CN118086473A - 一种基于原生质体高通量筛选林木CRISPR/Cas基因编辑系统候选靶点的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于原生质体高通量筛选林木CRISPR/Cas基因编辑系统候选靶点的方法，属于分子生物学技术领域。本发明提供了一种高通量筛选林木CRISPR/Cas基因编辑系统候选靶点的方法，包括将多个候选靶点构建到表达Cas蛋白的骨架载体中并提取质粒；分离林木原生质体，利用提取的质粒进行瞬时转化；提取经瞬时转化的原生质体DNA，根据靶点区域设计特异性引物，利用PCR扩增，结合Hi‑TOM高通量系统评价多个候选靶点的编辑效率。本发明将高通量平台Hi‑TOM系统与原生质体瞬时转化进行结合，能够快速筛选精准、高效的靶点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于原生质体高通量筛选林木CRISPR/Cas基因编辑系统候选靶点的方法。
背景技术
随着现代分子育种技术的发展，基因编辑技术为林木重要性状遗传改良与分子育种提供了重要技术支撑。然而对于CRISPR/Cas基因编辑系统而言，靶点设计是实现精准靶向目的基因的前提，如何保证其精准、高效的靶向，仍然是基因编辑技术中的重要问题。在先前研究中，研究者们利用传统的稳定遗传转化对靶点的编辑效率进行检测，然而由于稳定转化的周期长、工作量大，增大了筛选靶点的难度；另一方面，在靶点检测时，传统方法是先利用PCR扩增靶点附近区域、连接T载体并挑取单克隆进行一代测序，然而该方法通量低、花费高、耗时长且很难解析基因编辑常见的低频突变以及复杂突变。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于原生质体高通量筛选林木CRISPR/Cas基因编辑系统候选靶点的方法，具有通量高、准确性强等优点，能够快速筛选精准、高效的靶点。
本发明提供了一种高通量筛选林木CRISPR/Cas基因编辑系统候选靶点的方法，包括以下步骤：(1)将目的基因的若干候选靶点构建到表达Cas蛋白的骨架载体上，提取质粒；
(2)将步骤(1)提取得到的所述质粒瞬转至提取自林木组织的原生质体中，得基因编辑原生质体；
(3)以步骤(2)所述基因编辑原生质体的DNA为模板，与引物对配制PCR扩增体系，进行扩增反应；对扩增产物进行测序并结合Hi-TOM高通量系统评价候选靶点的编辑效率；所述引物对根据所述候选靶点的区域设计得到。
优选的，步骤(1)中所述候选靶点的数量超过1个。
优选的，步骤(1)中提取得到的质粒浓度大于1000ng/μL。
优选的，步骤(2)所述原生质体的浓度为(0.5～1)×107protoplasts/ml，活性为80％以上。
优选的，步骤(2)所述瞬转时，所述质粒和原生质体的体积比为100μL：1ml。
优选的，步骤(2)所述瞬转包括利用PEG/Ca2+介导的方法进行瞬时转化。
优选的，步骤(3)所述PCR扩增体系中还包括Taq高保真酶。
优选的，步骤(3)所述扩增产物的片段长度为150～300bp。
优选的，步骤(3)中利用Hi-TOM高通量系统测定的数据量为5000reads以上。
优选的，步骤(3)中将编辑效率超过60％的靶点认定为精准和高效的靶点。
有益效果：本发明提供了一种高通量筛选林木CRISPR/Cas基因编辑系统候选靶点的方法，包括将多个候选靶点构建到表达Cas蛋白的骨架载体中并提取质粒；分离林木原生质体，利用提取的质粒进行瞬时转化；提取经瞬时转化的原生质体DNA，根据靶点区域设计特异性引物，利用PCR扩增，结合Hi-TOM高通量系统评价多个候选靶点的编辑效率。本发明将具有极高灵敏度和准确性的基于二代测序的高通量平台Hi-TOM系统与原生质体瞬时转化进行结合，能够快速筛选精准、高效的靶点，克服了林木遗传转化过程繁琐、耗时长等问题，为后续利用遗传转化技术解析林木重要性状的遗传基础、加速优质良种选育工作提供了关键技术支撑。
附图说明
图1为本发明所述方法的流程示意图；
图2为对瞬时转化后的原生质体进行DNA提取的效果图，其中泳道M1为λ-HindIIIdigest Marker，1、2为瞬时转化后的原生质体DNA电泳胶图。
具体实施方式
本发明提供了一种高通量筛选林木CRISPR/Cas基因编辑系统候选靶点的方法，包括以下步骤：(1)将目的基因的若干候选靶点构建到表达Cas蛋白的骨架载体上，提取质粒；
(2)将步骤(1)提取得到的所述质粒瞬转至提取自林木组织的原生质体中，得基因编辑原生质体；
(3)以步骤(2)所述基因编辑原生质体的DNA为模板，与引物对配制PCR扩增体系，进行扩增反应；对扩增产物进行测序并结合Hi-TOM高通量系统评价候选靶点的编辑效率；所述引物对根据所述候选靶点的区域设计得到。
本发明将目的基因的若干候选靶点构建到表达Cas蛋白的骨架载体上，提取质粒。本发明所述候选靶点优选通过生物信息学筛选得到，实施例中通过对3个候选靶点进行验证对所述方法进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
本发明所述表达Cas蛋白的骨架载体优选为CRISPR/Cas骨架载体，对具体的载体种类并没有特殊限定，只要能够表达Cas蛋白即可，如实施例中选用pRGRB32载体。本发明将选定的多个候选靶点的基因序列插入到所述CRISPR/Cas骨架载体中，待确认完成了重组，再提取质粒。本发明需要获得大量高浓度、高纯度质粒DNA，要求质粒浓度大于1000ng/μL，OD260/280为1.8，总量为100μl；本发明对所述的提取质粒的方法并没有特殊限定，如实施例中选用康为世纪质粒提取试剂盒提取质粒。
提取质粒后，本发明利用提取得到的所述质粒瞬转提取自林木组织的原生质体，得基因编辑原生质体。本发明应用于瞬时转化所用的原生质体优选提取自林木的叶片。本发明对所述原生质体的分离提取方法并没有特殊限定，所述原生质体的浓度优选为(0.5～1)×107protoplasts/ml，活性为80％以上。
本发明利用所述质粒瞬转所述原生质体，所述瞬转的方法优选包括PEG/Ca2+介导的方法，且瞬转时，原生质体和质粒的体积比优选为10:1，即将100μL步骤(1)中的质粒加入到1ml所述原生质体中。
得基因编辑原生质体后，本发明利用所述基因编辑原生质体的DNA为模板，与引物对配制PCR扩增体系，进行扩增反应；对扩增产物进行测序并结合Hi-TOM高通量系统评价候选靶点的编辑效率；所述引物对根据所述候选靶点的区域设计得到。本发明在所述瞬转后，优选还包括孵育，所述孵育的时间优选为16h；而后将孵育16h的原生质体进行离心处理并去除上清，提取DNA。本发明所述离心处理优选为1500rpm离心3min，去除800μL上清，保留约300～400μL左右含有原生质体的液体，提取DNA的方法没有特殊限定，优选诺唯赞DNA提取试剂盒。
本发明利用提取得到的DNA为模板，利用根据靶点区域设计特异性引物进行PCR扩增，设计引物时检测位点优选在正向或反向引物10～100bp范围内，扩增长度优选在150～300bp范围内。本发明构建的PCR扩增体系中优选还包括Taq酶，更优选为Taq高保真酶。本发明进行PCR扩增后，结合Hi-TOM高通量系统评价候选靶点的编辑效率，本发明优选利用Hi-TOM技术评价候选靶点的编辑效率，且测定的读长read数目优选为5000read以上。
在本发明中，将编辑效率超过60％的靶点认定为精准和高效的靶点。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种基于原生质体高通量筛选林木CRISPR/Cas基因编辑系统候选靶点的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
根据图1所示流程进行MYB84基因编辑靶点的确认：
步骤S1，基于MYB84基因序列(SEQ ID No.1)和生物信息学预测，筛选3个靶点作为靶位点，利用边酶切边连接的方法将3个靶位点依次连接，利用BsaI(NEB)酶切pRGRB32载体，利用T4连接酶(NEB)将串联靶点序列克隆到pRGRB32载体中，并通过测序确认重组质粒序列。利用康为世纪质粒提试剂盒大量提取重组质粒，利用Qubit荧光光度计检测质粒DNA浓度，利用NanoDrop 2000微量分光光度计检测质粒DNA纯度，最终获得100μl浓度大于1000ng/μl的质粒DNA。
表1生物信息学预测的3个靶点
| 靶点序列 | SEQIDNo. | |
| 靶点1-1 | AGAAATAAACGAGAGCTTCA | 2 |
| 靶点1-2 | ACAAAGCCCTTACTGGCCAG | 3 |
| 靶点1-3 | CTCGACGGTTCAAGCAGACA | 4 |
步骤S2，分离原生质体，取培养4～5周的毛白杨良种‘1316’组培苗的第3～6片功能叶切成细丝，在黑暗条件下利用1.5％纤维素酶、0.5％果胶酶和0.5％离析酶对叶片进行酶解，酶解时间为5h；利用40目尼龙膜细胞筛过滤杂质，100g离心3min，弃上清，加入预冷的W5溶液，轻弹底部，重选原生质体，100g离心3min，弃上清，加入MMG溶液并进行重悬，调整原生质体浓度为(0.5～1)×107protoplasts/ml，置于冰上30min。
步骤S3，对原生质体悬液进行瞬时转化，主要包括以下步骤：
在灭菌后的10ml离心管中依次加入100μL步骤S1中的质粒DNA、1ml步骤S2中的原生质体悬液、1.1ml PEG/Ca2+溶液，轻弹管壁混匀，转入黑暗条件室温孵育15min；
沿管壁加入4.4ml W5溶液，轻弹管壁，终止反应，100g离心3min，弃上清，沿管壁加入1ml W5，100g离心3min，再次弃上清，沿管壁加入1ml W5，轻弹混匀，此时离心管内剩余大约1.1～1.2ml悬液；
将所有液体再转入一个提前用BSA溶液润洗过的离心管中(2ml EP管，横放)，室温黑暗条件孵育16h。
步骤S4，将孵育完成的原生质体悬液1500rpm、离心3分钟，弃上清，保留约300～400μL左右原生质体悬液，利用诺唯赞DNA提取试剂盒提取DNA，利用NanoDrop 2000微量分光光度计检测DNA纯度，利用琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1％、电压120V、时间45min)检测DNA完整性(图2)。
步骤S5，根据步骤S1中靶点位置设计引物，使检测位点在正向或反向引物10～100bp范围内，并在正向引物前端添加搭桥序列5’-ggagtgagtacggtgtgc-3’；反向引物前端添加搭桥序列5’-gagttggatgctggatgg-3’，具体引物如表2所示；根据诺唯赞高保真酶说明书进行扩增，最终扩增长度为297bp；利用Hi-TOM高通量系统进行二代测序，数据量为5000reads；最后依据原始序列进行数据分析，筛选高效的靶点位置，具体结果如表3-5所示，其中靶点1-2的编辑效率最高，为62.25％。
表2根据靶点位置设计的引物
| 引物名称 | 序列(5’to3’) | SEQIDNo. |
| MYB84-check-F | ggagtgagtacggtgtgcGCTAGTCTCAAGCAAGAAATCA | 5 |
| MYB84-check-R | gagttggatgctggatggCACATCTATGGAGTTTGTGTAT | 6 |
表3靶点1-1的编辑效率
表4靶点1-2的编辑效率
表5靶点1-3的编辑效率
实施例2
根据图1所示流程进行PXC1基因编辑靶点的确认：
步骤S1，基于PXC1基因序列(SEQ ID No.35)。
其余步骤同实施例1，最后依据原始序列进行数据分析，筛选高效的靶点位置，具体结果如表7-9所示，其中靶点2-2的编辑效率最高，为60.79％。
表6生物信息学预测的3个靶点
| 靶点序列 | SEQIDNo. | |
| 靶点2-1 | TGCCGTGAGTGTCAGTTTGG | 36 |
| 靶点2-2 | GAGAGAAACCACACGGCCGG | 37 |
| 靶点2-3 | CCACGCGGTGGGGAAACCAC | 38 |
表7根据靶点位置设计的引物
| 引物名称 | 序列(5’to3’) | SEQIDNo. |
| PXC1-check-F | ggagtgagtacggtgtgcCTGTCCGCACCTCTCTTACTG | 39 |
| PXC1-check-R | gagttggatgctggatggGAGAAAGTGAAGTGATGGGC | 40 |
表8靶点2-1的编辑效率
表9靶点2-2的编辑效率
表10靶点2-3的编辑效率
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种高通量筛选林木CRISPR/Cas基因编辑系统候选靶点的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将目的基因的若干候选靶点构建到表达Cas蛋白的骨架载体上，提取质粒；
(2)将步骤(1)提取得到的所述质粒瞬转至提取自林木组织的原生质体中，得基因编辑原生质体；
(3)以步骤(2)所述基因编辑原生质体的DNA为模板，与引物对配制PCR扩增体系，进行扩增反应，对扩增产物进行测序并结合Hi-TOM高通量系统评价候选靶点的编辑效率；所述引物对根据所述候选靶点的区域设计得到。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)中所述候选靶点的数量超过1个。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)中提取得到的质粒浓度大于1000ng/μL。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)所述原生质体的浓度为(0.5～1)×107protoplasts/mL，活性为80％以上。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤(2)所述瞬转时，所述质粒和原生质体的体积比为100μL：1ml。
6.根据权利要求1或5所述方法，其特征在于，步骤(2)所述瞬转包括利用PEG/Ca2+介导的方法进行瞬时转化。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)所述PCR扩增体系中还包括Taq高保真酶。
8.根据权利要求1或7所述方法，其特征在于，步骤(3)所述扩增产物的片段长度为150～300bp。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(3)中利用Hi-TOM高通量系统测定的数据量为5000reads以上。
10.根据权利要求1或9所述方法，其特征在于，步骤(3)中将编辑效率超过60％的靶点认定为精准和高效的靶点。
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2024
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