CN118106042A - 一种磺酸基阳离子交换介质的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种磺酸基阳离子交换介质的制备方法。本发明提供了一种磺酸基阳离子交换介质的制备方法，通过在琼脂糖表面引入一种活化剂，该活性剂的特征为带有烯烃，反应条件更为温和，制备过程简单，介质活化效率高，活化的微球烯丙基密度高的同时使得偶联的磺酸基配体密度同样更高，该交换介质具有较长的间隔臂，易于与生物蛋白结合，进而提高介质的离子交换容量、动态载量，进而表现为对阳离子蛋白质吸附效率高；与此同时本方法制备的阳离子交换介质具有机械强度高的特点，使用时流速压力可达4bar以上，线性流速最高可达1000cm/h。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种磺酸基阳离子交换介质的制备方法。
背景技术
层析技术在生物分离纯化领域十分重要，生物制品分离纯化的需求量大且多样化。生物制品尤其在医疗领域中诊断试剂、药品、疫苗等的应用最多，因此层析介质的结构与性能极大影响的分离纯化的效果。
分离纯化方法通常包括凝胶层析、亲和层析、离子交换层析、疏水层析。离子交换层析是生物大分子分离纯化最常用的方法。琼脂糖作为最主要的天然多糖分离介质之一，具有良好的亲水性和生物相容性，使其在生物医药领域应用极广。其中离子交换层析介质又分为阴离子交换介质和阳离子交换介质。阳离子交换介质常用的载体偶联配基。CN108276526B公开了一种大孔径聚合物阳离子交换层析介质。该阳离子交换层析介质以聚苯乙烯类微球为基质，微球表面接枝乙烯基功能单体，将聚苯乙烯类微球在乙烯基功能单体溶液中进行溶胀处理后加入中加入自由基聚合催化剂配体体系，进行接枝聚合反应，反应完毕后，除去未反应单体，真空干燥，得到阳离子交换层析介质。该发明制备的阳离子交换层析介质均在二甲亚砜类有机溶剂中反应得到，残留溶剂难去除，且制备过程复杂，后处理步骤较多，所以需要一种较绿色经济，操作简单的磺酸基阳离子交换介质及制备方法。
CN116174058A专利公开了一种阳离子交换层析介质及其制备方法，该阳离子交换层析介质以琼脂糖微球为基质，微球表面接枝烯丙基化后，需在引发剂作用下接枝聚合功能性配基。该方法中得到的介质微球烯丙基活化密度较低，且接枝配体需加入引发剂进行自由基反应，制备得到的每毫升阳离子交换介质的蛋白载量较低。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种磺酸基阳离子交换介质的制备方法，通过在琼脂糖表面引入一种活化剂，该活性剂的特征为带有烯烃，反应条件更为温和，制备过程简单，介质活化效率高，活化的微球烯丙基密度高的同时使得偶联的磺酸基配体密度同样更高，该交换介质具有较长的间隔臂，易于与生物蛋白结合，进而提高介质的离子交换容量、动态载量，进而表现为对阳离子蛋白质吸附效率高；与此同时本方法制备的阳离子交换介质具有机械强度高的特点，使用时流速压力可达4bar以上，线性流速最高可达1000cm/h。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
i)烯丙基活化
将一定量的琼脂糖微球分散于去离子水中，加入NaOH溶液、NaBH4和Na2SO4，在35～60℃下充分反应1～2h，加入活化剂，保温反应15～30h后，清洗得到烯丙基活化的琼脂糖微球。
ii)偶联磺酸基
将步骤i中得到的微球分散于去离子水中，加入一定量的偶联剂，室温下用NaOH溶液调pH5.0～7.0，在25～50℃下充分反应18～30h后，取出调pH9.0～11.0，加入一定量NaBH4反应1～2h后，水洗得到偶联磺酸基的琼脂糖微球。
进一步，步骤i中琼脂糖微球可以为琼脂糖微球粒径为45～300μm，优选为琼脂糖微球100～300μm。
进一步，步骤i中琼脂糖微球可以为琼脂糖微球4B、6B、4FF、6FF中的一种，优选为琼脂糖微球6FF。
进一步，步骤i中活化剂可以为3-溴-1-丙烯、羟丙基缩水甘油醚、4-溴-1-丁烯中的一种，优选为羟丙基缩水甘油醚。
进一步，步骤i中活化剂与琼脂糖微球的质量比为1:(1～8)，优选为1:(2～4)。
进一步，步骤i中NaOH溶液的质量浓度为30％～60％，优选为40％～50％。
进一步，步骤i中活化反应温度35～60℃，优选为45～55℃。
进一步，步骤ii中所述偶联剂为焦亚硫酸钠、羟乙基磺酸钠、乙烯基磺酸钠中的一种，优选为焦亚硫酸钠。
进一步，步骤ii中偶联剂与琼脂糖微球的质量比为1:(1～5)，优选为1:(1～2.5)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)在制备过程中在琼脂糖微球表面引入高效活化剂作为间隔臂，在相对温和的反应条件下提高了反应速率，增加了活性位点，从而提高了后续配基接入量和蛋白载量。
(2)在琼脂糖微球活化位点的上偶联磺酸基，该反应简单，经济高效，且工业污染少，制备得到的阳离子交换介质可洗脱再生反复使用。
(3)该制备方法操作简单，反应均可在无机溶液中进行，便于工业放大，制备的层析介质结构稳定，该制备介质操作时压力流速高，操作时流速压力4bar以上，最高时能达到1000cm/h以上，达到商品化使用要求，适合工业化规模生产，应用于生物大分子的分离纯化。。
(4)该方法制备的阳离子交换介质具有较长间隔臂，提高了分离生物大分子时离子交换容量和动态载量，耐压能力好，易于工业规模生产，适用于生物大分子的分离纯化。
附图说明
图1为光学显微镜下磺酸基阳离子介质图片。
图2为实施例1制备的层析介质动态载量测试图谱。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域技术人员在理解本发明的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围内。以下具体实施方式中所采用的原料均购于市场。
除非特殊说明，室温表示为25℃
实施例1
(1)在100mL锥形瓶中加入25g琼脂糖微球6FF(粒径100～300μm)，分散于2mL去离子水中，加入25mL的50％ NaOH溶液，NaBH4 0.07g，2.5g无水Na2SO4，在50℃下搅拌反应2h后，加入12g烯丙基缩水甘油醚，50℃继续搅拌反应24h，用去离子水和适量无水乙醇洗涤微球。经滴定测定烯丙基密度为280μmol/g.wet.gel。
(2)将上述微球重新分散于30mL去离子水中，加入10g焦亚硫酸钠，室温下用NaOH溶液调pH6.5，30℃搅拌反应24h，随后调pH10.0，加入NaBH40.03 g，继续反应1h。水洗后得到磺酸基阳离子交换介质。经测定BSA动态载量为42.3mg/mL。
实施例2
(1)在100mL锥形瓶中加入25g琼脂糖微球6FF(粒径100μm～300μm)，分散于2mL去离子水中，加入25mL的40％ NaOH溶液，NaBH4 0.07g，2.5g无水Na2SO4，在50℃下搅拌反应2h后，加入10g 4-氯-1-丁烯，50℃继续搅拌反应24h，用去离子水和适量无水乙醇洗涤微球。经滴定测定烯丙基密度为168μmol/g.wet.gel。
(2)将上述微球重新分散于30mL去离子水中，加入10g焦亚硫酸钠，室温下用NaOH溶液调pH6.5，30℃搅拌反应24h，随后调pH10.0，加入NaBH40.03 g，继续反应1h。水洗后得到磺酸基阳离子交换介质。经测定BSA动态蛋白载量为30.6mg/mL。
实施例3
1)在100mL锥形瓶中加入25g琼脂糖微球6FF(粒径45～90μm)，分散于2mL去离子水中，加入25mL的50％NaOH溶液，NaBH4 0.07g，2.5g无水Na2SO4，在50℃下搅拌反应2h后，加入6g烯丙基缩水甘油醚，50℃继续搅拌反应24h，用去离子水和适量无水乙醇洗涤微球。经滴定测定烯丙基密度为125μmol/g.wet.gel。
(2)将上述微球重新分散于30mL去离子水中，加入10g焦亚硫酸钠，室温下用NaOH溶液调pH6.0，30℃搅拌反应24h，随后调pH10.0，加入NaBH40.03 g，继续反应1h。水洗后得到磺酸基阳离子交换介质。经测定BSA动态蛋白载量为23.7mg/mL。
实施例4
(1)在100mL锥形瓶中加入25g琼脂糖微球6FF(粒径100μm～300μm)，分散于2mL去离子水中，加入25mL的50％NaOH溶液，NaBH4 0.07g，2.5g无水Na2SO4，在50℃下搅拌反应2h后，加入12g烯丙基缩水甘油醚，50℃继续搅拌反应24h，用去离子水和适量无水乙醇洗涤微球。经滴定测定烯丙基密度为260μmol/g.wet.gel。
(2)将上述微球重新分散于30mL去离子水中，加入8g焦亚硫酸钠，室温下用NaOH溶液调pH6.0，30℃搅拌反应24h，随后调pH10.5，加入NaBH40.03 g，继续反应1h。水洗后得到磺酸基阳离子交换介质。经测定BSA动态蛋白载量为32.6mg/mL。
实施例5
(1)在100mL锥形瓶中加入25g琼脂糖微球6FF(粒径100μm～300μm)，分散于2mL去离子水中，加入25mL的50％NaOH溶液，NaBH4 0.07g，2.5g无水Na2SO4，在50℃下搅拌反应2h后，加入8g烯丙基缩水甘油醚，50℃继续搅拌反应24h，用去离子水和适量无水乙醇洗涤微球。经滴定测定烯丙基密度为220μmol/g.wet.gel。
(2)将上述微球重新分散于30mL去离子水中，加入15g焦亚硫酸钠，室温下用NaOH溶液调pH6.5，30℃搅拌反应24h，随后调pH10.0，加入NaBH40.03 g，继续反应1h。水洗后得到磺酸基阳离子交换介质。经测定BSA动态蛋白载量为38.6mg/mL。
实施例6
1)在100mL锥形瓶中加入25g琼脂糖微球6FF(粒径100μm～300μm)，分散于2mL去离子水中，加入25mL的50％NaOH溶液，NaBH4 0.07g，2.5g无水Na2SO4，在50℃下搅拌反应2h后，加入10g烯丙基缩水甘油醚，50℃继续搅拌反应24h，用去离子水和适量无水乙醇洗涤微球。经滴定测定烯丙基密度为250μmol/g.wet.gel。
(2)将上述微球重新分散于30mL去离子水中，加入10g羟乙基磺酸钠，室温下用NaOH溶液调pH6.4，30℃搅拌反应24h，随后调pH10.2，加入NaBH40.03 g，继续反应1h。水洗后得到磺酸基阳离子交换介质。经测定BSA动态蛋白载量为34.9mg/mL。
对比例1
(1)在100mL锥形瓶中加入25g琼脂糖微球6FF(粒径100μm～300μm)，分散于2mL去离子水中，加入25mL的50％NaOH溶液，NaBH4 0.07g，2.5g无水Na2SO4，在50℃下搅拌反应2h后，加入25g烯丙基缩水甘油醚，50℃继续搅拌反应24h，用去离子水和适量无水乙醇洗涤微球。经滴定测定烯丙基密度为523μmol/g.wet.gel。
(2)将上述微球重新分散于30mL去离子水中，加入15g焦亚硫酸钠，室温下用NaOH溶液调pH6.5，30℃搅拌反应24h，随后调pH10.3，加入NaBH40.03 g，继续反应1h。水洗后得到磺酸基阳离子交换介质。经测定BSA动态蛋白载量为18.0mg/mL。
对比例2
(1)在100mL锥形瓶中加入25g琼脂糖微球6FF(粒径100μm～300μm)，分散于2mL去离子水中，加入25mL的50％w/w NaOH溶液，NaBH4 0.07g，2.5g无水Na2SO4，在50℃下搅拌反应2h后，加入12g烯丙基缩水甘油醚，40℃继续搅拌反应24h，用去离子水和适量无水乙醇洗涤微球。经滴定测定烯丙基密度为113μmol/g.wet.gel。
(2)将上述微球重新分散于30mL去离子水中，加入10g焦亚硫酸钠，室温下用NaOH溶液调pH6.3，30℃搅拌反应24h，取出调pH10.2，加入NaBH40.03 g，继续反应1h。水洗后得到磺酸基阳离子交换介质。经测定BSA动态蛋白载量为20.1mg/mL。
对比例3
(1)在100mL锥形瓶中加入25g琼脂糖微球6FF(粒径100μm～300μm)，分散于2mL去离子水中，加入25mL的40％w/w NaOH溶液，NaBH4 0.07g，2.5g无水Na2SO4，在50℃下搅拌反应2h后，加入3-溴-1-丙烯10g，50℃继续搅拌反应24h，用去离子水和适量无水乙醇洗涤微球。经滴定测定烯丙基密度为153μmol/g.wet.gel。
(2)将上述微球重新分散于30mL去离子水中，加入10g焦亚硫酸钠，室温下用NaOH溶液调pH5.0，30℃搅拌反应18h，取出调pH10.5，加入NaBH40.03 g，继续反应1h。水洗后得到磺酸基阳离子交换介质。经测定BSA动态蛋白载量为24.9mg/mL。
综上所述，本发明同等条件下，实施例1效果最好。从实施例2-3可以看出，加入的活化剂种类和比例对发明效果有较大影响，当加入的活化剂非最优或不足时，烯丙基密度、动态载量效果较低。从实施例4-6可以看出，在烯丙基密度非最优时，偶联剂的加入种类或比例同样对动态载量有较大影响，在烯丙基密度偏低时，提高偶联剂的比例，也可以得到较好的动态载量。对比例1可以看出，与琼脂糖微球比例1:1的活化剂可以增加烯丙基密度，但在步骤(2)接配基反应时却对发明效果影响很大。对比例2、对比例3可以看出NaOH溶液的浓度、反应温度对烯丙基密度、动态载量影响很大。
烯丙基密度测量方法：1.称取0.1g烯丙基活化的样品于250mL碘量瓶中，移液管量取10mLKBrO3～KBr溶液(0.1M)，量取5mL 6mol/L盐酸充分要摇动下加入碘量瓶中，并迅速盖好盖子，用去离子水封口，瓶中溶液变为棕黄色。用没有样品的碘量瓶作为空白。在暗处放置20min；2.分别迅速加入5mL 20％KI溶液，置于暗处5min；3.用0.1M的Na2S2O3标准溶液滴定，自身指示滴定至溶液呈无色透明即可。实验组和对照组消耗的Na2S2O3标准溶液分别记作V1和V0。C烯丙基(mmol/g.wet.gel)计算公式如下：
动态载量测量方法：将制备的介质装入层析柱中(CV＝1mL),连接到蛋白纯化系统中,通入10个柱体积去离子水，待床层平稳后，经缓冲液(20mM PB,pH3.5)平衡系统。配置2mg/mL的BSA溶液，控制0.5mL/min的速度上样。首先，让蛋白流经空柱，在出口处得到蛋白紫外检测信号(100％)；接着经缓冲液(20mM PB,pH3.5)平衡系统，让蛋白流入装有填料的层析柱中，待流穿曲线的紫外检测信号达到10％结束上样，记录出峰体积V1(mL)。用缓冲液(20mM PB,pH3.5)平衡系统，经缓冲液(20mM PB+1.0M NaCl,pH3.5)洗脱。上样10μL 1％丙酮，记录出峰体积V0(mL)。单位蛋白动态载量Q10％(mg/mL)计算公式如下：
。
Claims (10)
1.一种磺酸基阳离子交换介质的制备方法，包括如下步骤：
i)烯丙基活化
将一定量的琼脂糖微球Ⅰ分散于去离子水中，加入NaOH溶液、NaBH4和Na2SO4，在35～60℃下充分反应1～2h，加入活化剂，保温反应15～30h后，清洗后得到烯丙基活化的琼脂糖微球Ⅱ；
ii)偶联磺酸基
将步骤i)中得到的烯丙基活化的琼脂糖微球Ⅱ分散于去离子水中，加入一定量的偶联剂，室温下加入NaOH溶液，pH调至5.0～7.0，在25～50℃下充分反应18～30h，随后调节pH至9.0～11.0，加入一定量NaBH4反应1～2h后，水洗得到偶联磺酸基的琼脂糖微球Ⅲ，即磺酸基阳离子交换介质。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤i)中所述琼脂糖微球Ⅰ为琼脂糖微球4B、6B、4FF、6FF中的一种或多种，所述琼脂糖微球Ⅰ粒径为45～300μm。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤i)中所述琼脂糖微球Ⅰ粒径为100～300μm。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤i)中所述琼脂糖微球Ⅰ为琼脂糖微球6FF。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤i)中所述活化剂为3-溴-1-丙烯、羟丙基缩水甘油醚、4-氯-1-丁烯中的一种，活化剂与琼脂糖微球Ⅰ的质量比为1：(1～8)。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤i)中所述活化剂为羟丙基缩水甘油醚；活化剂与琼脂糖微球Ⅰ的质量比为1：(2～4)。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤i)中NaOH溶液的质量浓度为40～60％。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤i)中NaOH溶液的质量浓度为40％～50％。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤ii)中所述偶联剂为焦亚硫酸钠、羟乙基磺酸钠、羟甲基磺酸钠中的一种；偶联剂与琼脂糖微球Ⅱ的质量比为1：(1～5)。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤ii)中所述偶联剂为焦亚硫酸钠；偶联剂与琼脂糖微球Ⅱ的质量比为1：(1～2.5)。
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| CN202410347730.2A CN118106042A (zh) | 2024-03-25 | 2024-03-25 | 一种磺酸基阳离子交换介质的制备方法 |
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