CN118141929A - 整合素beta 8的表达抑制剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用 - Google Patents

整合素beta 8的表达抑制剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN118141929A
CN118141929A CN202410278939.8A CN202410278939A CN118141929A CN 118141929 A CN118141929 A CN 118141929A CN 202410278939 A CN202410278939 A CN 202410278939A CN 118141929 A CN118141929 A CN 118141929A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tumor
cells
cell
integrin beta
integrin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410278939.8A
Other languages
English (en)
Inventor
赖允鑫
魏新茹
苏金
牟棱
张泽宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University filed Critical First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority to CN202410278939.8A priority Critical patent/CN118141929A/zh
Publication of CN118141929A publication Critical patent/CN118141929A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70546—Integrin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0642—Granulocytes, e.g. basopils, eosinophils, neutrophils, mast cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了整合素beta 8的表达抑制剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用。所述表达抑制剂包括以整合素beta 8为靶标制备或筛选得到的使整合素beta 8低表达或不表达的试剂。本发明发现在肿瘤细胞中使整合素beta 8低表达或不表达，能够增强肿瘤细胞表面MHC分子的表达，提高肿瘤的免疫原性，促进其被抗原呈递细胞呈递给免疫细胞，促进T细胞浸润，从而提高机体抗肿瘤免疫能力，此外，还发现在淋巴细胞中使整合素beta 8低表达或不表达，能够提高淋巴细胞浸润肿瘤细胞的能力，促进T细胞免疫，即，本发明发现整合素beta8蛋白可作为肿瘤治疗的新靶点，针对肿瘤细胞和淋巴细胞均有效。

Description

整合素beta 8的表达抑制剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用
技术领域
本发明属于细胞免疫治疗技术领域，涉及整合素beta 8的表达抑制剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用。
背景技术
目前对于恶性肿瘤临床上主要的治疗手段包括手术、放疗、化疗等。但随着对机体免疫系统在肿瘤发生发展作用的深入研究和基因工程技术的进步，肿瘤治疗进行着革命性的进展，免疫治疗现已逐渐成为第四大肿瘤治疗方法，其主要通过增强针对肿瘤细胞的免疫应答，达到治疗肿瘤、防止肿瘤复发及转移的目的。相比于血液瘤，实体瘤的细胞疗法更需攻坚。
在肿瘤进展过程中，肿瘤细胞会改变正常的发育过程，形成抑制性的肿瘤微环境(tμmor microenvironment，TME)，其中包括免疫细胞、成纤维细胞和内皮细胞以及多种抑制分子，如免疫抑制细胞因子，以及抑制性免疫检查点通路、抑制肿瘤浸润淋巴细胞杀伤肿瘤的能力。即使免疫细胞到达肿瘤部位，肿瘤微环境会抑制T细胞浸润和增殖，为免疫细胞浸润提供物理屏障。要发挥良好的T细胞治疗效果，需要将足够量的T细胞运输到肿瘤部位，而且T细胞必须浸润到肿瘤内部来发挥其杀伤肿瘤的作用，但肿瘤的微环境会阻止T细胞进入肿瘤内部。如何突破物理屏障也成为限制免疫细胞治疗实体瘤的重要制约因素。
过去十年里，CAR-T细胞疗法改变了肿瘤治疗领域的格局，尤其是在血液类肿瘤中展现出传统疗法无可比拟的治疗效果，为患者带来了新的希望。但这种前沿疗法对占据癌症大多数的实体瘤仍然效果不佳。新兴的免疫细胞治疗是将人体自身的免疫细胞进行收集，然后进行体外编辑、培养扩大，增强其靶向杀伤功能，然后回输体内，激活和增强机体免疫功能，到达抗肿瘤、抗病毒的目的。但是不论是免疫细胞治疗、还是传统的手术治疗、化疗、放疗等治疗实体瘤的效果均没有实质上的突破。因此，如何提高免疫治疗的效果，如提高免疫细胞浸润到肿瘤内部、并保持其在肿瘤微环境中杀伤肿瘤的活力，是临床应用的关键。
整合素是一种异二聚体膜糖蛋白，介导细胞与细胞和/或细胞与细胞外基质之间的相互作用，广泛分布于哺乳动物中。18个已知的α亚基和8个已知的β亚基构成24个整合素异源二聚体。虽然整合素在分布和功能上多种多样，但它们通常作为细胞膜上的粘附分子，在细胞迁移、增殖、分化和存活等各种生物过程中发挥重要作用，从而在止血、免疫反应、发育和癌症中发挥重要作用。在生理条件下，大多数整合素处于静息状态，与配体结合的亲和力较低。当被细胞间刺激激活时，整合素会发生整体构象变化，从低亲和状态转变为高亲和状态。这被称为由内到外的信号传递。高亲和力的整合素然后结合多聚配体，转导外-内信号，启动各种生物活性，如激酶激活、基因表达和细胞骨架重排。整合素beta8蛋白是一个独特的整合素亚家族。它不像其他整合素那样传输双向信号。然而，人们对其结构、配体、信号传导和功能知之甚少。整合素beta8蛋白在肿瘤以及免疫细胞中的作用也需要进一步的研究。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供整合素beta 8的表达抑制剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用，深入分析整合素beta8蛋白在肿瘤以及免疫细胞中的作用，发现整合素beta8蛋白可作为肿瘤治疗的新靶点。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供整合素beta 8的表达抑制剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用，所述表达抑制剂包括以整合素beta 8为靶标制备或筛选得到的使整合素beta 8低表达或不表达的试剂。
本发明中，发现在肿瘤细胞中使整合素beta 8低表达或不表达(如敲除整合素beta 8的编码基因Itgb8)，能够增强肿瘤细胞表面MHC分子的表达，提高肿瘤的免疫原性，提高其被抗原呈递细胞呈递的能力，促进其被抗原呈递细胞呈递给免疫细胞，此外，促进T细胞浸润，从而提高机体抗肿瘤免疫能力，此外，还发现在淋巴细胞(如T细胞)中使整合素beta8低表达或不表达(如敲除整合素beta 8的编码基因Itgb8)，能够提高淋巴细胞浸润肿瘤细胞的能力，促进T细胞免疫从而展现出了更强的肿瘤杀伤效果；也就是说，本发明发现整合素beta8蛋白可作为肿瘤治疗的新靶点，针对肿瘤细胞和淋巴细胞均有效。
可以理解，本发明所述低表达指细胞内整合素beta 8的表达水平低于平均正常水平，不表达即细胞内整合素beta 8不表达，本领域技术人员能够理解并采用本领域的相应技术手段实现低表达或不表达，如采用RNAi技术、CRISPR/Cas9技术等等。
优选地，所述表达抑制剂包括核酸分子、核酸构建体、慢病毒、抗体或小分子化合物。
优选地，所述核酸分子包括双链RNA、siRNA或sgRNA中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述sgRNA(用于CRISPR/Cas9技术中引导Cas9酶靶向目的基因)的核酸序列包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的序列。
优选地，所述肿瘤包括黑色素瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾细胞癌或恶性淋巴瘤中任意一种。
SEQ ID NO.1(sgRNA-1)：agacttctcccggtgtcacctgg；
SEQ ID NO.2(sgRNA-2)：gtctcagtccaactgcatccagg；
SEQ ID NO.3(sgRNA-3)：ctccagctgggtccggaatgcgg。
第二方面，本发明提供一种整合素beta 8的表达抑制剂，所述表达抑制剂包括sgRNA(用于敲除整合素beta 8基因)，所述sgRNA的核酸序列包括SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.3所示的序列。
第三方面，本发明提供一种工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞低表达或不表达整合素beta 8。
优选地，所述工程化免疫细胞中含有载体，所述载体含有抑制整合素beta8蛋白表达的基因；或，所述工程化免疫细胞中缺失全部或部分整合素beta8基因。
优选地，免疫细胞中整合素beta8基因缺失或抑制其表达通过基因工程手段进行处理。
优选地，所述载体为慢病毒载体；一般慢病毒载体通过携带抑制序列(携带的抑制序列根据手段的不同而不同，对整合素beta8基因的抑制表达或敲除可选用不同的手段，如，RNAi技术，CRISPR/Cas9技术等等)，然后包装病毒，病毒感染免疫细胞，稳定转染，然后将免疫细胞中相应的基因抑制表达或敲除，然后进行筛选，即得到整合素beta8蛋白不表达或低表达的免疫细胞。
优选地，所述工程化免疫细胞的出发细胞包括T细胞、NK细胞、单核/巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞、单核/巨噬细胞或中性粒细胞中任意一种。
本发明构建的工程化免疫细胞低表达或不表达整合素beta 8，显著提高其浸润到肿瘤细胞的能力，可有效应用于提升宿主免疫活性。
第四方面，本发明提供第二方面所述的整合素beta 8的表达抑制剂，第三方面所述的工程化免疫细胞在制备治疗肿瘤的制剂中的应用。
第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面中所述的整合素beta 8的表达抑制剂或第三方面所述的工程化免疫细胞。
优选地，所述药物组合物还包括PD-1抗体。
本发明中，PD-1抗体指靶向PD-1(程序性死亡受体1)的抗体，为一种免疫药物(如市售的anti-PD-1单抗)，能够阻断PD-1与其配体的结合，本发明中发现，将整合素beta 8的表达抑制剂与PD-1抗体联用，能够显著提高治疗肿瘤效果。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
优选地，所述辅料包括载体、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。
第六方面，本发明提供整合素beta 8的表达抑制剂在制备肿瘤增殖抑制剂中的应用，所述表达抑制剂包括以整合素beta 8为靶标制备或筛选得到的使整合素beta 8低表达或不表达的试剂。
优选地，所述表达抑制剂包括核酸分子、核酸构建体、慢病毒、抗体或小分子化合物；优选地，所述核酸分子包括双链RNA、siRNA或sgRNA中任意一种或至少两种的组合；优选地，所述sgRNA(用于CRISPR/Cas9技术中引导Cas9酶靶向目的基因)的核酸序列包括SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.3所示的序列。
第七方面，本发明提供整合素beta 8的表达抑制剂在制备以非疾病诊断或治疗为目的肿瘤增殖抑制剂中的应用。
本发明中，发现整合素beta 8的表达抑制剂能够有效抑制肿瘤细胞的增殖，可作为增殖抑制剂，具有广阔的应用前景，例如肿瘤细胞相关机制的基础研究中等。
优选地，所述表达抑制剂包括核酸分子、核酸构建体、慢病毒、抗体或小分子化合物；优选地，所述核酸分子包括双链RNA、siRNA或sgRNA中任意一种或至少两种的组合；优选地，所述sgRNA(用于CRISPR/Cas9技术中引导Cas9酶靶向目的基因)的核酸序列包括SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.3所示的序列。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明发现免疫细胞中缺失整合素beta 8会增强免疫细胞的功能，增加肿瘤内部浸润的T细胞的数量，增强抗肿瘤的免疫反应，为实体瘤的治疗提供新的手段以及理论基础。克服了其他治疗实体肿瘤方法中T细胞浸润较少的问题；
(2)本发明发现在肿瘤细胞中使整合素beta 8低表达或不表达，能够提高肿瘤的免疫原性，提高浸润到肿瘤内部免疫细胞的免疫应答能力和肿瘤杀伤能力，验证以腺病毒形式在肿瘤原位注射的方式，在肿瘤原位敲除整合素beta 8基因从而提高肿瘤的免疫原性、增强免疫细胞浸润；发现整合素beta 8的表达抑制剂和PD-1抗体联合应用能够相互协同，抗肿瘤效果显著提升。
附图说明
图1A为本发明实施例1中利用sgRNA-1特异性敲除小鼠T细胞整合素beta 8的基因组测序图；
图1B为本发明实施例1中利用sgRNA-2特异性敲除小鼠T细胞整合素beta 8的基因组测序图；
图1C为本发明实施例1中利用sgRNA-3特异性敲除小鼠T细胞整合素beta 8的基因组测序图；
图2为本发明实施例1中MC38肿瘤大小图；
图3为本发明实施例1中MC38肿瘤重量统计图；
图4为本发明实施例1中MC38肿瘤中T细胞浸润情况的免疫组化图；
图5为本发明实施例1中MC38肿瘤中T细胞浸润情况的统计图；
图6为本发明实施例2中MC38肿瘤特异性敲除整合素beta 8的基因组测序图测序峰图；
图7为本发明实施例2中RNA水平鉴定Itgb8敲除的QRT-PCR统计图；
图8为本发明实施例2中蛋白水平鉴定Itgb8敲除的WB图；
图9为本发明实施例2中敲除与未敲除Itgb8的小鼠结肠癌细胞MC38增殖曲线统计图；
图10为本发明实施例2中敲除与未敲除Itgb8的小鼠结肠癌细胞在C57小鼠皮下生长曲线图；
图11为本发明实施例2中敲除与未敲除Itgb8的MC38肿瘤大小图；
图12为本发明实施例2中敲除与未敲除Itgb8的MC38肿瘤重量统计图；
图13为本发明实施例2中敲除与未敲除Itgb8的MC38肿瘤中T细胞浸润情况的免疫组化图；
图14为本发明实施例2中的敲除与未敲除Itgb8的MC38肿瘤中T细胞浸润情况的统计图；
图15为本发明实施例3中敲除与未敲除Itgb8的小鼠黑色素瘤细胞在C57小鼠皮下生长曲线图；
图16为本发明实施例3中敲除与未敲除Itgb8的小鼠黑色素瘤中T细胞浸润情况的免疫组化图；
图17为本发明实施例3中的敲除与未敲除Itgb8的小鼠黑色素瘤中T细胞浸润情况的统计图；
图18为本发明实施例4中敲除与未敲除Itgb8的人非小细胞肺癌A549在裸鼠皮下生长曲线图；
图19为本发明实施例4中敲除与未敲除Itgb8的人非小细胞肺癌A549在裸鼠皮下肿瘤形态图；
图20为本发明实施例5中MC38流式结果图；
图21为本发明实施例5中A549流式结果图；
图22为本发明实施例5中DC细胞与肿瘤抗原共定位的免疫荧光图；
图23为本发明实施例5中巨噬细胞与肿瘤抗原共定位的免疫荧光图；
图24为本发明实施例6中针对小鼠Itgb8的腺病毒结构图；
图25为本发明实施例6中腺病毒治疗实体肿瘤的肿瘤生长曲线统计图；
图26A为本发明实施例7中治疗实体肿瘤的肿瘤生长曲线图；
图26B为本发明实施例7中治疗实体肿瘤的肿瘤生长曲线统计图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
本发明具体实施例中使用的小鼠和细胞系包括：C57BL/6J小鼠、裸鼠购自广东药康生物科技有限公司，小鼠结肠癌细胞系MC38，小鼠黑色素瘤细胞系B16F10，人肺腺癌细胞系A549，购买自ATCC。
实施例1
1.设计靶向整合素beta 8的sgRNA
设计sgRNA，首先进入NCBI找到mouse Itgb8目的基因(NCBI ID:320910)，在目的基因界面找到GenBank，点击进入，下载带有目的基因详细信息的基因组序列文件，用snapgene软件打开该文件，sgRNA位点设计在上游靠近ATG的外显子中，离ATG 50bp后，且在外显子的CDS长度为非3的整数倍，基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列前，PAM序列的特征为NGG(N可以为任意核苷酸)，所以选择3’末端含有GG的sgRNA，这样可以构成PAM序列。同时，sgRNA的序列应避免以4个以上的T结尾，GC％含量最佳为30％-70％(40％-60％)。根据选择的sgRNA，通过生物信息学方法，对sgRNA进行脱靶分析。然后对靶细胞的靶位点序列进行进行确认，以靶位点为中心分别向两边延长400-500bp设计引物对，对靶位点进行PCR测序，根据测序结果决定下一步sgRNA的构建，综上设计出下面三条sgRNA：
Sg1组：整合素beta 8亚基sgRNA-1(SEQ ID NO.1)，agacttctcccggtgtcacctgg (PAM)；
Sg2组：整合素beta 8亚基sgRNA-2(SEQ ID NO.2)，gtctcagtccaactgcatccagg (PAM)；
Sg3组：整合素beta 8亚基sgRNA-3(SEQ ID NO.3)，ctccagctgggtccggaatgcgg (PAM)。
2.构建整合素beta 8亚基敲除的T细胞
(1)构建慢病毒载体：设计完sgRNA，lentiCRISPR v2(Plasmid#52961)是张锋实验室发布一个慢病毒载体系统，cas9和sgRNA表达框在同一载体上。而且Cas9的C端带有FLAG融合标签，载体包含Puromycin抗性基因，适合建稳转系。首先将合成的两条引物退火形成双链DNA，引物如下所示(Itgb8 sg1、Itgb8 sg2和Itgb8 sg3)，再与载体连接，从退火之后的反应体系中取4.5μL产物，再加入0.5μL已切开的lentiCRISPR v2载体和5μL的稀释的DNA双链，16℃连接3h以上。然后转化涂板，Amp抗性。挑克隆，提质粒送测序。
Itgb8 sg1：
F：5’--caccgAGACTTCTCCCGGTGTCACC--3’；
R：5’--aaacGGTGACACCGGGAGAAGTCTc--3’；
Itgb8 sg2：
F：5’--caccgGTCTCAGTCCAACTGCATCC--3’；
R：5’--aaacGGATGCAGTTGGACTGAGACc--3’；
Itgb8 sg3：
F：5’--caccgCTCCAGCTGGGTCCGGAATG--3’；
R：5’--aaacCATTCCGGACCCAGCTGGAGc--3’。
包装慢病毒
用DMEM的完全培养基培养293T细胞，约6×10^6个细胞接种到10cm细胞培养皿中，过夜；待293T细胞长到密度在80％至90％左右，将上清小心去掉，加入只含有1％FBS的DMEM培养基7mL，对293T细胞进行饥饿处理大约2h；2h后进行病毒的包装。准备质粒：将pSPAX2，pMD2.G两个辅助质粒和带有目的基因的表达质粒按12μg：3μg：9μg的比例加入到含有Opti-MEM的1.5mL的EP管或15mL离心管中(根据细胞盘数，每盘0.5mL的Opti-MEM溶液),另外，将PEI按总质粒量的三倍即72μg加入到另一管Opt-MEM中(每盘0.5mL的Opti-MEM溶液)，静置5min后，两者混合在一起，充分混匀，25℃静置20min；将PEI质粒混合液用1mL枪头逐滴加入293T细胞中，注意动作要轻缓，不要将细胞吹起来，每盘加入1mL，加完后，十字法混匀并放培养箱培养10h；将含PEI和质粒的上清小心去除，并加入新鲜培养基1％FBS的DMEM培养基(最好先预热至37℃)，每10cm细胞培养皿加入10mL，继续培养。24h收一次病毒上清，一共收3次。将上清用0.22微米过滤器后，感染目的细胞或放置于4℃冰箱，一周内有效。
(2)小鼠T细胞的分离和激活
分离脾脏：将小鼠脱臼处死，无菌取脾脏，放置于磨玻璃板间研磨成单细胞悬液，经200目滤网过滤后离心弃上清，用红细胞裂解液裂解红细胞5min离心，PBS清洗后进行下一步分选操作。
细胞的分选：完全参照美天妮公司Pan TlsolationKit的说明书进行，大致步骤如下：离心收集待分离的单个核细胞，用MACS buffer(0.5％BSA、0.08％EDTApH 7.2的PBS溶液)充分混悬细胞(每1×107的细胞需要加入40μL的MACS buffer)。然后加入生物素标记的一抗混合物(biotin-antibody cocktail)(每1×10^7的细胞需要加入10μL的一抗混合物)，充分混匀后4℃孵育5min；5min后，往细胞悬液中加入MACS buffer(每1×10^7的细胞需要加入30μL的MACS buffer)，加入相应包被的超微磁珠(每1×10^7的细胞需要加入20μL的超微磁珠)，充分混匀后置4℃孵育10min；将分离柱安装入磁场中，根据细胞的数量选择MS柱子，加入0.5mLMACS buffer，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱；直接将孵育好的待分选的细胞上柱子进行分选，在重力作用下T细胞流下来，用一个15mL离心管收集起来，其他细胞则被吸附在柱子中；待流尽后，加入MACS buffer 3mL，将残留在柱子里的T细胞洗下来；重复上一步骤。将分选得到的T细胞离心，并用PBS洗一次，计数；
T细胞激活：吸取T cell activationParticles即用CD3和CD28包被好的T细胞活化的磁珠(每5×10^6的T细胞需要加入25μL的磁珠)经培养基洗一次后，去上清，然后加入少量T细胞培养基充分吹散磁珠，然后与T细胞混合均匀，种在48孔板中，5×10^6的T细胞/mL/孔，刺激72h。
(3)小鼠T细胞感染病毒
经过72h刺激后，收集T细胞至15mL离心管内，离心300g，5min，然后去上清，加入1mLT细胞培养基去重悬细胞到一个新的1.5mL的EP管(微型离心管)中，利用分选的磁铁将磁珠吸附在管壁上，轻轻吸取T细胞到另外一个新的1.5mL离心管，重复一次磁珠吸取过程，将磁珠尽可能去除；加入T细胞培养基将T细胞适度重悬后，计数；根据需要转染的病毒上清的个数，将T细胞等分至6孔板中，一般为2×10^6至5×10^6T细胞/每个病毒上清，保证加入的T细胞悬液不超过1mL，然后加入病毒上清6mL，置于培养箱过夜或转染12h；病毒上清转染T细胞后，将细胞重悬，吸取至15mL离心管，离心300g，5min，弃病毒上清，然后用T细胞培养基以1×10^6T细胞/mL进行重悬，根据T细胞数量将细胞放在24孔、12孔或6孔板中，在T细胞培养基中培养4天后，进行敲除效果的鉴定。
3.基因组测序确定敲除效果
提T细胞基因组DNA，然后测序。测序引物是根据引物设计原则以靶位点为中心分别向两边延长400-500bp设计引物对，对靶位点进行PCR测序，确定小鼠T细胞已经成功敲除整合素beta 8，如图1所示，sgCtrl为未进行敲除T细胞结果，图1A、图1B、图1C分别是sg1，sg2，sg3 Itgb8敲除整合素beta 8亚基T细胞结果，测序结果显示：在基因组水平上，成功敲除Itgb8。
4.体内实验验证在T细胞上敲除整合素beta 8亚基后的抗肿瘤效果。
取对数生长期的小鼠结肠癌细胞MC38，经0.25％胰酶消化后使用高糖DMEM培养基将细胞悬液浓度调整为5×10^6个/mL，离心后用PBS洗涤两次，离心重悬，将5×10^5/只MC38肿瘤细胞注射至C57小鼠腹股沟皮下位置，待小鼠肿瘤长至100mm3的大小，将敲除Itgb8的T细胞1×10^6/只，尾静脉注射到小鼠体内，对照组T细胞也是同样操作。每周两次测量肿瘤大小，观察肿瘤生长情况。接种过MC38肿瘤细胞后的第31天处死小鼠，进行后续实验分析，包括肿瘤重量测量以及肿瘤浸润淋巴细胞含量检测。
治疗效果：肿瘤大小见图2，如图2所示sg1、sg2、sg3组肿瘤的大小均比对照组减小；肿瘤重量见图3，如图3所示sg1、sg2、sg3组肿瘤重量与对照组相比也是有减轻；CD8+T细胞浸润到实体瘤内部的免疫组化图见图4，如图4所示三个T敲除整合素beta 8组的CD8+T细胞阳性信号(棕褐色信号)远远多于对照组；T细胞浸润到实体瘤内部的统计图见图5，如图5所示sg2、sg3组浸润的CD8+T细胞数有统计学差异；以上实验结果表明，T细胞敲除整合素beta 8后肿瘤生长被有效抑制，其主要特征是敲除整合素beta 8亚基后的T细胞浸润到肿瘤内部数量增多，特别是细胞毒T淋巴细胞CD8+T细胞，敲除Itgb 8能够促进T细胞免疫从而展现出了更强的肿瘤杀伤效果。
根据实施例1中的结果，肿瘤大小以及T细胞浸润等综合比较，表明使用sgRNA-3进行敲除获得T细胞的效果最好。
实施例2
本实施例在MC38细胞上敲除Itgb8，敲除实验流程设计参照实施例1。
1.MC38细胞敲除Itgb8
小鼠结肠癌肿瘤细胞进行慢病毒感染，感染步骤参考实施例1，不再赘述，待敲除成功，进行挑细胞单克隆，选出完全敲除Itgb8细胞克隆(MC38-ITGB8-KO)进后续实验；
2.基因型鉴定(见图6)，QRT-PCR鉴定(见图7)，WB鉴定(见图8)，基因组测序峰图、RNA水平和蛋白水平上可以证明在结肠癌细胞MC38中有效敲除Itgb8；敲除和野生型生长趋势图(见图9)；MC38敲除和野生型体外生长趋势没有太大的变化，也表明敲除Itgb8后在体外培养环境中不会影响其生长。
2.MC38荷瘤实验
取对数生长期敲除Itgb8的小鼠结肠癌细胞MC38，经0.25％胰酶消化后使用高糖DMEM培养基将细胞悬液浓度调整为5×10^6个/mL，离心后用PBS洗涤两次，离心重悬，将5×10^5/只的肿瘤细胞(100μL)注射至C57小鼠腹股沟皮下位置，对照组也是同样操作。每周两次测量肿瘤大小，观察肿瘤生长情况。接种过MC38肿瘤细胞后的第36天处死小鼠，进行后续实验分析，包括肿瘤重量测量以及肿瘤浸润淋巴细胞含量检测。
肿瘤生长折线图(见图10)、肿瘤照片(见图11，un代表检测不到肿瘤)、肿瘤重量(见图12)、T细胞浸润免疫组化图(见图13，标尺1×为1000μm，2×为500μm，20×为50μm)、T细胞浸润数量统计图(见图14)，结果如图所示，敲除Itgb8组的肿瘤在小鼠体内生长被抑制，肿瘤重量下降，并且敲除组肿瘤内部浸润CD8+T细胞数增加。说明敲除肿瘤Itgb8也能促进免疫细胞对肿瘤的杀伤效果，特别是细胞毒T淋巴细胞CD8+T细胞。
实施例3
本实施例在B16F10细胞上敲除Itgb8，敲除实验流程设计参照实施例1。
取对数生长期敲除Itgb8的小鼠结肠癌细胞B16F10，经0.25％胰酶消化后使用高糖DMEM培养基将细胞悬液浓度调整为5×10^6个/mL，离心后用PBS洗涤两次，离心重悬，将5×10^5/只的肿瘤细胞(100μL)注射至C57小鼠腹股沟皮下位置，对照组也是同样操作。每周两次测量肿瘤大小，观察肿瘤生长情况。接种过B16F10肿瘤细胞后的第25天处死小鼠，进行后续实验分析，肿瘤浸润淋巴细胞含量检测.
肿瘤生长折线图(见15)、T细胞浸润免疫组化图(见图16，标尺1×为1000μm,2×为500μm,20×为50μm)、T细胞浸润数量统计图(见图17)，结果表明，敲除黑色素肿瘤中Itgb8组的肿瘤生长同样被抑制，并且敲除组肿瘤内部浸润CD8+T细胞数增加。
实施例4
本实施例在A549细胞上敲除Itgb8，敲除实验流程设计参照实施例1。
取对数生长期敲除Itgb8的小鼠结肠癌细胞A549，经0.25％胰酶消化后使用高糖DMEM培养基将细胞悬液浓度调整为5×10^6个/mL，离心后用PBS洗涤两次，离心重悬，将5×10^5/只的肿瘤细胞(100μL)注射至C57小鼠腹股沟皮下位置，对照组也是同样操作。每周两次测量肿瘤大小，观察肿瘤生长情况。接种过A549肿瘤细胞后的第53天处死小鼠，图18到图19展示的是敲除人肺癌细胞系A549中的Itgb8在裸鼠的皮下生长曲线图和肿瘤图，结果表明，敲除人肺癌细胞系A549中的Itgb8在裸鼠的皮下生长会受到抑制，没有敲除Itgb8的A549生长没有受到抑制。裸鼠是先天性无胸腺裸鼠，被作为研究细胞介导的免疫缺陷的模型。这些小鼠缺失胸腺，不能产生成熟的T细胞，只有固有免疫，说明敲除肿瘤Itgb8不仅能够促进适应性免疫，还能增强固有免疫对肿瘤的清除能力。
实施例5
(1)肿瘤细胞表面MHC-Ⅱ类分子的检测
取对数生长期的敲除和未敲除以及过表示Itgb8的小鼠结肠癌细胞MC38、人非小细胞肺癌细胞A549，经0.25％胰酶消化后使用高糖DMEM培养基将细胞悬液浓度调整为2×10^6个/mL，取100μL接种于12孔板中。12h后，在细胞中加入10ng/mL的IFN-γ诱导48h。将上述细胞调整细胞密度为1×10^5/mL，每孔50μL，加入MHC-Ⅱ-PE或HLA-DR-PE至浓度1μg/mL。实验组、阴性对照于冰上孵育1h，收集细胞用流式细胞仪检测。
MC38流式结果(见附图20)，“-”表示没加IFN-γ诱导的流式结果，灰色代表没有敲除Itgb8的MC38、橙色代表敲除Itgb8的MC38、蓝色代表过表达Itgb8的MC38，“+IFN-γ”代表加IFN-γ诱导的流式结果，横坐标代表MHC-Ⅱ-PE，纵坐标表示细胞数量的百分比，结果显示没加IFN-γ的三组均不表达MHC-Ⅱ，加IFN-γ诱导不敲除Itgb8的MC38、敲除Itgb8的MC38、过表达Itgb8的MC38在IFN-γ诱导下均表达MHC-Ⅱ，且敲除组比例升高至51％，过表达组则相对降低。
A549流式结果(见图21)，“-”表示没加IFN-γ诱导的流式结果，灰色代表没有敲除Itgb8的A549、橙色代表敲除Itgb8的A549、蓝色代表过表达Itgb8的A549，“+IFN-γ”代表加IFN-γ诱导的流式结果，横坐标代表HLA-DR-PE，纵坐标表示细胞数量的百分比；结果显示没加IFN-γ的三组均不表达HLA-DR。而不敲除Itgb8的A549、敲除Itgb8的A549、过表达Itgb8的A549在IFN-γ诱导下均表达HLA-DR，且敲除组比例升高至24％。
IFN-γ是唯一的II型干扰素，也是Th1细胞、CD8+T细胞、γδT细胞、NKT细胞、NK细胞、树突状细胞和巨噬细胞产生的标志性细胞因子，它参与细胞的抗病毒、抗肿瘤和免疫调控作用。IFN-γ还可以通过促进巨噬细胞活化、上调抗原处理及呈递分子的表达，此实验用IFN-γ来诱导MHC分子的表达。
总结：两个细胞系的流式结果说明肿瘤敲除Itgb8能够提高肿瘤本身的免疫原性，通过增强肿瘤细胞表面MHC分子的表达，促进其抗原提呈，提高肿瘤的免疫原性，从而促进免疫细胞对肿瘤的识别能力，更有效的清除肿瘤。
(2)淋巴结内抗原提呈实验
根据制造商的说明，用红色荧光膜标记Dil对MC38/MC38-Itgb8-KO细胞膜染色。Dil是一种亲脂性膜染色剂，它横向扩散，对整个细胞进行染色。它在结合到膜中之前是弱荧光的。这种红色荧光染料在光谱上类似于四甲基罗丹明，通常用作神经元和其他细胞的长期示踪剂。向1mL PBS中的1×10^6细胞悬浮液中，加入4μL Dil，在37℃下培养10min，然后在4℃下孵育15min。细胞的活力和表型不随标记而改变。PBS清洗细胞后用基质胶进行包裹，基质胶体积与肿瘤细胞体积1:1，随后将标记好的肿瘤细胞注射到C57小鼠皮下第六天后取小鼠肿瘤引流淋巴结，将取好的淋巴结立即放入液氮中速冻，随后送病理公司进行淋巴结冷冻切片，免疫荧光标记CD11c和F4/80，观察与标记的细胞膜有无共定位。
图22-图23代表DC细胞和巨噬细胞与肿瘤的共定位的结果，图22中绿色荧光代表树突状DC细胞，红色代表肿瘤抗原的信号，最后是共定位的结果。sgCtrl是未敲除组肿瘤的淋巴结，可以看到DC细胞与肿瘤抗原共定位的数量极少，sgItgb8是敲除组肿瘤的淋巴结，可以看到DC细胞与肿瘤抗原共定位的数量较多，且是有统计学差异；图23中粉色荧光代表巨噬细胞，红色代表肿瘤抗原的信号，最后是共定位的结果。sgCtrl是未敲除组肿瘤的淋巴结，可以看到DC细胞与肿瘤抗原共定位的数量极少，sgItgb8是敲除组肿瘤的淋巴结，可以看到巨噬细胞与肿瘤抗原共定位的数量较多，且是有统计学差异。
总结：可以发现敲除Itgb8的肿瘤细胞能够提高其被抗原递呈细胞的提呈的能力，促进肿瘤被抗原提呈细胞提呈给免疫细胞的能力，提高免疫系统对肿瘤的杀伤效果。
实施例6
本实施例进行腺病毒治疗。
敲除Itgb8的sgRNA(sgRNA-3)被克隆进腺病毒载体(pADV-μ6-spgRNA(Itgb8)-CMV-sfGFP-P2A-3×FLAG-sgCas9)，Mouse Itgb8 knockdown的腺病毒来自和元生物，病毒滴度为1.26×10^11pfu/mL。在腺病毒治疗肿瘤实验中，取对数生长期的小鼠结肠癌细胞MC38经0.25％胰酶消化后使用高糖DMEM培养基将细胞悬液浓度调整为5×10^6个/mL，离心后用PBS洗涤两次，离心重悬，将5×10^5/只的肿瘤细胞(100μL)注射至C57小鼠腹股沟皮下位置，待小鼠肿瘤长至40-100mm^3后进行肿瘤内部多点注射，每只小鼠病毒用量为3×10^8pfu，将3×10^8pfu的病毒用PBS重悬至20μL，分4点注射至肿瘤内部，48h后注射第二次。
腺病毒结构基因组结构示意图如图24，治疗结果(见图25)肿瘤生长曲线分别是空白对照组(Control，不导入腺病毒载体)、GFP对照组(Ad-GFP，导入不含sgRNA的空腺性病毒载体)、腺病毒治疗组(Ad-ITGB8-KO)；结果表明，腺病毒敲除组治疗效果相对于对照组较好。
实施例7
本实施例进行腺病毒治疗+PD-1单抗联合治疗。
Itgb8敲除的sgRNA(sgRNA-3)被克隆进腺病毒载体(pADV-μ6-spgRNA(Itgb8)-CMV-sfGFP-P2A-3xFLAG-sgCas9),Mouse Itgb8 knockdown的腺病毒来自和元生物，病毒滴度为1.26×10^11pfu/mL。在腺病毒治疗肿瘤实验中，取对数生长期的小鼠结肠癌细胞MC38经0.25％胰酶消化后使用高糖DMEM培养基将细胞悬液浓度调整为5×10^6个/mL，离心后用PBS洗涤两次，离心重悬，将5×10^5/只的肿瘤细胞(100μL)注射至C57小鼠腹股沟皮下位置，待小鼠肿瘤长至40-100mm^3后进行肿瘤内部多点注射，每只小鼠病毒用量为3×10^8pfu，将3×10^8pfu的病毒用PBS重悬至20μL，分4点注射至肿瘤内部，48h后注射第二次，96h后注射第三次；联合anti-PD-1单抗(品牌Selleck，货号A2122，Anti-mouse PD-1InVivo)，每只小鼠200μg，将200μg单抗重悬至100μL的PBS中，在第24h和72h通过腹腔注射的方式打到小鼠体内。
PD-1(程序性死亡受体1)，是一种重要的免疫抑制分子，为免疫球蛋白超家族，是一个288氨基酸残基的膜蛋白。其最初是从凋亡的小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆出来。以PD-1为靶点的免疫调节对抗肿瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等均有重要的意义。其配体PD-L1也可作为靶点，相应的抗体也可以起到相同的作用。PD-1和PD-L1结合启动T细胞的程序性死亡，使肿瘤细胞获得免疫逃逸。
治疗结果(见图26A和图26B)，肿瘤生长曲线分别是空白对照组、GFP对照组、anti-PD-1组、腺病毒治疗组、anti-PD-1联合腺病毒治疗组，结果表明anti-PD-1组、腺病毒治疗组均有抑制肿瘤的效果，但是联合组的肿瘤完全被抑制，说明此种联合治疗方法对实体肿瘤是有效的，anti-PD-1抗体能有效降低免疫细胞的耗竭，促进T细胞的杀伤功能，肿瘤Itgb8的敲除也能促进自身抗原的提呈且提高T细胞的浸润，从而起到了良好的抑制肿瘤效果。
综上所述，本发明发现免疫细胞中缺失整合素beta 8会增强免疫细胞的功能，增加肿瘤内部浸润的T细胞的数量，增强抗肿瘤的免疫反应，为实体瘤的治疗提供新的手段以及理论基础。克服了其他治疗实体肿瘤方法中T细胞浸润较少的问题；发现在肿瘤细胞中使整合素beta 8低表达或不表达，能够提高肿瘤的免疫原性，提高浸润到肿瘤内部免疫细胞的免疫应答能力和肿瘤杀伤能力，验证以腺病毒形式在肿瘤原位注射的方式，在肿瘤原位敲除整合素beta 8基因从而提高肿瘤的免疫原性、增强免疫细胞浸润；发现整合素beta 8的表达抑制剂和PD-1抗体联合应用能够相互协同，抗肿瘤效果显著提升。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.整合素beta 8的表达抑制剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用；
所述表达抑制剂包括以整合素beta 8为靶标制备或筛选得到的使整合素beta 8低表达或不表达的试剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述表达抑制剂包括核酸分子、核酸构建体、慢病毒、抗体或小分子化合物；
优选地，所述核酸分子包括双链RNA、siRNA或sgRNA中任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括黑色素瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾细胞癌或恶性淋巴瘤中任意一种。
4.一种整合素beta 8的表达抑制剂，其特征在于，所述表达抑制剂包括sgRNA，所述sgRNA的核酸序列包括SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示的序列。
5.一种工程化免疫细胞，其特征在于，所述工程化免疫细胞低表达或不表达整合素beta8。
6.根据权利要求5所述的工程化免疫细胞，其特征在于，所述工程化免疫细胞的出发细胞包括T细胞、NK细胞、单核/巨噬细胞或中性粒细胞中任意一种。
7.权利要求4所述的整合素beta 8的表达抑制剂或权利要求5或6所述的工程化免疫细胞在制备治疗肿瘤的制剂中的应用。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1或2中所述的整合素beta 8的表达抑制剂或权利要求5或6所述的工程化免疫细胞。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括PD-1抗体；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料；
优选地，所述辅料包括载体、润湿剂、崩解剂、乳化剂、助溶剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、包衣材料、着色剂、pH调节剂、抗氧剂、抑菌剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。
10.整合素beta 8的表达抑制剂在制备肿瘤增殖抑制剂中的应用；
所述表达抑制剂包括以整合素beta 8为靶标制备或筛选得到的使整合素beta 8低表达或不表达的试剂。
CN202410278939.8A 2024-03-12 2024-03-12 整合素beta 8的表达抑制剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用 Pending CN118141929A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410278939.8A CN118141929A (zh) 2024-03-12 2024-03-12 整合素beta 8的表达抑制剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410278939.8A CN118141929A (zh) 2024-03-12 2024-03-12 整合素beta 8的表达抑制剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118141929A true CN118141929A (zh) 2024-06-07

Family

ID=91301186

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410278939.8A Pending CN118141929A (zh) 2024-03-12 2024-03-12 整合素beta 8的表达抑制剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118141929A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210154231A1 (en) Method for producing t cells modified by chimeric antigen receptor
CN106967685B (zh) 共表达抗EGFRvIII嵌合抗原受体和免疫检查点抑制分子的转基因淋巴细胞及其用途
EP3603651B1 (en) Screening methods for targets for cancer therapy
CN114317607B (zh) 融合一代靶向cd7 car和二代靶向bcma的双靶点通用car-t细胞及制备方法
CN111094358A (zh) 一种分离的嵌合抗原受体以及包含其的修饰t细胞及用途
WO2023123195A1 (zh) 一种目的基因可调控的工程化免疫细胞及其制备方法和应用
CN112239759A (zh) 用于敲低PD1基因表达的microRNA及其嵌合抗原受体-T/NK细胞的构建
WO2022012531A1 (zh) 一种经修饰的免疫细胞的制备方法
CN114369622A (zh) 同时靶向cd7和cd19的双特异通用型car-t细胞及其制备方法
JP2020528046A (ja) Ｔ細胞に基づく免疫療法の有効性増強のための組成物および方法
US20200102534A1 (en) Afft2 cell
CN118141929A (zh) 整合素beta 8的表达抑制剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用
CN107858352B (zh) 一种shRNA-cluster序列及其表达载体和用途
CN113736742B (zh) Prtn3基因作为肿瘤免疫治疗中激活细胞毒性免疫细胞靶点的应用
CN115094035A (zh) 一种体外扩增诱导t细胞为组织定居记忆性t细胞的方法
CN110157745B (zh) 一种hafft1细胞的构建方法
CN117304343B (zh) Gpc3靶向的car-nk细胞的制备及其应用
WO2020033331A1 (en) Method and compositions for treating colon cancer and breast cancer
CN117965632B (zh) 一种功能增强型nk细胞的制备方法与应用
CN117866906B (zh) Foxr1抑制剂在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用
CN114075548B (zh) 一种靶向axl的car-t细胞及其制备方法和应用
CN117004574A (zh) 改造的免疫细胞、靶向KMT5A基因的gRNA和应用
CN116179606B (zh) 转录因子tcf1在抵抗car-t细胞耗竭和终末分化中的应用
CN113249331B (zh) 负载Tax抗原的DC细胞、CTL细胞及其制备方法和应用
CN109294995B (zh) 一种rfft1细胞

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination