CN118103492A - 细胞的处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了在维持高活性的情况下对冷冻的高活性NK细胞进行解冻的方法。将满足以下条件的用于悬浮高活性NK细胞的液体用于冷冻的细胞的解冻。提供了用于悬浮对人施用的细胞的液体，其满足以下条件。(1)含有钾离子，(2)pH为6.4以上，(3)不含有135mEq/L以上的浓度的氯离子，(4)不含有0.423mM以上的浓度的钙离子，(5)渗透压为200‑396mOsm。
Description
技术领域
本发明涉及处理高活性NK细胞等用于对人施用的细胞的方法。
背景技术
NK细胞在肿瘤细胞和病毒感染细胞的伤害中是重要的。2017年8月，以幼儿和年轻成人的复发·难治性B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)作为对应症，嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法在美国得到了认可，但近年来，替代CAR-T，CAR-NK的临床应用正在扩大(非专利文献1)。
当要对患者施用细胞时，首先考虑使用从患者自身采集的细胞，以防止引起排斥反应。但是，根据患者的状态，有时难以采集治疗所需量的细胞。另外，对于在体外活化、能够增值的程度来说有个人差异，增值活化存在困难的情况。此外，因为对于细胞的活化·增殖来说需要一定的时间，因此存在不能直接开始治疗的问题。在这点上，希望能预先活化细胞并储存以备施用。
作为储存细胞的方法，短时间储存时，已知不进行冷冻，以悬浮状态储存的方法(例如，专利文件1)，或长时间储存时，已知进行冷冻的储存方法(例如，专利文件2)。作为得到即使进一步冷冻细胞后解冻，也维持高生存率的细胞，研究了使用含有钠盐、钾盐、糖、冻害保护剂、碳酸氢盐和/或碳酸盐的用于冷冻的溶液(专利文献3)。
另外，对于NK细胞这样难以储存的细胞，已知在含有钠盐、钾盐、糖类、以及蛋白质作为活性成分的溶液中储存细胞的储存方法(专利文献4)。进一步，已知冷藏储存用细胞储存液，其含有锂离子和乳酸离子，渗透压为200-350mOsm/kg，pH为6.0-8.0(专利文献5)，该储存液中，糖类的含有量为0.5-150mM，钙离子浓度为1-4mM。进一步，已知细胞·组织储存液，其渗透压为270-450mOsm/kg，pH为7-8，包含K+和有机酸阴离子(专利文献6)。作为有机酸，可以示例乳酸。进一步，已知使用生理水溶液作为NK细胞等的哺乳动物细胞悬浮液，已知可以使用林格氏液(乳酸林格氏液)等的等渗(250-380mOms/l)水溶液作为生理水溶液(专利文献7)。本文的实施例中，使用乳酸林格氏溶液(大塚制药工厂社制[Lactec注射液])(段落0038)，其含有钾和乳酸，pH为6.0-7.5，不含有葡萄糖。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2006-230396号公报
专利文献2：日本特开2002-233356号公报
专利文献3：WO2011/021618
专利文献4：WO2013/115322
专利文献5：专利4947948号公报
专利文献6：WO2002/001952
专利文献7：日本特开2013-233102号公报
专利文献8：WO2021/177279(PCT/JP2021/007863，本申请的优先权日前未公开)
非专利文献
非专利文献1：Liu E,et al.N Engl J Med.2020；382:545-53
发明内容
发明要解决的课题
然而，在以往使用二甲基亚砜这样的保护剂的冷冻方法中，虽可以储存T细胞系和原代NK细胞，但对于细胞毒性高的NK细胞来说是不充足的，经冷冻解冻操作，其活性和生存率都显著降低。这通过程序冷冻仪、细胞密度调整、葡聚糖、白蛋白或羧化聚L-赖氨酸等的添加等是无法解决的。而且，如果以一定量的细胞死亡为前提对施用用细胞进行包装，则解冻后需要进行用于再活化培养的工序，必须对得到的细胞进一步洗净。因此，被冷冻、被贮备的高活性NK细胞存在为处理临床用的细胞需要利用满足一定基准的细胞培养加工设施(CPC)的现状。
一方面，本发明人等对将高活性NK细胞冷冻、解冻的方法进行了研究(专利文献8)。其中，发现即使在解冻的细胞维持高生存率的情况下，也有不维持高细胞毒性的情况。另外，提示关于解冻的细胞，如果维持高细胞毒性，则生存率也有可能高，可知用指定的方法评价的细胞毒性高是对解冻的细胞有用的评价基准。
本发明的课题之一在于提供对具有高活性的细胞有效的解冻方法。更具体地，提供以用指定的方法评价的细胞毒性为60％以上、优选80％以上的方式对冷冻的高活性NK细胞进行解冻的方法。
用于解决课题的手段
本发明人等发现在解冻冷冻的细胞时，用于稀释的液体的组成特别重要。另外，发现像这样用于稀释的液体的组成也可以仅设成被[与药品、医疗器械等的品质、有效性及安全性的确保等相关法律(昭和三十五年法律第一百四十五号)]认可的输液等所使用的成分，并完成了本发明。
本发明提供以下内容。
[1]一种用于悬浮对人施用的细胞的液体，其满足以下条件：
(1)含有钾离子，
(2)pH为6.4以上，
(3)不含有135mEq/L以上的浓度的氯离子，
(4)不含有0.423mM以上的浓度的钙离子，
(5)渗透压为200-396mOsm。
[2]根据1所述的液体，其是用于稀释含有对人施用的细胞的冷冻物或其解冻物的液体。
[3]根据1或2所述的液体，其中，含有4.00mEq/L以上的浓度的钾离子，
不含有钙离子，
pH为7.0-8.3。
[4]一种药物组合物，其含有1-3中任一项所述的液体中悬浮的对人施用的细胞的群体，其中对人施用的细胞为高活性NK细胞。
[5]根据4所述的药物组合物，其中，高活性NK细胞的群体为经过冷冻工序的群体。
[6]根据5所述的药物组合物，其中，冷冻前的高活性NK细胞的群体为使用含有白蛋白、转铁蛋白、胰岛素和IL-2的培养基回收的群体。
[7]一种含有对人施用的细胞的输液用药物组合物的提供方法，其包括以下工序：
(1)将该细胞利用动物细胞培养用培养基洗净的工序；
(2)根据需要，将洗净的该细胞悬浮在冷冻储存液中的工序；
(3)将悬浮在冷冻储存液中的该细胞冷冻而储存(储备)的工序；
(4)将冷冻储存的该细胞解冻的工序；及
(5)将解冻的该细胞悬浮在1-3中任一项所述的液体中，形成输液用药物组合物的工序。
另外，本发明提供以下内容。
[1]一种用于悬浮对人施用的细胞的液体，其满足以下条件：
(1)含有钾离子，
(2)pH为6.4以上，
(3)不含有135mEq/L以上的浓度的氯离子，
(4)不含有5.55mM以上的浓度的葡萄糖，
(5)不含有0.423mM以上的浓度的钙离子，
(6)渗透压为200-396mOsm。
[2]根据1所述的液体，其是用于稀释含有对人施用的细胞的冷冻物或其解冻物的液体。
[3]根据1或2所述的液体，其中，含有4.00mEq/L以上的浓度的钾离子，
不含有钙离子，
不含有葡萄糖，
pH为7.0-8.3。
[4]一种药物组合物，其含有1-3中任一项所述的液体中悬浮的对人施用的细胞的群体，其中对人施用的细胞为高活性NK细胞。
[5]根据4所述的药物组合物，其中，高活性NK细胞的群体为经过冷冻工序的群体。
[6]根据5所述的药物组合物，其中，冷冻前的高活性NK细胞的群体为使用含有白蛋白、转铁蛋白、胰岛素和IL-2的培养基回收的群体。
[7]一种含有对人施用的细胞的输液用药物组合物的提供方法，其包括以下工序：
(1)将该细胞利用动物细胞培养用培养基洗净的工序；
(2)根据需要，将洗净的该细胞悬浮在冷冻储存液中的工序；
(3)将悬浮在冷冻储存液中的该细胞冷冻而储存(储备)的工序；
(4)将冷冻储存的该细胞解冻的工序；及
(5)将解冻的该细胞悬浮在1-3中任一项所述的液体中，形成输液用药物组合物的工序。
附图说明
[图1]将高活性NK细胞冷冻、解冻后的细胞毒性。基于Plasma-Lyte A构成成分的浓度，设定不含有葡萄糖酸钠的组(1)、不含有葡萄糖酸钠且将其他各成分增量16％并调整渗透压的组(2)、不含有葡萄糖酸钠且用NaCl调整渗透压的组(3)、作为阳性对照的Plasma-Lyte A(4)、生理盐水(5)、生理盐水中添加与Plasma-Lyte A同浓度的葡萄糖酸钠的组(6)。解冻稀释后第3小时时，观察到(5)、(6)中活性显著降低。
[图2]将高活性NK细胞冷冻、解冻后的细胞毒性。基于Plasma-Lyte A构成成分的浓度，设定从Plasma-Lyte A中排除Mg2+、K+、CH3COO-(酢酸)的一种成分的组(1)-(3)，生理盐水中增加一种成分的组(4)-(6)，各组均不含有葡萄糖酸钠。解冻稀释后第3小时时，发现排除K+、CH3COONa的组(2)，(3)中活性降低，排除Mg+的组(1)中未发现降低。另外，从(4)-(6)的实验中观察到，仅有K+单独有助于活性。
[图3]将高活性NK细胞冷冻、解冻后的细胞毒性。作为阳性对照配制Plasma-LyteA(1)，作为阴性对照配制生理盐水(2)，基于Plasma-Lyte A构成成分的浓度，以不含有葡萄糖酸钠和氯化镁、对于生理盐水的渗透压比为0.80、0.95、1.0、1.10的方式进行配制(3-6)。另外，设定仅用NaCl将渗透压比调整为1.0的组(7)。对于活性，在(3)-(6)中未观察到影响，但在仅用NaCl将渗透压比调整为1.0的组(7)中观察到降低趋势。
[图4]将高活性NK细胞冷冻、解冻后的细胞毒性。作为阳性对照设定Plasma-LyteA(1)，作为阴性对照设定生理盐水(2)，配制在磷酸缓冲液中补充K+而使K+浓度为5mEq/L的组(3)、THAM点滴静脉注射液(4)、生理盐水/MEYLON/KCl的复合液(6)、水/MEYLON/KCl/NaCl的复合液(7)。另外，以K+浓度为2.5mEq/L的方式配制THAM/MEYLON的复合液(5)、水/CH3COONa/KCl/NaCl的复合液(8)。在(3)中观察到与生理盐水(2)相比活性升高，但无法充分实现活性的维持。另外，对于(5)、(8)也无法充分维持活性。
[图5]将高活性NK细胞冷冻、解冻后的细胞毒性。作为阳性对照设定Plasma-LyteA(1)，作为阴性对照设定生理盐水(2)，配制SOLMALT(7)和作为基于SOLMALT调整pH的组的SOLMALT/MEYLON复合液(3)、SOLMALT/THAM复合液(4)。另外，配制从Plasma-Lyte A中除去葡萄糖酸钠/Mg2+，其他成分与Plasma-Lyte A同浓度的复合液(5)、Plasma-Lyte A中除去葡萄糖酸钠/Mg2+，仅减少NaCl量，渗透压与(5)相同的复合液(6)。另外，增加用THAM调整SOLMALT的pH后加水而降低渗透压的组(8)。在(7)中无法维持活性，但对于(3)、(4)观察到活性改善的趋势。确认到该趋势有再现性，对于用THAM调整SOLMALT的pH后加水而降低渗透压的组(8)，也可以得到同样的结果。另外，从本结果实验性地观察到，pH下降到6.0时，维持活性变得困难，至8.8时可以接受(图5)。
[图6]将高活性NK细胞冷冻、解冻后的细胞毒性。作为阳性对照设定Plasma-LyteA(1)，作为阴性对照设定生理盐水(2)，配制SOLMALT(7)和作为基于SOLMALT调整pH的组的SOLMALT/MEYLON复合液(3)、SOLMALT/THAM复合液(4)。另外，配制从Plasma-Lyte A中除去葡萄糖酸钠/Mg2+，其他成分与Plasma-Lyte A同浓度的复合液(5)、Plasma-Lyte A中除去葡萄糖酸钠/Mg2+，仅减少NaCl量，渗透压与(5)相同的复合液(6)。明确了在替换为RPMI后，可观察到在解冻稀释随后无法观察到的活力(viability)的降低。
[图7-1]将高活性NK细胞冷冻、解冻后的细胞毒性。作为阳性对照设定Plasma-Lyte A(1)，作为阴性对照设定生理盐水(2)，配制作为基于SOLMALT用MEYLON调整pH的组的SOLMALT：MEYLON＝20:1复合液(3)、SOLMALT：MEYLON＝10:1复合液(4)、SOLMALT/MEYLON/水复合液(5)、Klinisalz(6)、作为基于Klinisalz用MEYLON调整pH的组的Klinisalz/MEYLON复合液(7)。另外，配制Plasma-Lyte A+14万IU/mL IMUNACE(8)、Plasma-Lyte A+875μM牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)的混合液(9)。明确了(3)中可以维持活性。并且可知(8)的活性维持能与Plasma-Lyte A(1)同等，IMUNACE的添加至少对以K562为对象的活性没有贡献。低pH的Klinisalz(6)、调整了pH但渗透压高的Klinisalz/MEYLON复合液(7)无法维持活性。
[图7-2]确认到替换为RPMI后的活力低下和活性之间的高相关再现性良好。
[图8]将高活性NK细胞冷冻、解冻后的细胞毒性。配制用MEYLON调整pH为7.6-8.0，K+浓度为5mEq/L的白蛋白/K.C.L./MEYLON的复合液(1)、白蛋白/K.C.L./生理盐水/MEYLON的复合液(2)、进一步作为调整Cl-浓度为80mEq/L的组的白蛋白/K.C.L./生理盐水/AMIZET/水/MEYLON的复合液(3)、K.C.L./生理盐水/AMIZET/水/MEYLON的复合液(4)、作为阳性对照的Plasma-Lyte A(6)。(2)和(4)显示良好的活性维持能，(3)显示显著的好成绩。
[图9]将高活性NK细胞冷冻、解冻后的细胞毒性。配制白蛋白/K.C.L./生理盐水/AMIZET/水/MEYLON的复合液(1)、K.C.L./生理盐水/AMIZET/水/MEYLON的复合液(2)、白蛋白/K.C.L./生理盐水/AMIZET/水/MEYLON的复合液(3)、作为阳性对照的Plasma-Lyte A(5)，将全部的渗透压设成300mOsm。(2)显示良好的活性维持能，(1)和(3)显示显著的好成绩。
[图10]解冻后3小时的对活性有影响的因子的精炼。根据统计分析结果提示，Cl-浓度、pH对于活性维持的影响大，另外，K+中有可能存在阈值。
[图11]对静脉内施用适宜的其他调整液的利用1。上：通过7-AAD染色的活力。下：Plasma-Lyte A(1)、调整液(2)的细胞毒性。以K562细胞作为靶细胞(T)，以混合比(E:T)1:1、2:1共培养2小时的情况。
[图12]对静脉内施用适宜的其他调整液的利用2。上：通过7-AAD染色的活力。下：Plasma-Lyte A(1)、调整液(2)的细胞毒性。以K562细胞作为靶细胞(T)，以混合比(E:T)1:1、2:1、4:1共培养2小时的情况。
[图13]葡萄糖的影响。用在Plasma-Lyte A中添加各浓度葡萄糖的液稀释的情况下的细胞毒性。将GAIA-102(E)与K562细胞(T)以ET比为0.5:1、1:1、或2:1混合，测定细胞毒性。通过使用JMP(注册商标)pro统计分析软件的非线性回归分析，根据以ET比4点(包括0)算出的细胞毒性率，算出E:T＝1:1的计算值。#1：葡萄糖的浓度为0、1、2、4、8、16、26、50g/L，#2：葡萄糖的浓度为0、4、8、16、26、38、50g/L。
具体实施方式
关于本发明，除了特别记载的情况以外，mM以与mmol/L相同的意思来使用。将数值范围表示为x～y时，该范围包括两端的值x和y。
[可以适用的细胞]
本发明可以适用于各种细胞。本发明优选可以适用的细胞之一为对人施用的细胞，优选为经过了通过在体外使用某种细胞因子的活化操作的、对人施用的细胞，这样的细胞包括细胞毒性高的NK细胞(高活性NK细胞)等。关于活化操作，典型地，通过使用含有白细胞介素(IL)-2的培养基孵育细胞。并且，下文中将本发明以适用于NK细胞或高活性NK细胞的情况为例进行说明，但本领域技术人员可以基于该说明，适当理解本发明也可适用于除此以外的细胞。
一般来说，NK细胞是指，不表达T细胞受体(TCR)、作为T细胞通用标记物的CD3、和作为膜免疫球蛋白的B细胞受体的大型的颗粒性淋巴细胞，在人中通常为CD16阳性、且CD56阳性。关于是否为NK细胞，本领域技术人员可以基于细胞表面标记物的表达蛋白等容易判断。NK细胞具有细胞毒性，关于该细胞毒性的有无和程度，可以用已知的各种方法测定。NK细胞可以包含外周血NK细胞、脐带血NK细胞、原代NK细胞、培养NK细胞、高活性NK细胞。
(原材料)
本发明优选可以适用的高活性NK细胞等的原材料可以为外周血、脐带血、骨髓和/或淋巴结、通过单采血液成分法(apheresis)采集的血液(单采成分血)。另外，原材料可以是由选自如下组的至少1种细胞来配制的，上述组由源自干细胞的造血干细胞、源自脐带血的造血干细胞、源自外周血的造血干细胞、源自骨髓的造血干细胞、脐带血单核细胞、外周血单核细胞组成，上述干细胞为选自由胚胎干细胞、成体干细胞及人工诱导多能干(iPS)细胞组成的群的任一种。原材料的供体可为接受通过高活性NK细胞等的免疫治疗的患者本身、该患者的近亲、或与患者无血缘关系的健康者。供体也可以是多个。
(培养基)
用于培养高活性NK细胞等的培养基包括KBM501培养基(kohjin-Bio株式会社。含有IL-2 1,750JRU/mL。)、Cosmedium008(CosmoBio。含有IL-2 1,750JRU/mL。)、FKCM101(Fukoku。不含有IL-2，或含有IL-2 175IU/mL。)、CellGro SCGM培养基(CellGenix，岩井化学药品株式会社)、X-VIVO15培养基(LONZA，TaKaRa Bio株式会社)、Gibco(注册商标)CTS(注册商标)AIM V(注册商标)Medium(Thermo Fisher Scientific。用于T细胞和树突状细胞增殖·操作的已知成分的无血清培养基)、CTS OpTmizer T Cell Expansion BasalMedium(Thermo Fisher Scientific。人T淋巴细胞的生长和增殖用)、IMDM、MEM、DMEM、RPMI-1640等，但并不限于这些。优选例为KBM501培养基、FKCM101或Cosmedium008。并且，关于本发明，除特意说明的情况外，对于细胞的培养是指，为了选自由细胞的生存维持、细胞的增幅、和细胞的活化组成的组的任一种目的，将细胞在培养基或以其为基础的液体中维持一段时间。在特定温度下进行一定时间的处理时，可称为孵育。
培养基中，可以以能达成本发明目的的浓度添加IL-2。IL-2的浓度可为2500IU/mL-2813IU/mL。IL-2优选具有人的氨基酸序列，在安全上，优选用DNA重组技术生产。IL-2的浓度可以以以国内标准单位(JRU)和国际单位(IU)表示。1IU约为0.622JRU，因此现有的培养基的1750JRU/mL约与2813IU/mL相当。
可以与前述IL-2同时或代替IL-2而以能达成本发明目的的浓度添加选自由IL-12、IL-15、和IL-18组成的组的任一种(非专利文献2：Leong JW et al.Biol Blood MarrowTransplant 20(2014)463-473)。各个浓度与其他细胞因子的有无、浓度无关，可为1pg/mL-1μg/mL。IL-2优选具有人的氨基酸序列，在安全上，优选用DNA重组技术生产。
培养基中，可添加受验者的自身血清、从BioWhit taker社和其他可以获得的人AB型血清、和从日本红十字会可以获得的献血人血清白蛋白。自身血清和人AB型血清优选以1-10％浓度添加，献血人血清白蛋白优选以1-10％浓度添加。也可以与血清一起，或代替血清添加人血小板溶解物(Human platelet lysate：HPL)。HPL为市售的，售卖的UItraGROTM系列(AventaCell BioMedical社)等。使用HPL的情况下也可以在培养基中进一步添加肝素钠。
不损害NK细胞培养效果的前提下，培养基中可含有适当的蛋白质、细胞因子、抗体、化合物、其他成分。细胞因子除了是前述的IL-2、IL-12、IL-15、和IL-18以外，还可以是IL-3、IL-7、IL-21、干细胞因子(SCF)、和/或FMS样酪氨酸激酶3配体。这些优选都具有人的氨基酸序列，在安全上，优选用DNA重组技术生产。
培养基优选为无血清培养基。无血清培养基优选含有血清白蛋白、转铁蛋白、和胰岛素。用于培养淋巴细胞的无血清培养基已被开发，市售，本发明中可以利用这些。优选的无血清培养基的一例是在基础培养基中添加作为辅助人T细胞增殖的成分而市售的CTSImmune Cell SR(Thermo Fisher Scientific)的培养基。
以获得作为目的的培养效果为前提，培养基的更换或补充在培养开始后任何时候进行都可，但优选每3-5天进行。
培养时使用的培养容器包括可以商业获得的培养皿、烧瓶、平板、多孔板，但并不限于这些。以不损害NK细胞的培养效果为前提，培养条件没有特别限制，一般为37℃，5％CO2及饱和水蒸气环境下的培养条件。以获得作为目的的培养效果为前提，培养时间没有特别限制。
本发明优选可以适用的高活性NK细胞等中，包括以下的[1]、[2]、[3]和[4]。
[1]具有以下(1)和(2)的特征的NK细胞：
(1)CD16阳性，CD56高表达性，且CD57阴性。
(2)NKG2C阳性，NKG2A阴性-低表达性，和CD94阳性。
[1]的高活性NK细胞也可以为CD16高表达性。另外[1]的高活性NK细胞无论是否是CD16高表达性，也可以进一步具有以下的特征。
(3)将该NK细胞作为效应细胞(E)，将K562细胞作为靶细胞(T)，以混合比(E:T)1:1共培养的情况下，细胞毒性为50％以上。
[1]的高活性NK细胞也可以表示如下：
将如下细胞群体在适当的培养基(例如，添加了5％人AB型血清(经过了钝化处理)的Cosmedium008)中培养14天获得的具有以下(1)和(3)的特征的NK细胞：其中，上述细胞群体从源自健康人的外周血单核细胞中，使用CD3珠(例如，CliniMACS CD3，Miltenyi Biotec公司，产品编号130-017-601)、LD columns(例如，CliniMACS CD3，Miltenyi Biotec公司，产品编号130-042-901)和分离缓冲液(例如，含有0.5％人AB型血清(经过了钝化处理)、2mMEDTA的PBS)除去CD3阳性细胞而得；
(1)CD16阳性，CD56高表达性，且CD57阴性。
(3)将该NK细胞作为效应细胞(E)，将K562细胞作为靶细胞(T)，以混合比(E:T)1:1共培养的情况下，细胞毒性为50％以上。
[1]的高活性NK细胞的详细特征和更具体的制造方法可以参照日本特开2018-193303。
[2]以下的细胞：
CCR5阳性、CCR6阳性和CXCR3阳性且CD3阴性的细胞。
[2]的细胞可以进一步是CD11c高表达性。
[2]的细胞可以表示如下：
为CCR5阳性、CCR6阳性、CXCR3阳性、Integrinα1阳性、Integrinα3阳性和Integrinβ3阴性，且CD3阴性的细胞。或为CCR5阳性、CCR6阳性、CXCR3阳性、CD11a高表达性和CD11c高表达性且CD3阴性的细胞，高表达性是通过与从外周血获得并未进行实际培养的NK细胞的群体中的表达比较来判断的。
根据本发明人等的研究，[2]的细胞对形成肿瘤块的实体癌显示出极高的细胞毒性。[2]的细胞的详细特征和更具体的制造方法可以参照日本特开2019-170176。
[3]可以用以下方法获得的高活性NK细胞：
向从新鲜的外周血或从冷冻单采成分血获得的单核细胞添加·悬浮CD3珠(例如，CliniMACS CD3，Miltenyi Biotec公司，130-017-601(每1×107细胞为5μL))，在使用冷冻单采成分血的情况下进一步添加·悬浮CD34珠(例如，CliniMACS CD34，Miltenyi Biotec公司，130-017-501(每1×107细胞为2.5μL))，在4℃，孵育15分钟后添加分离缓冲液(例如，含有0.5％人AB型血清(在56℃下经过了30分钟的钝化处理)、2mM EDTA的PBS)充分悬浮，离心。去除上清液，以LD columns(例如，Miltenyi Biotec公司，130-042-901)的每1columns的细胞数最大成为1×108的方式，悬浮在0.5mL的分离缓冲液中。再次添加2mL分离缓冲液后，LD columns中添加细胞悬浮液，回收从LD columns的溶出液。进一步向LD columns中添加1mL分离缓冲液，回收溶出液。对回收的液体进行离心，去除上清液后，在使用外周血的情况下，以成为5×108细胞/mL的方式，在使用冷冻单采成分血的情况下，以成为1×106细胞/mL的方式，在适当的培养基(例如，包含5％人AB型血清(在56℃下经过了30分钟的钝化处理)或在5％UltraGRO(AventaCell，HPCPLCRL10)中添加2U/mL的肝素钠的那种中的任一者的KBM501培养基)中悬浮细胞，适当更换培养基，并培养至第14天。
[3]的高活性NK细胞的具体的制造方法可以参照本说明书的实施例的项目。
[4]通过如下方式得到的细胞，即，获得[1]-[3]的细胞时，与IL-2同时或代替IL-2，以能达成本发明目的的浓度添加选自由IL-12、IL-15、和IL-18组成的组的任一种，进行培养。这样的细胞的具体的制造方法，可以参照前述非专利文献2。
并且，在下文中，对于本发明，以使用高活性NK细胞的情况为例进行说明，但本领域技术人员基于该说明，可以理解本发明也可适用于其他使用经过了在体外用某种细胞因子的活化操作的细胞的情况。
(细胞毒性)
关于本发明，除特意说明的情况外，高活性NK细胞等的活性或细胞毒性是指，对象细胞(效应细胞，E)对于靶细胞(T)的溶解能。细胞毒性可以用由效应细胞导致死亡的靶细胞的百分率(％)表示，通过以下公式计算。
(与效应细胞共培养的情况下的细胞死亡数-自然细胞死亡数(阴性对照))/(最大细胞死亡数(阳性对照)-自然细胞死亡数(阴性对照))×100
测定细胞毒性时，一般根据效应细胞的细胞毒性的程度等，可以使效应细胞和靶细胞的混合比(E:T)、效应细胞和靶细胞共培养的时间基于所用细胞种类和活性度强度合适。将NK细胞作为效应细胞时，靶细胞可为K562细胞、急性骨髓性白血病细胞、慢性骨髓性白血病细胞，但并不限于这些。效应细胞和靶细胞，活细胞和死细胞可以通过用放射性物质、荧光色素等标记过的抗体等试剂来区分，或定量。将NK细胞作为效应细胞时的细胞毒性可以在如下条件下测定，即，例如将K562细胞作为靶细胞，E:T＝1:0.05-10，优选为1:0.1-5，孵育时间为0.5-18小时，优选为1-12小时。
关于本发明，除特意说明的情况外，NK细胞等的活性高是指，将K562细胞作为靶细胞，以E:T＝2:1混合，共培养1-3小时，更具体为2小时的情况下的细胞毒性为50％以上。活性优选为60％以上，更优选为70％以上。
[回收]
本发明中，在后述的冷冻工序之前，将应该冷冻的高活性NK细胞等从培养系回收。回收可以通过进行离心分离使培养基和细胞分离来进行。根据需要，可以在培养系中添加适当的浓度的EDTA，使粘附的细胞从培养容器表面剥离。另外，可以将回收培养基后的培养容器表面用适当的溶液洗净，获得残留的细胞。根据需要，将获得的细胞用适当的溶液洗净，在适当的溶液中悬浮。
回收工序中，为剥离和洗净细胞，可以用培养基、等渗液、缓冲液等溶液。作为可以使用的培养基的例子，可举出KBM501培养基、Cosmedium008、FKCM101、CellGro SCGM培养基、X-VIVO15培养基、Gibco(注册商标)CTS(注册商标)AIM V(注册商标)Medium、CTSOpTmizer T Cell Expansion Basal Medium、IMDM、MEM、DMEM、RPMI-1640。等渗液是指，可以具有与体液(血浆)的渗透压(285±5mOsm/L)几乎相等的渗透压的液体，本发明中是指渗透压为285±13mOsm/L的液体。例如，Plasma-Lyte A的渗透压为294mOsm/L、PBS(-)的渗透压为280±4mOsm/L(冰点降低法)。作为可以使用的等渗液的例子，可举出Plasma-Lyte A(Baxter)、生理盐水、林格氏液(乳酸林格氏液、醋酸林格氏液、重碳酸林格氏液等)、5％葡萄糖水溶液。作为可以使用的缓冲液的例子，可举出磷酸缓冲生理盐水(Phosphate-buffered saline：PBS)、Tris盐酸缓冲液、Tris醋酸缓冲液、HEPES缓冲液。
回收工序中所用的溶液优选例之一为培养基，更优选为人淋巴细胞培养用培养基。人淋巴细胞培养用培养基可以含有人血清白蛋白、人转铁蛋白、重组型人胰岛素、和重组型人IL-2。这样的培养基优选例为KBM501培养基、FKCM101或Cosmedium008。KBM501培养基含有人血清白蛋白、人转铁蛋白、重组型人胰岛素、重组型人IL-2，不含有除此之外的蛋白质。另外，KBM501培养基含有抗生素(卡那霉素)、NaHCO3、L-Glutamine、pH调节剂。
回收工序中，如果使用PBS(-)，则解冻时的细胞的生存率降低，有时不优异。典型地，PBS(-)含有氯化钠136.9mM、绿化钾2.68mM、磷酸氢二钠8.1mM、磷酸氢钾1.47mM。
[预处理]
本发明中，在后述的冷冻工序之前，可以将应该冷冻的高活性NK细胞等预处理。预处理是指，将回收的细胞在含有添加剂的溶液中悬浮。预处理包括在含有添加剂的溶液中回收。
作为预处理所用的添加剂，可以使用选自由胆汁酸和苯基丁酸组成的组的任一种。胆汁酸的例子为牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、熊去氧胆酸(UDCA)、鹅去氧胆酸、胆酸、猪去氧胆酸、脱氧胆酸、7-氧代石胆酸(7-oxolithocholic acid)、石胆酸、碘去氧胆酸(Iododeoxycholic acid)、碘胆酸(Iocholic acid)、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺去氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸或其类似物、衍生物。苯基丁酸的例子为4-苯基丁酸(4-PBA)、甘油基(tri-4-PBA)、苯乙酸、2-POAA-OMe、2-POAA-NO2、2-NOAA或其药学上允许的盐，类似物、衍生物或前体药物。预处理所用的添加剂的特别优选例为选自由TUDCA和4-PBA组成的组的任一种。
作为用于预处理的添加剂使用胆汁酸的情况下，浓度适宜即可，但优选为100-5000μM，更优选为200-2500μM，进一步优选为400-1000μM。这样的范围在使用TUDCA的情况下特别适合。作为用于预处理的添加剂使用苯基丁酸的情况下，浓度适宜即可，但优选为1-1000μM，更优选为5-500μM，进一步优选为10-100μM。这样的范围在使用4-PBA的情况下特别适合。
用于预处理的添加剂的其他例子为二甲基亚砜(DMSO)。浓度适宜即可，但优选为0.5-15％，更优选为1-12.5％，进一步优选为2-10％。
用于预处理的溶液与回收时所用的溶液同样地，可以是培养基、等渗液、缓冲液等溶液。预处理中所用的溶液的优选例之一为培养基，更优选为人淋巴细胞培养用培养基，进一步优选为KBM501培养基、FKCM101或Cosmedium008。预处理所用的培养基另外可以含有血清白蛋白、人转铁蛋白、重组型人胰岛素、和重组型人IL-2，也可以含有抗生素(卡那霉素)、NaHCO3、L-Glutamine、pH调节剂。
用于预处理的时间没有特别限制。为了预处理，可以将细胞悬浮后数分钟-数小时、例如5分钟-4小时、更优选30分钟-3小时，静置悬浮液。静置可以在环境温度(例如1-30℃，典型的为15-25℃)下进行，可以在CO2培养箱中(例如36-42℃，典型的为37℃)下进行。
预处理时的细胞密度能适宜设定，可以设成适合细胞的维持的细胞密度。具体为1×105-1×107细胞/mL，优选为2×105-5×106细胞/mL，更优选为5×105-2×106细胞/mL。
特别优选的方式中，预处理为，在添加了400-1000μM的TUDCA或10-100μM的4-PBA的KBM501培养基、FKCM101或Cosmedium008中，以细胞密度成为5×105-2×106细胞/mL的方式进行悬浮。此时，可以在37℃、5％CO2下孵育30分钟-3小时。
本发明中预处理虽不是必须的，但通过在冷冻前对高活性NK细胞等用添加了4-PBA或TUDCA的KBM501培养基进行预处理，相比于不进行预处理的情况，可以改善解冻细胞时的生存率(也可以称为回收率)。
[冷冻]
本发明中，被回收、优选经过预处理的细胞通过通常的程序被冷冻。具体地，根据需要确认细胞数和生存率，进行离心分离，去除上清液后，以成为适当的细胞密度的方式在冷冻储存液中悬浮细胞。将细胞悬浮液分注到冷冻储存用的容器中后，在-80℃的冷冻库中冷冻并储存。根据需要，在液氮罐中冷冻储存。
本发明中能用的冷冻储存液可以含有钠盐、钾盐、糖类、碳酸氢盐、碳酸盐、和冻害保护剂。
可以使用的钠盐只要在溶媒中溶解时产生钠离子，则没有特别限制，可以为含氧酸盐、卤化物、氧化物、氢氧化物、无机盐或有机酸盐等。钠盐可以是1种或多种的组合。本发明中，氯化钠作为1种，氯化钠和柠檬酸钠作为多种被适当使用。钠盐含有量虽没有特别限制，但冷冻储存液中含有的全部钠离子的最终浓度优选为0.01-5000mM，更优选为0.1-1000mM，进一步优选为1-300mM。
可以使用的钾盐只要在溶媒中溶解时产生钾离子则没有特别限制，可以为含氧酸盐、卤化物、氧化物、氢氧化物、无机盐或有机酸盐等。钾盐可以是1种或多种的组合。本发明中，氯化钾被适当使用。钾盐含有量虽没有特别限制，但冷冻储存液中含有的全部钾离子的最终浓度优选为0.01-5000mM，更优选为0.1-1000mM，进一步优选为1-100mM。
可以使用的碳酸氢盐只要在溶媒中溶解时产生碳酸氢根离子则没有特别限制，可以用与各种阳离子的盐。例如，可以列举碳酸氢铵、碳酸氢钾、碳酸氢钙、碳酸氢钠和碳酸氢镁等。可以使用的碳酸盐只要在溶媒中溶解时产生碳酸根离子则没有特别限制，可以用与各种阳离子的盐。例如，可以列举碳酸铵、碳酸钾、碳酸钙、碳酸钠、碳酸钡和碳酸镁等。这些碳酸氢盐和/或碳酸盐可以是1种或多种的组合。本发明中，碳酸氢钠被适当使用。碳酸氢盐和/或碳酸盐的含有量虽没有特别限制，但冷冻储存液中含有的碳酸氢根离子和碳酸根离子的总和的最终浓度优选为0.01-1000mM，更优选为0.1-500mM，进一步优选为1-100mM。
冷冻储存液中钠离子和钾离子的浓度比(钠离子/钾离子)，优选为1/1000-1000/1，更优选为1/100-100/1，进一步优选为1/10-100/1，进一步优选为1/1-100/1，进一步优选为10/1-50/1。
可以使用的糖类为单糖、寡糖或糖醇，例如，作为单糖，可列举葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖，作为寡糖，可列举海藻糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖，作为糖醇，可列举木糖醇、山梨醇等。这些糖类可以是1种或多种的组合，本发明中优选为选自由葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖组成的组中的至少一种糖类，更优选为葡萄糖。糖类的含有量在冷冻储存液中，优选为0.01-100g/L，更优选为0.1-100g/L，进一步优选为0.25-50g/L。
作为可以使用的冻害保护剂的例子，可以列举二甲基亚砜(DMSO)、羟乙基淀粉(HES)、乙二醇、甘油等。冻害保护剂可以是1种或多种的组合。本发明中，选自由DMSO和羟乙基淀粉组成的组的任一种被适当使用。在作为冻害保护剂并用DMSO和羟乙基淀粉的情况下，总含有量优选包括在前述范围之内，且对于各自的浓度，DMSO浓度优选为0.01-50％，更优选为1-30％，进一步优选为2-15％，羟乙基淀粉浓度优选为0.01-50％，更优选为1-30％，进一步优选为2-15％。
本发明的适宜的方式中，前述的本发明的细胞的冷冻储存方法中使用的溶液的必要成分外，还可以进一步含有选自由蛋白质、镁盐和钙盐组成的组的成分。可以使用的蛋白质，具体地，可列举血清白蛋白、血清球蛋白等。另外，作为血清白蛋白，可列举人血清白蛋白、或牛血清白蛋白。本发明中，人血清白蛋白被适当使用。蛋白质的含有量在冷冻储存液中，优选为0.01-50％，更优选为1-30％，进一步优选为2-15％。可以使用的镁盐只要在溶媒中溶解时产生镁离子则没有特别限制，可以为含氧酸盐、卤化物、氧化物、氢氧化物、无机盐或有机酸盐等。镁盐可以是1种或多种的组合。本发明中，氯化镁被适当使用。镁盐含有量虽没有特别限制，但冷冻储存液中含有的全部镁离子的最终浓度优选为0.01-10mM，更优选为0.1-5mM。可以使用的钙盐只要在溶媒中溶解时产生钙离子则没有特别限制，可以为含氧酸盐、卤化物、氧化物、氢氧化物、无机盐或有机酸盐等。钙盐可以是1种或多种的组合。本发明中，氯化钙被适当使用。钙盐含有量虽没有特别限制，但冷冻储存液中含有的全部钙离子的最终浓度优选为0.01-10mM，更优选为0.1-5mM。另外，冷冻储存液中，除前述的成分以外，也可以进一步含有对细胞没有伤害性的物质，例如，维生素类、氨基酸类等。另外，从发挥pH调节和缓冲作用的观点出发，冷冻储存液除前述的成分以外，还可以含有磷酸根离子。
冷冻储存液的渗透压期望在冷冻时不会对细胞损伤的范围，从提高冷冻时成分向细胞的渗透性，和阻碍冰晶形成的观点出发，例如为500-8000mOsm/L，可以为1000-7500mOsm/L、1500-7000mOsm/L、1800-5000mOsm/L。冷冻储存液的pH期望在不会对细胞损伤的范围，例如为3.0-10.0，更优选为4.5-9.0。
本发明中，也可以使用市售的冷冻储存液。作为可以使用的制品的例子，可列举细胞·组织用冷冻储存液细胞库系列(STEM-CELLBANKE(注册商标))，更具体地，列举STEM-CELLBANKE(ZENOAQ、CB045)。
冷冻时的细胞优选处于对数生长阶段。
冷冻时的细胞密度能适宜设定，具体为1×106-2×108细胞/mL，优选为2×106-1×108细胞/mL，更优选为1×107-5×107细胞/mL。一个优选方式中，细胞在5mL容量的容器中以4×107细胞/mL被储存。高活性NK细胞的冷冻运输时可以高密度冷冻，这使产品更为紧凑，有助于降低运输成本。
[解冻·融解·稀释]
本发明中，冷冻储存的细胞可以按照各种程序解冻。例如，可以将放入细胞的冷冻储存用的容器在37℃的温浴等中根据需要震动并快速解冻。或可以从冷冻库中取出后不主动升温，放在室温下自然解冻。解冻时或解冻后的细胞冷冻物可以用适当的液体稀释。
(用于稀释的液体)
本发明提供用于悬浮对人施用的细胞的液体，更具体地，提供用于稀释细胞冷冻物的液体，其满足以下条件：
(1)含有钾离子，
(2)pH为6.4以上，
(3)不含有135mEq/L以上的浓度的氯离子(也就是说，氯离子的浓度低于135mEq/L，或不含有氯离子)，
(4)不含有5.55mM以上的浓度的葡萄糖(也就是说，葡萄糖的浓度低于5.55mM，或不含有葡萄糖)，
(5)不含有0.423mM以上的浓度的钙离子(也就是说，钙离子的浓度为0.423mM以下，或不含有钙离子)，
(6)渗透压为200-396mOsm。
并且，关于本发明，除特意说明的情况外，液体中不含有某种成分是指，用通常的检测方法检测不到的情况。
稀释液的钾离子浓度优选为0.50-8.0mM，更优选为1.0-7.0mM，进一步优选为2.5-6.0mM。或者，作为氯化钾优选含有0.496-5.96mM。
一个优选方式中，稀释液的钾离子的浓度为4.00mEq/L以上。上限值没有特别限制，例如为18.0mEq/L以下，优选为15.0mEq/L以下，更优选为10.0mEq/L以下，进一步优选为7.50mEq/L以下。
另一个优选方式中，与其他成分的有无、浓度无关，稀释液中不含有钙离子。另外，另一个优选方式中，与其他成分的有无、浓度无关，稀释液中不含有葡萄糖。进而，另一个优选方式中，稀释液的pH为7.0-8.3，优选为7.2-8.1，进一步优选为7.3-7.9。
稀释液中所含的离子可以源自能用作药物的盐。这样的盐可以是碳酸盐、碳酸氢盐、含氧酸盐、卤化物、氧化物、氢氧化物、无机盐或有机酸盐等。盐可以是1种或多种的组合。
稀释液可以含有钠盐、葡萄糖酸和醋酸盐。还可以进一步含有镁盐。稀释液的钠离子的浓度优选为14.0-200mM，更优选为28.0-182mM，进一步优选为70.0-168mM。或者，作为氯化钠，优选含有0.496-5.96mM，作为葡萄糖酸钠，优选含有2.30-27.7mM，作为醋酸钠，优选含有2.70-32.5mM。稀释液的葡萄糖酸根离子的浓度优选为2.3-32.3mM，更优选为4.6-29.9mM，进一步优选为12.4-27.7mM。稀释液的醋酸根离子的浓度优选为2.7-37.8mM，更优选为5.4-35.1mM，进一步优选为13.5-32.5mM。
稀释液可以用被认可的药物来构成。这样的药物的例子如下所示。
通用名：AMIZET
商品名：AMIZET B输液
药效分类名：综合氨基酸制剂
组成(1袋200mL中)
有效成分L-异亮氨酸1,700mg、L-亮氨酸2,700mg、苹果酸赖氨酸(lysinemalate)、(作为L-赖氨酸)2,432mg、(1,600mg)、L-蛋氨酸780mg、L-苯丙氨酸1,540mg、L-苏氨酸960mg、L-色氨酸320mg、L-缬氨酸1,800mg、苹果酸半胱氨酸(cysteine malate)、(L-半胱氨酸)310mg、(200mg)、L-酪氨酸100mg、L-精氨酸2,200mg、L-组氨酸940mg、L-丙氨酸1,720mg、L-天冬氨酸100mg、L-谷氨酸100mg、甘氨酸1,100mg、L-脯氨酸1,280mg、L-丝氨酸840mg
添加物琥珀酸(pH调节剂)适量
电解质不含有Na+，Cl-
通用名：MEYLON
商品名：MEYLON静脉注射液8.4％
一般名：碳酸氢钠
组成(20mL中)
碳酸氢钠1.68g(8.4％)
电解质浓度Na+1000mEq/L、HCO3-1000mEq/L
通用名：K.C.L.
商品名：K.C.L.点滴液15％
一般名：氯化钾
制剂名氯化钾制剂
组成
成分氯化钾3g(15w/v％，2mol液体)[钾(K)含量：40mEq(1573.36mg)]
添加物核黄素磷酸酯钠含有6mg
通用名：献血白蛋白
商品名：献血白蛋白25％静脉注射液12.5g/50mL
药效分类名：血浆分级制剂(人血清白蛋白制剂)
组成(50mL中)
有效成分人血清白蛋白12.5g
添加物乙酰色氨酸250.97mg、氢氧化钠43.44mg、辛酸钠169.75mgpH 6.4-7.4，渗透压比(与生理盐水相比)0.5-1.0
(优选方式)
稀释液的特别优选方式之一为以下所示：
pH＝7.2
其他优选组成为以下所示。
pH＝7.2
其他优选组成为以下所示。
pH＝7.2
与用于冷冻储存的液体一同悬浮在用于稀释的液体中的细胞，可以直接施用。从用于施用的观点出发，优选用于冷冻储存的液体和用于稀释的液体混合后的混合液变为等渗(具有与体液基本相等的渗透压，具体为285±13mOsm/L)。优选方式中，由于用于冷冻储存的液体为高渗液(例如，1500-7000mOsm/L)，用于稀释的液体可以为低渗透压的液体。本领域技术人员可以考虑通过用于稀释的液体对用于冷冻储存的液体的稀释倍率，适当确定用于稀释的液体的成分浓度。
即使是任一组成，用于稀释的液体优选不含有40％以上浓度的血清，更优选完全不含有血清。因为含有血清时，会有细胞的生存率降低的情况。
在用于稀释的液体中悬浮时的细胞密度可以适宜设定，可以设为适合细胞维持的细胞密度，或适合施用的细胞密度。具体为1×105-1×107细胞/mL，优选为2×105-5×106细胞/mL，更优选为5×105-2×106细胞/mL。
用于稀释的液体中，细胞可以相对长时间维持。可以在用于稀释的液体中悬浮细胞后数分钟-数小时、例如5分钟-6小时，更优选为30分钟-4小时，将悬浮液静置。静置可以在环境温度(例如1-30℃，典型的为15-25℃)下进行，可以在CO2培养箱中(例如36-42℃，典型的为37℃)进行。
[药物组合物方面的应用]
本发明提供一种药物组合物，其包含以适当的方法回收，根据需要预处理，冷冻储存的高活性NK细胞等。
本发明提供的药物组合物可以适用于对高活性NK细胞等具有敏感性的各种疾病的治疗和/或预防。这样的疾病的例子为癌或感染症，具体地，包括皮肤癌、口腔癌、胆囊癌、胆管癌、肺癌、肝癌、胃癌、大肠癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、神经母细胞瘤、白血病，和由病毒、细菌等引起的感染症，但并不限于这些。并且，本发明人等使用本申请的方法冷冻·解冻的细胞，确认到对于在无治疗下30天内死亡的大肠癌模型动物的效果。
通过本发明的药物组合物的细胞疗法可以单独实施，或与手术疗法、化疗、放疗、抗体药物等组合实施。
通过本发明提供的药物组合物的一个方式的优势如下所示。
(剂型)
注射剂(细胞悬浮液)
(成分·含量)
构成细胞：高活性NK细胞等
含量：6×106个-4.8×109细胞/60kg
(副成分)
复合电解质液10-45％
氯化钠液10-45％
20-30％人血清白蛋白液5-30％
二甲基亚砜2-15％
其他
或
作为药物添加剂可接受的冷冻储存液100％
(配制方法)
将冷冻的组合物在37℃恒温水槽等中解冻，直至完全解冻为止。解冻后迅速在无菌性地另外准备好的作为药物添加剂可接受的等渗液中悬浮。
(解冻后的稳定性)
关于解冻后的有效时间，在室温储存时为6小时，优选为4小时。
实施例
1.实施例之间共通的方法
A).高活性NK细胞GAIA-102的培养方法
以冷冻单采成分血(HemaCare/Cellero)为原料，解冻后用Lovo Cell ProcessingSystem(FRESENIUS KABI)进行洗净和浓缩，获得PBMCs。
使用CliniMACS Prodigy(注册商标)(Miltenyi Biotec)，从获得的PBMCs中去除CD3阳性细胞和CD34阳性细胞，用KBM501培养基※1溶出。计数溶出液中的细胞数，计算出总细胞数。培养通过以下方式进行，即，使用粘附培养用袋640cm2，将以成为5×105细胞/mL的方式用KBM501培养基配制的细胞悬浮液在每1袋接种200mL，在CO2培养箱(37℃，5％CO2)中进行培养。培养第9天，以最终液量每1袋成为650mL的方式，追加KBM501培养基，培养至第14天。
※1：添加5％ UltraGRO(AventaCell、HPCPLCRL10)和2U/mL肝素钠(NIPRO)的KBM501(KOHJIN-BIO)
B).高活性NK细胞GAIA-102的回收方法
培养第14天时回收培养液，进一步在培养袋中添加1mM EDTA，剥离粘附的细胞，将包含剥离细胞的所有的细胞回收液离心后，用KBM501培养基洗净，再次悬浮。
C).高活性NK细胞GAIA-102的冷冻方法
将按照高活性NK细胞的培养方法、回收方法记载的程序获得的GAIA-102的活细胞数计数，将2×108细胞悬浮在5mL的HSC-BANKER(ZENOAQ，CB071)中，在-80℃下冷冻。
D).通过7-AAD染色的活力测定方法
将在各条件下解冻的GAIA-102在96孔板(IWAKI，4870-800SP)中以1×105细胞/孔配制并离心分离，去除上清液后，添加用PBS稀释的7-AAD溶液(Beckman Coulter,A07704)，悬浮，室温下孵育20分钟。将染色后的细胞用流式细胞仪(BD LSR Fortessa，BDBiosciences公司)进行测定，用FlowJo软件分析，由7-AAD阳性率算出活力。
E).对于肿瘤细胞的毒性测定方法
细胞毒性的测定中，准备使解冻的GAIA-102与K56细胞反应的组、作为阴性对照仅有K562细胞的组、作为阳性对照用10％福尔马林处理K562细胞的组。
《GAIA-102》
将在各条件下解冻、稀释的GAIA-102根据冷冻时的活细胞数分取必要量后，用10％FBS/RPMI1640配制为1×106细胞/ml的浓度。
《K562》
将K562细胞在无血清RPMI1640培养基中悬浮，用PKH26 Red Fluorescent CellLinker Kit染色后，用10％FBS/RPMI1640配制为1×106细胞/ml的浓度。
将GAIA-102与K56细胞以细胞比2:1添加到96孔板(IWAKI，4870-800SP)，混合，在37℃、5％ CO2下反应2小时。反应后，离心分离(500×g，5分钟)，去除上清液后，添加用PBS稀释的7-AAD溶液，悬浮，室温下孵育20分钟。用流式细胞仪进行测定，用FlowJo软件分析，算出细胞毒性率(％Lysis)※2。
※2：细胞毒性率＝(K562细胞死细胞率-阴性对照死细胞率)/(阳性对照死细胞率-阴性对照死细胞率)×100
对于使用的试剂、点滴剂
解冻的溶媒验证中，使用了以下的试剂·点滴剂。
氯化钠(nacalai tesque)
氯化钾(nacalai tesque)
氯化镁六水合物(nacalai tesque)
醋酸钠三水合物(nacalai tesque)
葡萄糖酸钠(nacalai tesque)
TUDCA(东京化成工业株式会社)
水(nacalai tesque)
Plasma-Lyte A(Baxter)
生理盐水大塚生理盐水注射液(大塚制药株式会社)
D-PBS(nacalai tesque)
SOLMALT输液(Terumo株式会社)
THAM点滴静脉注射套装(大塚制药株式会社)
MEYLON静脉注射液8.4％(大塚制药株式会社)
Klinisalz输液(共和Criticare株式会社)
IMUNACE注射液35(共和药品株式会社)
献血白蛋白25％静脉注射液(日本制药株式会社)
K.C.L.点滴液15％(丸石制药株式会社)
AMIZET B输液(Terumo株式会社)
2.各实施例的方法
2-1)Plasma-Lyte A成分验证
将冷冻48小时以上的GAIA-102在37℃水浴中解冻后，室温下静置3.5小时。解冻开始30分钟和3小时后，进行通过7-AAD染色的活力测定、细胞毒性测定。
解冻后，用下表所示的溶液1-6稀释41倍。基于Plasma-Lyte A构成成分的浓度，设定不含有葡萄糖酸钠的组(1)、不含有葡萄糖酸钠且将其他各成分增量16％并调整渗透压的组(2)、不含有葡萄糖酸钠且用NaCl调整渗透压的组(3)、作为阳性对照的Plasma-Lyte A(4)、生理盐水(5)、生理盐水中添加与Plasma-Lyte A同浓度的葡萄糖酸钠的组(6)。并且，除特意说明的情况外，渗透压全部是通过计算求得的。
[表1]
*括号内为制剂中的含有量
结果：
在任一组中均未观察到解冻后活力降低，但在生理盐水(5)、生理盐水中添加与Plasma-Lyte A同浓度的葡萄糖酸钠的组(6)中观察到显著的活性降低(图1)。该现象是解冻稀释后第3小时时观察到的，解冻随后未观察到。明确了仅用NaCl和葡萄糖酸Na无法保持解冻稀释后的活性。
2-2)Plasma-Lyte A必要成分的特定
对葡萄糖酸Na以外的成分进行验证。将冷冻48小时以上的GAIA-102在37℃水浴中解冻后，室温下静置3.5小时。解冻开始30分钟和3.5小时后，进行通过7-AAD染色的活力测定、细胞毒性测定。
解冻后，用下表所示的溶液稀释41倍。所有组均不含葡萄糖酸钠，基于Plasma-Lyte A构成成分的浓度，设定从Plasma-Lyte A中排除Mg2+、K+、CH3COO-(酢酸)的一种成分的组(1)-(3)，生理盐水中增加一种成分的组(4)-(6)。
[表2]
结果：
对于活力，仅在去除K+的组(2)中，在解冻稀释后第3小时时观察到略有降低。另一方面，对于活性，在去除K+和CH3COO-的组(2)，(3)中观察到降低，在去除Mg+的组(1)中未观察到降低。另外，根据生理盐水中增加一种成分的组(4)-(6)的实验，发现了仅有K+单独有助于活性(图2)。
2-3)K+和CH3COO-的最适浓度范围的探索
将冷冻48小时以上的GAIA-102在37℃水浴中解冻后，室温下静置3.5小时。解冻开始30分钟和3小时后，进行通过7-AAD染色的活力测定、细胞毒性测定。
解冻后，用下表所示的溶液稀释41倍。作为阳性对照配制Plasma-Lyte A(1)，作为阴性对照配制生理盐水(2)，基于Plasma-Lyte A构成成分的浓度，以不含有葡萄糖酸钠和氯化镁、对于生理盐水的渗透压比为0.80、0.95、1.0、1.10的方式进行配制(3-6)。另外，设定仅用NaCl将渗透压比调整为1.0的组(7)。
[表3]
结果：
关于各个浓度下的活力，在解冻稀释后3.5小时内未观察到降低。对于活性，在(3)-(6)中也未观察到影响，但在仅用NaCl将渗透压比调整为1.0的组(7)中观察到降低趋势。
2-4)CH3COONa/KCl～成品的替代可能性的验证1
将冷冻48小时以上的GAIA-102在37℃水浴中解冻后，室温下静置3小时。解冻开始3小时后进行细胞毒性测定。
解冻后，用下表所示的溶液稀释41倍。作为阳性对照设定Plasma-Lyte A(1)，作为阴性对照设定生理盐水(2)，配制在磷酸缓冲液中补充K+，而使K+浓度为5mEq/L的组(3)、THAM点滴静脉注射液(4)、生理盐水/MEYLON/KCl的复合液(6)、水/MEYLON/KCl/NaCl的复合液(7)。另外，以K+浓度为2.5mEq/L的方式配制THAM/MEYLON复合液(5)、水/CH3COONa/KCl/NaCl的复合液(8)。
[表4]
结果：
在磷酸缓冲液中补充K+而使K+浓度为5mEq/L的组(3)中，观察到与生理盐水(2)相比活性升高，但无法充分实现活性的维持。另外，对于以K+浓度为2.5mEq/L的方式配制的THAM/MEYLON复合液(5)、水/CH3COONa/KCl/NaCl的复合液(8)也无法充分维持活性(图4)。
2-5)CH3COONa/KCl～成品的替代可能性的验证2
将冷冻48小时以上的GAIA-102在37℃水浴中解冻后，室温下静置3小时。解冻开始3小时后，进行细胞毒性测定。
解冻后，用下表所示的溶液稀释41倍。作为阳性对照设定Plasma-Lyte A(1)，作为阴性对照设定生理盐水(2)，配制SOLMALT(7)和作为基于SOLMALT调整pH的组的SOLMALT/MEYLON复合液(3)、SOLMALT/THAM复合液(4)。另外，配制从Plasma-Lyte A中除去葡萄糖酸钠/Mg2+，其他成分与Plasma-Lyte A同浓度的复合液(5)、Plasma-Lyte A中除去葡萄糖酸钠/Mg2+，仅减少NaCl量，渗透压与(5)相同的复合液(6)。另外，增加用THAM调整SOLMALT的pH后加水而降低渗透压的组(8)。也测定配制后的各个溶媒的pH。
[表5]
结果：
在SOLMALT(7)中无法维持活性，但对于基于SOLMALT调整pH的SOLMALT/MEYLON复合液(3)、SOLMALT/THAM复合液(4)观察到活性改善的趋势。确认到该趋势有再现性，对于用THAM调整SOLMALT的pH后加水而降低渗透压的组(8)，也可以得到同样的结果。另外，从本结果实验性地观察到，pH下降到6.0时，维持活性变得困难，至8.8时可以接受(图5)。
2-6)活性的维持与活力的关系
对于用2-5)记载的溶液稀释的组，在解冻后1小时和3小时后进行通过7-AAD染色的活力测定、细胞毒性测定，对于用于毒性测定的反应后的GAIA-102的活力也进行了分析。
结果：
明确了在替换为RPMI后，可观察到在解冻稀释随后无法观察到的活力的降低。替换为RPMI后，随时间经过，可观察到活力降低，明确了该降低幅度与活性有极高的关联(图6)。
2-7)活性的维持与渗透压/pH的关系
将冷冻48小时以上的GAIA-102在37℃水浴中解冻后，室温下静置3小时。解冻开始3小时后进行细胞毒性测定。解冻后，用下表所示的溶液稀释41倍。作为阳性对照设定Plasma-Lyte A(1)，作为阴性对照设定生理盐水(2)，配制作为基于SOLMALT用MEYLON调整pH的组的SOLMALT：MEYLON＝20:1复合液(3)、SOLMALT：MEYLON＝10:1复合液(4)、SOLMALT/MEYLON/水复合液(5)、Klinisalz(6)、作为基于Klinisalz用MEYLON调整pH的组的Klinisalz/MEYLON复合液(7)。另外，配制Plasma-Lyte A+14万IU/mL IMUNACE(8)、Plasma-Lyte A+875μM牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)的混合液(9)。也测定配制后的各个溶媒的pH。
[表6]
对于用记载的溶液稀释的组，在解冻后1小时和3小时后，进行通过7-AAD染色的活力测定、细胞毒性测定，对用于毒性测定的反应后的GAIA-102的活力也进行了分析。
结果：
明确了在作为基于SOLMALT用MEYLON调整pH的组的SOLMALT：MEYLON＝20:1复合液(3)中可以维持活性。并且，可知Plasma-Lyte A+14万IU/mL IMUNACE(8)的活性维持能与Plasma-Lyte A(1)同等，IMUNACE的添加至少对以K562为对象的活性没有贡献。低pH的Klinisalz(6)、调整了pH但渗透压高的Klinisalz/MEYLON复合液(7)无法维持活性(图7-1)。确认到替换为RPMI后的活力低下和活性之间的高相关再现性良好(图7-2)。
2-8)解冻后3小时的对活性有影响的因子的精炼1
将冷冻48小时以上的GAIA-102在37℃水浴中解冻后，室温下静置3小时。解冻开始3小时后，进行细胞毒性测定。解冻后，用下表所示的溶液稀释41倍。配制用MEYLON调整pH为7.6-8.0，K+浓度为5mEq/L白蛋白/K.C.L./MEYLON的复合液(1)、白蛋白/K.C.L./生理盐水/MEYLON的复合液(2)、进一步作为调整Cl-浓度为80mEq/L的组的白蛋白/K.C.L./生理盐水/AMIZET/水/MEYLON的复合液(3)、K.C.L./生理盐水/AMIZET/水/MEYLON的复合液(4)、作为阳性对照的Plasma-Lyte A(6)。也测定配制后的各个溶媒的pH。
[表7]
结果：
(2)和(4)显示良好的活性维持能，(3)显示显著的好成绩(图8)。
2-9)解冻后3小时的对活性有影响的因子的精炼2
将冷冻48小时以上的GAIA-102在37℃水浴中解冻后，室温下静置4小时。解冻开始3小时后，进行细胞毒性测定，4小时后，进行通过7-AAD染色的活力测定。解冻后，用下表所示的溶液稀释41倍。配制白蛋白(献血白蛋白25％静脉注射液：BENESIS，日本血液制剂机构)/K.C.L./生理盐水/AMIZET/水/MEYLON的复合液(1)、K.C.L./生理盐水/AMIZET/水/MEYLON的复合液(2)、白蛋白/K.C.L./生理盐水/AMIZET/水/MEYLON的复合液(3)、作为阳性对照的Plasma-Lyte A(5),将全部的渗透压设成300mOsm。也测定配制后的各个溶媒的pH。
[表8]
结果：
(2)显示维持了良好的活性，(1)和(3)显示出显著的好成绩。
2-10)统计分析
本发明人等收集了以上的实验数据，使用JMP(注册商标)Pro 15(SAS InstituteInc.)进行统计分析。根据统计分析结果提示，Cl-浓度和pH对活性维持的影响大，另外，K+中有可能存在阈值(图10)。
2-11)对静脉内施用适宜的其他调整液的利用1
用Plasma-Lyte A和下表的调整液解冻后，将GAIA-102稀释41倍，室温下静置3小时后，测定对于K562的细胞毒性和通过7-AAD染色的活力。
调整液显示出优于Plasma-Lyte A的成绩(图11)。
[表9]
配制液200mL
2-12)对静脉内施用适宜的其他调整液的利用2
另外，用Plasma-Lyte A和假设使用时添加白蛋白的情况下的下表的调整液解冻后，将GAIA-102稀释45倍，室温下静置3小时后，测定对于K562的细胞毒性和通过7-AAD染色的活力。调整液显示出优于Plasma-Lyte A的成绩(图12)。
[表10]
配制液33mLpH＝7.3
3)葡萄糖的影响的确认
将冷冻的GAIA-102在37℃水浴中解冻2分40秒后，用各稀释液10倍稀释。
[表11]
室温下静置3小时后，评价对于K562的细胞毒性。依照前述「E).对于肿瘤细胞的毒性测定方法」记载的方法，其中GAIA-102(E)与K562细胞(T)以ET比为0.5:1、1:1或2:1混合，测定细胞毒性。通过使用JMP(注册商标)pro统计分析软件的非线性回归分析，根据以ET比4点(包括0)算出的细胞毒性率，算出E:T＝1:1的计算值。
结果：
在葡萄糖浓度为26g/L以下的稀释液中，特别是16g/L以下的稀释液中，维持高细胞毒性(图13)。
Claims (7)
1.一种用于悬浮对人施用的细胞的液体，其满足以下条件：
(1)含有钾离子，
(2)pH为6.4以上，
(3)不含有135mEq/L以上的浓度的氯离子，
(4)不含有0.423mM以上的浓度的钙离子，
(5)渗透压为200-396mOsm。
2.根据权利要求1所述的液体，其是用于稀释含有对人施用的细胞的冷冻物或其解冻物的液体。
3.根据权利要求1所述的液体，其中，
含有4.00mEq/L以上的浓度的钾离子，
不含有钙离子，
pH为7.0-8.3。
4.一种药物组合物，其含有权利要求1-3中任一项所述的液体中悬浮的对人施用的细胞的群体，其中对人施用的细胞为高活性NK细胞。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中，高活性NK细胞的群体为经过冷冻工序的群体。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，冷冻前的高活性NK细胞的群体为使用含有白蛋白、转铁蛋白、胰岛素和IL-2的培养基回收的群体。
7.一种含有对人施用的细胞的输液用药物组合物的提供方法，其包括以下工序：
(1)将该细胞利用动物细胞培养用培养基洗净的工序；
(2)根据需要，将洗净的该细胞悬浮在冷冻储存液中的工序；
(3)将悬浮在冷冻储存液中的该细胞冷冻而储存(储备)的工序；
(4)将冷冻储存的该细胞解冻的工序；及
(5)将解冻的该细胞悬浮在权利要求1-3中任一项所述的液体中，形成输液用药物组合物的工序。
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