细胞外基质、胃蛋白酶以10:1(w/w)的比例溶解在0.01M的盐酸溶液中，神经组织脱细胞外基质在盐酸溶液中的质量比为2wt％在室温下搅拌1天，所得的溶液过40目筛网，制得2wt％神经组织脱细胞外基质溶液；
S3.往2wt％神经组织脱细胞外基质溶液中加入0.25％(w/v)的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂固体和20％(w/v)甲基丙烯酰化海藻酸钠固体，通过溶解或溶胀制备成甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质溶液；
S4.将甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质溶液涂覆在芯层表面；然后于365nm紫外光下室温交联10min，制备成甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质凝胶；
S5.将所述甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质凝胶依次采用含有50mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、25mM N-羟基琥珀酰亚胺和95％乙醇的溶液和10％氯化钙溶液在室温下交联24h，制备成所述基于细胞外基质的神经修复材料。
实施例3一种基于细胞外基质的神经修复材料的制备方法
S1.取新鲜大鼠坐骨神经去除附着在神经组织上的筋膜、脂肪等，剪碎成小块，在2～8℃的PBS溶液中冲洗、搅拌24h，每天更换两次水，确保组织没有血液和碎片。第二天，将组织在含有1％脱氧胆酸钠、1％聚乙二醇辛基苯基醚的PBS中搅拌24h。第三天，将组织在含有2％脱氧胆酸钠、2％聚乙二醇辛基苯基醚的PBS中搅拌24h。第四天，将组织在含有3％脱氧胆酸钠、3％聚乙二醇辛基苯基醚的PBS中搅拌24h。第五天，将组织在去离子水中搅拌4h以上，制备成神经组织脱细胞外基质，作为神经修复材料的芯层；
S2.将步骤S1的神经组织脱细胞外基质、胃蛋白酶以10:1(w/w)的比例溶解在0.01M的盐酸溶液中，神经组织脱细胞外基质在盐酸溶液中的质量比为2wt％，在室温下搅拌1天，所得的溶液过40目筛网，制得2wt％神经组织脱细胞外基质溶液；
S3.往2wt％神经组织脱细胞外基质溶液中加入0.25％(w/v)的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂固体和20％(w/v)甲基丙烯酰化海藻酸钠固体，通过溶解或溶胀制备成甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质溶液；
S4.将甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质溶液涂覆在芯层表面；然后于365nm紫外光下室温交联10min，制备成甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质凝胶；
S5.将所述甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质凝胶依次采用含有50mM 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、25mM N-羟基琥珀酰亚胺和98％乙醇的溶液和8％氯化钙溶液在室温下交联16h，制备成所述基于细胞外基质的神经修复材料。
实施例4
同实施例1的制备方法，区别在于，步骤S3中所述甲基丙烯酰化海藻酸钠固体的质量浓度为10％(w/v)。
实施例5
同实施例1的制备方法，区别在于，步骤S3中所述甲基丙烯酰化海藻酸钠固体的质量浓度为12.5％(w/v)。
实施例6
同实施例1的制备方法，区别在于，步骤S3中所述甲基丙烯酰化海藻酸钠固体的质量浓度为15％(w/v)。
实施例7
同实施例1的制备方法，区别在于，步骤S3中所述甲基丙烯酰化海藻酸钠固体的质量浓度为17.5％(w/v)。
测试例
(1)表面形貌
上述实施例1制备得到的神经修复材料的实物如图2所示，由图2可以看出，神经修复材料整体呈现柱状结构，直径约为1mm，长度约为30mm。进而测试实施例1制备得到的神经修复材料的表面形貌，测试方法如下：使用扫描电子显微镜来评估导管的微观结构。将导管附着在导电胶带上并喷上铂/金，厚度约10nm。通过在5～15kV的电压下加速电子20s来获得图像。
表面形貌如图3所示，由图3(a)～(b)可以看出，神经修复材料的芯层和皮层连接紧密，无明显间隙，皮层厚度约为75μm；由图3(b)可以看出，神经修复材料的芯层呈现多通道结构。
(2)缝合强度
测试上述实施例1和实施例4～7制备得到的神经修复材料的缝合强度，测试方法如下：样品分为对照组(未覆膜的去细胞神经基质，即没有皮层只有芯层)和实验组(实施例1、实施例4～7)。参考《YY/T 0500-2021心血管植入物血管假体管状血管移植物和血管补片》，将试样一端固定，在另一端距边缘2mm处用4-0尼龙单丝缝合线穿刺。将缝合线与拉力机相连，以10mm/min的速度进行拉伸，记录瞬间拉断时的最大承受力。同一样本进行3次平行试验。
缝合强度如图4(a)所示。由图4(a)可以看出，在10wt％～20wt％的范围内，随着甲基丙烯酰化海藻酸钠(AlgMA)含量的增加，导管的缝合强度呈现上升趋势，由于20wt％几乎是常温下甲基丙烯酰化海藻酸钠溶解度的极限，超过20wt％的话，溶液粘度太高，难以均匀涂覆在芯层外。相比于对照组，实验组中实施例1的神经修复材料(即20wt％AlgMA样品)的缝合强度显著提升。
(3)机械性能
测试上述实施例1和实施例4～7制备得到的神经修复材料的机械性能，测试方法如下：样品分为对照组(未覆膜的去细胞神经基质，即没有皮层只有芯层)和实验组(实施例1、实施例4～7)。将样品的两端固定在机器的夹具上，两夹具间距15mm。将神经修复材料的两端分别固定在万能材料试验机两侧夹具上，用10mm/min的速度向两端拉伸，至神经修复材料断裂。
机械性能如图4(b)～(f)所示。由图4(b)-(f)可以看出，在10wt％～20wt％的范围内，随着甲基丙烯酰化海藻酸钠(AlgMA)含量的增加，导管的拉伸强度、弹性模量、断裂伸长率、韧性和应力-应变曲线呈现上升趋势。相比于对照组，实验组中实施例1的神经修复材料(即20wt％AlgMA样品)在弹性、延展性、韧性等方面均有显著提升。
(4)降解性能
测试上述实施例1制备得到的神经修复材料皮层的降解性能，测试方法如下：将神经修复材料皮层浸入37℃的PBS溶液中持续不同时间(1、2、3、4、5、6、7天)后，将导管从PBS中取出，进行冷冻干燥。然后，使用分析天平称量干燥的导管并记录。
降解性能如图5所示。由图5可以看出，样品在PBS溶液中降解缓慢，6周后剩余质量超过85％，表明其在生理环境中具有较好的稳定性，具有合适的降解速率。
(5)孔隙率
测试上述实施例1和对实施例4～7制备得到的神经修复材料皮层的孔隙率，测试方法如下：利用比重法测量水凝胶/晶胶孔隙率。具体地，恒温条件下，称量装满无水乙醇的比重瓶，记为M1。将风干至恒重为Mds的样品加入比重瓶中，通过超声、抽真空除去内部气泡。待样品达溶胀平衡后，用无水乙醇重新灌满比重瓶，称重记为M2。小心取出样品，拭去表面无水乙醇，快速称重，记为Mws。根据公式计算孔隙率ε：孔隙率ε(％)＝100×(Mws-Mds)/(M1+Mws-M2)。
孔隙率如图6所示。由图6可以看出，在10wt％～20wt％的范围内，AlgMA溶液质量浓度越高，孔隙率越低。所述神经修复材料皮层的孔隙率均高于70％，多孔的结构便于营养物质和氧气向芯层流动。
(6)溶胀率和平衡含水量
测试上述实施例1和实施例4～7制备得到的神经修复材料皮层的溶胀率和平衡含水量，测试方法如下：将神经修复材料皮层浸入24℃的PBS溶液中持续不同时间(1、2、3、4、6、8、10h)后，将导管从PBS中取出，进行冷冻干燥。然后，使用分析天平称量干燥的导管并记录。
溶胀率和平衡含水量如图7所示。由图7可以看出，在10wt％～20wt％的范围内，AlgMA溶液质量浓度越高，平衡含水量越低，溶胀速率越慢。说明随着AlgMA溶液质量浓度的提高，水凝胶交联度增加，分子链段伸展能力减小，导致存储水分子的空间减小，从而使溶胀比降低。
(7)细胞毒性试验
测试上述制备得到的神经修复材料的细胞毒性，测试方法如下：参考《GB/T16886.5-2017医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》。
实验分为：空白对照、阴性对照、阳性对照、实施例1样品(100％样品浸提液、75％样品浸提液、50％样品浸提液、25％样品浸提液)共7组；其中，阴性对照为细胞完全培养基；阳性对照为10％二甲基亚砜；空白对照为不含试验样品的浸提介质。
浸提液制备：将实施例1的神经修复材料、含10％血清和1％双抗的细胞完全培养基以1:10(w/w)的比例加入封闭容器中，(37±1)℃分别浸提(24±2)h、(48±2)h、(72±2)h制备浸提液。
在96孔板每孔中加入100μL的雪旺细胞悬液(5000个细胞/100μL)，并置于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h，除去培养液。按实验设计分组，每孔加入100μL对应的溶液。继续培养24h后，除去培养液，每孔加入10μL CCk8溶液和90μL完全培养基，在37℃条件下反应1h。
在酶标仪450nm波长下，分别测定吸光度，按下式计算存活率。
式中：
OD450a——供试品吸光度；
OD450b——空白对照组吸光度。
细胞毒性测试结果如图8(a)所示，由图8(a)可以看出，浸提时间为1d、2d、3d的浸提液在4个浓度下，雪旺细胞24h存活率均超过100％，可以认为神经修复材料不具备细胞毒性。
(8)细胞增殖试验
测试方法如下：
实验分为：空白对照、阴性对照、阳性对照、实施例1样品(100％浸提液)共4组；其中，阴性对照为细胞完全培养基；阳性对照为10％二甲基亚砜；空白对照为不含试验样品的浸提介质。
浸提液制备：将实施例1的神经修复材料、含10％血清和1％双抗的细胞完全培养基以1:10(w/w)的比例加入封闭容器中，(37±1)℃浸提(24±2)h制备浸提液。
在96孔板每孔中加入100μL的雪旺细胞悬液(2000个细胞/100μL)，并置于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h，除去培养液。按实验设计分组，每孔加入100μL对应的溶液。分别培养1d、3d、5d，期间每天更换一次分组对应的培养液。
除去培养液，每孔加入10μL CCk8溶液和90μL完全培养基，在37℃条件下反应1h。
在酶标仪450nm波长下，分别测定吸光度。
细胞增殖测试结果如图8(b)所示。由图8(b)可以看出，随着培养天数的增加，实施例1样品组吸光度值逐渐升高，表明神经修复材料能支持雪旺细胞持续增殖。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于细胞外基质的双层结构神经导管，其特征在于，由芯层和粘接在芯层外的皮层复合而成；所述芯层为具有多通道柱状结构的神经组织脱细胞外基质，所述皮层为神经组织脱细胞外基质与甲基丙烯酰化海藻酸钠交联的复合凝胶。
2.根据权利要求1所述双层结构神经导管，其特征在于，所述皮层的厚度为50～1000μm。
3.根据权利要求1所述所述双层结构神经导管，其特征在于，所述双层结构神经导管的可变直径为0.1mm～10mm，可变长度为0.5mm～100mm。
4.权利要求1～3任一所述双层结构神经导管的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.脱除神经组织中的细胞，获得神经组织脱细胞外基质，作为神经导管的芯层；
S2.将步骤S1的神经组织脱细胞外基质酶解，得到神经组织脱细胞外基质溶液；
S3.向步骤S2的神经组织脱细胞外基质溶液中加入光引发剂和甲基丙烯酰化海藻酸钠，通过溶解或溶胀制备成甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质溶液；
S4.将步骤S3的甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质溶液涂覆在步骤S1的芯层表面，然后紫外光交联，制备成甲基丙烯酰化海藻酸钠-细胞外基质凝胶以作为神经导管的皮层；
S5.将步骤S4的材料依次在含有化学交联剂溶液、乙醇溶液和钙离子溶液中进行交联固化，使芯层和皮层复合粘接，即得双层结构神经导管。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤S1所述神经组织为来源于鼠、兔、猪、牛或人体的坐骨神经。
6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤S2所述酶解为将神经组织脱细胞外基质与胃蛋白酶、盐酸溶液混合、消化，制得细胞外基质溶液。
7.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤S3所述甲基丙烯酰化海藻酸钠添加量为神经组织脱细胞外基质溶液的10～20％(m/v)。
8.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤S3所述光引发剂为水溶性、细胞相容性的光引发剂。
9.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤S4所述紫外光交联为365nm紫外光下室温下光交联5～10min。
10.权利要求1～3任一所述双层结构神经导管在制备周围神经修复产品中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410092206.5A CN118141994A (zh) | 2024-01-22 | 2024-01-22 | 一种基于细胞外基质的双层结构神经导管及其制备方法和应用 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410092206.5A CN118141994A (zh) | 2024-01-22 | 2024-01-22 | 一种基于细胞外基质的双层结构神经导管及其制备方法和应用 |
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| CN118141994A true CN118141994A (zh) | 2024-06-07 |
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