CN118126927A - 贴壁细胞的无血清快速悬浮驯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药学领域，一种贴壁细胞的无血清快速悬浮驯化方法包括：冻存细胞的复苏与传代；单克隆制备及筛选；无血清悬浮驯化；经筛选的单克隆细胞在无血清培养基以及肝素钠中培养驯化；继续传代培养并补加无血清培养基以及肝素钠，根据细胞结团情况考虑是否添加肝素钠，连续传代至细胞完全适应悬浮无血清培养，最后获得细胞活率高，生长速率快，结团率低的悬浮细胞。本发明驯化前期筛选了贴壁HEK293T优势单克隆，采用直接无血清悬浮驯化并添加了成分明确的肝素钠来改善细胞结团，大大缩短了细胞驯化周期。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药学技术领域，尤其是贴壁细胞的无血清快速悬浮驯化方法。
背景技术
近年来细胞与基因治疗已成为生物医药领域的热门领域，其中对于嵌合抗原受体-T细胞治疗(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,CAR-T)的研究更是如火如荼，其中一个重要的环节就是病毒载体的生产，CAR-T的病毒载体通常是慢病毒载体(LVVs)，而行业内用于慢病毒载体生产的细胞主要是HEK293T细胞，该细胞系是贴壁细胞，来源是HEK293细胞(human embryonic kidney293cells)中稳转了SV40T-antigen基因，并且SV40T与p53结合可导致细胞周期控制失调，使细胞转化效率提高，因此HEK293T可快速扩增含有SV40 ori的载体，拷贝数达105以上。
基于HEK293T的贴壁特性，截止目前慢病毒载体的生产中贴壁生产工艺仍占很大部分比例，然而贴壁生产中，胎牛血清(FBS)通常必不可少，这势必会增加外源性污染的风险；由于胎牛血清价格昂贵，这也增加了生产的成本；而且胎牛血清是天然混合物，成分尚不完全清楚，这也会增加下游纯化工艺的负担；最后胎牛血清的批次间的差异也会对病毒载体生产产生影响。除此之外，贴壁工艺的另一挑战就是难以实现规模化放大生产，放大生产，不仅增加成本，也会对工艺稳定性和产品一致性造成巨大挑战。因此悬浮细胞生产工艺被不断开发和优化，悬浮生产工艺采用的物料，如培养基是无血清培养基，无动物源成分且成分明确，悬浮培养也容易规模放大生产，可达2000L，并且悬浮工艺还具有成本低、工艺稳定、操作方便等优点，因此悬浮工艺被广泛应用于生物制药行业。
悬浮生产工艺的一个关键是驯化出HEK293T细胞，即将具有贴壁特性的HEK293T人为驯化为悬浮细胞，HEK293T具有上皮细胞特性，贴壁性强，驯化过程结团严重，并且结团不利于质粒的转染，进而影响病毒的产量，这也是驯化的一大难点，传统的驯化方法为梯度减血清，即采用DMEM和无血清培养基按比例添加的方式，FBS的浓度由10％逐渐降低为7.5％、5％、2.5％、1％、0％，但是该方法周期长，通常需3-5个月，因此快速无血清悬浮驯化HEK293T是解决上述问题的关键。
发明内容
本申请的目的在于提供一种贴壁细胞的无血清快速悬浮驯化方法，旨在解决上述现有技术中的问题。
一种贴壁细胞的无血清快速悬浮驯化方法，包括以下步骤：
S1、细胞复苏与传代；将冻存细胞经水浴解冻后使用带血清培养基进行复苏以及传代培养，传代至细胞各参数稳定，细胞参数包括：活率、细胞直径、倍增时间、细胞形态以及无支原体污染；
S2、单克隆制备及筛选；取对数期细胞，以有限稀释法进行单克隆制备，获得50个单克隆细胞；通过评估细胞形态和生长速率，筛选出11个单克隆细胞，这11个单克隆细胞通过质粒转染后，评估生物滴度，筛选出生物滴度最高的克隆细胞；
S3、无血清悬浮驯化；经筛选的单克隆细胞稳定传代后进行驯化，消化、重悬、离心取沉淀，并用30mL无血清培养基重悬制成细胞悬液，向细胞悬液内添加肝素钠至终浓度200-300U/mL；并于CO2环境中耐CO2水平摇床上培养24±4h；继续传代培养并补加无血清培养基以及肝素钠，添加肝素钠终浓度为100-200U/mL，根据细胞结团情况考虑是否添加肝素钠，连续传代至细胞完全适应悬浮无血清培养，最后获得细胞活率高，生长速率快，结团率低的悬浮细胞。
进一步地，选用的贴壁细胞为HEK293T细胞。
进一步地，所述细胞复苏所用培养基为DMEM培养基，并加入10％FBS以及1％ PS。
进一步地，细胞复苏过程中，细胞于37℃水浴解冻后迅速取出加入5mL新鲜的培养基，1000rpm，离心5min，去上清，加入5mL培养基重悬后置于T25培养瓶中，在37℃，5％CO2培养箱中培养48h±4h。
进一步地，悬浮驯化过程中，首次加入肝素钠后细胞培养条件为：37.0±1℃，5.0±0.5％ CO2，80rpm。
进一步地，加入肝素钠后传代培养时，细胞取样计数，按1×106cells/mL传代，补加无血清培养基和肝素钠，将细胞稀释到传代密度，耐CO2水平摇床上继续培养24±4h，每天传代一次，传2～3次；按0.5×106cells/mL的密度继续传代细胞，每隔一天传代一次，并根据细胞结团情况考虑是否添加肝素钠。
本发明的有益效果是：本发明驯化前期筛选了贴壁HEK293T优势单克隆，采用直接无血清悬浮驯化并添加了成分明确的肝素钠来改善细胞结团，大大缩短了细胞驯化周期。
附图说明
图1为HEK293T细胞贴壁生长的细胞形态图。
图2为HEK293T单克隆生物滴度。
图3为驯化成功的HEK293T悬浮细胞形态图。
图4为HEK293T悬浮驯化4-A8组别的细胞数。
图5为HEK293T悬浮驯化4-A8组别的细胞活率。
图6为HEK293T悬浮驯化4-A8组别的细胞直径。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一、实验材料及设备
细胞系为HEK293T细胞，从ATCC细胞库购买。DMEM培养基，Gibc o，货号：2517393。Freestyle293，Gibco，货号：12338-018。0.05％Trypsin-EDTA(1X)，Gibco，货号：2366086。肝素钠，BioFROXX，货号：1170GR001。
CO2培养箱，ESCO，型号：CCL-170B-8。摇床，上海达姆，型号：SC 240C。离心机，Eppendorf，型号：5810R。荧光倒置显微镜，Nikon，型号：Eclipse T&2。细胞培养瓶，Corning，T25货号：430639。125mL摇瓶，Thermo Scientific，4115-0125。
实施例二、HEK293T贴壁培养
取1支实验室冻存的HEK293T细胞，复苏。37℃水浴，轻轻摇晃，解冻后迅速取出加入5mL新鲜的培养基(HG-DMEM+10％FBS+1％PS)中，1000rpm，离心5min，去上清，5mL培养基重悬后加入T25培养瓶中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。细胞复苏后活率达到80％以上，表明复苏成功。培养48h后细胞融合率达到70-80％，如图1所示，形成致密单层，呈上皮细胞样，此时细胞处于指数生长期，可进行传代处理。
传代处理过程：吸出培养瓶中的培养基，用DPBS洗培养瓶两次，加入2mL消化液，培养箱中消化5min左右，取出加入新鲜完全培养基终止消化(体积是消化液的2倍以上)，1000rpm，离心5min，去上清，取适量培养基重悬计数，15uL细胞悬液和15uL 0.2％台盼蓝混匀后，取15uL混合液加入计数板，活细胞计数仪计数，记录细胞密度和活率。取3个T25瓶做平行，分别加入5mL含血清培养基，1×106个细胞每瓶。固定培养基体积和细胞数，连续传代3次。
实施例三、HEK293T细胞单克隆挑选
HEK293T细胞以有限稀释法进行克隆筛选，得到50个单克隆细胞。具体为细胞稀释：取对数生长期HEK293T，消化重悬计数后，用培养基稀释细胞，细胞稀释液细胞密度为10个cell/mL，体积50mL。细胞铺板：将混匀的细胞稀释液转移到加样容器中再次混匀，用排枪铺板，100uL/孔，共5块板，置于CO2培养箱中静置培养，5％ CO2，37℃。挑克隆：培养24h后观察96孔中的细胞，挑出50个单克隆，按照孔板位置编号。通过显微镜观察细胞形态及检测细胞生长速度后筛选出11个单克隆细胞，进行EGFP质粒转染，并对其生物滴度进行评价选得到最优单克隆细胞株4-A8，如图2所示。
实施例四、无血清悬浮驯化
取稳定传代3次的对数生长期的HEK293T单克隆细胞株4-A8，消化、重悬、离心后用30mL无血清培养基重悬细胞，吹打均匀后，将细胞悬液全部接种于1个125mL摇瓶，向瓶内添加肝素钠(终浓度200-300U/mL)。将摇瓶放于CO2培养箱中耐CO2水平摇床上培养24±4h(培养条件：37.0±1℃，5.0±0.5％ CO2，80rpm)。细胞取样计数，按1×106cells/mL传代，补加无血清培养基，将细胞稀释到传代密度，每瓶添加肝素钠(终浓度100-200U/mL)。贴上标签放回培养箱中耐CO2水平摇床(转速100rpm)上继续培养24±4h，每天传代一次，传2～3次。按0.5×106cells/mL的密度继续传代细胞(转速160rpm)，每隔一天传代一次，并根据细胞结团情况考虑是否添加肝素钠，连续传代至细胞完全适应悬浮无血清培养。最终得到驯化成功HEK293T悬浮细胞形态如图3所示，且对其细胞数、细胞活率以及细胞直径的测定如图4-图6所示。说明HEK293T细胞的悬浮驯化程度好，活性高。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (6)
1.一种贴壁细胞的无血清快速悬浮驯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、细胞复苏与传代；将冻存细胞经水浴解冻后使用带血清培养基进行复苏以及传代培养，传代至细胞各参数稳定，细胞参数包括：活率、细胞直径、倍增时间、细胞形态以及无支原体污染；
S2、单克隆制备及筛选；取对数期细胞，以有限稀释法进行单克隆制备，获得50个单克隆细胞；通过评估细胞形态和生长速率，筛选出11个单克隆细胞，这11个单克隆细胞通过质粒转染后，评估生物滴度，筛选出生物滴度最高的克隆细胞；
S3、无血清悬浮驯化；经筛选的单克隆细胞稳定传代后进行驯化，消化、重悬、离心取沉淀，并用30mL无血清培养基重悬制成细胞悬液，向细胞悬液内添加肝素钠至终浓度200-300U/mL；并于CO2环境中耐CO2水平摇床上培养24±4h；继续传代培养并补加无血清培养基以及肝素钠，添加肝素钠终浓度为100-200U/mL，根据细胞结团情况考虑是否添加肝素钠，连续传代至细胞完全适应悬浮无血清培养，最后获得细胞活率高，生长速率快，结团率低的悬浮细胞。
2.根据权利要求1所述的贴壁细胞的无血清快速悬浮驯化方法，其特征在于，选用的贴壁细胞为HEK293T细胞。
3.根据权利要求2所述的贴壁细胞的无血清快速悬浮驯化方法，其特征在于，所述细胞复苏所用培养基为DMEM培养基，并加入10％FBS以及1％PS。
4.根据权利要求3所述的贴壁细胞的无血清快速悬浮驯化方法，其特征在于，细胞复苏过程中，细胞于37℃水浴解冻后迅速取出加入5mL新鲜的培养基，1000rpm，离心5min，去上清，加入5mL培养基重悬后置于T25培养瓶中，在37℃，5％CO2培养箱中培养48h±4h。
5.根据权利要求1所述的贴壁细胞的无血清快速悬浮驯化方法，其特征在于，悬浮驯化过程中，首次加入肝素钠后细胞培养条件为：37.0±1℃，5.0±0.5％CO2，80rpm。
6.根据权利要求5所述的贴壁细胞的无血清快速悬浮驯化方法，其特征在于，加入肝素钠后传代培养时，细胞取样计数，按1×106cells/mL传代，补加无血清培养基和肝素钠，将细胞稀释到传代密度，耐CO2水平摇床上继续培养24±4h，每天传代一次，传2～3次；按0.5×106cells/mL的密度继续传代细胞，每隔一天传代一次，并根据细胞结团情况考虑是否添加肝素钠。
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