CN118125930A - L-异亮氨酸的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种L‑异亮氨酸的分离纯化方法，先用稀酸调L‑异亮氨酸发酵液pH至6.5，然后加入中性蛋白酶处理，再用稀酸调发酵液pH至3.0‑6.0，然后依次经陶瓷膜过滤、阳离子交换、阴离子交换，硫酸根沉淀、活性炭脱色及浓缩结晶，最后干燥得到食品级L‑异亮氨酸纯品。本发明先用中性蛋白酶处理发酵液，将大分子蛋白水解为多肽，消除了部分泡沫。发酵液适宜的pH可大大降低泡沫量，进一步消除泡沫，减少物料损失。通过向解吸液中加入碳酸钙，离心沉淀解吸液中残留的硫酸根，从而降低了离子交换的压力。本方法制备得到的L‑异亮氨酸纯度达99.3％以上，收率达88.7％以上。
Description
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，具体地说，涉及一种L-异亮氨酸的分离纯化方法。
背景技术
L-异亮氨酸是人体8种必需氨基酸之一，又是3种支链氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。L-异亮氨酸在1904年第一次被EHRLICH从甜菜糖浆中分离出来。随着对制造L-异亮氨酸的不断深入研究，人们开始在工业上大规模的生产L-异亮氨酸。相比利用蛋白质水解法和化学合成法生产L-异亮氨酸，微生物发酵法在生产过程中绿色环保、成本大大减少、反应易控制以及能适用于大规模的生产，是现在工业上生产L-异亮氨酸的主要方法。
L-异亮氨酸作为人体必需的种氨基酸之一，是合成人体激素、酶类的原料，具有促进蛋白质合成和抑制分解的效果，但体内无法自身合成，成年人每天需要从外界摄取20mg/kg(体重)的L-异亮氨酸。因此，L-异亮氨酸在食品、医药、饲料和运动保健领域具有广泛的应用及商业价值。
在食品行业中，L-异亮氨酸可强化某些食品的营养。L-异亮氨酸还可与其他氨基酸配制成氨基酸能量饮料和运动员饮料，有形成肌肉、减轻肌肉疲劳，提高运动员的耐性，促进骨骼肌蛋白的合成速率，利于肌肉恢复。另外，L-异亮氨酸也可制作成生酮饮食治疗癫痫病。
在医药行业中，主要用于配制复方氨基酸输液包括营养型氨基酸输液、治疗型高支链氨基酸输液及各种口服液制剂，为肝硬化患者提供蛋白和能量促进冠动脉患者心肌蛋白周转，提高尿毒症患者的食欲和营养，避免营养不良，为间质性肝炎提供蛋白和能源力。
在饲料行业中，L-异亮氨酸作为动物营养有着特殊的作用，因此受到研究者的广泛关注。目前，L-异亮氨酸制成饲料添加剂，节省蛋白质饲料，使饲料成分得到利用，提高饲料利用率，从而降低成本。
在运动保健行业中，L-异亮氨酸可提高人体的免疫力，促进人体能量的消耗，减少脂肪量，可用于减肥药的配制。通过糖皮质激素来控制血糖减少中枢性疲劳。另外，异亮氨酸对治疗运动型障碍及外伤有一定作用，可减少迟发性运动障碍的症状力，治疗伤口，改善受伤导致的认知障碍。
由于L-异亮氨酸的应用领域广泛，并且新的用途被不断发现，大大增加了市场需求量。目前，国内己有厂家进行批量生产L-异亮氨酸，但是这些企业生产菌株产酸能力低，生产工艺和生产设备落后，产量不能满足市场需求。因此，改善菌株生产能力、优化工艺流程、提高分离提取效率成为亟待解决的问题。
L-异亮氨酸工业化生产工艺主要有：蛋白质水解法、化学合成法和发酵法。蛋白质水解法生产设备简单，成本低，但缺点是污染严重、收率低、产品的纯度低。化学合成法原料来源有限，步骤复杂，且由于异亮氨酸存在四种旋光异构体，而大多数合成法只能先制得外消旋体，经外消旋拆分后才能得到L-异亮氨酸，所以很难实现工业化生产。微生物发酵法生产L-异亮氨酸能够实现大规模工业化生产，且原料成本低，易于控制，其利用微生物的代谢作用可生物合成并过量积累L-异亮氨酸，在目前生产L-异亮氨酸的方法中具有垄断地位。发酵法主要包括添加前体物发酵法和直接发酵法。添加前体物发酵法可以避免L-异亮氨酸合成途径中的反馈调节作用，但由于前体物质稀少或价格昂贵，很少被应用。直接发酵法就是通过特定的育种手段对微生物进行定向筛选，选育出营养缺陷型或结构类似物抗性突变株，解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏，从而达到过量积累L-异亮氨酸的目的。目前，L-异亮氨酸产生菌大多为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和大肠杆菌(Escherichia coli)。
生产上分离提取L-异亮氨酸的方法有很多种，如离子交换法、膜分离法和色谱法等。其中离子交换法最为常用，主要是基于一种合成的离子交换剂作为吸附剂，以吸附溶液中需要分离的离子。生物工业中最常用的交换剂为离子交换树脂，广泛用于提取氨基酸、有机酸、抗生素等小分子生物制品。在提取过程中，生物制品从发酵液中吸附在离子交换树脂上，然后在适宜条件下用洗脱剂将吸附物从树脂上洗脱下来，达到分离、浓缩、提纯的目的。此方法的特点是树脂无毒性且可反复再生使用，少用或不用有机溶剂，因而成本低，设备简单，操作方便。但当混合氨基酸之间的等电点相差较小时，不易分离，且耗盐量大、产生过量的再生废液、操作周期较长。膜分离是指利用膜的选择透过性能将离子或分子或某些微粒从水中分离出来的过程。用膜分离溶液时，使溶质通过膜的方法称为渗析，使溶剂通过膜的方法称为渗透。根据溶质或溶剂透过膜的推动力和膜种类不同，膜分离法通常可以分为电渗析、反渗透、超滤及微滤。对于分子量相近、物化性质相似的多肽或氨基酸很难用超滤膜进行分离，纳滤膜分离技术则对多肽和氨基酸的分级分离具有明显的优势。膜分离主要特点有：①膜分离过程不发生相变，因此能量转化的效率高，该技术是一种节能技术。②膜分离过程在常温下进行，因而特别适于对热敏性物料，如果汁、酶、药物等的分离、分级和浓缩。③膜分离技术不仅适用于有机物和无机物的分离以及生物学病毒、细菌到微粒的分离，而且还适用于许多特殊溶液体系的分离，如溶液中大分子与无机盐的分离及一些共沸物或近沸物系的分离，而常规的蒸馏方法对于后者常常是无能为力的。④装置简单，操作容易、易控制、维修且分离效率高。作为一种新型的水处理方法，与常规水处理方法相比，膜分离技术具有占地面积小、适用范围广、处理效率高等优点。色谱法又称层析法或色层法，是一种利用物质的溶解性、吸附性等特性的物理化学分离方法。其分离原理是根据混合物的各组分在互不相溶的两相(称为固定相和流动相)作用的差异作为分离依据的。色谱法能解决那些物理常数相近，化学性质类似的同系物、异构体等复杂多组分混合物的分离分析问题，既能鉴定化合物又能做定量测定。而且色谱法的仪器装置不复杂，操作较方便。此外它还具有分离效能高、灵敏度高、分析速度快、定量结果准确和易于自动化等优点。
目前已知分离提取L-异亮氨酸的方法中，第一步普遍采用发酵液中菌体变性分离得到清液，忽略了发酵液泡沫量大的问题，使得陶瓷膜过滤困难，并且物料损失导致收率降低。
异亮氨酸提取工艺采用阳离子交换柱去除杂酸与杂质，它可以去除NH4+、Ca2+、Mg2+等杂质离子及一部分酸性氨基酸，但高流中的硫酸根离子与一大部分杂质氨基酸没有去除，导致高流液的质量不高，杂质量偏大，同时高流中还有大量的色素，使最终得到的产品等级低，只能生产USP24级别的异亮氨酸产品，异亮氨酸的品质很难得到提高。现有工艺采用二次结晶、二次脱色，去除异亮氨酸中的杂质，得到异亮氨酸成品。但是二次结晶、二次分离得到异亮氨酸成品过程中，产生大量的异亮氨酸母液，母液再一次上离交柱，使得母液的损失量变大，异亮氨酸的提取精制收率低，浪费严重。
现有技术存在的主要问题有：(1)异亮氨酸发酵液浓度＞5％以后，发酵液一种稳定的乳状胶体溶液，极为粘稠，且泡沫不易消除；(2)加入大量稀硫酸调节pH后，可以使得部分蛋白质凝聚，为除去硫酸根后续会增大离子交换柱的用水量；(3)成品中硫酸根离子不合格，物料返投不但浪费了大量资源，而且收率大大降低；(4)由于结晶过程在较高温度下进行，母液中异亮氨酸浓度较高，导致一次结晶收率较低；(5)絮凝剂残留对L-异亮氨酸的纯度造成影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种改良的L-异亮氨酸的分离纯化方法。
为了实现本发明目的，本发明提供L-异亮氨酸的分离纯化方法，包括以下步骤：
(1)发酵液预处理：用稀酸调L-异亮氨酸发酵液pH至6.5，然后加入中性蛋白酶，50-55℃保温1-6h，再用稀酸调发酵液pH至3.0-6.0(优选pH调至5.0)；
(2)陶瓷膜过滤：将发酵液经过陶瓷膜，收集含有L-异亮氨酸的滤清液；
(3)离子交换：滤清液经阳离子交换树脂柱去除杂质，洗脱收集得到L-异亮氨酸高流液(即高浓度洗脱液)，再进入阴离子交换树脂柱进行除杂，洗脱收集解吸液；
(4)测定解吸液中硫酸根含量；
(5)除去硫酸根：向解吸液中加入与硫酸根等摩尔量的碳酸钙，生成硫酸钙沉淀，离心除去沉淀，收集上清液；
(6)上清液经活性炭脱色，得到L-异亮氨酸溶液；
(7)对L-异亮氨酸溶液进行蒸发浓缩结晶，干燥得到食品级L-异亮氨酸纯品。
进一步地，步骤(1)所述稀酸为浓度1M的稀硫酸、稀盐酸或麸酸，优选稀盐酸。
进一步地，步骤(1)所述中性蛋白酶的添加量为发酵液质量百分数的0.03-0.05％。
优选地，步骤(1)加入中性蛋白酶，55℃保温3h。
进一步地，步骤(2)设置陶瓷膜温度50-60℃，压力0.1-0.2MPa，得到滤清液。
进一步地，步骤(3)所述阳离子交换树脂柱为001×7型强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂柱。
所用洗脱液为氨水0.5-1.0wt％。
进一步地，步骤(3)所述阴离子交换树脂柱为201×7型强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂柱。
所用洗脱液为氢氧化钠2-6％。
优选地，L-异亮氨酸高流液进入阴离子交换树脂柱的流量为9m3/h。
进一步地，步骤(4)测定硫酸根含量采用硫酸根重量法。
进一步地，步骤(6)加入上清液质量百分数0.3-0.5％的活性炭，45-50℃搅拌转速45-50rpm，维持25-30min。
优选地，步骤(7)蒸发浓缩的温度为55-60℃。
进一步地，待蒸发至L-异亮氨酸浓度达到60-65w/v％时停止浓缩，将浓缩液倒入容器中加入晶种进行结晶，晶种的添加量为浓缩液质量百分数的1-5％。
本发明中，用于制备所述L-异亮氨酸发酵液的菌种可以是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌(Escherichia coli)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)或乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumla ctofermentum)。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明先用中性蛋白酶处理发酵液，将大分子蛋白水解为多肽，消除了部分泡沫。
(二)通过加入中性蛋白酶处理后，向发酵液中加入稀盐酸，再将发酵液pH由6.5调至5.0，此适宜pH可大大降低发酵液泡沫量，进一步消除泡沫，减少物料损失，并减少了原工艺使用硫酸调节pH，导致的硫酸根的引入。
(三)尽管发酵液采用了稀盐酸稀释，但由于发酵配方中含有大量的硫酸铵，还是会导致大量硫酸根的存在，为了降低后续提取步骤中离子交换的压力，有效降低硫酸根浓度，在解吸液中加入碳酸钙，通过离心沉淀解吸液中残留的硫酸根离子，硫酸根离子浓度降低，降低了离子交换的压力，使硫酸根浓度从1.1％降至0.14％以下。
(四)本方法制备得到的L-异亮氨酸纯度达99.3％以上，收率达88.7％以上。
附图说明
图1为本发明L-异亮氨酸分离纯化方法的工艺流程图。
具体实施方式
本发明提供一种L-异亮氨酸的分离纯化方法，流程见图1，包括如下步骤：
(1)发酵液预处理：先用稀酸调发酵液pH6.5，然后加入中性蛋白酶，再调节发酵液pH3.0-6.0；
(2)陶瓷膜过滤：将发酵液经过陶瓷膜，收集含有L-异亮氨酸的滤清液；
(3)离子交换：滤清液经阳离子柱(阳离子交换树脂柱)去除杂质，洗脱收集得到L-异亮氨酸高流液，再进入阴柱(阴离子交换树脂柱)进行除杂；
(4)测定解吸液中硫酸根含量；
(5)除去硫酸根：加入与硫酸根等摩尔量的碳酸钙，生成硫酸钙沉淀，离心后得到离心液；
(6)活性炭脱色：脱炭后收集L-异亮氨酸溶液；
(7)浓缩结晶：对L-异亮氨酸溶液进行蒸发浓缩结晶，干燥得到食品级L-异亮氨酸纯品。
前述的方法，步骤(1)具体操作为：先将pH调到6.5，加入中性蛋白酶反应后再将pH调到3.0-6.0，观察发酵液中泡沫的消除情况，确定合适的稀酸和pH。所述中性蛋白酶添加量为0.03-0.05％，控制温度为50-55℃，充分搅匀后反应时间为1-6h；所述调节发酵液pH稀酸分别为浓度1M的稀硫酸、稀盐酸或麸酸。
前述的方法，步骤(2)中设置陶瓷膜温度50-60℃，压力0.1-0.2MPa，得到滤清液。
前述的方法，步骤(3)所述滤清液经阳离子柱，洗脱收集后，去除杂质离子NH4+、Ca2 +、Mg2+及部分酸性氨基酸，得到L-异亮氨酸高流液；L-异亮氨酸高流液进入阴柱，流量为9m3/h，除去大部分硫酸根、色素及一部分杂酸，收集解吸液。
前述的方法，步骤(4)采用硫酸根重量法测定硫酸根的含量。
前述的方法，步骤(5)中的硫酸钙沉淀采用离心除去。
前述的方法，步骤(6)进行活性炭脱色，活性炭添加量0.3％，搅拌转速50rpm，50℃维持30min，脱炭后收集L-异亮氨酸溶液。
前述的方法，步骤(7)浓缩温度60℃。在蒸发至L-异亮氨酸浓度达到60％(w/v)时停止浓缩，将浓缩液倒入结晶器中晶种的添加质量为结晶蒸发器中物料质量的1-5％，测定L-异亮氨酸纯度并计算最终收率。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的陶瓷膜的孔径50nm，商品编号为8421299090，购自南京艾宇琦膜科技有限公司。
阳离子交换树脂柱的商品编号为001×7型强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂柱，购自宜兴市双达环保科技有限公司。
阴离子交换树脂柱的商品编号为201×7型强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂柱，购自宜兴市双达环保科技有限公司。
进行阳离子交换使用的洗脱液为0.5-1.0wt％氨水。进行阴离子交换使用的洗脱液为2-6％氢氧化钠。
中性蛋白酶购自潍坊益昊生物技术有限公司，50000U/g。
以下实施例中L-异亮氨酸发酵液的制备方法可参见CN111172086A说明书实施例2。
实施例1L-异亮氨酸的分离纯化方法
(1)发酵液预处理：用1M盐酸将发酵液pH调到6.5，加入中性蛋白酶，中性蛋白酶添加量为发酵液质量百分数的0.05％，控制反应温度为55℃，时间为3h；充分反应后再用1M稀硫酸将pH调为6.0，此时发酵液面上方有大量泡沫。
(2)陶瓷膜过滤：设置陶瓷膜温度55℃，压力0.2MPa，将预处理后的发酵液经过陶瓷膜过滤，去除菌体蛋白等杂质，收集滤清液。
(3)离子交换：滤清液经阳离子柱，洗脱(所用洗脱液为0.7wt％氨水)收集后，去除杂质离子NH4+、Ca2+、Mg2+及部分酸性氨基酸，得到L-异亮氨酸高流液；L-异亮氨酸高流液进入阴柱，流量为9m 3/h，除去大部分硫酸根、色素及一部分杂酸，收集离交解吸液(所用洗脱液为4％氢氧化钠)。
(4)除去硫酸根：采用1M的稀硫酸调pH6.0，根据分析测定的硫酸根含量为1.4％，向将解吸液中加入与硫酸根等摩尔量的碳酸钙，钙离子和硫酸根生成硫酸钙沉淀，离心弃去沉淀，此时硫酸根浓度为0.14％。
(5)活性炭脱色：上清液中加入活性炭，添加量0.3％，搅拌转速50rpm，50℃维持30min，脱炭后收集L-异亮氨酸溶液，透光率可达到97.9％。
(6)浓缩结晶：将L-异亮氨酸溶液进行浓缩，控制水浴温度60℃，浓缩至L-异亮氨酸浓度达到60％(w/v)停止浓缩；将浓缩液倒入结晶器中，缓慢开启搅拌，转速30rpm，夹套通入冷却水降温，之后加入食品级晶种2％，加水提纯放罐，经液相色谱测得纯度为97.6％，计算最终收率为79.4％。
实施例2L-异亮氨酸的分离纯化方法
(1)发酵液预处理：用1M盐酸将发酵液pH调到6.5，加入中性蛋白酶，中性蛋白酶添加量为发酵液质量百分数的0.05％，控制反应温度为55℃，时间为3h；充分反应后再用1M稀麸酸将pH调为6.0，此时发酵液面上方有大量泡沫。
(2)陶瓷膜过滤：设置陶瓷膜温度55℃，压力0.2MPa，将预处理后的发酵液经过陶瓷膜过滤，去除菌体蛋白等杂质，收集滤清液。
(3)离子交换：滤清液经阳离子柱，洗脱(所用洗脱液为0.7wt％氨水)收集后，去除杂质离子NH4+、Ca2+、Mg2+及部分酸性氨基酸，得到L-异亮氨酸高流液；L-异亮氨酸高流液进入阴柱，流量为9m 3/h，除去大部分硫酸根、色素及一部分杂酸，收集离交解吸液(所用洗脱液为4％氢氧化钠)。
(4)除去硫酸根：采用1M的稀麸酸调pH6.0，根据分析测定的硫酸根含量为1.1％，向将解吸液中加入与硫酸根等摩尔量的碳酸钙，钙离子和硫酸根生成硫酸钙沉淀，离心弃去沉淀，此时硫酸根浓度为0.14％。
(5)活性炭脱色：上清液中加入活性炭添加量0.3％，搅拌转速50rpm，50℃维持30min，脱炭后收集L-异亮氨酸溶液，透光率可达到97.2％。
(6)浓缩结晶：将L-异亮氨酸溶液进行浓缩，控制水浴温度60℃，浓缩至L-异亮氨酸浓度达到60％(w/v)停止浓缩；将浓缩液倒入结晶器中，缓慢开启搅拌，转速30rpm，夹套通入冷却水降温，之后加入食品级晶种2％，加水提纯放罐，经液相色谱测得纯度为95.7％，计算最终收率为80.5％。
实施例3L-异亮氨酸的分离纯化方法
(1)发酵液预处理：用1M盐酸将发酵液pH调到6.5，加入中性蛋白酶，中性蛋白酶添加量为发酵液质量百分数的0.05％，控制反应温度为55℃，时间为3h；充分反应后再用1M稀盐酸将pH调为6.0，此时发酵液面上方有少量泡沫。
(2)陶瓷膜过滤：设置陶瓷膜温度55℃，压力0.2MPa，将预处理后的发酵液经过陶瓷膜过滤，去除菌体蛋白等杂质，收集滤清液。
(3)离子交换：滤清液经阳离子柱，洗脱(所用洗脱液为0.7wt％氨水)收集后，去除杂质离子NH4+、Ca2+、Mg2+及部分酸性氨基酸，得到L-异亮氨酸高流液；L-异亮氨酸高流液进入阴柱，流量为9m 3/h，除去大部分硫酸根、色素及一部分杂酸，收集离交解吸液(所用洗脱液为4％氢氧化钠)。
(4)除去硫酸根：采用1M的稀盐酸调pH6.0，根据分析测定的硫酸根含量为1.1％，向将解吸液中加入与硫酸根等摩尔量的碳酸钙，钙离子和硫酸根生成硫酸钙沉淀，离心弃去沉淀，此时硫酸根浓度为0.14％。
(5)活性炭脱色：上清液中加入活性炭添加量0.3％，搅拌转速50rpm，50℃维持30min，脱炭后收集L-异亮氨酸溶液，透光率可达到97.8％。
(6)浓缩结晶：将L-异亮氨酸溶液进行浓缩，控制水浴温度60℃，浓缩至L-异亮氨酸浓度达到60％(w/v)停止浓缩；将浓缩液倒入结晶器中，缓慢开启搅拌，转速30rpm，夹套通入冷却水降温，之后加入食品级晶种2％，加水提纯放罐，经液相色谱测得纯度为98.1％，计算最终收率为83.6％。
实施例4L-异亮氨酸的分离纯化方法
(1)发酵液预处理：用1M盐酸将发酵液pH调到6.5，加入中性蛋白酶，中性蛋白酶添加量为发酵液质量百分数的0.05％，控制反应温度为55℃，时间为3h；充分反应后再用1M稀盐酸将pH调为5.0，此时发酵液面上方无泡沫。
(2)陶瓷膜过滤：设置陶瓷膜温度55℃，压力0.2MPa，将预处理后的发酵液经过陶瓷膜过滤，去除菌体蛋白等杂质，收集滤清液。
(3)离子交换：滤清液经阳离子柱，洗脱(所用洗脱液为0.7wt％氨水)收集后，去除杂质离子NH4+、Ca2+、Mg2+及部分酸性氨基酸，得到L-异亮氨酸高流液；L-异亮氨酸高流液进入阴柱，流量为9m 3/h，除去大部分硫酸根、色素及一部分杂酸，收集离交解吸液(所用洗脱液为4％氢氧化钠)。
(4)除去硫酸根：采用1M的稀盐酸调整pH5.0，根据分析测定的硫酸根含量为1.1％，向将解吸液中加入与硫酸根等摩尔量的碳酸钙，钙离子和硫酸根生成硫酸钙沉淀，离心弃去沉淀，此时硫酸根浓度为0.14％。
(5)活性炭脱色：上清液中加入活性炭添加量0.3％，搅拌转速50rpm，50℃维持30min，脱炭后收集L-异亮氨酸溶液，透光率可达到98.1％。
(6)浓缩结晶：将L-异亮氨酸溶液进行浓缩，控制水浴温度60℃，浓缩至L-异亮氨酸浓度达到60％(w/v)停止浓缩；将浓缩液倒入结晶器中，缓慢开启搅拌，转速30rpm，夹套通入冷却水降温，之后加入食品级晶种2％，加水提纯放罐，经液相色谱测得纯度为99.3％，计算最终收率为88.7％。
实施例5L-异亮氨酸的分离纯化方法
(1)发酵液预处理：用1M盐酸将发酵液pH调到6.5，加入中性蛋白酶，中性蛋白酶添加量为发酵液质量百分数的0.05％，控制反应温度为55℃，时间为3h；充分反应后再用1M稀盐酸将pH调为4.0，此时发酵液面上方有少量泡沫。
(2)陶瓷膜过滤：设置陶瓷膜温度55℃，压力0.2MPa，将预处理后的发酵液经过陶瓷膜过滤，去除菌体蛋白等杂质，收集滤清液。
(3)离子交换：滤清液经阳离子柱，洗脱(所用洗脱液为0.7wt％氨水)收集后，去除杂质离子NH4+、Ca2+、Mg2+及部分酸性氨基酸，得到L-异亮氨酸高流液；L-异亮氨酸高流液进入阴柱，流量为9m 3/h，除去大部分硫酸根、色素及一部分杂酸，收集离交解吸液(所用洗脱液为4％氢氧化钠)。
(4)除去硫酸根：采用1M的稀盐酸调整pH4.0，根据分析测定的硫酸根含量为1.1％，向将解吸液中加入与硫酸根等摩尔量的碳酸钙，钙离子和硫酸根生成硫酸钙沉淀，离心弃去沉淀，此时硫酸根浓度为0.14％。
(5)活性炭脱色：上清液中加入活性炭添加量0.3％，搅拌转速50rpm，50℃维持30min，脱炭后收集L-异亮氨酸溶液，透光率可达到97.8％。
(6)浓缩结晶：将L-异亮氨酸溶液进行浓缩，控制水浴温度60℃，浓缩至L-异亮氨酸浓度达到60％(w/v)停止浓缩；将浓缩液倒入结晶器中，缓慢开启搅拌，转速30rpm，夹套通入冷却水降温，之后加入食品级晶种2％，加水提纯放罐，经液相色谱测得纯度为98.9％，计算最终收率为82.5％。
实施例6L-异亮氨酸的分离纯化方法
(1)发酵液预处理：用1M盐酸将发酵液pH调到6.5，加入中性蛋白酶，中性蛋白酶添加量为发酵液质量百分数的0.05％，控制反应温度为55℃，时间为3h；充分反应后再用1M稀盐酸将pH调为3.0，此时发酵液面上方有大量泡沫。
(2)陶瓷膜过滤：设置陶瓷膜温度55℃，压力0.2MPa，将预处理后的发酵液经过陶瓷膜过滤，去除菌体蛋白等杂质，收集滤清液。
(3)离子交换：滤清液经阳离子柱，洗脱(所用洗脱液为0.7wt％氨水)收集后，去除杂质离子NH4+、Ca2+、Mg2+及部分酸性氨基酸，得到异亮氨酸高流液；L-异亮氨酸高流液进入阴柱，流量为9m 3/h，除去大部分硫酸根、色素及一部分杂酸，收集离交解吸液(所用洗脱液为4％氢氧化钠)。
(4)除去硫酸根：采用1M的稀盐酸调整pH3.0，根据分析测定的硫酸根含量为1.1％，向将解吸液中加入与硫酸根等摩尔量的碳酸钙，钙离子和硫酸根生成硫酸钙沉淀，离心弃去沉淀，此时硫酸根浓度为0.14％。
(5)活性炭脱色：上清液中加入活性炭添加量0.3％，搅拌转速50rpm，50℃维持30min，脱炭后收集L-异亮氨酸溶液，透光率可达到97.4％。
(6)浓缩结晶：将L-异亮氨酸溶液进行浓缩，控制水浴温度60℃，浓缩至L-异亮氨酸浓度达到60％(w/v)停止浓缩；将浓缩液倒入结晶器中，缓慢开启搅拌，转速30rpm，夹套通入冷却水降温，之后加入食品级晶种2％，加水提纯放罐，经液相色谱测得纯度为98.6％，计算最终收率为81.8％。
对比例1L-异亮氨酸的分离纯化方法
(1)陶瓷膜过滤：发酵液加热后直接过滤，此时发酵液中有大量泡沫，设置陶瓷膜温度55℃，压力0.2MPa，将发酵液经过陶瓷膜过滤，去除菌体蛋白等杂质，收集滤清液。
(2)离子交换：滤清液经阳离子柱，洗脱(所用洗脱液为0.7wt％氨水)收集后，去除杂质离子NH4+、Ca2+、Mg2+及部分酸性氨基酸，得到L-异亮氨酸高流液；L-异亮氨酸高流液进入阴柱，流量为9m 3/h，除去大部分硫酸根、色素及一部分杂酸，收集离交解吸液(所用洗脱液为4％氢氧化钠)。
(3)活性炭脱色：解吸液中活性炭添加量0.3％，搅拌转速50rpm，50℃维持30min，脱色结束后经板框过滤机过滤，循环打料，澄清后开始收集滤清液，最终滤清液透光率达到90.8％。
(4)浓缩结晶：将滤清液进行浓缩，控制水浴温度60℃，浓缩至L-异亮氨酸浓度达到60％(w/v)停止浓缩；将浓缩液倒入结晶罐中，缓慢开启搅拌，夹套通入冷却水降温，之后加入食品级晶种2％，加水提纯放罐，经液相色谱测得纯度为89.5％，计算最终收率为70.4％。
对比例2L-异亮氨酸的分离纯化方法
(1)发酵液预处理：用1M稀硫酸调整发酵液pH，将pH调至6，发酵液面上方有大量泡沫。
(2)陶瓷膜过滤：设置陶瓷膜温度55℃，压力0.2MPa，将发酵液经过陶瓷膜过滤，去除菌体蛋白等杂质，收集滤清液。
(2)离子交换：滤清液经阳离子柱，洗脱(所用洗脱液为0.7wt％氨水)收集后，去除杂质离子NH4+、Ca2+、Mg2+及部分酸性氨基酸，得到L-异亮氨酸高流液；L-异亮氨酸高流液进入阴柱，流量为9m 3/h，除去大部分硫酸根、色素及一部分杂酸，收集离交解吸液(所用洗脱液为4％氢氧化钠)。
(3)活性炭脱色：解吸液中活性炭添加量0.3％，搅拌转速50rpm，50℃维持30min，脱色结束后经板框过滤机过滤，循环打料，澄清后开始收集滤清液，最终滤清液透光率达到93.7％。
(4)浓缩结晶：将滤清液进行浓缩，控制水浴温度60℃，浓缩至L-异亮氨酸浓度达到60％(w/v)停止浓缩；将浓缩液倒入结晶罐中，缓慢开启搅拌，夹套通入冷却水降温，之后加入食品级晶种2％，加水提纯放罐，经液相色谱测得纯度为92.3％，计算最终收率为71.8％。
各实施例及对比例L-异亮氨酸的收率及纯度见表1：
表1
| 滤清液透光％ | 纯度％ | 收率％ | 产品等级 | |
| 实施例1 | 97.9 | 97.6 | 79.4 | USP32 |
| 实施例2 | 97.2 | 95.7 | 80.5 | USP32 |
| 实施例3 | 97.8 | 98.1 | 83.6 | USP32 |
| 实施例4 | 98.1 | 99.3 | 88.7 | USP32 |
| 实施例5 | 97.8 | 98.9 | 82.5 | USP32 |
| 实施例6 | 97.4 | 98.6 | 81.8 | USP32 |
| 对比例1 | 90.8 | 89.5 | 70.4 | USP32 |
| 对比例2 | 93.7 | 92.3 | 71.8 | USP32 |
从表1可以看出，实施例4最佳，即先用稀盐酸调L-异亮氨酸发酵液pH至6.5，然后加入中性蛋白酶，再用稀盐酸调发酵液pH至5.0，此时发酵液泡沫最少，减少物料损失，并且减少了原工艺中由于使用硫酸调节pH引入的硫酸根。本方法制备得到的L-异亮氨酸纯度达99.3％以上，收率达88.7％以上，优于现有技术。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.L-异亮氨酸的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)发酵液预处理：用稀酸调L-异亮氨酸发酵液pH至6.5，然后加入中性蛋白酶，50-55℃保温1-6h，再用稀酸调发酵液pH至3.0-6.0；
(2)陶瓷膜过滤：将发酵液经过陶瓷膜，收集含有L-异亮氨酸的滤清液；
(3)离子交换：滤清液经阳离子交换树脂柱去除杂质，洗脱收集得到L-异亮氨酸高流液，再进入阴离子交换树脂柱进行除杂，洗脱收集解吸液；
(4)测定解吸液中硫酸根含量；
(5)除去硫酸根：向解吸液中加入与硫酸根等摩尔量的碳酸钙，生成硫酸钙沉淀，离心除去沉淀，收集上清液；
(6)上清液经活性炭脱色，得到L-异亮氨酸溶液；
(7)对L-异亮氨酸溶液进行蒸发浓缩结晶，干燥得到食品级L-异亮氨酸纯品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述稀酸为浓度1M的稀硫酸、稀盐酸或麸酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述中性蛋白酶的添加量为发酵液质量百分数的0.03-0.05％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)设置陶瓷膜温度50-60℃，压力0.1-0.2MPa，得到滤清液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述阳离子交换树脂柱为001×7型强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂柱；
所用洗脱液为0.5-1.0wt％氨水。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述阴离子交换树脂柱为201×7型强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂柱；
所用洗脱液为2-6％氢氧化钠。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)测定硫酸根含量采用硫酸根重量法。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)加入上清液质量百分数0.3-0.5％的活性炭，45-50℃搅拌转速45-50rpm，维持25-30min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(7)蒸发浓缩的温度为55-60℃；和/或
待蒸发至L-异亮氨酸浓度达到60-65w/v％时停止浓缩，将浓缩液倒入容器中加入晶种进行结晶，晶种的添加量为浓缩液质量百分数的1-5％。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，用于制备所述L-异亮氨酸发酵液的菌种为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)或乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)。
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