CN118126124A - 具有qrrad结构的生物活性多肽、组合物及其应用 - Google Patents

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CN118126124A CN202410285522.4A CN202410285522A CN118126124A CN 118126124 A CN118126124 A CN 118126124A CN 202410285522 A CN202410285522 A CN 202410285522A CN 118126124 A CN118126124 A CN 118126124A
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胡菲菲
吕淑敏
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Abstract

本公开属于生物技术领域，具体涉及一种具有QRRAD结构的生物活性多肽、组合物及其应用。具体提供了一种生物活性多肽，其氨基酸序列的通式如SEQ ID NO:5所示：EE‑X3‑QRRAD‑X9，式中，X3＝L或M；X9＝TRCFRRCC或不存在。本公开提供的生物活性多肽，能够显著促进人皮肤成纤维细胞HSF生长，同时具有较高的DPPH·清除率，说明其具有较强的抗氧化能力。此外，实验证明其还能够提高斑马鱼col1a1a基因相对表达量，对于保护皮肤组织正常结构和功能、减少皱纹、延缓皮肤衰老具有重要意义。

Description

具有QRRAD结构的生物活性多肽、组合物及其应用
技术领域
本公开属于生物技术领域，具体涉及一种具有QRRAD结构的生物活性多肽、组合物及其应用。
背景技术
随着年龄增加，衰老是不可避免的自然过程，其中，机体进行有氧呼吸过程产生的活性氧，具有强氧化性，能够造成核酸和蛋白质结构损伤，诱发系列疾病以及机体和皮肤的衰老(化妆品抗氧化功效评价方法研究进展.化工管理.2018(19))。而保持皮肤年轻是几乎所有人的愿望，因此有助于皮肤抗衰的护肤品，被广泛研究，种类不断增加，效果也逐步加强，目前比较常用的抗衰产品包括：A醇、维生素C、玻色因、活性多肽类等。
其中，活性多肽在化妆品行业也常被称为胜肽，因其良好的生物活性以及安全性，被广泛研究并应用。例如研究较早的具有抗氧化作用的活性多肽谷胱甘肽，为由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合的含有巯基的三肽，具有抗氧化作用和整合解毒作用；半胱氨酸上的巯基为谷胱甘肽活性基团(故谷胱甘肽常简写为G-SH)，易与自由基等身体内的毒素结合，而具有整合解毒作用；谷胱甘肽还能帮助保持正常的免疫系统的功能(基础生物化学，中国农业大学出版社，2014：19)。
目前，越来越多的研究者都在致力于活性生物多肽的研究和开发，出现了很多的抗氧化效果更优秀的多肽结构，例如申请号为CN202210356740.3的中国发明公开了一种氨基酸序列为Gly-His-Lys-Gly-His-Lys(GHKGHK)的六肽，具有抗氧化活性以及很强的清除DPPH自由基的能力，可应用于抗氧化、抗衰老、促进伤口愈合等方面。申请号为CN202210071612.4中国发明，公开了一种氨基酸序列为Pal-Gly-His-Lys-Thr-His-Arg-Ser(Pal-GHKTHRS)的多肽，也具有较高的DPPH自由基清除率，对于皮肤损伤具有较好的修复作用。另外申请号为CN202210046677.3中国发明还公开了一种寡肽-1衍生物，经过对寡肽-1(GHK序列的三肽-1，氨基酸序列为H-Gly-His-Lys-OH)进行修饰，获得的寡肽-1衍生物具有更加优异的抗氧化活性、抗紫外线效果明显提升，进一步减少因UV而增加的MMP的表达及活性，有效改善皱纹，防止皮肤的老化；同时具有优异的促胶原蛋白活性和透皮吸收性能。
综上所述，活性多肽在皮肤抗氧化、抗衰老方面具有重要研究价值和应用前景，如何获得更优抗氧化性、更高安全性和稳定性以及透皮吸收率更高的活性多肽，仍是本领域技术人员要解决的重要问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本公开的目的在于提供一种具有QRRAD结构的生物活性多肽、组合物及其应用。
在一方面，本公开提供了一种生物活性多肽，其氨基酸序列的通式如SEQ ID NO:5所示：EE-X3-QRRAD-X9，式中，X3＝L或M；X9＝TRCFRRCC或不存在。
另一方面，本公开提供了一种组合物，包括活性成分和辅料，其特征在于，所述活性成分包括前述的生物活性多肽；
优选地，所述辅料包括常规的稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂和稳定剂。
另一方面，本公开提供了一种前述的生物活性多肽或前述的组合物在制备抗氧化、抗衰和/或促进伤口愈合的药物或产品中的应用；
优选地，所述产品为护肤品、美容产品或医美用品。
本公开的有益效果至少如下：
本公开提供的生物活性多肽，能够显著促进人皮肤成纤维细胞HSF生长，同时具有较高的DPPH自由基(DPPH·)清除率，说明其具有较强的抗氧化能力。此外，实验证明其还能够提高斑马鱼col1a1a基因相对表达量，对于保护皮肤组织正常结构和功能、减少皱纹、延缓皮肤衰老具有重要意义。
附图说明
图1为实施例2中多肽对DPPH·清除率的测定的实验结果图。
图2为实施例3中多肽对人皮肤成纤维细胞(HSF)影响的结果图，与空白对照组比较，其中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，***表示p<0.001。
图3为实施例4中多肽对斑马鱼col1a1a基因相对表达量影响的结果图，与正常对照组比较，其中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001。
具体实施方式
定义和说明
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。应理解本发明不限于具体的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，当然可以对以上进行变化。还应理解本申请所用术语仅为了描述具体的实施方式，并不旨在进行限制。
除非该内容被另外明确说明，否则本说明书以及所附权利要求中所用的单数形式"一个"、"一种"和"该"包括复数指代。因此，例如，提及"一种多肽"包括了两种或更多种多肽等的组合。
术语“氨基酸”指同时包含氨基和羧基官能团的分子，α-氨基酸的氨基和羧基连接在同一个碳原子(α碳)上。α碳可以另外有1-2个有机取代基。氨基酸包含L和D同分异构体和消旋混合物。如无特别说明，本公开中多肽序列中的氨基酸残基都是L同分异构体即L-氨基酸，D-氨基酸在氨基酸名称或缩写前加小写字母“d”表示，如dK。
本公开中多肽的氨基酸组成可以改变而基本不影响其生物活性。例如，一个多肽序列可以包含一个或多个保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是一个氨基酸残基被另一个有相似侧链的氨基酸残基取代。文献中根据氨基酸残基侧链的性质对氨基酸残基进行分类。含有碱性侧链氨基酸残基包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸；包含酸性侧链及其酰胺侧链氨基酸残基包括天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；小脂肪族、非极性或弱极性侧链氨基酸残基包括甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸；大脂肪族、非极性侧链氨基酸残基包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸；芳香族氨基酸残基包括苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸；含硫侧链氨基酸残基包括半胱氨酸、甲硫氨酸。
术语“辅助基团”指改变多价呈递物和/或多价呈递物组成部分(例如，框架部分，功能团部分，间隔基团等)特性的基团部分。可以改变的性质包括，例如，溶解性(在水，脂肪，脂类，生物体液等中的)，疏水性，亲水性，框架的柔性，抗原性，分子大小，分子重量，体内半衰期，体内分布，生物相容性，免疫原性，稳定性，结合到多价靶上的强度等。
本领域技术人员理解，尽管不是全部，但这些特性有许多相互之间基本上是重叠的，而且辅助基团将影响这些特性的改变。例如，人们期望在多价呈递物的框架上引入一个或多个聚(乙二醇)(PEG)基团将提高亲水性和水溶性，增加分子量和分子大小，而且，取决于未PEG化的(unPEGylated)框架的本性，会增加体内保留时间。此外，人们期望PEG能降低抗原性，并且通过结合于溶剂分子(如水)上的氢来提高聚合呈递物的整个刚性。框架的特性与能够影响这些特性的辅助基团之间相似的重叠区域对本领域技术人员来说是显而易见的。
能够提高多价呈递物的水溶性和/或亲水性的辅助基团被实际用于本发明。因此，使用辅助基团来提高多价呈递物的水溶性和/或亲水性属于本发明范围，这些辅助基团包括，例如，聚(乙二醇)，醇，多元醇(如甘油，丙氧基甘油，糖类，包括单糖，低聚糖和多糖类，等等)，羧化物，聚羧化物(如聚谷氨酸，聚丙烯酸等)，胺，聚胺(如聚甘氨酸，聚(氮丙啶)等)。
同样属于本发明范围的是辅助基团的用途，这些辅助基团使得多价呈递物能够被掺入囊中，如脂质体或胶粒。术语“脂类”指所有能够形成双层的脂肪酸衍生物，它使得在脂类材料的亲水部分朝向水相的同时疏水部分朝向双层。亲水性源于磷酸根，羧酸根，硫酸根，氨基，巯基，硝基等基团的存在。包含了，例如，但不限于，长链饱和或不饱和脂肪烃基团后的呈递物就获得了疏水性，而且这些基团可以被一个或多个芳香，环脂或杂环基团取代。优选的脂类是磷酸甘油酯和(神经)鞘脂类，具有代表性的实例包括磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨，酸磷脂酰肌醇，磷脂酸，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰-乙醇胺，二棕榈酰磷脂酰胆碱，二油酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰-磷脂酰胆碱或二亚油酰磷脂酰胆碱。其它无磷化合物，如鞘脂类和糖鞘脂类化合物也属于脂类基团。另外，上述两性脂类也可以与其它脂类，包括甘油三酯和甾醇类，混合后使用。
多价呈递物的柔性可通过引入庞大和/或刚硬的辅助基团来控制。庞大或刚硬基团的存在可以阻止框架中的键或框架和辅助基团之间的键或框架和功能团之间的键的自由旋转。刚硬基团可以包括，例如，其构象的易变性受到存在的环和/或多键的限制的基团。其它可以带来刚性的基团包括聚合基团，如低聚-或聚脯氨酸链。
刚性也可以通过静电获得。因此，无论辅助基团是负电荷还是正电荷，相同电荷的辅助基团会迫使呈递物框架形成使相同电荷彼此之间距离最大的构型。使带有相同电荷的基团彼此之间更接近的能量消耗将使框架保持在维持同电荷辅助基团之间分离的构型。另外，带有相反电荷的辅助基团将被吸引到与其带相反电荷的基团上，并且将进入分子间和分子内离子键。这种非共价结合机理将保持框架成为允许具相反电荷的基团相结合的构象。在将辅助基团加到框架上之后，通过本领域技术人员已知的脱保护反应，改变pH，氧化反应，还原反应或其它机理，使辅助基团带有电荷，或者，带有未掩蔽的潜在电荷的过程属于本发明范围。
庞大基团包括，例如，大原子或离子(如碘，硫，金属离子等)，含有大原子的基团，多环基团，包括芳香基团，非芳香基团和含有一个或多个碳-碳多键的结构(即烯和炔)。庞大基团还包括支链或直链型低聚物和聚合物。预计支链型每增加单位分子量所增加的结构刚性比直链型更多。
通过谨慎地选择辅助基团来改变多价呈递物的抗原性也属于本发明范围。在某些应用中可能需要降低多价呈递物的抗原性。如上所述，掩蔽基团，如聚(乙二醇)，是本领域已知的能够降低单价和多价分子抗原性的基团。在其它应用中(人们)可能需要提高多价呈递物的抗原性，因此，就激发了免疫反应。在这些应用中辅助基团可以包括本领域已知的能够提高半抗原免疫原性的基团。适于提高多价呈递物免疫原性的基团包括，但不限于，钥孔戚血蓝素(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)这样的蛋白质。其它能够提高多价呈递物抗原性的基团将是本领域技术人员已知的。
术语“组合物”或“制剂”表示含有一种或多种本申请所述多肽与其他组分的混合物，所述其他组分例如生理学可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
术语“水剂”是指使用水作为溶剂的液体制剂。在一些方案中，水性液体制剂是不需冻干、喷雾干燥和/或冷冻来维持稳定性(例如化学和/或物理稳定性和/或生物活性)的制剂。
术语“冻干类制剂”也称冻干粉针剂，是指用冷冻干燥法制得的注射用无菌粉末。
本申请所用的“约”在指代可测量数值(如量、持续时间等)时意在涵盖相对于具体数值±20％或±10％的变化，包括±5％、±1％和±0.1％，因为这些变化适于进行所公开的方法。
术语“稳定剂”表示药学上可接受的赋形剂，其在制造，储存和应用过程中保护活性药物成分和/或制剂免受化学和/或物理降解。稳定剂包括但不限于如以下定义的糖，氨基酸，盐，多元醇和他们的代谢产物，例如氯化钠、氯化钙、氯化镁、甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、精氨酸或其盐(如盐酸精氨酸)、甘氨酸、丙氨酸(α-丙氨酸、β-丙氨酸)、甜菜碱、亮氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、4-羟基脯氨酸、肌氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、奥品类(opines)、丙氨奥品、章鱼碱、甘氨奥品(strombine))和三甲胺的N-氧化物(TMAO)、人血清白蛋白(hsa)、牛血清白蛋白(bsa)、α-酪蛋白、球蛋白、α-乳白蛋白、LDH、溶菌酶、肌红蛋白、卵清蛋白和RNAaseA。部分稳定剂，如氯化钠、氯化钙、氯化镁、甘露醇、山梨醇、蔗糖等也可起到控制渗透压的作用。在本发明中具体地使用的稳定剂选自多元醇、氨基酸、盐、糖中的一种或一种以上。优选的盐为氯化钠，优选的糖为蔗糖和海藻糖，优选的多元醇为山梨醇和甘露醇。优选的氨基酸为精氨酸或其盐(如盐酸精氨酸)、甘氨酸、脯氨酸。优选的稳定剂为氯化钠、甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、盐酸精氨酸、甘氨酸、脯氨酸、氯化钠-山梨醇、氯化钠-甘露醇、氯化钠-蔗糖、氯化钠-海藻糖、盐酸精氨酸-甘露醇、盐酸精氨酸-蔗糖。
术语“表面活性剂”一般包括保护蛋白质例如抗体免受空气/溶液界面诱导的应力、溶液/表面诱导的应力的影响以减少抗体的聚集或使制剂中颗粒物的形成最小化的试剂。示例性的表面活性剂包括但不限于非离子型表面活性剂例如聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80)、聚乙烯-聚丙烯共聚物、聚乙烯-聚丙烯二醇、聚氧乙烯-硬脂酸酯、聚氧乙烯烷基醚、例如聚氧乙烯单月桂基醚、烷基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆，Pluronic)、十二烷基硫酸钠(SDS)。
待用于人体或动物体的制剂必须为无菌的。这可容易地通过无菌滤膜过滤实现。
具体实施方式详述
一方面，本公开提供了一种生物活性多肽，其氨基酸序列的通式如SEQ ID NO:5所示：EE-X3-QRRAD-X9，式中，X3＝L或M；X9＝TRCFRRCC或不存在。
在一些实施方案中，当X3＝L或M时，X9不存在。
在一些实施方案中，当X3＝M时，X9＝TRCFRRCC。
在一些实施方案中，所述生物活性多肽选自SEQ ID NO:1-4任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述生物活性多肽的核苷酸序列如下所示：
(1)EELQRRAD(SEQ ID NO:1)；或
(2)EEMQRRAD(SEQ ID NO:2)；或
(3)EEMQRRADTRCFRRCC(SEQ ID NO:3)；或
(4)EELQRRADTRCFRRCC(SEQ ID NO:4)。
在一些实施方案中，所述生物活性多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1-3所示的任一项。
在一些实施方案中，所述生物活性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3所示；在一些实施方案中，所述生物活性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在一些实施方案中，所述生物活性多肽的N端或C端修饰有辅助基团。在一些实施方案中，所述辅助基团为酰胺基、乙酰基或棕榈酰基。
在一些实施方案中，带有辅助基团的生物活性多肽选自SEQ ID NO:6-10任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述带有辅助基团的生物活性多肽的核苷酸序列如下所示：
(1)Ac-EELQRRAD-NH2(SEQ ID NO:6)；
(2)Pal-EELQRRAD-NH2(SEQ ID NO:7)；
(3)Ac-EEMQRRADTRCFRRCC-NH2(SEQ ID NO:8)；
(4)Pal-EEMQRRAD-NH2(SEQ ID NO:9)；
(5)Ac-EELQRRADTRCFRRCC-NH2(SEQ ID NO:10)。
在一些实施方案中，带有辅助基团的生物活性多肽选自SEQ ID NO:6-9任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，带有辅助基团的生物活性多肽选自SEQ ID NO:6-8任一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，带有辅助基团的生物活性多肽为SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；更优选为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
另一方面，本公开提供了一种组合物，其包括活性成分和辅料，所述活性成分包括前述的生物活性多肽。在一些实施方案中，所述辅料包括常规的稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂和稳定剂。
另一方面，本公开提供了一种利用前述生物活性多肽或前述的组合物在制备抗氧化、抗衰和/或促进伤口愈合的药物或产品中的应用。
在一些实施方案中，所述产品为护肤品、美容产品或医美用品。
多肽化学合成方法
多肽固相化学合成方法是一种发展完善的方法学，可参文献例如R.C.Sheppard,Solid Phase Peptide Synthesis.A Practical Approach,Oxford-IRL Press,New York,1989。
线性多肽使用Boc固相多肽合成法或Fmoc固相多肽合成法。如果使用Fmoc化学合成C-末端是羧基的多肽，通常选用Wang树脂；C-末端是酰胺的多肽通常选用Rink amide树脂(包括Rink Amide-AM树脂、Rink Amide-MBHA树脂等)。如果使用Boc化学合成C-末端是羧基的多肽，通常选用Pam树脂；C-末端是酰胺的多肽通常选用MBHA树脂。常用的缩合剂和活化剂是DIC和HOBT，其他可选肽键缩合剂包括EDC、BOP、HBTU、DEPBT、TBTU等。根据反应难度，氨基酸可以用1.1倍-10倍当量，反应时间15分钟-24小时。多肽可以手工合成，也可以使用多肽固相合成仪合成。Fmoc保护基用20％哌啶/DMF脱除。Boc保护基用TFA脱除。肽键缩合反应用茚三酮(Ninhydrin，2,2-Dihydroxyindane-1,3-dione)试剂监测。
固相合成可以选用已预装载C末端氨基酸的树脂，或者选用未装载氨基酸的树脂。
在Rink Amide树脂上装载第一个氨基酸的方法可参考业内通常做法。一种常用方法简述如下：称量适量的树脂，在固相合成管中用20％哌啶/DMF脱除Fmoc保护基(15mL/g树脂，30分钟X2)，用DMF洗涤树脂。称量相当于树脂氨基5倍当量的Fmoc氨基酸、HATU、HOAT和10倍当量的NMM，加入DMF混匀后转入固相合成管。反应过夜后，用DMF洗涤树脂。向固相合成管加入1:1醋酸酐/吡啶(v/v)，30分钟后排空，用DMF洗涤树脂。第一个氨基酸装载完毕。
使用Fmoc固相多肽合成法时，常用的氨基酸及保护基如下：Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
合成过程中采用有适当保护的结构单元，如上述标准氨基酸、Fmoc-8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(CAS No.166108-71-0)、Fmoc-Glu-OtBu(CAS No.84793-07-7)。脂肪酸部分的引入可以使用结构单元来实现，例如但不限于十八烷二酸单叔丁酯。在每个偶联步骤之后，未反应的肽中间体可以用乙酸酐(10当量)和过量可力丁(20当量)封端。
固相Fmoc化学合成多肽后，常用的切割试剂是TFA。将干树脂放在一个摇瓶中，加入适当量含有90:4:2:2:2(v/v)三氟乙酸：三异丙基硅烷：1,2-乙二硫醇：水：苯甲硫醚切割液(10-25mL/g树脂)，盖上盖子，在室温下进行间歇式旋转震荡。2小时后抽滤树脂，以新的TFA清洗树脂2-3次，合并滤液，滴加8-10倍体积的冰乙醚。最后，离心收集沉淀出来的多肽粗品。
使用Boc固相多肽合成法时，常用氨基酸和保护基如下：Boc-Cys(4-MeBzl)-OH、5Boc-Asp(OcHx)-OH、Boc-Glu(OcHx)-OH、Boc-His(Bom)-OH、Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH、Boc-Asn(Xan)-OH、Boc-Arg(Tos)-OH、Boc-Ser(Bzl)-OH、Boc-Thr(Bzl)-OH、Boc-Trp(CHO)-OH和Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH。
如果赖氨酸的侧链氨基用于合成内酰胺或酰化反应，赖氨酸的侧链氨基可以使用烯丙氧羰基(aloc)保护或Fmoc保护。如果天冬氨酸或谷氨酸的侧链羧基用于内酰胺合成或酰化反应，10羧基应该转化为烯丙酯或9-芴基甲基保护，例如Boc-Glu(OAllyl)-OH、Boc-Glu(Ofm)-OH。固相Boc化学合成多肽后，对于PAM、MBHA树脂，通常采用HF切割，每0.1毫摩尔树脂加5毫升HF，同时加入对甲苯酚、对巯基苯酚或苯甲醚等试剂，混合物在冰浴条件下搅拌1小时。真空抽干HF后，多肽用冰乙醚沉淀，离心收集沉淀，经过HPLC分离纯化，冷冻干燥得到最后产品。
纯化
将粗肽溶于水和乙腈(例如水/乙腈(3:1))的合适混合物中，并通过反相制备型HPLC(例如AKTA purifier、岛津LC-20AR等)纯化，根据装载的粗肽量和极性大小选用不同填料和大小的柱子，例如C8或C18半制备柱或制备柱。缓冲液A为0.1％TFA水溶液，缓冲液B为0.1％TFA的乙腈。缓冲液B梯度上升进行洗脱，通过分析型HPLC检查相关级分(fraction)。使用ZORBAX 300SB-C18(4.6X250mm,5μM)柱，缓冲液A为0.1％TFA水溶液，缓冲液B为0.1％TFA的乙腈。流速1ml/min，在210nm波长检测。将含有纯的目标肽的级分混合并冷冻干燥，得到肽三氟乙酸盐，为白色固体。产品分装于玻璃小瓶中保存。
制备方法
本公开的多肽是直链肽。可以按照多肽序列自C末端至N末端的顺序逐步偶联每一个氨基酸，从而得到多肽主链。过程为：首先将一个氨基被封闭基团保护的氨基酸共价连接在固相载体上，脱掉第一个氨基酸的氨基保护基，这样第一个氨基酸就接到固相载体上。然后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基经过活化后，与己接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端延长，直至生成所需要的肽链。最后脱去保护基，水解肽链和固相载体之间的共价键，就得到了合成好的肽。
具体合成方法参考专利CN2021108155833。
为了达到清楚和简洁描述的目的，本文中作为相同的或分开的一些实施方案的一部分来描述特征，然而，将要理解的是，本公开的范围可包括具有所描述的所有或一些特征的组合的一些实施方案。
实施例
实施例1：多肽的合成
本实施例采用Fmoc固相多肽合成法，由羧基端向氨基端方向合成，多肽1-5的氨基酸按照前述氨基酸顺序依次连接。具体合成方法参考专利CN202110815583.3。通过液质联用鉴定分离出的产物多肽，用5％ACN/H2O(含0.1％甲酸)为起始，以梯度(6％/min的速度增加ACN的比例)，流速为0.4mL/min，洗脱分析15分钟，确定目标多肽，理论分子量以及实测值(M+2H)2+如下表1。
表1多肽1-5的氨基酸序列表及液质联用鉴定结果
注：表中的-NH2指多肽的C端被酰胺化封闭，Ac-为乙酰基，Pal-为棕榈酰基。
实施例2DPPH·清除率的测定
本实施例中通过DPPH·清除率的测定实验，研究多肽1-5对DPPH·清除能力的影响。
分组方法：
样品组：多肽1-5的PBS水溶液(浓度为10mg/mL)分别与1mM DPPH无水乙醇溶液等体积混合；
对照组：PBS溶液与1mM DPPH无水乙醇溶液等体积混合；
空白组：多肽1-5的PBS溶液、PBS溶液分别与无水乙醇溶液等体积混合。
实验方法：使用PBS溶液溶解多肽1-5，分别配成10mg/mL的溶液，另配制浓度为1mMDPPH无水乙醇溶液。取50μL多肽的PBS溶液与50μL DPPH无水乙醇溶液混合于96孔板，并振荡，在室温下反应30min，然后在517nm处测定吸光值A。空白组以等体积无水乙醇溶液代替DPPH溶液，对照组以等体积PBS代替多肽溶液。DPPH·清除率按式计算：
DPPH·清除率＝[1-(Ai-Aj)/Ao]×100％
式中：Ao--对照组吸光度；Ai--样品组吸光度；Aj--空白组吸光度。
使用GraphPad Prism绘制样品组和空白对照组的DPPH·清除率柱状图。
结果分析：图1为多肽对DPPH·清除率的测定的实验结果图。图中，空白对照的DPPH·清除率＝[1-(Ao-Aj)/Ao]×100％，由图1可知，在5mg/mL的药物浓度下，多肽1、3的DPPH·清除率高于80％，具有较强的抗氧化能力，对于保护皮肤组织正常结构和功能、延缓皮肤衰老具有重要意义；多肽2次之，超过60％；多肽5的DPPH·清除效果最差，但也接近40％。
实施例3多肽1-5对人皮肤成纤维细胞(HSF)的促生长作用
本实施例中通过CCK8实验研究多肽1-5在0.2mM浓度下对人皮肤成纤维细胞HSF的促生长作用。
分组方法：
样品组：接种HSF细胞，且含有0.2mg/mL多肽1-5的DMEM溶液。
培养基组：仅含有DMEM培养基，不接种细胞，且不添加多肽。
空白对照组：未添加多肽，其它条件与样品组相同。
实验方法：将HSF细胞以10000个/孔的密度接种于96孔板中，每孔100μL，于37℃、5％CO2恒温培养箱中孵育24h；移除孔中溶液，分别加入以DMEM为溶剂配制的0.2mg/mL多肽1-5的溶液，每孔100μL，作为样品组；同时设置仅含培养基的培养基组和仅含细胞和培养基的空白对照组；每组各设置5个平行孔。在细胞培养箱孵育48h后，弃去原培养基，PBS洗涤2次，加入含10％CCK8的DMEM培养基，避光孵育4h。在酶标仪450nm处测定吸光度，计算细胞活力值(细胞存活率)。
细胞存活率(％)＝(A1-A)/(A0-A)*100％，
式中：A1-样品组吸光值；A-培养基组吸光值；A0-空白对照组吸光值。使用GraphPadPrism绘制样品组和对照组的细胞存活率柱状图。
结果分析：多肽对人皮肤成纤维细胞HSF的促生长作用如图2所示。可以看出，多肽1、2、3、4的细胞存活率均超过空白对照组的100％，多肽3的细胞存活率最高，表现出明显的促进HSF细胞增殖的能力，有较强的修复衰老细胞的能力。
实施例4多肽1-5的斑马鱼抗皱功效评价
皮肤的生长、修复、营养以及弹性、张力都与胶原蛋白有关，它的流失会使皮肤光滑度下降，产生皱纹。在四足动物中，I型胶原蛋白是一个三聚体，主要由两个α1链和一个α2链组成，分别由col1a1a和col1a2基因编码，在结缔组织和骨中执行胶原蛋白相关生物功能。在斑马鱼中存在三种I型胶原基因，分别编码α1(I)、α2(I)和α3(I)链的col1a1a、col1a1b和col1a2。因此，通过检测col1a1a或(和)col1a1b或(和)col1a2基因相对表达量可表明样品是否具有抗皱功效。本实施例中通过检测col1a1a基因相对表达量评价样品的抗皱功效。
试验体系：野生型AB品系斑马鱼；鱼龄为受精后4天(4dpf)。
分组方法：
样品组：给予0.3mM多肽处理，培养24h；
正常对照组：未给予多肽处理，其他培养条件与样品组相同；
每组各30尾斑马鱼(三次生物学重复，N＝3)。
实验方法：
随机选取4dpf的斑马鱼于6孔板中，每孔30尾。水溶给予样品终浓度为0.3mM，同时设置正常对照组，每孔容量为3mL(三次生物学重复，N＝3)。在28℃条件下避光孵育24h。提取各实验组斑马鱼总RNA，合成cDNA，利用q-PCR检测β-actin和目的基因的基因表达。用β-actin作为基因表达的内参，计算目的基因的RNA相对表达量。
数据处理与结果分析：
数据处理：采用如下公式计算目的基因的RNA相对表达量：
RNA相对表达量＝2ΔΔC(t)
ΔΔC(t)＝ΔC(t)正常对照组-ΔC(t)样品组
ΔC(t)＝C(t)目的基因-C(t)β-actin
使用GraphPad Prism软件绘制样品组和正常对照组的目的基因的RNA相对表达量柱状图(图3)。其中，正常对照组的ΔΔC(t)＝ΔC(t)正常对照组-ΔC(t)正常对照组＝0，RNA相对表达量＝1。
实验结果：图3为斑马鱼col1a1a基因相对表达量。由实验结果可知，在0.3mM测试浓度下，多肽1、3显示其具有优异的抗皱功效(P＜0.0001)；其次是多肽2和多肽4；多肽5在该测试浓度下暂未显示明显抗皱功效。
综上，本公开提供的生物活性多肽能够显著促进人皮肤成纤维细胞HSF生长，同时具有较高的DPPH·清除率，说明其具有较强的抗氧化能力。此外，实验证明其还能够提高斑马鱼col1a1a基因相对表达量，对于保护皮肤组织正常结构和功能、减少皱纹、延缓皮肤衰老具有重要意义。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生物活性多肽，其氨基酸序列的通式如SEQ ID NO:5所示：EE-X3-QRRAD-X9，式中，X3＝L或M；X9＝TRCFRRCC或不存在。
2.根据权利要求1所述的生物活性多肽，其特征在于，当X3＝L或M时，X9不存在。
3.根据权利要求1所述的生物活性多肽，其特征在于，当X3＝M时，X9＝TRCFRRCC。
4.根据权利要求1述的生物活性多肽，其包含选自SEQ ID NO:1-4任一项所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的生物活性多肽，其特征在于，所述生物活性多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:1-3所示的任一项。
6.根据权利要求5所述的生物活性多肽，其特征在于，所述生物活性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示；
优选地，所述生物活性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
7.根据权利要求1-6任一项所述的生物活性多肽，其特征在于，其N端或C端修饰有辅助基团；
优选地，带有辅助基团的生物活性多肽选自SEQ ID NO:6-10任一项所示的氨基酸序列；
优选地，带有辅助基团的生物活性多肽选自SEQ ID NO:6-9任一项所示的氨基酸序列；
优选地，带有辅助基团的生物活性多肽选自SEQ ID NO:6-8任一项所示的氨基酸序列；更优选为SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；更优选为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
8.一种组合物，其包括活性成分和辅料，其特征在于，所述活性成分包括权利要求1-7任一项所述的生物活性多肽；
优选地，所述辅料包括常规的稀释剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂和稳定剂。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，其剂型包括膏霜、乳液、水剂、凝胶、油剂、粉剂、泥、气雾剂、贴类、冻干类、胶囊剂、片剂。
10.权利要求1-7任一项所述的生物活性多肽或权利要求8或9所述的组合物在制备抗氧化、抗衰和/或促进伤口愈合的药物或产品中的应用；
优选地，所述产品为护肤品、美容产品或医美用品。
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