CN117004574A - 改造的免疫细胞、靶向KMT5A基因的gRNA和应用 - Google Patents
改造的免疫细胞、靶向KMT5A基因的gRNA和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117004574A CN117004574A CN202310956987.3A CN202310956987A CN117004574A CN 117004574 A CN117004574 A CN 117004574A CN 202310956987 A CN202310956987 A CN 202310956987A CN 117004574 A CN117004574 A CN 117004574A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- kmt5a
- gene
- cell
- immune cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101150042466 KMT5A gene Proteins 0.000 title claims abstract description 70
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 68
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 title claims abstract description 33
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title claims description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 31
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 48
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 40
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 33
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 13
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 12
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 12
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 12
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 claims description 7
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 claims description 3
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 abstract description 22
- 101001008816 Homo sapiens N-lysine methyltransferase KMT5A Proteins 0.000 abstract description 17
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 7
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 109
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 22
- 102100027771 N-lysine methyltransferase KMT5A Human genes 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 9
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 8
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 7
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 101001023379 Homo sapiens Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 5
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 4
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 102000009339 Proliferating Cell Nuclear Antigen Human genes 0.000 description 4
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000011198 co-culture assay Methods 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 102100030385 Granzyme B Human genes 0.000 description 3
- 101001009603 Homo sapiens Granzyme B Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 2
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 2
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 108010009254 Lysosomal-Associated Membrane Protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 2
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 2
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 101150059443 cas12a gene Proteins 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 206010012818 diffuse large B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- -1 saCas9 Proteins 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- WRIYPTGFYKBSFU-UHFFFAOYSA-N ()-Conen Chemical compound CCCCOP(=O)(SCC)SCC1=CC=CC=C1 WRIYPTGFYKBSFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 101100385358 Alicyclobacillus acidoterrestris (strain ATCC 49025 / DSM 3922 / CIP 106132 / NCIMB 13137 / GD3B) cas12b gene Proteins 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000005243 Chondrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 101100329224 Coprinopsis cinerea (strain Okayama-7 / 130 / ATCC MYA-4618 / FGSC 9003) cpf1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 101710181478 Envelope glycoprotein GP350 Proteins 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100034523 Histone H4 Human genes 0.000 description 1
- 108010016918 Histone-Lysine N-Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000000581 Histone-lysine N-methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 101000945496 Homo sapiens Proliferation marker protein Ki-67 Proteins 0.000 description 1
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000037984 Inhibitory immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008026 Inhibitory immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 208000000172 Medulloblastoma Diseases 0.000 description 1
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102100034836 Proliferation marker protein Ki-67 Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010038111 Recurrent cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 102000051614 SET domains Human genes 0.000 description 1
- 108700039010 SET domains Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101000910035 Streptococcus pyogenes serotype M1 CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1 Proteins 0.000 description 1
- 201000001322 T cell deficiency Diseases 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000003721 Triple Negative Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011467 adoptive cell therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000011855 chromosome organization Effects 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000032798 delamination Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000011038 discontinuous diafiltration by volume reduction Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000008975 immunomodulatory function Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 206010027191 meningioma Diseases 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- XMSZANIMCDLNKA-UHFFFAOYSA-N methyl hypofluorite Chemical compound COF XMSZANIMCDLNKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Hematology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种改造的免疫细胞、靶向KMT5A基因的gRNA和应用,涉及生物技术领域。本发明提供的改造的免疫细胞通过下调或清除KMT5A基因的表达,增强了免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。本发明提供的靶向KMT5A基因的gRNA的靶点序列如SEQ ID NO.1所示,或为其反向互补序列,具有编辑效率高的优势,为免疫疗法开辟了新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其是涉及一种改造的免疫细胞、靶向KMT5A基因的gRNA和应用。
背景技术
免疫细胞在癌症、传染病和自身免疫的免疫控制中发挥着重要作用。以细胞毒性T细胞为例,CD8+T细胞是细胞毒性免疫细胞,通过直接杀伤肿瘤细胞发挥抗肿瘤免疫作用。抗原特异性CD8+T细胞的激活由T细胞受体(TCR)识别主要组织相容性复合体(MHC)I类(MHC-I)提呈的同源抗原,导致T细胞增殖、细胞因子产生和靶细胞杀伤。T细胞缺陷可导致反复感染或癌症,而CD8+T细胞的过度激活可导致免疫病理学和自身免疫。CD8+T细胞已成为新的癌症治疗药物的聚焦点。经批准的免疫检查点抑制剂通过中和CTLA-4或PD-1/PD-L1增强CD8+T细胞的抗肿瘤反应。无论是单药还是与其他疗法联合使用,这些药物在多种肿瘤适应症中都有效。
利用免疫细胞与嵌合抗原的细胞治疗受体(CARs)已证明在治疗肿瘤方面取得了临床成功。发现以前未知的调节免疫细胞功能的基因,可为免疫疗法开辟不同的途径,因为很大一部分患者对目前批准的疗法仍然没有反应或有不希望有的副作用。
KMT5A(赖氨酸甲基转移酶5A),KMT5A被称为SET8、PR-Set7/9或SETD8,是含有SET结构域的蛋白赖氨酸甲基化酶(protein lysine methyltransferases,KMT)的家族成员之一。KMT5A能够通过催化组蛋白H4第20位赖氨酸的单甲基化(H4K20me1)而在多种生物过程中发挥关键作用,包括基因转录控制、复制起源调节、基因组完整性维持和细胞周期进展和发育。越来越多的证据表明SET8可能参与肿瘤的发展和进展(例如,有研究者认为在三阴性乳腺癌的发生和转移过程中,体内发生KMT5A甲基化依赖性调节机制,该机制使SNIP1具有致癌功能),然而KMT5A在肿瘤免疫治疗中的作用尚不清楚。
但目前对于KMT5A基因进行修饰,从而改造免疫细胞的研究尚处于空白阶段,CRISPR/Cas9系统可以在体外切割双链DNA,Cas9蛋白可以被输送到人类原代细胞,以有效地敲除检查点基因,甚至重写内源性基因组序列,该系统已被用于下一代过继细胞疗法的开发应用。但目前仍需要开发出更加安全有效的KMT5A基因修饰方法以改造免疫细胞。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种改造的免疫细胞,以期进一步提高免疫细胞对肿瘤的杀伤能力。本发明的第二目的在于提供上述改造的免疫细胞的制备方法和用于制备方法中涉及的相关产品,以提高上述改造的免疫细胞的制备效率。本发明的目的还在于提供包括上述改造的免疫细胞及其制备方法在肿瘤药物方面的应用。
为解决上述技术问题,本发明特采用如下技术方案:
根据本发明的一个方面,提供了一种改造的免疫细胞,所述免疫细胞的KMT5A基因表达被下调或清除。
优选地,所述免疫细胞选自T细胞、B细胞、天然杀伤细胞、粒细胞、肥大细胞、肿瘤浸润淋巴细胞和/或外周血单个核细胞。
优选地,所述KMT5A基因表达被下调或清除是通过至少一种CRISPR/Cas基因编辑系统进行了基因编辑。
优选地,所述CRISPR/Cas基因编辑系统包含靶向KMT5A基因的gRNA,所述gRNA的靶点序列如SEQ ID NO.1所示,或为其反向互补序列。
根据本发明的另一个方面,还提供了一种靶向KMT5A基因的gRNA,所述gRNA的靶点序列如SEQ ID NO.1所示,或为其反向互补序列。
根据本发明的另一个方面,还提供了一种用于编辑KMT5A基因的组合物,该组合物包含(ⅰ)和(ⅱ):
(ⅰ)如上述的靶向KMT5A基因的gRNA或编码所述gRNA的多核苷酸;
(ⅱ)Cas核酸酶或编码Cas核酸酶的多核苷酸。
根据本发明的另一个方面,还提供了上述改造的免疫细胞的制备方法,包括获得上述用于编辑KMT5A基因的组合物,将所述组合物引入免疫细胞,从而使KMT5A基因表达被下调或清除。
根据本发明的另一个方面,还提供了一种递送系统,所述递送系统包括活性成分和递送载体,所述活性成分包括上述的靶向KMT5A基因的gRNA,或上述的用于编辑KMT5A基因的组合物;所述递送载体包括脂质体、纳米颗粒、基因枪或电转设备。
根据本发明的另一个方面,还提供了上述的改造的免疫细胞,或上述的靶向KMT5A基因的gRNA,或上述的用于编辑KMT5A基因的组合物,或上述改造的免疫细胞的制备方法,或上述递送系统在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
根据本发明的另一个方面,还提供了用于治疗肿瘤的药物,包括上述改造的免疫细胞。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明提供的改造的免疫细胞通过下调或清除KMT5A基因的表达提高了增强了免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用,共培养条件下,清除率达到了约75%;同时还能增强免疫细胞细胞因子分泌和脱颗粒能力,进一步增强了免疫细胞的杀伤效果。下调或清除免疫细胞中KMT5A基因的表达还大幅提高了免疫细胞的增殖能力。
本发明利用CRISPR/Cas技术对免疫细胞的KMT5A基因进行修饰,选择性地敲除KMT5A基因,进而获得了能够有效抑制肿瘤的免疫细胞。
本发明提供的靶向KMT5A基因的gRNA靶向特异性好,脱靶率低,可以实现对KMT5A基因进行有效编辑,编辑效率高达66%,能有效敲低KMT5A基因的表达,所构建的免疫细胞所带有的突变基因型稳定性高,具有可遗传性。
本发明提供的改造的免疫细胞制备方法简单有效,成本低,所制备的免疫细胞具有持续、高效肿瘤抑制效果,安全性好的优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了Sanger测序检测T细胞中KMT5A基因的编辑效果;
图2示出了qPCR分析T细胞的KMT5A mRNA转录情况;
图3示出了qPCR检测编辑后T细胞中PD1基因的mRNA表达;
图4A示出了体外共培养试验中各细胞与CRIMSON-PSMA-PC3细胞共培养后,CRIMSON-PSMA-PC3细胞的存活率;
图4B示出了体外共培养试验中各细胞与CRIMSON-PSMA-PC3细胞共培养后,荧光显微镜检测CRIMSON-PSMA-PC3细胞数量的结果;
图4C示出了各细胞的IFN-γ分泌量;
图4D示出了体外共培养试验中各细胞与CRIMSON-PSMA-PC3细胞共培养后,细胞的脱颗粒能力的检测结果;
图5A示出了体内杀伤实验流程示意图;
图5B示出了体内杀伤实验中肿瘤体积随时间变化结果;
图5C示出了体内杀伤实验中流式细胞仪分析检测KMT5A-down-CAR-T细胞在血液,淋巴结,脾脏和肿瘤中的分布情况;
图6示出了KMT5A基因编辑的肿瘤浸润CD8+T细胞的特征。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
除非另有定义,否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的,将应用以下定义,并且在适当时,以单数形式使用的术语也将包括复数形式,反之亦然。
除非上下文另有明确说明,否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如,提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20%的范围。在一些可选的实施方式中,术语“约”表示其后的数值的±10%的范围。在一些可选的实施方式中,术语“约”表示其后的数值的±5%的范围。
本文中术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之,所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
本文中“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。
本文中“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生,例如,A和/或B包括(A和B)和(A或B)。
本文中“嵌合抗原受体(CAR)”是一种融合蛋白,其包含能够结合抗原的胞外结构域,与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域,以及至少一个胞内结构域。“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽,“胞内结构域”是指已知的作为传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域的任何寡肽或多肽。“结构域”是指多肽中独立于其它区域且折叠成特异结构的区域。
本文中术语“多核苷酸”指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式,多核苷酸包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。多核苷酸的实例包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸包含编码上述抗体或其抗原结合片段的部分,编码可选地为编码正义链或反义链。多核苷酸可以是天然存在的、合成的、重组的或它们的任意组合。
根据本发明的一个方面,提供了一种改造的免疫细胞,所述免疫细胞的KMT5A基因表达被下调或清除。所述KMT5A基因表达被下调或清除可采用本领域任选的可接受的手段,例如当不限于通过基因编辑系统敲除免疫细胞中的KMT5A基因,或通过干扰RNA沉默KMT5A基因。
可选的实施方式中,所述KMT5A基因表达被下调或清除是通过至少一种CRISPR/Cas基因编辑系统进行了基因编辑。
可选的实施方式中,所述CRISPR/Cas基因编辑系统包含靶向KMT5A基因的gRNA,所述gRNA的靶点序列如SEQ ID NO.1所示,或为其反向互补序列。
可选的实施方式中,所述免疫细胞选自T细胞,B细胞,天然杀伤(NK)细胞,粒细胞,粒细胞具体的选自中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞,肥大细胞,肿瘤浸润(TIL)淋巴细胞和/或外周血单个核细胞。
可选的实施方式中,所述免疫细胞选自CD8+T细胞。
可选的实施方式中,所述免疫细胞为表达CAR(嵌合抗原受体)的免疫细胞,优选为表达CAR的T细胞(CAR-T)细胞,进一步优选为表达CAR的CD8+T细胞。本发明不限制表达CAR的免疫细胞中嵌合抗原受体的结构,对于嵌合抗原受体中的能够结合抗原的胞外结构域,跨膜结构域和胞内结构域,本领域技术人员可以根据公知的教材、参考文献、工艺手册、商品说明和标准文件等记载的方法进行选择,本发明对此不做限制。
可选的实施方式中,表达CAR的免疫细胞靶向前列腺特异性膜抗原,其嵌合抗原受体含有PSMA(prostrate specific membrane antigen,前列腺特异性膜抗原)结合结构域(PSMA-CAR)。可选的实施方式中,PSMA-CAR依次包括CD8α信号肽、PSMA单链抗体重链可变区、Linker、PSMA单链抗体轻链、CD8铰链区、CD8α跨膜结构域、4 1BB的胞内共刺激元件和CD3ζ的胞内结构域。可选的实施方式中,其嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。可选的实施方式中,PSMA-CAR还含有I型干扰素,包括但不限于IFNα,IFNβ,IFNε,IFNκ,IFNω,IFNδ和IFNτ。可选的实施方式中,含有I型干扰素(IFNα2b)的PSMA CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。可选的实施方式中,上述靶向前列腺特异性膜抗原的表达CAR的免疫细胞是CD8+T细胞。
根据本发明的一个方面,提供了一种用于靶向KMT5A基因的gRNA(向导RNA),所述gRNA的靶点序列如SEQ ID NO.1所示,或为其反向互补序列。可以理解的是,所述gRNA还任选的含有本领域已知的、常规的骨架序列,例如但不限于组成发夹区和/或连接区的序列,具体的骨架序列组成本领域技术人员可参考本领域教材、参考文献、工艺手册、商品说明或标准文件、等记载的方法来进行,本发明对此不做限制。
可选的实施方式中,靶向KMT5A基因的gRNA经进一步的修饰,所述修饰例如但不限于甲基化修饰、甲氧基修饰、氟化修饰或硫代修饰中的一种或任意几种。
根据本发明的一个方面,还提供了一种用于编辑KMT5A基因的组合物,该组合物包含(ⅰ)和(ⅱ):
(ⅰ)上述用于靶向KMT5A基因的gRNA,或编码上述靶向KMT5A基因的gRNA的多核苷酸;
(ⅱ)Cas核酸酶,或编码Cas核酸酶的多核苷酸。
本文中Cas核酸酶指的是能够与靶序列结合,或者对靶序列进行切割或产生切口,或者使靶序列产生突变的Cas核酸酶,所述Cas核酸酶包括但不限于天然的Cas核酸酶或含有Cas核酸酶主要功能结构域的多肽或者复合物;或者经突变的Cas核酸酶或多肽;或者与其他功能区域融合的,含有Cas核酸酶,或含有Cas核酸酶功能结构域的融合蛋白。所述Cas核酸酶包括但不限于Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9、Cas12a、Cas12b、SaCas9或SpCas9;或由上述Cas核酸酶突变和/或与其他功能结构域融合后的蛋白、多肽或复合物。
可选的实施方式中,编码上述gRNA的多核苷酸是重组载体,重组载体转化至受试细胞中表达gRNA。可选的实施方式中,编码Cas核酸酶的多核苷酸是重组载体,重组载体转化至受试细胞中表达Cas核酸酶。可选的实施方式中,同一重组载体含有编码上述gRNA的片段和编码Cas核酸酶的片段。
可选的实施方式中,编辑KMT5A基因的组合物包含Cas核酸酶和gRNA形成的核糖核蛋白复合物(RNP)。
根据本发明的一个方面,还提供了上述改造的免疫细胞的制备方法,包括获得上述用于编辑KMT5A基因的组合物,将所述组合物引入免疫细胞,从而使KMT5A基因表达被下调或清除。所述制备方法中可采用本领域已知的、常规的任何方式将上述用于编辑KMT5A基因的组合物引入免疫细胞,引入方式例如但不限于脂质体导入、纳米颗粒递送、载体、转染、热休克、电转染、转导、基因枪或显微注射。可选的实施方式中,上述用于编辑KMT5A基因的组合物包括Cas核酸酶和gRNA形成的RNP复合物,采用电转染的方式将其导入待编辑的免疫细胞中。
根据本发明的一个方面,还提供了一种递送系统,所述递送系统包括活性成分和递送载体,所述活性成分包括上述靶向KMT5A基因的gRNA,或上述用于编辑KMT5A基因的组合物,所述递送载体包括脂质体、纳米颗粒、基因枪或电转设备。
根据本发明的一个方面,还提供了上述改造的免疫细胞,或上述靶向KMT5A基因的gRNA,或上述用于编辑KMT5A基因的组合物,或上述改造的免疫细胞的制备方法,或上述递送系统在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
根据本发明的一个方面,还提供了一种用于治疗肿瘤的药物,所述药物包括上述改造的免疫细胞。可选的实施方式中,用于治疗肿瘤的药物还包括药物学可接受的辅料。所述辅料包括但不限于载体、稀释剂、缓冲剂、保护剂、稳定剂、吸附剂、基质和赋形剂中的一种或几种的组合。
本发明的构思是通过抑制KMT5A基因表达以提高免疫细胞的杀伤力,因此免疫细胞可以杀伤的肿瘤种类都属于本文中记载的治疗肿瘤的药物可治疗的对象。一些治疗肿瘤的药物的实施例例如但不限于血液肿瘤、实体瘤或其组合。血液肿瘤例如但不限于急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。实体瘤例如但不限于前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、肺癌、软骨肉瘤、甲状腺癌、肾癌、间皮瘤、骨肉瘤、胆管癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、脑膜瘤、胰腺癌、多发性鳞状细胞瘤、食管癌、肺小细胞癌、结直肠癌、乳腺癌、成神经管细胞瘤、乳腺癌、或其组合。当改造的免疫细胞为表达CAR的免疫细胞,治疗肿瘤的药物更适于免疫细胞中嵌合抗原受体中抗原结合域能够结合的具有对应的肿瘤标志物的肿瘤类型。例如一些实施例中,改造的免疫细胞为表达结合PSMA嵌合抗原受体的细胞,其可应用于制备治疗前列腺肿瘤的药物中。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明,但是,应当理解为,这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用,而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1人T细胞的制备
1.人外周血单核细胞PBMC的分离
取健康人的血液30ml,并转移至50mL离心管中;另取一50mL离心管,管内预先加入15mL淋巴细胞分离液,将离心管内的全血缓慢加入预先加有淋巴细胞分离液的离心管中。离心机缓升缓降,800g离心25分钟,然后吸取单核细胞层至新的50mL离心管中,加入PBS30mL,混匀,500g离心10分钟,弃上清,用40mL PBS重悬细胞,300g离心10分钟。
用含10%FBS、1%青霉素/链霉素的X-vivo培养基(Lonza,#BEBP02-054Q)重悬所得到的PBMC细胞。
2.人CD8+T淋巴细胞的分选与活化
将PBMC细胞用x-vivo培养基重悬,每107细胞加入70μL x-vivo无血清培养基,和20μL人CD8分离磁珠,4℃孵育15分钟,然后加入PBS到15mL清洗细胞,800g离心5分钟,弃上清,加入500μL x-vivo培养基重悬细胞,且细胞总数不超过1×108,获得细胞悬液。分离柱放入磁力架,用3mL x-vivo无血清培养基缓冲液润洗分离柱,待全部缓冲液流出,然后将细胞悬液加入分选柱中缓慢流出丢弃流出液;之后用3mL x-vivo无血清培养基清洗分离柱3次。再加入5mL x-vivo无血清培养基至分选柱中,将分离柱移出磁场,迅速用活塞将细胞推入新的15mL离心管中,300g离心10分钟。弃上清,加入x-vivo完全培养基,调整细胞密度为1×106cell/ml,随后加入TransAct活化试剂(Miltenyi Biotec),每106细胞/ml加入10μL,混匀后在37℃、5%CO2培养箱中培养2天。
实施例2构建表达嵌合抗原受体的T细胞
1.构建PSMA-CART载体、病毒滴度测定。
该载体由上海邦耀生物科技有限公司赠与,构建方法、扩增方法及病毒滴度测定参见CN113717942A(申请号CN202110580868.3,发明名称为“一种联合嵌合抗原受体和I型干扰素的免疫治疗方法及其应用”的中国专利申请,公开日为2021年11月30日,CN113717942A说明书第348-664段)。
2.PSMA-CAR慢病毒包装制备。
采用三质粒系统进行包装制备,采用三种质粒:PSMA-CART载体,包装辅助质粒psPAX2质粒(Addgene ID,#12260)和pMD2.G质粒(Addgene ID,#12259)。
将293T细胞铺于10cm培养皿中,于含5%CO2的37℃培养箱中孵育24h,第二天细胞密度达到50%以上时转染慢病毒质粒。在一个1.5ml EP管中加入250μl无血清DMEM,加入18μg包装质粒,其中psPAX2质粒:pMD2.G质粒:PSMA-CAR载体质粒质量比例为2:1:3;另一个EP管中加入250μl无血清DMEM以及60μl lipo2000。5分钟后,将两个EP管的液体充分混匀,静置20分钟。将得到的混合液加入到细胞培养皿的293T细胞中,混匀,37℃的5%CO2培养箱培养。6小时后换液,加入新鲜的完全培养基,继续培养。转染后48h收集含慢病毒的上清。4℃,25000rpm离心2小时,进行慢病毒液的浓缩。去掉病毒上清,按照病毒原液1:100体积比加入X-VIVO培养基重悬病毒。
3.将步骤2的PSMA-CAR慢病毒感染CD8+T细胞。
按慢病毒量:细胞数为1:200比例将浓缩病毒加入到实施例2得到的活化48h后的CD8+T细胞中,37℃条件下培养48h,之后更换新鲜培养基,继续培养。
4.流式细胞仪检测T细胞CAR表达。
由于阳性CD8+T细胞表面会表达CD3ε、CD8α,故在病毒感染五天后用流式细胞检测CAR表达。
病毒感染的CD8+T细胞染色采用APC/Cyanine7anti-human CD8Antibody(Biolegend,cat#344714)、PE anti-human-CD107a(Invitrogen,#12-1079-42)抗体进行细胞表面染色,染色30分钟,流式细胞仪(FACSAria)收集细胞,FlowJo 9.9.6(Treestar,Ashland,OR)软件分析。流式结果显示发明人已制备得到CAR表达为阳性的T细胞。
实施例3构建KMT5A基因编辑体系并检测编辑效率。
1.靶向KMT5A基因的sgRNA设计及合成
根据KMT5A基因序列(GeneBank,ID:387893),发明人设计和筛选了一种靶向KMT5A基因第四外显子的sgRNA(sgKMT5A),所述sgRNA靶点序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
具体如下所示:
KMT5A-sgRNA靶点序列:AGCCCTGAAAAAGCCCATCA(SEQ ID NO.1),所述sgRNA由IDT(Integrated DNA Technologies)合成,所述KMT5A-sgRNA scaffold序列为GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ IDNO.19)。
KMT5A基因编辑体系包括sgKMT5A和spCas9-NLS(购自QB3MacroLab,Berkeley)。采用上述基因编辑系统能够有效编辑CD8+T细胞基因组中KMT5A基因。将冻干的sgRNA(IDT合成)重悬在无RNA酶的去离子水中,终浓度为100pmol/μL,储存在-80℃中备用。
2.RNP电转,对KMT5A基因进行编辑
实施例2中制备的T细胞慢用病毒转染48小时后,进行sgRNA和spCas9的电转。首先解冻sgRNA,按照1:1(v/v)的比例将解冻后的sgRNA到加入spCas9-NLS(浓度为40μM),于37℃孵育15分钟,得到核糖核蛋白复合物(RNP)。
以20μl电转试剂重悬106CD8+T细胞,然后将上述RNP添加到悬液中,用枪轻柔吹打,随后立即转移到电转杯中(电解缓冲液来自人T细胞转染试剂盒(Lonza,#VPA-1002)),使用Lonza 4D电穿孔系统EH115程序电转,电穿孔后,立即向每个孔中加入80μL预热培养基,并在室温孵育2分钟。然后将细胞转移到具有50U/mL IL-2(Peprotech,USA))的X-VIVO培养基中培养,细胞密度为106细胞/mL。
3.T细胞基因组提取。
电转3天后,提取基因组DNA,T细胞基因组DNA提取步骤如下:
(1)将培养的细胞处理为细胞悬液,1000rpm离心1min,弃上清后加入200μL缓冲液GA,充分振荡使细胞彻底悬浮。
(2)加入20μL Proteinase K溶液并充分混匀。
(3)加入200μL缓冲液GB并颠倒混匀,可观察到白色絮状沉淀产生。70℃放置10min,可观察到溶液变清亮,简短离心去除管盖内壁水珠。
(4)加入200μL无水乙醇,振荡15s充分混匀,并简短离心去除管盖内壁水珠。将所有液体和沉淀加入吸附柱CB3中,吸附柱放入收集管。12000rpm离心30s。弃废液,并将吸附柱放回收集管。
(5)向吸附柱CB3内加入500μL缓冲液GD(使用前按照瓶身标记加入相应体积的无水乙醇),12000rpm离心30s。弃废液,并将吸附柱CB3放回收集管。
(6)向吸附柱CB3内加入600μL漂洗液PW(使用前按照瓶身标记加入相应体积的无水乙醇),12000离心30s。弃废液,并将CB3吸附柱放回收集管。重复此操作步骤一次。
(7)将CB3吸附柱和收集管12000rpm离心2min。弃废液,并将吸附柱置于室温下至彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液,避免漂洗液中的乙醇影响后续酶反应。
(8)将CB3吸附柱转移入干净的离心管中,向吸附膜中心部位滴加50-200μL缓冲液TE或ddH2O(pH7.0~8.5)。室温放置2~5min后12000rpm离心2min,收集离心管中的溶液。为提高DNA提取率可将离心得到的溶液再次加入吸附柱CB3中,室温放置2~5min,12000rpm离心2min,收集离心管中溶液。
4.T细胞KMT5A基因编辑效率检测
根据基因组的对应编辑位置设计检测的上游引物,采用以下引物进行PCR检测:
KMT5A check-F:TGAAGTCCGAGGAACAGAAG(SEQ ID NO.2)
KMT5A check-R:CATCAGAGGAACCAAACTGC(SEQ ID NO.3)。
经过对PCR产物的Sanger测序,并进行编辑效率分析,分析结果如图1所示,分析结果表明该编辑系统对KMT5A基因的靶向编辑效率达到66%,获得编辑后的CAR-T细胞命名为KMT5A-down-CAR-T细胞。
5.荧光定量PCR分析KMT5A-down-CAR-T细胞的KMT5A基因表达,如下:
(1)取数量为1×106的KMT5A-down-CAR-T细胞,12000rpm离心1min,进行mRNA分离,并对分离的mRNA进行定量分析(具体分离和定量分析步骤与实施例5的3.3的mRNA分离和定量分析步骤相同)。将β-actin作为内参,如图2所示,KMT5A-down-CAR-T细胞的KMT5AmRNA表达量显著降低。
(2)为便于对比,发明人还制备了编辑PD-1基因的CAR-T细胞,将其命名为PD-1-CAR-T细胞。靶向PD-1基因的sgRNA靶点序列如下:gtggcatactccgtctgctc(SEQ ID NO.4)。PD-1-CAR-T细胞的制备过程与KMT5A-down-CAR-T细胞相同,通过检测,发现PD-1的表达量显著降低,如图3所示,T细胞的PD1mRNA表达显著降低。
实施例4KMT5A-down-CAR-T细胞对PSMA-PC3细胞杀伤效果验证
1.构建crimson-PSMA-PC3细胞系。
将人前列腺癌细胞系PSMA-PC3细胞系(由上海邦耀生物科技有限公司赠与,利用慢病毒稳定表达PSMA和荧光素酶,参见CN113717942A,说明书第0507-0510段),将CRIMSON作为报告分子的慢病毒感染,3天后,流式细胞仪分选,收集CRIMSON阳性细胞,得到荧光标记的PSMA-PC3细胞系,命名为CRIMSON-PSMA-PC3细胞系。
2.PSMA-PC3细胞系和T细胞体外共培养试验。
将CRIMSON-PSMA-PC3细胞作为靶细胞,将实施例3中制备得到的KMT5A-down-CAR-T细胞加入到预先铺好CRIMSON-PSMA-PC3细胞的培养板中,KMT5A-down-CAR-T细胞与CRIMSON-PSMA-PC3细胞按照1:1共培养36小时,并分析KMT5A-down-CAR-T细胞的杀伤效果。
如图4A所示,在共培养36小时后,对KMT5A-down-CAR-T细胞杀伤作用进行了检测。图4A中,“PSMA-PC3”表示CRIMSON-PSMA-PC3细胞单独培养,“PSMA-PC3and CTRL”表示CRIMSON-PSMA-PC3细胞与CD8+T细胞共培养,“PSMA-PC3and KMT5A”表示CRIMSON-PSMA-PC3细胞与KMT5A-down-CAR-T细胞共培养。从图中可以看出,相比较CRIMSON-PSMA-PC3细胞和CTRL(CAR-T细胞)共培养的情况,KMT5A-down-CAR-T细胞对CRIMSON-PSMA-PC3细胞具有显著的杀伤作用,CRIMSON-PSMA-PC3细胞数量仅剩下25%左右。对于共培养情况,发明人通过荧光显微镜检测,结果参见图4B所示,可以看出各个共培养后的肿瘤细胞剩余量,相对于CAR-T细胞,KMT5A-down-CAR-T细胞对PSMA-PC3细胞的杀伤效果更为显著。
除定向凋亡外,CD8+T细胞还可以通过释放IFN-γ(γ干扰素)的细胞因子等杀死靶细胞,IFN-γ是可溶性二聚体细胞因子,可以根据的分泌量相对得出CD8+细胞的杀伤作用强弱。发明人利用ELISA技术检测不同CD8+T细胞PSMA-PC3细胞体外共培养后IFN-γ的分泌量。从图4C可以看出,没有进行KMT5A基因敲低的CD8+T细胞的IFN-γ分泌量仅为200pg/mL,而进行KMT5A基因编辑后的CD8+T细胞的IFN-γ分泌量达到了约280pg/mL。
此外,在KMT5A基因编辑敲低的CD8+T细胞与肿瘤细胞共培养2小时后,发明人还分析了KMT5A-down-CAR-T细胞的脱颗粒能力。图4D中“sgCTRL”为对照组:CD8+T细胞与CRIMSON-PSMA-PC3细胞共培养,“sgKMT5A”为实验组:KMT5A-down-CAR-T细胞与CRIMSON-PSMA-PC3细胞共培养,通过对比发现,KMT5A-down-CAR-T细胞的脱颗粒能力远高于CD8+T细胞。图4D中“CD107a”表示溶酶体相关膜蛋白1(Lysosome-associatedmembraneprotein1,LAMP-1),其大多分布在溶酶体膜和内体膜上。当CD8+T细胞杀伤肿瘤靶细胞时,CD107a分子被转运到细胞膜表面,CD107a分子的阳性表达与CD8+T细胞的细胞毒性正相关,KMT5A-down-CAR-T细胞膜表面的CD107a分子远高于对照组CD8+T细胞,由图4D可以看出,KMT5A-down-CAR-T细胞的脱颗粒能力远高于对照组。
3.PSMA-PC3细胞系和T细胞体内杀伤试验。
为进一步验证KMT5A-down-CAR-T细胞的杀伤作用,发明人还进一步设计了体内杀伤实验:将KMT5A-down-CAR-T细胞注射至已接种PSMA-PC3细胞的小鼠中评估KMT5A-down-CAR-T细胞杀伤效果,如图5A所示。
具体操作如下:
3.1肿瘤细胞移植。
NSG裸鼠雌鼠(6-8周龄,购自集萃药康),共15只,在SPF级动物实验室饲养一周,以适应环境,之后将5×106的PSMA-PC3细胞皮下注射到NSG小鼠背部进行荷瘤造模。将荷瘤小鼠随机分为四组,上述四组荷瘤小鼠分别尾静脉注射PBS(用作阴性对照组,图中标注为“PBS”,小鼠数量为3)、sgCTRL-CAR-T细胞(图中标注为“sgCTRL”,小鼠数量为4)、KMT5A-down-CAR-T细胞(图中标注为“sgKMT5A”,小鼠数量为4)以及PD-1-CAR-T细胞(用作阳性对照组,图中标注为“sgPD-1”,小鼠数量为4)。
于静脉注射之日为测量起始点,之后在14,26,50天分别用游标卡尺测量肿瘤大小,由图5B可以看出随时间推移,注射KMT5A-down-CAR-T细胞的小鼠,肿瘤体积减少速度显著高于其他三组,在60天时,其肿瘤体积最小,这表明KMT5A-down-CAR-T细胞的体内杀伤作用最显著。
3.2制备肿瘤细胞悬液并进行分析。
50天后,对各组荷瘤小鼠实施安乐死,收集肿瘤并保存在冰的2%FBS中;分离外周血、腹股沟淋巴结、脾脏和肿瘤,进行流式细胞分析。在抗凝管收集的外周血中加入红细胞裂解液,冰上裂解10分钟,加PBS终止裂解,800g离心5min,去掉上清,取部分细胞进行流式检测,剩余细胞全部冻存;脾脏和淋巴结分别研磨,70μm滤膜过滤除去非T细胞成分,加红细胞裂解液,在冰上裂解10min,加适量PBS终止裂解,800g离心5min,去掉上清,加适量PBS重悬细胞,再通过40um滤膜过滤除去红细胞碎片,计数,取部分细胞进行流式检测,剩余细胞全部冻存。
将肿瘤用手术剪剪碎,加入胶原酶Collagenase IV(GibcoTM,#17104019,配制浓度为1μg/ml)37℃条件下解离60分钟,细胞悬液用100μm滤膜过滤两次,再次通过40mm细胞过滤器过滤以去除大块,PBS缓冲液清洗两次,然后进行流式细胞仪分析检测敲低KMT5A基因CD8+T细胞在血液,淋巴结,脾脏和肿瘤中的分布情况,由图5C可以看出,编辑前后的T细胞在血液,淋巴结,脾脏和肿瘤中均有分布,且在淋巴结中显著上调,在肿瘤组织中的浸润比CTLR-T的浸润百分比更高,在血液和脾脏中分布和未编辑的没有显著差异。以上结果说明敲低KMT5A基因后,能促进CD8+T细胞对肿瘤的抑制作用。
3.3肿瘤浸润TIL细胞的特征分析。
从小鼠肿瘤中分离肿瘤浸润的T细胞(TIL)浸润的TIL细胞数量与对肿瘤的杀伤能力相关,其数量多少代表离开血液进入肿瘤并发挥肿瘤杀伤功能的细胞数量的多少。发明人对TIL细胞的Ki67、PCNA、GZMB、IFN-γ的mRNA表达量进行了检测。
其中,Ki67,是指MKI67,为细胞增殖标志物,其表达量越高,表明细胞生长越快。PCNA,是指增殖细胞核抗原,为细胞增殖标记物,表达量越高,代表细胞增殖状态越好。GZMB,是指Granzyme B,或称为颗粒酶B,为一种丝氨酸蛋白酶,其表达量高低反应了免疫细胞的杀伤能力。IFN-γ,是指II型干扰素,是行使免疫调节功能的细胞因子,其表达量反应了T细胞的杀伤能力。
具体操作步骤如下:
(1)对TIL细胞进行mRNA分离,具体步骤如下:
将TIL细胞处理为细胞悬液,12000rpm离心1min;然后弃上清,加入500μL Trizol吹打混匀,室温静置3~5min;再加入200μL氯仿,振荡15~20s,冰上静置3~5min;12000rpm,4℃条件下离心15min,可观察到溶液分层;将上层液体吸入新EP管中,加入500μL异丙醇并颠倒混匀,冰上静置10min。之后,12000rpm,4℃条件下离心10min,弃上清,加入1mL的70%~75%乙醇吹打均匀;最后,7500rpm,4℃条件下离心5min,弃上清。沉淀晾干后用RNase Free水溶解,得到分离后的mRNA。
(2)对分离的mRNA进行定量分析,具体步骤如下:
利用PrimeScriptTM RT Master Mix(Takara,#RR036A)配制反转录反应体系,体系如下:5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)2μL,Total RNA 500ng,用RNase Free dH2O补足10μL体积。轻轻混匀后进行反转录反应,PCR反应程序如下:37℃15分钟,85℃5秒4℃终止,得到cDNA。之后利用qPCR SYBR Green Master Mix(Low RoxPlus)(Yeasen,#11202ES03)进行定量PCR。
定量PCR反应液配制如下:qPCR SYBR Green Master Mix(Low Rox Plus)10μl,上游引物(10μM)0.5μl,下游引物(10μM)0.5μl,cDNA 1μl,灭菌超纯水8μl,总体积为20μl。利用Applied Biosystems 7300Fast Real-Time PCR System进行定量PCR反应。反应程序如下:95℃,5min;95℃,10s;56℃,20s;72℃,20s共40个循环。
采用定量PCR所用引物序列如下:
引物名称 | 引物序列 |
KMT5A-qF | ACCGACGGGGAGAACGTATT(SEQ ID NO.5) |
KMT5A-qR | GCATTCCAGAGCATTTGTTCG(SEQ ID NO.6) |
GZMB-qF | TACCATTGAGTTGTGCGTGGG(SEQ ID NO.7) |
GZMB-qR | GCCATTGTTTCGTCCATAGGAGA(SEQ ID NO.8) |
Ki67-qF | GAGGTGTGCAGAAAATCCAAA(SEQ ID NO.9) |
Ki67-qR | CTGTCCCTATGACTTCTGGTTGT(SEQ ID NO.10) |
PCNA-qF | GCGTGAACCTCACCAGTATGT(SEQ ID NO.11) |
PCNA-qR | TCTTCGGCCCTTAGTGTAATGAT(SEQ ID NO.12) |
IFNγ-qF | TGTCGCCAGCAGCTAAAACA(SEQ ID NO.13) |
IFNγ-qR | GCAGGCAGGACAACCATTAC(SEQ ID NO.14) |
β-actin-qF | CATTGCCGACAGGATGCAG(SEQ ID NO.15) |
β-actin-qR | CTCGTCATACTCCTGCTTGCTG(SEQ ID NO.16) |
将β-actin作为内参,从图6可以看出,KMT5A基因编辑后,肿瘤浸润TIL细胞(图中标注“sgKMT5A”)的Ki67和PCNA的mRNA表达上调,相对于对照组(图中标注“sgCTRL”,代表未进行编辑的CAR-T细胞)表达量大幅增加,这表明其增殖能力远高于对照组;TIL细胞的GZMB和IFN-γ的mRNA表达量相对于对照组(图中标注“sgCTRL”,代表未进行编辑的CAR-T细胞),表达量大幅增加,这表明KMT5A基因编辑后,肿瘤浸润TIL细胞杀伤能力增加。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种改造的免疫细胞,其特征在于,所述免疫细胞的KMT5A基因表达被下调或清除。
2.根据权利要求1所述的改造的免疫细胞,其特征在于,所述免疫细胞选自T细胞、B细胞、天然杀伤细胞、粒细胞、肥大细胞、肿瘤浸润淋巴细胞和/或外周血单个核细胞。
3.根据权利要求1或2所述的免疫细胞,其特征在于,所述KMT5A基因表达被下调或清除是通过至少一种CRISPR/Cas基因编辑系统进行了基因编辑。
4.根据权利要求3所述的免疫细胞,其特征在于,所述CRISPR/Cas基因编辑系统包含靶向KMT5A基因的gRNA,所述gRNA的靶点序列如SEQ ID NO.1所示,或为其反向互补序列。
5.一种靶向KMT5A基因的gRNA,其特征在于,所述gRNA的靶点序列如SEQ ID NO.1所示,或为其反向互补序列。
6.用于编辑KMT5A基因的组合物,其特征在于,包含(ⅰ)和(ⅱ):
(ⅰ)如权利要求5所述的gRNA或编码所述gRNA的多核苷酸;
(ⅱ)Cas核酸酶或编码Cas核酸酶的多核苷酸。
7.权利要求1~4任一项所述的改造的免疫细胞的制备方法,其特征在于,包括获得权利要求6所述的组合物,将所述组合物引入免疫细胞,从而使KMT5A基因表达被下调或清除。
8.一种递送系统,其特征在于,所述递送系统包括活性成分和递送载体,所述活性成分包括权利要求5所述的gRNA,或权利要求6所述的组合物;所述递送载体包括脂质体、纳米颗粒、基因枪或电转设备。
9.权利要求1~4任一项所述的改造的免疫细胞,或权利要求5所述的gRNA,或权利要求6所述的组合物,或权利要求7所述的制备方法,或权利要求8所述的递送系统在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
10.用于治疗肿瘤的药物,其特征在于,包括权利要求1~4任一项所述的免疫细胞。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310956987.3A CN117004574A (zh) | 2023-07-31 | 2023-07-31 | 改造的免疫细胞、靶向KMT5A基因的gRNA和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310956987.3A CN117004574A (zh) | 2023-07-31 | 2023-07-31 | 改造的免疫细胞、靶向KMT5A基因的gRNA和应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117004574A true CN117004574A (zh) | 2023-11-07 |
Family
ID=88572197
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310956987.3A Pending CN117004574A (zh) | 2023-07-31 | 2023-07-31 | 改造的免疫细胞、靶向KMT5A基因的gRNA和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117004574A (zh) |
-
2023
- 2023-07-31 CN CN202310956987.3A patent/CN117004574A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6974681B2 (ja) | 細胞傷害性が増加した改変ナチュラルキラー細胞及びナチュラルキラー細胞株 | |
AU2020221409A1 (en) | Modified natural killer (NK) cells for immunotherapy | |
EP3854877A1 (en) | Modified t cell, preparation method therefor and use thereof | |
CN105658789B (zh) | 干细胞微粒和miRNA | |
US11141471B2 (en) | Universal donor checkpoint inhibitor silenced/gene edited cord blood killer cells | |
CN114174495A (zh) | 肿瘤浸润淋巴细胞疗法及其用途 | |
JP2023516300A (ja) | 腫瘍浸潤リンパ球の活性化及び増殖のための方法 | |
US20170152506A1 (en) | Inactivation of lymphocyte immunological checkpoints by gene editing | |
WO2022170219A1 (en) | Adjuvant therapy for cancer | |
CN107523569B (zh) | Pdcd1基因的用途及其相关药物 | |
WO2016177892A1 (en) | Molecular profiling of cd8 t-cells in autochthonous melanoma identifies maf as driver of exhaustion | |
WO2022012531A1 (zh) | 一种经修饰的免疫细胞的制备方法 | |
CN112574952A (zh) | 一种工程化人体免疫细胞、其制备方法及应用 | |
CN114369622A (zh) | 同时靶向cd7和cd19的双特异通用型car-t细胞及其制备方法 | |
CN114787381A (zh) | 获得用于测序的核酸的方法 | |
CN111107856A (zh) | 增强基于t细胞的免疫疗法的效力的组合物和方法 | |
CN117004574A (zh) | 改造的免疫细胞、靶向KMT5A基因的gRNA和应用 | |
EP4359541A2 (en) | Engineered cells for therapy | |
CN112266899A (zh) | 修饰的免疫细胞及其用途 | |
Guo et al. | Mettl3-dependent m6A modification is essential for effector differentiation and memory formation of CD8+ T cells | |
EP4289939A1 (en) | Population of transfected immune cells and method for their production | |
EP3789485A1 (en) | Cellular therapies for cancer | |
CN118141929A (zh) | 整合素beta 8的表达抑制剂在制备治疗肿瘤的制剂中的应用 | |
WO2023196921A1 (en) | Granzyme expressing t cells and methods of use | |
WO2023227354A1 (en) | Nucleic acid modified biological cell with expansion-dependent gene expression |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |