CN118126844A - 一种固氮真菌及其在香榧种植中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固氮真菌及其应用，该固氮真菌为青霉属GN2‑3，它的碱基序列如序列表NO.1所示；该固氮真菌青霉属GN2‑3可改善香榧种植土壤。优点在于：本发明从土壤中筛选出的固氮真菌青霉属GN2‑3对可以促进土壤氮元素转化，增加土壤中的氮元素，帮助香榧植物对氮的吸收利用，促进植物生长。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种固氮真菌及其在香榧种植中的应用。
背景技术
近年来，香榧生产和分布的主要区域陆续出现枝叶黄化现象，即“黄金枝”。香榧黄金枝现象严重的枝条易落叶，枝条下垂，树势衰退，严重影响了香榧的产量和品质，进而严重影响了果农的收益和香榧产业的健康发展。氮是植物生长的重要元素，氮元素可以促进植物细胞的分裂和生长，从而有助于植物的生长和发育；氮元素是合成叶绿素的重要元素之一，它可以增加植物叶绿素的含量，有利于光合作用的进行。氮元素缺乏将影响植物正常的生长发育，氮肥是生产中最常用的肥料类型之一，然而，氮肥的过度使用和不合理管理已经导致了诸多问题，比如土壤酸化、水体富营养化、温室气体排放等。因此，研究固氮真菌以影响土壤中的氮转化过程，促进植物对于土壤中氮元素的吸收利用，对于香榧的种植具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种固氮真菌及其应用。本发明的固氮真菌可以促进土壤氮元素转化，增加土壤中的氮元素，帮助香榧植物对氮的吸收利用，促进植物生长。
本发明的技术方案：一种固氮真菌，所述固氮真菌为青霉属(Penicilliumsp.)GN2-3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNO.41116，保藏日期：2024年03月11日,保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
上述的固氮真菌，所述固氮真菌含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
一种固氮真菌的应用，所述固氮真菌用于香榧种植土壤的改善。
上述的固氮真菌的应用，所述固氮真菌用于增加香榧种植土壤铵态氮、谷氨酰胺酶和脲酶活性，促进土壤氮元素转化。
前述固氮真菌的应用，将所述的固氮真菌在用作农用微生物菌剂肥料中。
与现有技术相比，本发明采用香榧根际土壤为样品，通过稀释涂布平板法、平板划线法对溶磷真菌进行分离和纯化，并对菌株进行形态观察和ITS rDNA鉴定，经鉴定该固氮真菌GN2-3属于青霉菌属，最适生长条件为28℃、pH值为7。在阿须贝固体培养基中固氮真菌GN2-3可正常生长，具有固氮能力。本发明固氮真菌对于土壤氮的转化具有很大的帮助，可以应用本发明的固氮真菌进行香榧土壤的氮元素转换，促进植物对于土壤中氮元素的吸收利用，并应用于生物肥料中，促进氮肥的可持续利用。
附图说明
图1为固氮真菌青霉菌在PDA固体培养基上的正面菌落形态图；
图2是固氮真菌青霉菌在PDA固体培养基上的背面菌落形态图；
图3为固氮真菌青霉菌在阿须贝固体培养基上的菌落形态图。
图4为固氮真菌青霉菌在显微镜下孢子的形态图。
图5为固氮真菌GN2-3的ITS rDNA基因序列构建的系统发育树。
图6为不同处理组根际土壤(RS)与非根际土壤(BS)中铵态氮含量的示意图；
图7为不同处理组根际土壤(RS)与非根际土壤(BS)中谷氨酰胺酶含量的示意图；
图8为不同处理组根际土壤(RS)与非根际土壤(BS)中脲酶活性的示意图；
图9是不同处理组根际土壤(RS)与非根际土壤(BS)的PH值示意图；
图10是不同处理组根际土壤(RS)与非根际土壤(BS)的土壤电导率的示意图；
图11是不同处理组根际土壤(RS)与非根际土壤(BS)中土壤有机质含量示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
实施例1：一种固氮真菌的筛选及鉴定；
1.样品来源：
选择浙江农林大学香榧林香榧根际土壤为土壤样品；
2.主要实验试剂及培养基：
Ashby无氮培养基：甘露醇10g、KH2PO40.2g、MgSO4·7H2O 0.2g、NaCl 0.2g、CaSO4·2H2O 0.1g、CaCO35g、琼脂粉15-20g、ddH2O定容至1000mL，调节pH至7.2-7.4。
PDA固体培养基：200g马铃薯、20g葡萄糖、15-20g琼脂、蒸馏水定容至1000mL，pH自然，121℃，灭菌30min。
3.主要的实验方法：
3.1菌株的筛选；
称取5g从香榧根际采集的土壤过筛，并将其放入装有45毫升无菌水的三角形烧瓶中，在28度摇床振荡培养40min。从锥形瓶内吸取振荡培养后的菌悬液1mL，以稀释涂布平板法制作悬浮液，将悬浮液依次稀释为10-2、10-3、10-4，每次梯度稀释均匀涂布在Ashby无氮培养基(HB85491642，青岛海博生物科技有限公司)。每浓度重复3次，28℃培养箱培养5-7d，分别挑取不同形态的、具有清晰的红色的单菌落，在平皿上做好标记，经过多次筛选得到具有较好固氮能力的真菌；在Ashby无氮培养基上重复划线培养进行纯化，重复以上操作3次以上，直至得到纯菌种；将纯化的菌株接种于PDA斜面在-80℃保藏。
3.2菌株的鉴定；
3.2.1菌株形态学观察；
依据真菌鉴定手册(魏景涛,1979)等相关文献资料对溶磷真菌进行形态学观察。溶磷真菌的形态学特征：
如图1所示，在PDA培养基上生长7d，菌落直径37-40mm，菌落厚，边缘完整；质地绒状，覆盖稀疏气生菌丝；分生孢子结构大量产生，容易脱落，淡黄色；菌落边缘菌丝体白色；渗出液缺乏；可溶性色素缺乏；如图2所示，菌落背面淡黄色。
如图3所示，在Ashby无氮培养基上，菌株可以生长但受到氮元素限制，菌丝呈白色絮状，中间带玫红色。在显微镜下，固氮真菌的孢子形态图如图4所示。
3.2.2菌株的ITS rDNA鉴定；
用CTAB法对真菌DNA进行提取，将所得真菌基因组DNA用真菌ITS rDNA通用引物进行PCR扩增，电泳后割胶回收PCR产物，进行ITS rDNA测序，ITS rDNA序列(SEQ ID No.1)如下：TCCCACCCGTGTTTATCATACCTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGTCATGGGCGCCGGGGGGCACTCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACCCCCCTGAACGCTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGCGATTAGCTAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGCCCCCCGGGTCCGGGGGGCGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCCGTAGGCCCGGCCGGCGCCCGCCGGCGACCCCCCTCAATCTTTCTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA
将测序结果用BLAST软件对ITS rDNA序列进行同源性比较，发现筛选得到的固氮真菌GN2-3最相近的种属是青霉属，同源性达98％，结合真菌形态特征、生长条件结果，确定固氮真菌属于青霉属，命名GN2-3；根据ITS rDNA测序结果，利用NCBI提供的Blast工具和MEGA11.0等相关软件建立了系统发育树(如图5所示)。
实施例2：菌株对土壤质量影响
选取生长状况一致的香榧幼苗，移栽到直径10cm育苗盆，缓苗一周，所有盆栽放于温室内，温度循环26℃/22℃(日/夜)，相对湿度60％。定期观察记录幼苗生长情况，并适量补水。实验设置三个处理组，无氮营养液+真菌GN2-3孢子液组(NGN)，无氮营养液组(N),全营养液组(Q)，每处理六个重复，每十天浇灌50mL处理液，处理时间60d。
测量生理指标：
分别选取根际土壤(RS)与非根际土壤(BS)，用分光光度法测量土壤中铵态氮、谷氨酰胺酶、脲酶活性、土壤PH值、土壤电导率和土壤有机质。测试结果中，土壤中铵态氮含量如图6所示，谷氨酰胺酶含量如图7所示，脲酶活性如图8所示；土壤PH值的结果如图9所示，土壤电导率的结果如图10所示，土壤有机质的结构如图11所示。从图6-图11的结果可以看出，本发明固氮真菌对于土壤氮的转化具有很大的帮助，可以应用本发明的固氮真菌进行香榧土壤的氮元素转换，促进植物对于土壤中氮元素的吸收利用，并应用于生物肥料中，促进氮肥的可持续利用。
Claims (5)
1.一种固氮真菌，其特征在于：所述固氮真菌为青霉属(Penicillium sp.)GN2-3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO.41116，保藏日期：2024年03月11日,保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.根据权利要求1所述的固氮真菌，其特征在于：所述固氮真菌含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的固氮真菌的应用，其特征在于：所述固氮真菌用于香榧种植土壤的改善。
4.根据权利要求3所述的固氮真菌的应用，其特征在于：所述固氮真菌用于增加香榧种植土壤铵态氮、谷氨酰胺酶和脲酶活性，促进土壤氮元素转化。
5.根据权利要求3所述的固氮真菌的应用，其特征在于：将所述的固氮真菌在用作农用微生物菌剂肥料中。
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