CN118126252A - 一种具有ros清除能力的聚谷氨酸-甲基丙烯酰胺复合水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有ROS清除能力的聚谷氨酸‑甲基丙烯酰胺复合水凝胶及其制备方法。将甲基丙烯酰胺（MAAM）、过硫酸钾、Cu‑COF和聚谷氨酸（PGA），采用“一锅法”制备复合水凝胶。通过MAAM与PGA的脱水缩合构建水凝胶网络作为支架体系，可以有效改善聚甲基丙烯酰胺水凝胶难降解、生物相容性差等缺点，并通过Cu（II）与凝胶体系内的羧基金属配位结合具有类似超氧化物歧化酶功能的Cu‑MOF，赋予复合水凝胶清除活性氧（ROS）的功能。总体来说，本发明制备得到的复合水凝胶展现了良好的抗氧化性、力学性能、生物相容性以及可降解性等性能，可应用于由于病灶ROS过多导致的骨代谢性疾病如骨质疏松性骨缺损。

Description

一种具有ROS清除能力的聚谷氨酸-甲基丙烯酰胺复合水凝胶 及其制备方法
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种具有ROS清除能力的聚谷氨酸-甲基丙烯酰胺复合水凝胶及其制备方法，该复合水凝胶可用于骨质疏松性骨缺损修复。
背景技术
骨组织工程支架是一种典型的人造三维支架，可应用于各种疾病如骨质疏松性骨缺损导致的骨缺损修复。骨修复是个复杂且长期的过程，微观层面涉及到如骨髓间充质干细胞、成骨细胞、破骨细胞等各种细胞的活性和表型，进而影响到宏观层面骨组织修复的完整性。糖尿病患者通常伴随着骨代谢失调引发的骨质疏松，摔倒、磕碰后更易骨折、骨裂，而患者由于高糖的身体条件，修复部位通常会积累较高的ROS水平，不仅会造成成骨细胞、干细胞等细胞的氧化应激行为，降低细胞活性，也会损伤细胞内的线粒体，影响细胞的正常代谢过程，而受损的线粒体又会进一步产生大量的ROS，形成“高ROS水平-线粒体损伤-高ROS水平”的恶性循环，最终导致骨缺损部位长时间无法愈合，给患者带来极大的经济压力和精神损失。
目前针对骨缺损修复和糖尿病骨修复已有相应解决方案。中国专利“一种可塑性复合骨修复支架及其制备方法”（CN115054734A）公开了一种用于骨缺损修复的羧基改性壳聚糖接枝多肽/天然生物骨复合材料，针对现有骨粉难塑型且对促进骨细胞生长方面能力不足的技术问题，采用酶催化法将多肽接枝在羧基改性壳聚糖上，并与天然骨粉混合反应获得可塑性复合骨支架。该支架能够在三个月时间促进骨缺损完全愈合。中国专利“一种用于糖尿病骨修复的双层结构骨膜及其制备方法”（CN111265722A）公开了一种用于糖尿病骨修复的双层结构骨膜，通过静电纺丝工艺制备获得内层为壳聚糖/聚乙烯醇/毛蕊异黄酮共混纳米纤维层，外层为聚对二氧环已酮纳米纤维层的双层骨膜，具有抗菌抑菌、降血糖功能，有利于骨细胞的生长和骨组织的修复的作用。上述材料具有促进骨缺损修复的作用，但是依然无法有效解决骨代谢失调引发的高ROS水平下的骨缺损修复问题。
聚谷氨酸（PGA）是一种纯天然高分子材料，具有无毒、可完全降解、强大的锁水、保水等特点，常应用于化妆品领域。本发明将PGA引入甲基丙烯酰胺（MAAM）分子链，可以有效改善聚甲基丙烯酰胺（PMAAM）水凝胶的降解性能，大大提高生物相容性，更多的交联位点进一步提高了凝胶的力学性能，为缺损处新骨的形成提供力学支持。其次为了赋予复合水凝胶多功能性，通过金属离子-羧基配位作用搭载具有类似超氧化物歧化酶催化能力的Cu-COF材料，以Cu（II）作为氧化还原活性金属中心的Cu-COF可以催化ROS如超氧自由基阴离子（O2 •−）分解，稳定的配位键不仅提高了凝胶材料的载药量，还可以协同提高材料的抗氧化性，进一步增强复合水凝胶清除ROS的能力，打破由于高ROS水平导致的“高ROS水平-线粒体损伤-高ROS水平”恶性循环，恢复线粒体的正常代谢功能，提高成骨细胞、干细胞等细胞的活性进而恢复骨代谢平衡，最终达到修复骨质疏松性骨缺损的目的。
发明内容
本发明旨在提供一种具有ROS清除能力的聚谷氨酸-甲基丙烯酰胺复合水凝胶及其制备方法，该复合水凝胶可用于骨质疏松性骨缺损修复。复合水凝胶模拟骨组织细胞外基质，以MAAM为单体，KPS为引发剂引发MAAM的自由基聚合，形成PMAAM水凝胶基底，其次加入的PGA作为另一种高分子链与PMAAM分子链以酰胺键相结合，有效改善了PMAAM的力学性能较差、难降解和生物相容性差等缺点。同时搭载具有类似超氧化物歧化酶催化能力的，以Cu（II）作为氧化还原活性金属中心具有抗氧化作用的Cu-COF材料，赋予了复合水凝胶清除ROS的功能。其次Cu（II）能够与凝胶的羧基发生配位作用，形成金属-羧酸配位键。由于金属配位键优异的稳定性，不仅提高了凝胶网络的载药量，还可以进一步增加材料的抗氧化性，协同增强复合水凝胶清除ROS能力。可以有效降低糖尿病型骨质疏松性骨缺损病灶区域的高ROS水平，从而达到恢复骨修复能力的目的。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种用于骨质疏松性骨缺损修复的具有ROS清除能力的聚谷氨酸-甲基丙烯酰胺复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
（1）依次称取四（4-甲酰基苯）甲烷（TFHPM）和4,5-二氯-1,2-苯二胺（DCPDA）加入派热克斯玻璃管中，混合均匀得到固体A；
（2）向步骤（1）制备得到的固体A中依次加入一定量的对二甲苯、1,4-二氧六环和乙酸溶液，混合均匀后放入液氮中反复冻融，得到溶液A；
（3）将步骤（2）制备得到的溶液A放入烘箱中反应，得到黄色固体，随后用丙酮和四氢呋喃洗涤黄色固体1~5次；
（4）将步骤（3）制备得到的黄色固体冷冻干燥1~3天，得到的样品命名为COF；
（5）称取醋酸铜加入无水甲醇中，混合得到饱和醋酸铜-甲醇溶液。将步骤（4）制备得到的COF加入该饱和醋酸铜-甲醇溶液，均匀混合，在10 ℃~50 ℃下放置1~5天，得到绿色固体；
（6）将步骤（5）中制备得到的绿色固体用无水甲醇洗涤1~5次，得到的样品命名为Cu-COF；
（7）依次称取甲基丙烯酰胺（MAAM）、过硫酸钾（KPS）倒入烧杯中，加入去离子水，在20 ℃~90 ℃下搅拌溶解直至完全溶解没有气泡，得到溶液B；
（8）称取聚谷氨酸（PGA）倒入烧杯中，加入去离子水，20 ℃~90 ℃下搅拌溶解直至完全溶解没有气泡，得到溶液C；
（9）称取Cu-COF，加入去离子水中，超声分散得到Cu-COF溶液；
（10）将步骤（8）和（9）分别制备得到的溶液C和Cu-COF溶液加入步骤（7）制备得到的溶液B，混合均匀，得到溶液D；
（11）将步骤（10）制备得到的溶液D置于油浴锅中搅拌反应；反应结束后，采用流延法将反应后的溶液倒入模具中，放入烘箱中成胶，得到最终样品复合水凝胶。
进一步地：
步骤（1）中，TFHPM和DCPDA的质量比值为0.5~3.0。
步骤（2）中，对二甲苯、1,4-二氧六环和乙酸溶液用于反应的体积分别为0.1~1.0mL、0.1~1.0 mL和0.1~1.0 mL，乙酸溶液的浓度为1~6 mol/L。
步骤（3）中，烘箱中反应温度为30 ℃~230 ℃，反应时间为1~5天。
步骤（5）中，COF和饱和醋酸铜-甲醇溶液的质量体积比为0.005~0.1g/mL。
步骤（7）中，MAAM固体最终用于反应的浓度为1wt% ~70wt% ，KPS固体最终的用于反应浓度为0.1wt% ~50wt%。
步骤（8）中，PGA固体最终的用于反应的浓度为1wt% ~70wt% 。
步骤（10）中，用于最终反应的Cu-COF的浓度为1wt% ~50wt% 。
步骤（11）中，反应温度为30 ℃~100 ℃，反应时间为1~12 h，转速为100~800 rpm，烘干温度为30℃~100 ℃，烘干时间为2~24 h。
与现有技术相比，本发明的显著优点创新之处在于：
1. Cu（II）离子与PGA的羧基通过金属-羧基配位作用形成稳定的金属配位键，不仅提高了凝胶的载药量，还可以进一步提高复合水凝胶的抗氧化性，赋予复合水凝胶优良的清除ROS如O2 •−的能力，可以有效降低病灶区域的高ROS水平。
2. 通过将PGA引入PMAAM，有效改善了复合水凝胶的难降解性、生物相容性差、力学性能差等缺点，首先解决了材料植入体内后由于材料难以降解影响骨修复进程的问题，其次复合水凝胶更高的力学性能可以为骨缺损空腔提供更有利的力学支撑，最后较好的生物相容性可以有效降低材料植入体内后引发的毒性问题。
3. 由于Cu-COF材料具有的独特的多孔性、高比表面积和优异的孔隙率，可以作为载体负载多种小分子药物或诊断剂，进行药物递送或疾病诊断，赋予复合水凝胶多功能性，协同治疗疾病，进一步了扩大复合水凝胶在医学领域中的应用。
附图说明
图1为实施例1、2所制备的COF、Cu-COF材料，分别为COF的透射电子显微镜（TEM）图像，Cu-COF的扫描电子显微镜（SEM）图像。
图2为实施例1、2所制备的COF、Cu-COF材料，分别为COF、Cu-COF的X-射线粉末衍射模拟图（XRD）。
图3为实施例3、4、5所制备的PMAAM、MP 1.0、MP 2.0水凝胶，分别为PMAAM、MP 1.0、MP 2.0的数码图像和SEM图像
图4为实施例3、4、5所制备的PMAAM、MP 1.0、MP 2.0水凝胶，分别为PMAAM、MP 1.0、MP 2.0的傅里叶红外光谱（FTIR）谱图。
图5为实施例3、4、5所制备的PMAAM、MP 1.0、MP 2.0水凝胶，分别为PMAAM、MP 1.0、MP 2.0的压缩应力-应变曲线。
图6为实施例3、4、5所制备的PMAAM、MP 1.0、MP 2.0水凝胶，分别为PMAAM、MP 1.0、MP 2.0的溶胀-降解曲线。
图7为实施例6、7所制备的MPC、MPC-Cu水凝胶，分别为MPC和MPC-Cu的紫外-可见吸收（UV-vis）光谱谱图。
图8为实施例4、6、7所制备的MP 1.0、MPC、MPC-Cu水凝胶，分别为不处理、MP 1.0、MPC和MPC-Cu处理的MSC细胞的第1、3、7天的DEAD/LIVE染色结果。
图9为实施例4、6、7所制备的MP 1.0、MPC、MPC-Cu水凝胶，分别为不处理、MP 1.0、MPC和MPC-Cu处理的茜素红（ARS）和碱性磷酸酶（ALP）染色结果半定量分析图。
图10为实施例4、6、7所制备的MP 1.0、MPC、MPC-Cu水凝胶，分别为不处理、MP 1.0、MPC和MPC-Cu处理的微计算机断层扫描（Micro-CT）的常规骨分析参数。分别为不处理、MP1.0、MPC和MPC-Cu处理的骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁分离度（Tb.Sp）数据图。
具体实施方案
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。此外应理解，在阅读了本发明讲述的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
步骤（1）：依次称取0.05 mmol四（4-甲酰基苯）甲烷（TFHPM）和0.10 mmol 4,5-二氯-1,2-苯二胺（DCPDA）加入派热克斯玻璃管中，混合均匀，得到固体A；
步骤（2）：向步骤（1）制备得到的固体A中依次加入0.5 mL对二甲苯、0.9mL 1,4-二氧六环和0.3 mL乙酸溶液（6 mol/L），混合均匀后放入液氮中反复冻融，得到溶液A；
步骤（3）：将步骤（2）制备得到的溶液A放入烘箱中120 ℃反应3天，得到黄色固体，随后用丙酮和四氢呋喃洗涤黄色固体3次；
步骤（4）：将步骤（3）制备得到的黄色固体冷冻干燥2天，得到最终样品COF。
实施例2
步骤（1）：依次称取0.05 mmol四（4-甲酰基苯）甲烷（TFHPM）和0.10 mmol 4,5-二氯-1,2-苯二胺（DCPDA）加入派热克斯玻璃管中，混合均匀得到固体A；
步骤（2）：向步骤（1）制备得到的固体A中依次加入0.5 mL对二甲苯、0.9mL 1,4-二氧六环和0.3 mL乙酸溶液（6 mol/L），混合均匀后放入液氮中反复冻融，得到溶液A；
步骤（3）：将步骤（2）制备得到的溶液A放入烘箱中120 ℃反应3天，得到黄色固体，随后用丙酮和四氢呋喃洗涤黄色固体3次；
步骤（4）：将步骤（3）制备得到的黄色固体冷冻干燥2天，得到的样品命名为COF；
步骤（5）：称取50 mg醋酸铜加入5 mL无水甲醇中，混合得到饱和醋酸铜-甲醇溶液。将步骤（4）制备得到的COF加入该饱和醋酸铜-甲醇溶液，均匀混合，在30 ℃下放置2天，得到绿色固体；
步骤（6）：将步骤（5）中制备得到的绿色固体用无水甲醇洗涤3次，得到最终样品Cu-COF。
实施例3
步骤（1）：依次称取8.5 g甲基丙烯酰胺（MAAM）、0.1 g过硫酸钾（KPS）倒入烧杯中，加入30 mL去离子水，在60 ℃下搅拌溶解直至完全溶解没有气泡，得到溶液B；
步骤（2）：将步骤（1）制备得到的溶液B置于油浴锅中60 ℃搅拌反应1 h, 反应结束后，采用流延法将反应后的溶液倒入模具中，放入60 ℃烘箱中成胶3 h，得到最终样品PMAAM。
实施例4
步骤（1）：依次称取8.5 g甲基丙烯酰胺（MAAM）、0.1 g过硫酸钾（KPS）倒入烧杯中，加入15 mL去离子水，在60 ℃下搅拌溶解直至完全溶解没有气泡，得到溶液A；
步骤（2）：称取1.0 g聚谷氨酸（PGA）倒入烧杯中，加入15 mL去离子水，30 ℃下搅拌溶解直至完全溶解没有气泡，得到溶液B；
步骤（3）：将步骤（2）制备得到的溶液B加入步骤（1）制备得到的溶液A，混合均匀，得到溶液C；
步骤（4）：将步骤（3）制备得到的溶液C置于油浴锅中60 ℃搅拌反应1 h；反应结束后，采用流延法将反应后的溶液倒入模具中，放入60℃烘箱中成胶3 h，得到最终样品MP1.0。
实施例5
步骤（1）：依次称取8.5 g甲基丙烯酰胺（MAAM）、0.1 g过硫酸钾（KPS）倒入烧杯中，加入15 mL去离子水，在60 ℃下搅拌溶解直至完全溶解没有气泡，得到溶液A；
步骤（2）：称取2.0 g聚谷氨酸（PGA）倒入烧杯中，加入15 mL去离子水，30 ℃下搅拌溶解直至完全溶解没有气泡，得到溶液B；
步骤（3）：将步骤（2）制备得到的溶液B加入步骤（5）制备得到的溶液A，混合均匀，得到溶液C；
步骤（4）：将步骤（3）制备得到的溶液C置于油浴锅中60 ℃搅拌反应1 h；反应结束后，采用流延法将反应后的溶液倒入模具中，放入60 ℃烘箱中成胶3 h，得到最终样品MP2.0。
实施例6
步骤（1）：依次称取0.05 mmol四（4-甲酰基苯）甲烷（TFHPM）和0.10 mmol 4,5-二氯-1,2-苯二胺（DCPDA）加入派热克斯玻璃管中，混合均匀得到固体A；
步骤（2）：向步骤（1）制备得到的固体A中依次加入0.5 mL对二甲苯、0.9mL 1,4-二氧六环和0.3 mL乙酸溶液（6 mol/L），混合均匀后放入液氮中反复冻融，得到溶液A；
步骤（3）：将步骤（2）制备得到的溶液A放入烘箱中120 ℃反应3天，得到黄色固体，随后用丙酮和四氢呋喃洗涤黄色固体3次；
步骤（4）：将步骤（3）制备得到的黄色固体冷冻干燥2天，得到的样品命名为COF；
步骤（5）：依次称取8.5 g甲基丙烯酰胺（MAAM）、0.1 g过硫酸钾（KPS）倒入烧杯中，加入15 mL去离子水，在60 ℃下搅拌溶解直至完全溶解没有气泡，得到溶液B；
步骤（6）：称取1.0 g聚谷氨酸（PGA）倒入烧杯中，加入10 mL去离子水，30 ℃下搅拌溶解直至完全溶解没有气泡，得到溶液C；
步骤（7）：称取10 mg COF，加入5 mL去离子水中，超声分散得到COF溶液；
步骤（8）：将步骤（6）和（7）分别制备得到的溶液C和COF溶液加入步骤（5）制备得到的溶液B，混合均匀，得到溶液D；
步骤（9）：将步骤（8）制备得到的溶液D置于油浴锅中60 ℃搅拌反应1 h；反应结束后，采用流延法将反应后的溶液倒入模具中，放入60 ℃烘箱中成胶3 h，得到最终样品MPC。
实施例7
步骤（1）：依次称取0.05 mmol四（4-甲酰基苯）甲烷（TFHPM）和0.10 mmol 4,5-二氯-1,2-苯二胺（DCPDA）加入派热克斯玻璃管中，混合均匀得到固体A；
步骤（2）：向步骤（1）制备得到的固体A中依次加入0.5 mL对二甲苯、0.9mL 1,4-二氧六环和0.3 mL乙酸溶液（6 mol/L），混合均匀后放入液氮中反复冻融，得到溶液A；
步骤（3）：将步骤（2）制备得到的溶液A放入烘箱中120 ℃反应3天，得到黄色固体，随后用丙酮和四氢呋喃洗涤黄色固体3次；
步骤（4）：将步骤（3）制备得到的黄色固体冷冻干燥2天，得到的样品命名为COF；
步骤（5）：称取50 mg醋酸铜加入5 mL无水甲醇中，混合得到饱和醋酸铜-甲醇溶液。将步骤（4）制备得到的COF加入该饱和醋酸铜-甲醇溶液，均匀混合，在30 ℃下放置2天，得到绿色固体；
步骤（6）：将步骤（5）中制备得到的绿色固体用无水甲醇洗涤3次，得到的样品命名为Cu-COF；
步骤（7）：依次称取8.5 g甲基丙烯酰胺（MAAM）、0.1 g过硫酸钾（KPS）倒入烧杯中，加入15 mL去离子水，在60 ℃下搅拌溶解直至完全溶解没有气泡，得到溶液B；
步骤（8）：称取1.0 g聚谷氨酸（PGA）倒入烧杯中，加入10 mL去离子水，30 ℃下搅拌溶解直至完全溶解没有气泡，得到溶液C；
步骤（9）：称取10 mg Cu-COF，加入5 mL去离子水中，超声分散得到Cu-COF溶液；
步骤（10）：将步骤（8）和（9）分别制备得到的溶液C和Cu-COF溶液加入步骤（7）制备得到的溶液B，混合均匀，得到溶液D；
步骤（11）：将步骤（10）制备得到的溶液D置于油浴锅中60 ℃搅拌反应1 h；反应结束后，采用流延法将反应后的溶液倒入模具中，放入60 ℃烘箱中成胶3 h，得到最终样品MPC-Cu。
图1为上述实施例1、2所制备的COF、Cu-COF材料，分别为COF的TEM图像，Cu-COF的SEM图像。由图1可知，COF与Cu-COF在都呈现不规则长条形，两者间形貌没有明显差别。此外，从Cu-COF的Mapping元素分析可以看到均匀分布的Cu元素，说明Cu元素已经成功搭载在Cu-COF上。
图2为上述实施例1、2所制备的COF、Cu-COF材料，分别为COF、Cu-COF的XRD图像。由图2可知，Cu-COF在5.30°、8.10°、8.47°、9.25°和10.15°处的峰分别对应于（101）、（112）、（004）、（200）和（202）晶型，表明了Cu-COF的三维晶体结构。
图3为上述实施例3、4、5所制备的PMAAM、MP 1.0、MP 2.0水凝胶，分别为PMAAM、MP1.0、MP 2.0的照片和SEM图像。由图3可知PMAAM常温下呈半透明状态，MP 1.0、MP 2.0常温下呈白色状态。SEM图像显示三个组别均为多孔结构。其中PMAAM的孔径约为10 μm，明显大于经过PGA接枝过后的MP 1.0、MP 2.0的孔径，表明了加入了PGA的水凝胶具有更多的交联位点和更密的交联网络，这样不仅能够一定程度上提高水凝胶的力学强度，也为模拟细胞外基质的复杂多孔结构满足细胞之间复杂的营养物质的运输和交换打下基础。
图4为上述实施例3、4所制备的PMAAM、MP 1.0水凝胶和PGA材料，分别为PMAAM、MP1.0、PGA的傅里叶红外光谱（FTIR）谱图。由图4可知，富含羟基的PGA在3423 nm的峰显示了羟基的拉伸振动，MP 1.0在3425 nm同样出现了宽峰，说明MP 1.0也有羟基特征基团。同时PMAAM在1380 nm出现了甲基的特征峰，而MP 1.0在1387 nm也出现了相同的伸缩振动峰，此外，MP1.0在1632 nm处出现的峰偏移表明了酰胺C=O的出现，证明了MP 1.0的成功合成。
图5为上述实施例3、4、5所制备的PMAAM、MP 1.0、MP 2.0水凝胶，分别为PMAAM、MP1.0、MP 2.0的压缩-应力曲线。由图5可知，随着PGA浓度的添加，显著增加了水凝胶的力学强度。PMAAM在80%压缩应变下的应力约为0.45 Mpa，随着PGA的加入提升到MP 1.0在80%压缩应变下的约为0.92 Mpa的压缩应力。其次，随着PGA浓度的提高，水凝胶的力学强度也有一定程度的提升，这是由于更多的PGA给予了材料更多的交联位点。
图6为上述实施例3、4、5所制备的PMAAM、MP 1.0、MP 2.0水凝胶，分别为PMAAM、MP1.0、MP 2.0的溶胀-降解曲线。由图6可知，三个组别在初期处于溶胀状态，其中MP 1.0、MP2.0在第8天达到溶胀平衡，随后开始降解过程，而PMAAM在第27天才达到溶胀平衡，并且溶胀率远高于MP 1.0、MP 2.0的溶胀率。这是由于PMAAM属于难降解材料，而接枝了PGA的水凝胶由于PGA的可降解性，赋予了水凝胶可降解特性，并且达到溶胀平衡时的溶胀率远低于PMAAM。
图7为上述实施例6、7所制备的MPC、MPC-Cu水凝胶，分别为MPC和MPC-Cu的紫外-可见吸收（UV-vis）光谱谱图。由于在超氧阴离子（O2 •−）的存在下，NBT会被还原并在560 nm处被吸收。由图7可知，由于MPC中的COF材料没有以二价铜Cu（II）作为氧化还原位点，所以MPC不具有类似超氧化物歧化酶的作用即清除ROS的功能，于是探针（Probe）与MPC在560 nm处的吸光度没有显著差异。而MPC-Cu中搭载的Cu-COF以二价铜Cu（II）作为氧化还原位点，具有类似超氧化物歧化酶的作用即可清除ROS的功能，所以在560 nm处能够观察到具有时间依赖性的吸光度变化趋势，随着MPC-Cu处理时间的延长，560nm处的吸光度逐渐下降，表明了O2 •−被逐渐清除。证明了MPC-Cu的清除ROS的功能。
图8为上述实施例4、6、7所制备的MP 1.0、MPC、MPC-Cu水凝胶，分别为不处理和MP1.0、MPC和MPC-Cu水凝胶处理的MSC细胞第1、3、7天的DEAD/LIVE染色结果。由图6可知，经过三个组别的水凝胶处理后的MSC细胞，显示了良好的增殖情况，三个组别在第7天的细胞密度相当且都与Control组无明显差异。证明了材料是无毒具有良好生物相容性的。
图9为上述实施例4、6、7所制备的MP 1.0、MPC、MPC-Cu水凝胶，分别为不处理、MP1.0、MPC和MPC-Cu处理的茜素红（ARS）和碱性磷酸酶（ALP）染色结果半定量分析图。由图9可知，与MPC组相比，MP 1.0组培养的MSC细胞的ALP、ARS染色结果没有明显区别。这种结果可能是由于COF材料不具备清除ROS的功能，不能有效减少ROS对MSC细胞造成的负面影响。而在成骨培养基中培养14天和21天后，MPC-Cu处理的MSC细胞ALP和ARS染色结果均达到最大值。这种结果是由于Cu（II）的搭载赋予了复合水凝胶抗氧化能力，恢复了MSC细胞的活性。
图10为上述实施例4、6、7所制备MP 1.0、MPC、MPC-Cu水凝胶，分别为不处理和MP1.0、MPC和MPC-Cu水凝胶处理4周和8周后的大鼠颅骨骨缺损修复的微计算机断层扫描（Micro-CT）常规骨分析参数图。由图10可知，经过8周时间处理，Control组别的BV/TV仅有16%，一方面原因是5 mm是骨缺损修复的临界尺寸，是无法通过机体自身自行修复的缺损尺寸，另一方面原因是骨质疏松性骨缺损微环境是一个骨代谢失调的环境，由于成骨细胞与破骨细胞在微环境中的活性、功能的平衡失调，导致缺损无法正常恢复。而MP 1.0、MPC、MPC-Cu水凝胶处理的组别均在30%以上，其中MPC-Cu组别达到了45%，表明了较多的新骨形成。同样的，MPC-Cu水凝胶处理8周后的颅骨Tb. Th、Tb. N数值均高于其他组别，代表缺损处出现了新骨的桥接。并且Tb. Sp数值低于Control组，代表了更好的骨形成过程。这样较好的修复效果是因为其搭载的COF-Cu材料的抗氧化功能，可以通过清除过多的ROS，减少由于高浓度ROS导致的成骨细胞的氧化应激行为，恢复受损的线粒体的同时恢复成骨细胞的活性，从而调节骨代谢水平至理想状态，恢复骨缺损修复能力。上述结果表明了MPC-Cu水凝胶可以作为骨质疏松性骨缺损理想的骨缺损修复材料。
以上实施例说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰，但这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种具有ROS清除能力的聚谷氨酸-甲基丙烯酰胺复合水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）依次称取四（4-甲酰基苯）甲烷TFHPM和4,5-二氯-1,2-苯二胺DCPDA加入派热克斯玻璃管中，混合均匀得到固体A；
（2）向步骤（1）的固体A中依次加入一定量的对二甲苯、1,4-二氧六环和乙酸溶液，混合均匀后放入液氮中反复冻融，得到溶液A；
（3）将步骤（2）得到的溶液A放入烘箱中反应，得到黄色固体，随后用丙酮和四氢呋喃洗涤黄色固体1~5次；
（4）将步骤（3）制备得到的黄色固体冷冻干燥1~3天，得到的样品命名为COF；
（5）称取醋酸铜加入无水甲醇中，混合得到饱和醋酸铜-甲醇溶液；将步骤（4）制备得到的COF加入该饱和醋酸铜-甲醇溶液，均匀混合，在10 ℃~50 ℃下放置1~5天，得到绿色固体；
（6）将步骤（5）中制备得到的绿色固体用无水甲醇洗涤1~5次，得到的样品命名为Cu-COF；
（7）依次称取甲基丙烯酰胺MAAM、过硫酸钾KPS倒入烧杯中，加入去离子水，在20 ℃~90℃下搅拌溶解直至完全溶解没有气泡，得到溶液B；
（8）称取聚谷氨酸PGA倒入烧杯中，加入去离子水，20 ℃~90 ℃下搅拌溶解直至完全溶解没有气泡，得到溶液C；
（9）称取Cu-COF，加入去离子水中，超声分散得到Cu-COF溶液；
（10）将步骤（8）和（9）分别制备得到的溶液C和Cu-COF溶液加入步骤（7）制备得到的溶液B，混合均匀，得到溶液D；
（11）将步骤（10）制备得到的溶液D置于油浴锅中搅拌反应；反应结束后，采用流延法将反应后的溶液倒入模具中，放入烘箱中成胶，得到最终样品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，TFHPM和DCPDA的质量比值为0.5~3.0。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，对二甲苯、1,4-二氧六环和乙酸溶液用于反应的体积分别为0.1~1.0 mL、0.1~1.0 mL和0.1~1.0 mL，乙酸溶液的浓度为1~6 mol/L。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，烘箱中反应温度为30 ℃~230℃，反应时间为1~5天。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）中，COF和饱和醋酸铜-甲醇溶液的质量体积比为0.005~0.1 g/mL。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（7）的溶液B中，MAAM的浓度为1wt% ~70wt%，KPS的浓度为0.1wt% ~50wt% 。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（8）的溶液C中，PGA的浓度为1wt% ~70wt% 。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（10）的溶液D中，Cu-COF的浓度为1wt% ~50wt% 。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（11）中，反应温度为30 ℃~100 ℃，反应时间为1~12 h，转速为100~800 rpm，烘干温度为30 ℃~100 ℃，烘干时间为2~24 h。
10.如权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的一种具有ROS清除能力的聚谷氨酸-甲基丙烯酰胺复合水凝胶。
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