CN118091116A - 一种时间分辨荧光微球修饰抗体的制备方法及其制备的o型口蹄疫病毒检测试纸条和应用 - Google Patents

一种时间分辨荧光微球修饰抗体的制备方法及其制备的o型口蹄疫病毒检测试纸条和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种时间分辨荧光微球修饰抗体的制备方法及其制备的O型口蹄疫病毒检测试纸条和应用，属于体外检测技术领域。一种时间分辨荧光微球修饰抗体的制备方法，包括以下步骤：将平均粒径200nm的时间分辨荧光微球进行活化，将活化的时间分辨荧光微球分散在pH值为8的硼酸盐缓冲液中与待修饰抗体进行化学反应，封闭后得到时间分辨荧光微球修饰抗体。本发明以时间分辨荧光微球标记抗体，采用免疫层析技术，实现口蹄疫O型病毒定性以及口蹄疫O型疫苗定量快速免疫分析。本发明的优点是灵敏度高，可准确定量，检测快速、操作方便，经济实用，能够实现对大批量样品进行快速和现场检测。

Description

一种时间分辨荧光微球修饰抗体的制备方法及其制备的O型 口蹄疫病毒检测试纸条和应用
技术领域
本发明属于体外检测技术领域，具体涉及一种时间分辨荧光微球修饰抗体的制备方法及其制备的O型口蹄疫病毒检测试纸条和应用。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是一种高度接触性传染病，在全世界广泛流行，严重影响了畜牧业发展，造成了巨大的经济损失。接种口蹄疫病毒疫苗是预防口蹄疫暴发的最有效措施。因此，对于该病的确诊以及对于免疫接种疫苗的选择至关重要。为了保证动物得到有效的免疫接种，在生产中应该严格控制疫苗质量。常用的攻毒保护实验是最为可靠评价疫苗效力的方法，但此方法消耗大量的人力、物力和时间，检验成本巨大，效率低，无法满足现实生产中间产品、成品的快速检验的需求。
免疫层析检测技术(Lateral flow assay，LFA)是一种经典的即时检测技术，已被广泛地应用于医学、环境监测、检验检疫等领域。将该技术与试纸条读数仪的结合，可以定量检测目标抗原，且敏感性与ELISA可达到同一数量级。免疫层析法中最常用的标记物为胶体金和单分散乳胶。以胶体金或者乳胶微球为标记物的光学定量免疫层析检测技术，是通过检测硝酸纤维素膜表面标记物光反射信号的密度来实现定量检测，因此，传统胶体金存在不稳定性、与抗体结合不牢固、只能定性等缺点。近年来，新型纳米材料标记物的研制也日新月异，将其应用于免疫层析技术亦朝着高灵敏度、多元化、定量检测的方向发展。时间分辨荧光微球具有尺寸均一可控，表面规整，荧光强度较强的特点，作为标记物建立免疫层析检测试纸条，能够实现快速检测、高灵敏度和定量分析的目的。然而，目前时间分辨荧光微球标记抗体的方法存在标记效率低的问题，直接影响免疫反应的检测灵敏度。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种时间分辨荧光微球修饰抗体的制备方法，通过优化时间分辨荧光微球的活化条件和抗体偶联缓冲液，使时间分辨荧光微球活化时保持分散的状态同时提高与抗体的结合效率，从而提高抗体检测灵敏度。
本发明提供了一种时间分辨荧光微球修饰抗体的制备方法，包括以下步骤：
将平均粒径200nm的时间分辨荧光微球进行活化，得到活化的时间分辨荧光微球；
将所述活化的时间分辨荧光微球分散在抗体偶联缓冲液中与待修饰抗体进行化学反应，封闭后得到时间分辨荧光微球修饰抗体；
所述抗体偶联缓冲液为pH值为8的硼酸盐缓冲液。
优选的，所述活化的方法为将所述时间分辨荧光微球在NHS和EDC的作用下活化。
优选的，所述时间分辨荧光微球、NHS和EDC的质量比为(18～22)：1：1。
优选的，所述时间分辨荧光微球和待修饰抗体的质量比为(4～6)：1。
本发明提供了一种所述制备方法得到的时间分辨荧光微球修饰抗体，时间分辨荧光微球通过微球表面羧基和抗体中的氨基形成酰胺键进行偶联；
所述抗体包括兔抗O型口蹄疫病毒抗体；
所述兔抗O型口蹄疫病毒抗体是由O型口蹄疫病毒146S蛋白作为免疫抗原免疫家兔，收集抗血清分离纯化所得。
本发明提供了一种O型口蹄疫病毒检测试纸条，包括底板和由下向上依次粘附的样品吸收垫、结合物释放垫、检测垫和吸水垫，所述检测垫由下向上依次设置有T线和C线，所述结合物释放垫上负载有所述时间分辨荧光微球修饰抗体；
所述T线包被有豚鼠抗O型口蹄疫病毒抗体；所述C线包被有羊抗兔二抗；
所述豚鼠抗O型口蹄疫病毒抗体是由O型口蹄疫病毒146S蛋白作为免疫抗原免疫豚鼠，收集抗血清分离纯化所得。
优选的，所述结合物释放垫上的时间分辨荧光微球修饰抗体的负载浓度为2.1～2.3μg/mL。
优选的，所述结合物释放垫预先用处理液处理；
所述处理液为含质量浓度1％牛血清白蛋白、质量浓度5％海藻糖、质量浓度0.1％PVPK30、体积浓度0.2％Tween-20、体积浓度0.1％Proclin300的pH 8.0的0.02mol/LTris-HCl缓冲液。
优选的，所述豚鼠抗O型口蹄疫病毒抗体的包被浓度为200～220μg/mL；
所述羊抗兔二抗的包被浓度为220～280μg/mL。
优选的，当进行定量检测时，还包括抗原标准品；
所述抗原标准品包括所述O型口蹄疫病毒146S蛋白。
本发明提供了一种时间分辨荧光微球修饰抗体的制备方法，包括以下步骤：将平均粒径200nm的时间分辨荧光微球进行活化，得到活化的时间分辨荧光微球；将所述活化的时间分辨荧光微球分散在抗体偶联缓冲液中与待修饰抗体进行化学反应，封闭后得到时间分辨荧光微球修饰抗体；所述抗体偶联缓冲液为pH值为8的硼酸盐缓冲液。本发明通过优化时间分辨荧光微球的粒径，从而使时间分辨荧光微球最大程度与抗体发生化学反应，提高抗体修饰效率，同时抗体偶联缓冲液使时间分辨荧光微球保持较高的分散状态，进一步提高抗体修饰效率，从而大大提高时间分辨荧光微球修饰抗体的检测灵敏度。
本发明提供了一种O型口蹄疫病毒检测试纸条，包括底板和由下向上依次粘附的样品吸收垫、结合物释放垫、检测垫和吸水垫，所述检测垫由下向上依次设置有T线和C线，所述结合物释放垫上负载有所述时间分辨荧光微球修饰抗体；所述T线包被有豚鼠抗O型口蹄疫病毒抗体；所述C线包被有羊抗兔二抗；所述豚鼠抗O型口蹄疫病毒抗体是由O型口蹄疫病毒146S蛋白作为免疫抗原免疫豚鼠，收集抗血清分离纯化所得。本发明首次应用免疫层析技术快速、定性的测定待检样本中是否含有口蹄疫O型病毒，同时，利用稳定标记物——时间分辨荧光微球建立定量标准曲线，并创新地应用于口蹄疫O型疫苗样本中146S含量的测定，较常用质谱分析、蔗糖密度梯度离心等分析146S含量的方法操作更简单、结果判定更快捷、直观。其次，鉴于传统胶体金标识物灵敏度较传统酶联免疫吸附实验低，且不能进行结果的定量，无法满足实验室精确定量的检测要求。本发明筛选出具有信号放大功能的时间分辨荧光微球新型免疫层析技术标记物，用于免疫层析诊断技术，由于其Stokes位移大(＞150nm)且荧光寿命比本底物质荧光寿命高5～6个数量级，能够有效地消除各种非特异性荧光的干扰，提高检测的灵敏度，建立定量标曲。本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、不受检测设备限制、储存简单、保质期长的优点。用本发明试纸条简便、快速、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。
附图说明
图1为免疫层析试纸条结构示意图，图中：1、卡壳；2、底板；3、吸水垫；4、硝酸纤维素膜；5、结合物释放垫；6、样品吸收垫；7、检测线；8、质控线；
图2为试纸条样品检测结果示意图；
图3为本发明试纸条的标准曲线；
图4为本发明试纸条符合率相关性曲线；
图5为三种型号Eu-PSM标记后信号值结果；
图6为三种活化液的标准曲线图；
图7为不同抗体浓度信号变化结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种时间分辨荧光微球修饰抗体的制备方法，包括以下步骤：
将平均粒径200nm的时间分辨荧光微球进行活化，得到活化的时间分辨荧光微球；
将所述活化的时间分辨荧光微球分散在抗体偶联缓冲液中与待修饰抗体进行化学反应，封闭后得到时间分辨荧光微球修饰抗体；
所述抗体偶联缓冲液为pH值为8的硼酸盐缓冲液。
本发明将平均粒径200nm的时间分辨荧光微球进行活化，得到活化的时间分辨荧光微球。
在本发明中，考虑到不同粒径的时间分辨荧光微球，其所含的羧基含量、荧光分子数量存在较大差异以及微球与抗体结合时存在的空间位阻的差异等，本发明将不同粒径(平均粒径分别为100nm、200nm和300nm)的时间按分辨荧光微球分别标记抗体，结果表明，偶联后的时间按分辨荧光微球的粒径比标记前的稍微偏大，且分散度也变大，灵敏度检测表明粒径200nm的时间分辨荧光微球的荧光信号最强，优于平均粒径分别为100nm和300nm的时间按分辨荧光微球作为标记物的检测试纸条。
在本发明中，所述活化的方法优选为将所述时间分辨荧光微球在NHS和EDC的作用下活化。所述时间分辨荧光微球、NHS和EDC的质量比优选为(18～22)：1：1，更优选为20:1:1。在本发明实施例中，所述时间分辨荧光微球在活化前优选，进行超声分散。活化时，所述时间分辨荧光微球的固含量(质量)优选为0.1％。所述NHS优选溶解于乙醇溶液中，形成10mg/mL的A液，在活化时，取5μl的A液添加到1mL的时间分辨荧光微球分散液中。所述EDC优选溶解于乙醇溶液中，形成10mg/mL的B液，在活化时，取5μl的B液添加到1mL的时间分辨荧光微球分散液中。所述活化时的体系条件优选为室温(22～27℃)下反应15～30min，更优选为25℃下反应25min。活化后，分离固相，将分离的固相重悬于抗体偶联缓冲液中。
活化后，本发明将所述活化的时间分辨荧光微球分散在抗体偶联缓冲液中与待修饰抗体进行化学反应，封闭后得到时间分辨荧光微球修饰抗体。
在本发明中，所述时间分辨荧光微球和待修饰抗体的质量比优选为(4～6)：1，更优选为5:1。所述时间分辨荧光微球的浓度优选为0.1％。所述待修饰抗体的浓度优选为2.1～2.3μg/mL，更优选为2.26μg/mL。所述待修饰抗体优选包括兔抗O型口蹄疫病毒抗体。本发明实施例中，对不同浓度的抗体溶液进行标记，在2.26μg/mL的抗体蛋白浓度下分散度参数最小，分散情况最好，同时，信号值最高，具有较为理想的灵敏度。
在本发明中，为了进一步提高抗体的标记效率，还对抗体偶联缓冲液的种类进行优化筛选，分别使用pH 7.0PBS、pH 8.0BBS和pH 9.0CBS作为分散溶液将时间分辨荧光微球标记到兔抗O型口蹄疫病毒抗体上，结果表明，pH 8.0的BBS溶液有利于微球在活化时保持较为分散的状态。
在本发明中，所述封闭的方法优选采用质量浓度10％BSA添加到反应体系中至终浓度为0.5％，封闭1h。所述封闭后，离心，收集沉淀，将沉淀重悬于免疫微球缓冲液中避光保存。
本发明提供了一种所述制备方法得到的时间分辨荧光微球修饰抗体，时间分辨荧光微球通过微球表面羧基和抗体中的氨基形成酰胺键进行偶联；
所述抗体包括兔抗O型口蹄疫病毒抗体；
所述兔抗O型口蹄疫病毒抗体是由O型口蹄疫病毒146S蛋白作为免疫抗原免疫兔子，收集抗血清分离纯化所得。
在本发明中，所述O型口蹄疫病毒146S蛋白的制备方法，优选为将O型口蹄疫病毒接种BHK-21单层细胞，待细胞病变达到90％以上时，调节pH至7.6～7.8，加入抗生素后进行灭活，得到病毒颗粒；将所述病毒颗粒进行抗原脱脂和浓缩，再进一步利用蔗糖密度梯度离心方法收集146S抗原。
在本发明中，所述兔抗O型口蹄疫病毒抗体的制备方法，优选将所述O型口蹄疫病毒146S蛋白与等量的弗式完全佐剂混合，肌肉注射豚鼠，10d后将所述O型口蹄疫病毒146S蛋白与等量的弗式不完全佐剂混合再次注射豚鼠，间隔10d后再次免疫，三免15d后心脏采血，灭活，选择同型抗原的琼扩反应效价不低于1:8；与异型抗原不高于1:2的血清进行HiTrapProteinAHP亲和层析柱纯化。
本发明提供了一种O型口蹄疫病毒检测试纸条(结构示意图见图1)，包括底板和由下向上依次粘附的样品吸收垫、结合物释放垫、检测垫和吸水垫，所述检测垫由下向上依次设置有T线和C线，所述结合物释放垫上负载有所述时间分辨荧光微球修饰抗体；
所述T线包被有豚鼠抗O型口蹄疫病毒抗体；所述C线包被有羊抗兔二抗；
所述豚鼠抗O型口蹄疫病毒抗体是由O型口蹄疫病毒146S蛋白作为免疫抗原免疫豚鼠，收集抗血清分离纯化所得。
在本发明中，所述结合物释放垫上的时间分辨荧光微球修饰抗体的负载浓度优选为2.1～2.3μg/mL，更优选为2.26μg/mL。时间分辨荧光微球修饰抗体的喷涂量为每1cm结合物释放垫喷涂0.01mL时间分辨荧光微球修饰抗体。时间分辨荧光微球修饰抗体的缓冲体系优选为pH 8.0硼酸盐缓冲液。所述结合物释放垫优选采用处理液预处理，烘干，备用，以便减少在结合物释放垫的残留。所述处理液优选为含质量浓度1％牛血清白蛋白、质量浓度5％海藻糖、质量浓度0.1％PVPK30、体积浓度0.2％Tween-20、体积浓度0.1％Proclin300的pH 8.0的0.02mol/L Tris-HCl缓冲液。结合物释放垫的材料优选玻璃纤维或聚酯膜。
在本发明中，所述豚鼠抗O型口蹄疫病毒抗体的包被浓度优选为200～220μg/mL，更优选为214μg/mL。所述豚鼠抗O型口蹄疫病毒抗体的溶剂优选为pH 7.4的0.02mol/LPB。所述豚鼠抗O型口蹄疫病毒抗体的喷涂量优选为1.0μl/cm。所述羊抗兔二抗的包被浓度为220～280μg/mL，更优选为250μg/mL。所述羊抗兔二抗的喷涂量优选为1.0μl/cm。所述喷涂后，将检测垫置于37℃下烘干30min。所述检测垫的材料优选包括硝酸纤维素膜。
在本发明中，当进行定量检测时，优选还包括抗原标准品；所述抗原标准品包括所述O型口蹄疫病毒146S蛋白。
本发明对所述试纸条的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的制备方法即可。所述试纸条安装置于塑料卡壳内，形成检测卡。
在本发明中，所述检测的样本优选包括水疱皮、水疱液或疫苗。当样本为水疱皮时，待检样品的制备方法优选为无菌条件下将待检水疱皮(采取新鲜未破裂、没有异味的水疱皮)用pH 7.50.05M PBS缓冲液洗2～3次，并用消毒滤纸吸去水分称重，加少许玻璃砂研磨，制成1:3(w/v)的悬液，室温浸毒1～2h或4℃冰箱内浸毒一夜，振摇后以4000rpm离心10min，取上清液即为待检样品。水可直接作为待检样品。当样本为疫苗时，待检样品的制备方法优选为将疫苗破乳剂与4倍体积的油乳剂灭活疫苗充分混匀，4℃，3000rpm离心10min，离心后的最下层的病毒抗原作为待检样品。
在本发明中，所述试纸条或检测卡的检测方法，优选为取20μL待检样品加入加样孔，之后加入70μL样品稀释液，当液体全部浸湿硝酸纤维素膜后，静置15min。将反应15min的试纸条插入荧光分析仪，填写对应的样本编号后，点击“检测”，电脑即时显示检测结果。定性检测结果判定：T/C值＜0.125为阴性；T/C值≥0.125为阳性。定量检测结果判定：将检测得到的T/C值带入标准曲线的回归方程中计算出待测样品中O型口蹄疫病毒含量(检测结果示意图见图2)。
下面结合实施例对本发明提供的一种时间分辨荧光微球修饰抗体的制备方法及其制备的O型口蹄疫病毒检测试纸条和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
兔抗口蹄疫O型抗体和豚鼠抗口蹄疫O型抗体制备
1.抗原的制备
(1)毒种的繁殖与灭活
将O/MYA98/JSCJ/2010细胞毒种，按维持液5％～10％的量接种生长良好的BHK-21单层细胞转瓶内，于37℃培养8～12h，当达到90％以上细胞病变时，用7.5％NaHCO3溶液调pH至7.6～7.8，加入青霉素(100IU/mL)、链霉素(100IU/mL)，病毒液用2mmol/L二乙烯亚胺在30℃下灭活24h，加入2％硫代硫酸钠阻断，4000rpm，2～8℃离心30min，取上清，-20℃冷冻保存。
(2)抗原纯化
1)抗原脱脂与浓缩
具体步骤如下：a.取10000mL灭活制苗病毒抗原液，按80g/L加入PEG 6000和40g/L加入NaCl，充分搅拌4h，2～8℃过夜；
b.将上述处理的病毒液8000rpm离心45min，弃上清；
c.pH 7.4PB缓冲液(0.2mol/LNa2HPO4，0.2mol/LNaH2PO4)悬浮沉淀(冰上操作)，匀浆器反复研磨，至终体积100mL；
d.加2倍体积三氯乙烯于密闭容器中，剧烈振荡充分乳化。2～8℃8000rpm离心30min，收集上层液；
e.将上层液置于4℃、45000rpm离心180min，弃上清；
f.PB缓冲液悬浮沉淀，匀浆器中研磨，至终体积6mL；
g.加1％的脱氧胆酸钠溶液，充分摇匀，2～8℃过夜，即为浓缩病毒抗原。
2)蔗糖密度梯度离心配制
50％蔗糖母液；用50％蔗糖配制45％、35％、25％、15％四种浓度梯度蔗糖溶液；离心管中先加45％蔗糖溶液2.5mL，依次叠加35％、25％、15％蔗糖溶液2.5mL，制备6个蔗糖梯度柱，2～8℃静置平衡过夜；次日将浓缩病毒抗原液6mL分别加入6个蔗糖梯度柱顶部(每个柱子加入1mL)，2～8℃、35000rpm离心150min。
3)146S抗原收集
离心结束后，取上述梯度离心纯化抗原6管，自上而下吸取梯度离心抗原，每次吸取0.5mL作为1个收集级分，对收集的级分进行顺序编号，共收集22个级分。其余5支离心管重复上述操作，并分别将同层收集级分合并至22个级分管中。用紫外分光光度计(北京普析TU-190)测定22个级分OD259nm值，当收集级分出现明显吸收峰值，取该区域OD259nm大于2.0的级分合并，作为146S抗原，-20℃保存备用。
2.豚鼠抗口蹄疫O型病毒抗体的制备
(1)豚鼠抗口蹄疫O型病毒免疫血清的制备
取上述制备的O/MYA98/JSCJ/2010纯化抗原(稀释至30μg/mL)与等量弗氏完全佐剂按充分混合后，取0.6mL于豚鼠后肢股内侧肌肉接种，10d后取同等浓度抗原与等量弗氏不完全佐剂按充分混合后，取0.8mL进行二免，10d后与二免程序相同，取1.2mL进行三免。第三次接种后15d，心脏采血，分离、收集血清，置56℃水浴灭活30min。制备的血清用免疫琼脂糖双扩散法进行鉴定，与同型抗原的琼扩反应效价不低于1:8；与异型抗原不高于1:2为合格，-80℃保存备用。
(2)豚鼠抗口蹄疫O型病毒抗体的纯化
采用HiTrap ProteinA HP亲和层析柱(GE)，按使用说明进行操作。操作时用至少8倍柱体积的pH 7.4、0.02mol/LPB平衡HiTrap ProteinAHP亲和层析柱，流速2mL/min，流洗至流出液OD280nm不高于0.1，用注射器将豚鼠抗口蹄疫O型病毒免疫血清注入加样阀，再用至少4倍柱体积的pH 7.4、0.02mol/L PB洗脱杂蛋白，用0.1mol/LpH 3.0柠檬酸缓冲液洗脱吸附于柱上的IgG，同时收集样品。用SDS-PAGE电泳方法测定纯度不低于95％；用紫外分光光度法测定豚鼠抗口蹄疫O型病毒抗体浓度，含量不低于1.5mg/mL，-20℃冷冻保存备用。
3.兔抗口蹄疫O型抗体的制备
(1)兔抗口蹄疫O型免疫血清的制备
将上述制备的O/MYA98/JSCJ/2010株纯化抗原加等量的弗氏完全佐剂初次免疫按100μg/mL分别给体重3～4kg家兔皮下多点注射，一个月后按初免同等剂量加弗氏不完全佐剂加强免疫，免疫三周后采血收集免疫血清。制备的血清用免疫琼脂糖双扩散法进行鉴定，与同型抗原的琼扩反应效价不低于1:16；与异型抗原不高于1:2为合格，-20℃保存备用。
(2)兔抗口蹄疫O型病毒抗体的纯化
采用HiTrap ProteinA HP亲和层析柱(GE)，按使用说明进行操作。操作时用至少8倍柱体积的pH 7.4、0.02mol/LPB平衡HiTrap ProteinAHP亲和层析柱，流速2mL/min，流洗至流出液OD280nm不高于0.1，用注射器将兔抗口蹄疫O型病毒免疫血清注入加样阀，再用至少4倍柱体积的pH 7.4、0.02mol/LPB洗脱杂蛋白，用0.1mol/LpH 3.0柠檬酸缓冲液洗脱吸附于柱上的IgG，同时收集样品。用SDS-PAGE电泳方法测定纯度不低于95％；用紫外分光光度法测定兔抗口蹄疫O型病毒抗体浓度，含量不低于2.0mg/mL，-20℃冷冻保存备用。
实施例2
时间分辨荧光微球的活化
具体步骤如下：(1)超声分散微球，约2min，然后手工摇匀；
(2)在2mL的EP管中，加入100μL微球(固含1％)，再加超纯水900μL，待用；
(3)配制：10mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)乙醇溶液A液，10mg/mL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)乙醇溶液B液；
(4)在微球悬液中加入5μl的A液、混匀，再加入5μl的B液、再次混匀，室温反应15～30min；
(5)14000rpm，离心15min，去上清，加入1mL 0.02mol/L硼酸盐缓冲液，然后超声分散均匀。
实施例3
口蹄疫O型病毒时间分辨荧光定量试纸条的制备
1、荧光微球标记物的制备：
时间分辨荧光微球标记抗体：取1mL活化后的微球悬液，超声分散，按2.26μg/mL的终浓度将兔抗口蹄疫O型病毒抗体溶解于微球悬液，边搅拌边滴加抗体；室温下混匀1h；加10％BSA至终浓度为0.5％，封闭1h；13000rpm离心15min，弃上清；取1mL免疫微球缓冲液(配方为含pH 8.0的0.02mol/LTris-HCl、1％牛血清白蛋白、5％海藻糖、0.1％PVPK30、0.2％Tween-20、0.1％Proclin300缓冲液)加入到离心后的沉淀中，混匀，冷藏避光保存，待用。
2、荧光微球结合垫的制备：
将结合物释放垫垫用含pH 8.0的0.02mol/LTris-HCl、1％牛血清白蛋白、5％海藻糖、0.1％PVPK30、0.2％Tween-20、0.1％Proclin300缓冲液浸泡2h，37℃下烘干2h。用喷膜仪将荧光微球标记的检测抗体喷涂至结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01mL荧光微球标记的检测抗体，37℃干燥1～2h，置于干燥环境中备用。
3、NC膜(硝酸纤维素膜)的制备：
用pH 7.4的0.02mol/LPB分别将纯化的豚鼠抗口蹄疫O型病毒抗体调整至浓度为214μg/mL，用点喷仪按1.0μl/cm喷于280mm×25mm的NC膜上作为检测带；将商品化羊抗兔抗体IgG(浓度不小于1.0mg/mL)浓度调整至250μg/mL，用点喷仪按1.0μl/cm喷于280mm×25mm的NC膜上为质控带。含有检测带和质控带的硝酸纤维素膜37℃烘干30min取出。
4、时间分辨荧光微球检测试纸卡的制备
在PVC底板上依次粘贴样品吸收垫，喷涂有荧光微球标记的兔抗口蹄疫O型抗体的结合物释放垫，喷涂有豚鼠抗口蹄疫O型抗体作为检测线和羊抗兔二抗作为质控线的硝酸纤维素膜，吸水垫；其中，结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与硝酸纤维素膜的始端连接，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述硝酸纤维素膜上的检测线和质控线与所述试纸条的长相呈垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；组装完成后剪切成3.98mm的宽度，即成为免疫层析试纸条。
把免疫层析试纸条固定在塑料底卡上，试纸条表面用面卡压紧，面卡在对应试纸条样品吸收垫和NC膜的部分分别预留加样孔和检测窗。该检测卡组装好后装入铝箔袋，加入干燥剂封口，放置于冷藏干燥环境下可保存12个月。
实施例4
口蹄疫O型病毒及口蹄疫O型疫苗146S含量的检测
1、口蹄疫O型病毒检测试纸条标准曲线的建立
将口蹄疫O型病毒O/MYA98/JSCJ/2010株灭活制苗病毒抗原液浓缩纯化后，利用蔗糖密度梯度方法提取146S抗原，用紫外分光光度计测定146S存在区域(蔗糖密度35％～45％)的级分OD259nm值，按照抗原定量公式I计算抗原含量。
146S抗原(μg/mL)＝128.7×OD259nm公式I
取5批不同批次口蹄疫O型病毒O/MYA98/JSCJ/2010株灭活制苗病毒抗原液按照以上方法提取146S抗原，将获得的5份146S抗原进行5×倍比稀释，稀释度从原倍、5×、25×、125×至625×，将每个稀释度的样品作为标准品，分别利用紫外分光光度计测定其抗原含量，同时每份标准品用制备好的试纸条平行检测5次，检测所得的样品T/C值，结合其相应的抗原含量，拟合标准曲线。
2、样品检测
1)定性检测样品处理：无菌操作将待检水疱皮(采取新鲜未破裂、没有异味的水疱皮)用pH 7.5、0.05M PBS缓冲液洗2～3次，并用消毒滤纸吸去水分称重，加少许玻璃砂研磨，制成1:3(w/v)的悬液，室温浸毒1～2h或4℃冰箱内浸毒一夜，振摇后以4000rpm离心10min，取上清液即为待检样品。水疱液可直接作为待检样品。
2)定量检测疫苗样品处理：将疫苗破乳剂与4倍体积的油乳剂灭活疫苗充分混匀，4℃，3000rpm离心10min，离心后的最下层的病毒抗原作为待检样品。
3)样品检测：取20μL待检样品加入加样孔，之后加入70μL样品稀释液，当液体全部浸湿硝酸纤维素膜后，静置15min。将反应15min的试纸条插入荧光分析仪，填写对应的样本编号后，点击“检测”，电脑即时显示检测结果。
4)用上述制备的试纸条进行检测：
a.定性检测结果判定：T/C值＜0.125为阴性；T/C值≥0.125为阳性。
b.定量检测结果判定：根据试剂盒中配备计算抗原含量的公式，将检测得到的T/C值带入公式中计算出疫苗样品含量。
实施例5
基本参数的建立
1.定量阈值：用阴性样品进行重复测定3次，计算3次结果的均值M与标准差SD，以阴性均值加三倍标准差(M+3SD)作为定量阈值，定量阈值为0.125。
2.线性范围：取口蹄疫O型病毒146S含量分别为225.2μg/mL、202.6μg/mL、184.0μg/mL、61.8μg/mL、47.6μg/mL的样本进行测定，每个浓度重复测量5次，以试纸条结果T/C为横坐标，146S含量为纵坐标(表1)，将测定浓度代入拟合标准曲线(见图3)，得到线性方程如下：
y＝196.27x+6.6945，R2＝0.9648。
表1口蹄疫O型病毒检测试纸条标准曲线建立
实施例6
性能测试
1.敏感性测试：对口蹄疫O型、A型、Asia1型灭活细胞毒、口蹄疫阳性疫苗样品、动物常见病毒病阳性样品、阴性样品等共计113份样品进行敏感性检测试验，结果显示，试纸条对阳性样品检出率为90.5％，对特异性样品检出率为96％。
2.最低检出量：取口蹄疫O型病毒抗原146S用样品稀释液连续10倍倍比稀释后试纸条检测，在样品1:1000稀释时能检测到阳性结果，在样品1:10000稀释时检测结果为阴性，因此最低检出量为1:1000稀释的146S样品对应的含量为26.39μg/mL。
表2最低检出量检测结果
注：Ct值＜35为阳性；Ct值≥35为阴性。T/C≥0.125为阳性；T/C＜0.125为阴性。
重复性测试：取三批实施例中所制备的时间分辨荧光微球检测试纸条检测43份口蹄疫阳性疫苗样品，每批试纸条标品平行检测3次，结果显示3批批次内CV值分别为5.48％、6.23％和5.79％，3批批次间CV值为10.14％。
符合性测试：取100份口蹄疫阳性疫苗样本进行测试，检测结果与蔗糖密度梯度离心检测结果进行比对，以蔗糖密度梯度离心检测的口蹄疫病毒146S含量为横坐标，本发明检测口蹄疫病毒146S含量为纵坐标，绘制样本相关性曲线见图4，相关性系数R大于0.9，证实具有较高的符合性。
实施例7
时间分辨荧光微球的活化
1.材料
1.1试剂
时间分辨荧光微球，购自上海涛宇；
N-羟基琥珀酰亚胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，乙醇，硼砂，硼酸均为国产分析纯。
1.2仪器及器具
台式离心机，Eppendorf公司；
Malvern ZetasizerNano S90纳米粒度电位仪，Malvern公司；
荧光免疫分析仪，上海金标公司。
2.方法
2.1时间分辨荧光微球(Eu-PSM)活化与标记步骤
2.1.1Eu-PSM活化
(1)超声分散微球，约2min，然后手工摇匀；
(2)在2mL的EP管中，加入100μL微球(固含1％)，再加超纯水900μL，待用；
(3)配制：10mg/mLN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)乙醇溶液A液，10mg/mL1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)乙醇溶液B液；
(4)在微球悬液中加入5μl的A液、混匀，再加入5μl的B液、再次混匀，室温反应15～30min；
(5)14000rpm，离心15min，去上清，加入1mL抗体偶联缓冲液，然后超声分散均匀。
2.1.2Eu-PSM标记抗体
取1mL活化后的微球悬液，超声分散，按20μg/mL将兔抗口蹄疫O型病毒抗体加入微球悬液，边搅拌边滴加抗体；室温下混匀1h；加10％BSA至终浓度为0.5％，封闭1h；13000rpm离心15min，弃上清；取1mL微球稀释液加入到离心后的沉淀中，混匀，冷藏避光保存，待用。
2.2时间分辨微球筛选
不同粒径的Eu-PSM因为其羧基含量、荧光分子数量存在较大差异以及在空间位阻上存在影响，对抗体免疫反应灵敏度会产生影响。本实验分别测试了100nm、200nm、300nm三种类型的Eu-PSM进行测试，评估Eu-PSM粒径，分散度的变化，灵敏度和线性范围的差异。三种材料的参数表3：
表3三种型号Eu-PSM信息表
名称 平均粒径(nm) 密度(g/cm3) 固含 基团 羧基密度(μmol/g)
EU001 100 1.05 1％ -COOH 159
EU002 200 1.05 1％ -COOH 210
EU003 300 1.05 1％ -COOH 290
注：固含为颗粒(固体)占混合液的质量百分比。
(1)在标记过程中，使用三种不同粒径的微球进行标记，其他标记步骤不变。
(2)试纸条的制备参照实施例3制备试纸条的方法。
(3)微球及标记物的粒径、分散度通过Nano S90纳米粒度电位仪测定得到。
(4)三种标记物分别测试浓度为35μg/mL、30μg/mL、25μg/mL的口蹄疫O型灭活制苗病毒抗原液(质控品)，通过比对其信号比值来筛选实验所用微球。
2.3抗体偶联缓冲液的筛选
通过实验发现，不同的Eu-PSM对不同的活化液有不同的标记效率，使用pH7.0PBS、pH 8.0BBS和pH 9.0CBS进行兔抗口蹄疫O型抗体与上述所选的时间分辨荧光微球的标记，其他标记步骤不变。测定活化微球的粒径，分散度，蛋白标记率，信号值，绘制标准曲线。
(1)在标记过程中，使用三种不同的活化液进行微球活化，其他标记步骤不变。
(2)试纸条的制备参考实施例3制备试纸条的的方法。
(3)微球及标记物的粒径、分散度通过Nano S90纳米粒度电位仪测定得到。
(4)三种活化液条件的标记物分别测试浓度为35μg/mL、30μg/mL、25μg/mL的口蹄疫O型灭活制苗病毒抗原液(质控品)，通过比对其信号比值来筛选最优抗体偶联缓冲液。
3结果
3.1时间分辨微球筛选结果
微球在标记蛋白过程中，最容易发生变化的就是粒径及其均一度。但在应用过程中，对应用后的结果再进行测试确认是很有必要的。分别对标记前后的Eu-PSM进行粒径与分散度测试，得到表4和图5结果，由表4可以看出，标记前后微球的粒径发生的变化，标记后的微球粒径比标记前的稍微偏大，分散度参数也变大，也就是分散情况变差，这是发生偶联反应后正常情况，也表明了抗体蛋白已经偶联到微球上。通过对三个水平浓度的质控品进行测试，得到图5信号值结果，FCEU002灵敏度最优，因此选择EU002100002作为后续调试微球。
表4Eu-PSM标记前后参数表
注：Z-Ave组数据是由Nano S90纳米粒度电位仪检测获得，代表纳米粒样本的平均粒径，D/3组数据是由Nano S90纳米粒度电位仪测定，代表颗粒的标准等效粒径。
3.2标记活化液的筛选
通过对不同的活化液进行标记测试，得到表5和图6结果，pH 8.0的BBS溶液有利于微球在活化时保持较为分散的状态，从而使得偶联反应充分发生，优选此条件进行后续实验测试。
表5不同活化液偶联物状态差异表
活化液条件 CBSBuffer(pH9.0) PBSBuffer(pH7.0) BBSBuffer(pH8.0)
粒径(nm) 388 354 331
分散度(PdI) 0.211 0.182 0.132
4.结论
4.1时间分辨荧光微球筛选
选择平均粒径200nm的时间分辨荧光微球作为本实验的最佳标记物。
4.2标记活化液的筛选
选择pH 8.0的BBS溶液PdI较小，分散度好，能更均匀的与交联剂产生化学反应，且蛋白偶联率高。
聚苯乙烯微球(PSM)在免疫诊断中具有广泛的应用。本研究所用的时间分辨微球是含镧系元素铕离子螯合物的纳米级PSM，每个PSM都包裹着无数的镧系离子螯合物，同时，用适当密度的羧基或其他官能团修饰其表面，以与蛋白质或抗体共价偶联，提高蛋白质的标记效率。本研究中使用的时间分辨铯离子聚苯乙烯微球(Eu-PSM)可以用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化其表面修饰的羧基。EDC可以与具有羧基的酰胺键形成中间体，并且由于其不稳定性，可以通过添加NHS形成相对稳定的中间体，使得在蛋白偶联过程更易控制，效率更高，形成可识别目标物的稳定蛋白抗体示踪物。
实施例8
时间分辨荧光微球标记抗体的制备方法
1材料
1.1试剂
碳酸钾，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，氯化钠：全为国产分析纯；已活化时间分辨荧光微球溶液：本实验室制备；吐温-20，蔗糖：购自Sigma，BSA：购自索莱宝公司。
1.2抗体
兔抗口蹄疫O型病毒抗体IgG。
1.3仪器
高速离心机：Thermo Fisher；
HJ-1大功率磁力搅拌器：江苏大地自动化仪器厂；
TU-1900双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。
台式离心机，eppendorf公司；
Malvern ZetasizerNano S90纳米粒度电位仪，Malvern公司；荧光免疫分析仪，上海金标公司。
2方法
2.1抗体标记浓度的确定
抗体的含量对免疫反应有着极为重要的作用，过少或过高都会造成反应性偏低(前带和后带现象)，同时，由于微球本身也有对抗体蛋白标记量的限制，因此测试蛋白的用量很有必要。分别选择22.62μg/mL、4.52μg/mL、2.83μg/mL、2.26μg/mL、1.88μg/mL、1.51μg/mL六个浓度范围进行测试，测试标记后微球的粒径、分散度、信号值。
2.2检测方法
(1)在标记过程中，使用不同的抗体浓度进行，使用平均粒径为200nm的微球、pH8.0 BBS为活化液，其他标记步骤不变。
(2)试纸条的制备参照实施例3试纸条的制备方法。
(3)微球及标记物的粒径、分散度通过Nano S90纳米粒度电位仪测定得到。
(4)六种抗体浓度的标记物分别测试高中低三个水平的质控品，通过比对其信号比值来分析灵敏度和测试线性范围。
3结果
3.1抗体标记浓度的筛选结果
通过对抗体标记浓度进行测试研究，由表6和图7结果分析得出，在2.26μg/mL的抗体蛋白浓度下分散度参数最小，分散情况最好，同时，信号值最高，具有较为理想的灵敏度。
表6不同抗体浓度偶联物状态差异表
4结论
兔抗口蹄疫O型抗体IgG最适标记量的选择能使微球分散均匀且标记结合物检测高中低浓度质控品信号值最高，最适标记量为2.26μg/mL。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种时间分辨荧光微球修饰抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将平均粒径200nm的时间分辨荧光微球进行活化，得到活化的时间分辨荧光微球；
将所述活化的时间分辨荧光微球分散在抗体偶联缓冲液中与待修饰抗体进行化学反应，封闭后得到时间分辨荧光微球修饰抗体；
所述抗体偶联缓冲液为pH值为8的硼酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述活化的方法为将所述时间分辨荧光微球在NHS和EDC的作用下活化。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述时间分辨荧光微球、NHS和EDC的质量比为(18～22)：1：1。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述时间分辨荧光微球和待修饰抗体的质量比为(4～6)：1。
5.一种权利要求1～4中任意一项所述制备方法得到的时间分辨荧光微球修饰抗体，其特征在于，时间分辨荧光微球通过微球表面羧基和抗体中的氨基形成酰胺键进行偶联；
所述抗体包括兔抗O型口蹄疫病毒抗体；
所述兔抗O型口蹄疫病毒抗体是由O型口蹄疫病毒146S蛋白作为免疫抗原免疫家兔，收集抗血清分离纯化所得。
6.一种O型口蹄疫病毒检测试纸条，包括底板和由下向上依次粘附的样品吸收垫、结合物释放垫、检测垫和吸水垫，所述检测垫由下向上依次设置有T线和C线，其特征在于，所述结合物释放垫上负载有权利要求5所述时间分辨荧光微球修饰抗体；
所述T线包被有豚鼠抗O型口蹄疫病毒抗体；所述C线包被有羊抗兔二抗；
所述豚鼠抗O型口蹄疫病毒抗体是由O型口蹄疫病毒146S蛋白作为免疫抗原免疫豚鼠，收集抗血清分离纯化所得。
7.根据权利要求6所述O型口蹄疫病毒检测试纸条，其特征在于，所述结合物释放垫上的时间分辨荧光微球修饰抗体的负载浓度为2.1～2.3μg/mL。
8.根据权利要求6所述O型口蹄疫病毒检测试纸条，其特征在于，所述结合物释放垫预先用处理液处理；
所述处理液为含质量浓度1％牛血清白蛋白、质量浓度5％海藻糖、质量浓度0.1％PVPK30、体积浓度0.2％Tween-20、体积浓度0.1％Proclin300的pH 8.0的0.02mol/LTris-HCl缓冲液。
9.根据权利要求6所述O型口蹄疫病毒检测试纸条，其特征在于，所述豚鼠抗O型口蹄疫病毒抗体的包被浓度为200～220μg/mL；
所述羊抗兔二抗的包被浓度为220～280μg/mL。
10.根据权利要求6～9中任意一项所述O型口蹄疫病毒检测试纸条，其特征在于，当进行定量检测时，还包括抗原标准品；
所述抗原标准品包括所述O型口蹄疫病毒146S蛋白。
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