CN118086223A - 一种热稳定性高的空肠弯曲杆菌噬菌体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种热稳定性高的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP‑CJ‑22003，所述噬菌体RDP‑CJ‑22003的保藏编号为：CGMCC NO.45407。同时公开了该噬菌体在预防和治疗空肠弯曲杆菌病的药物中的应用，以及在制备家禽饲料添加剂和消毒剂等方向的应用。本发明提供的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP‑CJ‑22003在60℃处理60min，效价仅下降一个数量级，仍保持在10⁷pfu/mL，经70℃处理60min，80℃处理10min，效价仍保持在10⁵pfu/mL，对温度有较高的耐受性，RDP‑CJ‑22003对温度具有较高的耐受性，在噬菌体的生产、运输和存储中有非常重要的意义。且在家禽肠道中广泛存在，易分离，产品开发周期短；对其宿主具有专一性，不会损害正常的肠道菌群；为工业化生产噬菌体用于预防或者治疗空肠弯曲杆菌病的防治、环境消毒提供了噬菌体来源。

Description

一种热稳定性高的空肠弯曲杆菌噬菌体及其应用

技术领域

本发明涉及噬菌体技术领域，特别涉及一种热稳定性高的空肠弯曲杆菌噬菌体及其应用。

背景技术

空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)是世界范围内引起人类细菌性肠胃炎最常见的的人兽共患病原菌之一，在每年感染弯曲杆菌的约900万人中，空肠弯曲杆菌引发的病例数约占90％，结肠弯曲杆菌引发的病例数约占10％。空肠弯曲杆菌作为家禽体内常见的寄生细菌，通常对家禽不具有致病性，却会威胁人类的健康。有实验表明，最低口服500-800CFU空肠弯曲杆菌就会导致人感染弯曲杆菌病。家禽，尤其是鸡在整个生产过程中持续地向外部环境进行排菌，严重影响了人的安全与健康。

家禽作为空肠弯曲杆菌最常见的宿主，被认为是空肠弯曲杆菌病最主要的来源。空肠弯曲杆菌可以在家禽肠道内大量定殖，并通家禽生产过程进行传递，最终传播给人，对人类的生命健康造成威胁。

大量研究发现，鸡群通常在2-3周后开始出现弯曲杆菌的感染，且一旦有一只鸡感染，弯曲杆菌便会通过粪口、食物和水源等途径在数天之内迅速感染整个鸡群。基于弯曲杆菌的传播特点，养殖环节中，弯曲杆菌的防控手段主要包括以下三类：①通过生物安全措施阻断弯曲杆菌的传播；②使用抗菌物质降低鸡体内的弯曲杆菌定殖水平；③通过免疫等方式增强鸡群对弯曲杆菌的抵抗能力。

在家禽屠宰过程中，空肠弯曲杆菌的污染问题无法得到彻底的控制，会造成下游生产环节的空肠弯曲杆菌污染。鸡群初始污染水平对屠宰过程中的弯曲杆菌污染水平有着显著的影响。低感染鸡群的屠宰流程中鸡群阳性率都维持在极低水平，到分割环节阳性率仅为2.00％，而高感染组鸡群在进入屠宰生产线后，鸡胴体样品阳性率迅速升高，到分割环节阳性率高达80.00％，这证明了在养殖环节控制弯曲杆菌的污染水平，能够有效地降低屠宰环节中的弯曲杆菌污染水平。

在养殖过程中，可通过喂服兽药，在饲料中添加抑菌杀菌成分的饲料添加剂，喂服有抑菌效果的益生菌或多糖类添加剂等方式控制空肠弯曲杆菌的污染水平。其中，因鸡的消化道相对较短，肠道黏膜屏障脆弱，在集约化养殖条件下，与长消化道动物相比更加容易受到不良微生物的侵害，导致各类疾病的发生。使用饲料添加剂是防治肠道疾病、改善肉鸡和蛋鸡生产性能的有效手段之一。

饲料添加剂常以饲料颗粒形式存在，饲料颗粒化的优点是减少了运输与投料过程的饲料损失。增加了可口性。限制动物对饲料的选择，减少饲料的浪费，在制作颗粒化饲料添加剂过程中通常会经过60-100℃的高温，对用以生产的噬菌体热稳定性有很高的热稳定性要求。

因此，亟待开发一种热稳定性高的、耐酸碱的、稳定遗传且裂解率高的噬菌体产品用于防治空肠弯曲杆菌。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的不足，提供一种热稳定性高的空肠弯曲杆菌噬菌体及其应用。本申请在家禽养殖场进行了空肠弯曲杆菌噬菌体的分离，并利用不同分型的空肠弯曲杆菌完成噬菌体的初步筛选。在此基础上，筛选高热稳定性的噬菌体，并对其进行热稳定性的测定和其他生物学性能的测定，从中分离得到一株高热稳定性的空肠弯曲杆菌噬菌体。

本发明具体技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种热稳定性高的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003，所述噬菌体RDP-CJ-22003的保藏编号为：CGMCC NO.45407

第二方面，本发明提供了一种杀菌组合物，包括如第一方面所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003。

进一步的，所述杀菌组合物中还包括用于抗空肠弯曲杆菌的抗生素。

进一步的，所述抗生素包括β-内酰胺类、氨基糖类、四环素类、大环内酯类、林可胺类、多肽类、多磷类中的任意一种。优选的，所述抗生素包括阿莫西林、安普霉素、阿米卡星、新霉素、单硫酸卡那霉素、多西环素、氟苯尼考、金霉素、土霉素、泰乐菌素、替米考星、林可霉素、黏菌素、磷霉素钠中的任意一种。

第三方面，本发明还提供了第一方面所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003或者第二方面所述的杀菌组合物在制备预防和/或治疗空肠弯曲杆菌感染的疾病的药物中的应用。同时，本发明还提供了第一方面所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003或者第二方面所述的杀菌组合物在制备预防和/或治疗空肠弯曲杆菌感染的疾病的饲料中的应用。

第四方面，本发明提供了一种生物制剂，所述生物制剂的有效成分包括如第一方面所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003或者第二方面所述的杀菌组合物。

第五方面，本发明提供了一种饲料添加剂，所述饲料添加剂的有效成分包括如第一方面所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003或者第二方面所述的杀菌组合物。

第六方面，本发明提供了一种家禽饲料，所述饲料包含第五方面所述的饲料添加剂。

第七方面，本发明还提供了一种消毒剂，所述消毒剂的有效成分包括如第一方面所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003。

本发明具有如下优点：

1、本发明提供的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003在家禽肠道中广泛存在，易分离，产品开发周期短；对其宿主具有专一性，不会损害正常的肠道菌群；此外，还具有自我复制和自限性特征等优点，为工业化生产噬菌体用于预防或者治疗空肠弯曲杆菌病的防治、环境消毒提供了噬菌体来源。

2、本发明提供的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003在pH6-8的条件下，37℃培养1h后，其效价仅下降1个数量级，效价仍保持在108pfu/mL以上，说明RDP-CJ-22003有较好的耐酸碱性能。

3、本发明提供的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003在60℃处理60min，效价仅下降一个数量级，仍保持在107pfu/mL，经70℃处理60min，80℃处理10min，效价仍保持在105pfu/mL，对温度有较高的耐受性，RDP-CJ-22003对温度具有较高的耐受性，在噬菌体的生产、运输和存储中有非常重要的意义。

4、本发明提供的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003连续传30代后，测定其效价，其效价稳定在108pfu/mL以上，说明该噬菌体具有较好的遗传稳定性，适合工业化生产。

5、本发明提供的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003裂解率达97.88％，对宿主有良好的裂解效果，适合在养殖过程中使用。

6、本发明提供的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003与抗生素协同作用，是一种安全、高效、廉价的防控抗生素耐药空肠弯曲杆菌的方法，实验证明，通过与多种抗生素的协同实验，证实该噬菌体可以与β-内酰胺类、氨基糖类、四环素类、大环内酯类、林可胺类、多肽类和多磷类抗生素有较好的协同作用，可以有效降低抗生素的使用量，将其MIC降至至原来的1/2-1/16，提高养殖收益，保障食品安全、保护消费者健康。

7、本发明提供的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003与课题组前期成果噬菌体RDP-CJ-22002相比，在热稳定性方面具有显著进步。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一种实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1：本发明空肠弯曲杆菌镜检照片；

图2：本发明空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003的电镜照片；

图3：本发明空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003的酸碱稳定性曲线；

图4：本发明空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003的热稳定性曲线；

图5：本发明空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003的遗传稳定性曲线；

图6：本发明空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003的一步生长曲线；

图7：本发明空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003与RDP-CJ-22002的热稳定性对比曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1：空肠弯曲杆菌噬菌体的分离

1.1样品处理：

将鸡肠道内容物、粪便用生理盐水浸泡8-12小时。离心6000rpm，20min，用0.45μm的膜过滤除菌，备用。

1.2共培养：

取100μL宿主菌液(空肠弯曲杆菌)与200μL过滤液置于5mL SM液体培养基中，42℃，微氧条件下过夜培养。

1.3空肠弯曲杆菌分离与鉴定

1.3.1病料采集：

无菌条件下采集病死鸡的肝脏组织和盲肠。

鸡感染空肠弯曲杆菌发病，腹腔内有大量红色腹水，肝脏肿大质脆、边缘钝圆、表面有黄白色坏死灶，脾和肾苍白肿大、有针尖大小的出血点，心肌苍白、心冠有出血斑点，有的病鸡小肠黏膜有充血、出血，盲肠淋巴充血，有的病死鸡卵巢变性、卵泡破裂。

1.3.2空肠弯曲杆菌的富集

将肝脏病料研磨液和盲肠内容物接种于SM培养基增菌，37℃微需氧条件培养6-8h。

1.3.3空肠弯曲杆菌的纯化

将肝脏和盲肠内容物涂布于CCDA培养基，同时将肝脏研磨液和盲肠内容物增菌液划线于CCDA培养上，挑取CCDA培养基上的疑似菌落(无色半透明毛玻璃样小菌落，单个菌落呈中心凸起，周边不规则)再次换线纯化1-2次，最后划线于哥伦比亚血平板上扩大培养。

1.3.4空肠弯曲杆菌的鉴定：

镜检：

如图1所示，空肠弯曲杆菌革兰氏阴性弯曲杆菌，呈逗点状、螺旋状或S状。

分子鉴定：

采用革兰氏阴性菌核酸提取试剂盒提取DNA，选用空肠弯曲杆菌MaqA引物、弯曲杆菌属16SrRNA、结肠菌ceuE基因的多重PCR进一步鉴定。反应体系和反应条件分别如表1和表2所示。

表1 PCR反应体系

表2 PCR反应条件

1.4噬菌体分离和纯化

采用双层平板法进行噬菌体的分离。将共培养液12000rpm，10min离心，过0.22μm的膜备用。取100μL过滤清液与100μL菌液置于上层培养基中，铺双层平板，42℃，微氧条件下培养48h。扣取较大较亮的噬菌斑进一步纯化，纯化3-4次，直至噬菌斑大小均匀为止。

SM液体培养基成分(g/L)：胰酪蛋白胨：2.5，酵母浸粉：5.0，蛋白胨：15.0，氯化钠：5.0，PH：7.2-7.6。

上层培养基成分成分(g/L)：胰酪蛋白胨：2.5，酵母浸粉：5.0，酵母蛋白胨：15.0，氯化钠：5.0，氯化镁：0.01，氯化钙：0.01，琼脂：7.0，PH：7.2-7.6。

1.5噬菌体的保藏：

扣取纯化好的噬菌斑，置于灭菌后的生理盐水中，浸泡20-30min，过0.22μm的滤芯除菌，10倍稀释过滤液，取适当浓度的稀释液100μL与200μL菌液置于上层培养基中，铺双层平板，42℃，微氧条件下培养48h。选取云雾状的平板，用生理盐水浸泡平板，然后刮取上层至50mL离心管中，振荡5-10min，5000rpm，10min，离心，用注射吸取清液，过0.22μm的膜，然后与冻干保护剂(16％脱脂奶粉，2％甘露醇，0.5％维生素C)1∶1混合均匀，分装于安瓿管中，置于冻干机中预冻4-6h后，然后真空冷冻干燥36-48h，对冻干后的样品，抽真空封存。

1.6透射电镜观察噬菌体的形态

1.6.1实验方法：

取高于10⁵PFU/mL噬菌体样品50μL滴于微孔铜网上，沉淀1min，用滤纸吸去多余的液体。在铜网上滴加50μl的1％的磷钨酸(PTA)，染色5min，用滤纸吸去多余的染液，干燥后用透射电镜观察并拍照，透射电镜图如图2所示。

1.6.2实验结果及分析

如图2所示，电镜条件测定得到，该噬菌体有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约40nm，有尾，尾长约100nm，基因长度105895bp。根据病毒分类国际委员会(ICTV)的定义，该噬菌体的形态符合肌尾噬菌体科的特征，属于肌尾噬菌体科，并将该噬菌体命名为RDP-CJ-22003。

该噬菌体于2023年1月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.45407，请求保藏单位为瑞科盟(青岛)生物工程有限公司，分类命名为空肠完全杆菌噬菌体，命名为RDP-CJ-22003，目前状态为存活。

1.7噬菌体的基因组分析

噬菌体RDP-CJ-22003的基因组序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

通过对全基因分析，发现该噬菌体不含有毒力基因和溶原性基因，从分子水平上证明噬菌体的安全性，进一步发现，基因中含有3个裂解酶基因，可以更有效的裂解病原菌，增强噬菌体的杀菌效果。

实施例2：空肠弯曲杆菌噬菌体酸碱稳定性

2.1实验方法

用稀盐酸和稀NaOH溶液调节生理盐水的酸碱度，配成pH值为3、4、5、6、7、8、9、10、11的缓冲液，再用配置好的缓冲溶液将噬菌体稀释成1*10⁸fu/mL，将稀释液在42℃，水浴1h，用生理盐水10倍比稀释后铺双平板测定效价。42℃，微氧条件下培养48h。

2.2实验结果

实验结果显示，如图3所示，在pH6-8的条件下，37℃培养1h后，其效价仅下降1个数量级，效价仍保持在10⁸pfu/mL以上，说明RDP-CJ-22003有较好的耐酸碱性能。该特性在治疗疾病过程中有很好的应用价值，RDP-CJ-22003本身具有高的活性，且对酸碱具有较好的耐受性，这可以保证有足够数量的噬菌体到达肠道发挥杀菌作用。

实施例3：空肠弯曲杆菌噬菌体热稳定性

3.1实验方法

将噬菌体原液分装到50毫升灭菌离心管中，分别在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃和90℃的条件下孵育10min、30min和60min，然后用生理盐水10倍梯度稀释后，铺双平板测定其效价。

3.2实验结果

由图4可知随温度的升高和时间的延长，噬菌体效价逐渐下降，在60℃处理60min，效价仅下降一个数量级，仍保持在10⁷pfu/mL，经70℃处理60min，80℃处理10min，效价仍保持在10⁵pfu/mL，对温度有较高的耐受性，RDP-CJ-22003对温度具有较好的耐受性。该特性在噬菌体的生产、运输和存储中有非常重要的意义。

实施例4：空肠弯曲杆菌噬菌体遗传稳定性

4.1实验方法

将RDP-CJ-22003连续传代30次，每代培养基中加入等量的RDP-CJ-22001和BCJ-22003，每代培养时间36h，然后铺双平板，测定其效价。

4.2实验结果

实验结果如图5所示，将RDP-CJ-22003连续传30代后，测定其效价，其效价稳定在10⁸pfu/mL以上，说明该噬菌体具有较好的遗传稳定性，适合工业化生产。

实施例5：空肠弯曲杆菌噬菌体最佳感染复数(MOI)

5.1实验方法

按照感染复数为10∶1、1∶1、1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000的比例将噬菌体增殖液和宿主加入液体培养基中，并且确保培养体系的总体积相同。42℃，微氧条件下培养12h，常温下12000r/min离心5min，取上清液铺双平板测定其效价。42℃，微氧条件下培养48h。

5.2实验结果

实验结果如表3所示，当感染复数为1∶10时，培养12h后，此时效价最高，说明RDP-CJ-22003的最佳感染复数为1∶10。

表3最佳感染复数实验结果表

实施例6：空肠弯曲杆菌噬菌体一步生长曲线

6.1实验方法

取对数生长期的菌悬液，按照最佳感染复数的比例接种空肠弯曲杆菌CJ-22003和噬菌体RDP-CJ-22003，在42℃的条件下，水浴10min，然后常温下12000r/min离心5min，弃上清液，除去未吸附在宿主上的游离噬菌体，如此用液体培养基洗涤两次。再将沉淀重悬于42℃的液体培养基中，迅速置于42℃微氧环境下。定点取样测定其效价，以时间为横坐标，噬菌体效价对数值为纵坐标，绘制生长曲线，得出噬菌体的潜伏期、裂解期，并计算出平均裂解量为10⁶。平均裂解量＝暴发末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌浓度。

6.2实验结果

实验结果如图6所示，该噬菌体感染宿主菌后，40min效价没有明显变化，说明其潜伏期约为40min；噬菌体侵染宿主菌后的40-110min内，噬菌体数量急剧增加，可见噬菌体的裂解期约为70min；在随后的370min内，噬菌体数量基本不变，进入稳定生长期。最后计算出平均裂解量为165PFU/感染细胞。

实施例7：空肠弯曲杆菌噬菌体裂解率实验

7.1实验方法

无菌条件下，分别取1mL样品和1mL宿主菌菌液(1×10⁵CFU/mL)，42℃孵育15分钟，混匀后用生理盐水稀释至10^-1-10^-3个梯度，每个梯度取100μL涂布于固体平板上，42℃，微氧条件下培养48h，每个梯度重复两次。同时取1mL生理盐水和1mL宿主菌菌液(1×10⁵CFU/mL)作为空白对照，重复以上步骤。选取30-300个菌落数的平板进行计数。该试验重复3次，取其平均值。噬菌体裂解率＝(1-处理组菌落数/对照组菌落数)×100％。

7.2实验结果

实验结果如表4所示，RDP-CJ-22003的裂解率达97.88％，对宿主有良好的裂解效果，适合在养殖过程中使用。

表4空肠弯曲杆菌噬菌体裂解率实验数据

实施例8：空肠弯曲杆菌噬菌体的应用

8.1实验方法

本实施例通过考察噬菌体与抗生素的协同作用，提高抗生素的敏感性，降低抗生素用量。

方法如下：用LB培养基配制浓度为1.024％的抗生素溶液(其中氟苯尼考、多西环素、黏菌素、泰乐军属、新霉素浓度为0.1024％)于96孔板中先加入100uL灭菌LB培养基，于第1列孔中分别加入配好的药液100uL，依次倍比稀释至第11列，弃去，最后一列为阳性对照。再分别加入100uL纯化菌株菌悬液(增殖液稀释100倍)和再分别加入100uL菌和噬菌体，于42℃微氧条件下培养40-48。

8.2实验结果

实验结果如表5所示，空肠弯曲杆菌噬菌体与抗生素有较好的协同作用，可以将其MIC降低至原来的1/2-1/16，这在禽类养殖过程中，可以大幅减少抗生素的使用量，提高养殖效益，保障食品健康。

表5噬菌体与抗生素的协同作用实验数据

实施例9：空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003对比RDP-CJ-22002的优势提升

本发明的噬菌体RDP-CJ-22003与课题组前期成果噬菌体RDP-CJ-22002进行对比分析，本申请的噬菌体RDP-CJ-22003在热稳定性方面具有显著进步。

实验结果如图7所示，随温度的升高和时间的延长，噬菌体效价逐渐下降，RDP-CJ-22003在60℃处理60min，效价仅下降一个数量级，仍保持在107pfu/mL，而RDP-CJ-22002在60℃处理60min，效价下降两个数量级；RDP-CJ-22003经70℃处理60min，效价仍保持在105pfu/mL，对温度有较好的耐受性，而RDP-CJ-22002经70℃处理60min后效价仅有10³pfu/mL。

上面以举例方式对本发明进行了说明，但本发明不限于上述具体实施例，凡基于本发明所做的任何改动或变型均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种热稳定性高的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003，其特征在于，所述噬菌体RDP-CJ-22003的保藏编号为：CGMCC NO.45407。

2.一种杀菌组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003。

3.根据权利要求2所述的一种杀菌组合物，其特征在于，组合物中还包括用于抗空肠弯曲杆菌的抗生素。

4.根据权利要求3所述的一种杀菌组合物，其特征在于，所述抗生素包括β-内酰胺类、氨基糖类、四环素类、大环内酯类、林可胺类、多肽类、多磷类中的任意一种。

5.根据权利要求1所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003或者权利要求2-4任一项所述的杀菌组合物在制备预防和/或治疗空肠弯曲杆菌感染的疾病的药物中的应用。

6.根据权利要求1所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003或者权利要求2-4任一项所述的杀菌组合物在制备预防和/或治疗空肠弯曲杆菌感染的疾病的饲料中的应用。

7.一种生物制剂，其特征在于，所述生物制剂的有效成分包括如权利要求1所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003或者权利要求2-4任一项所述的杀菌组合物。

8.一种饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂的有效成分包括如权利要求1所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003或者权利要求2-4任一项所述的杀菌组合物。

9.一种家禽饲料，其特征在于，所述饲料包含权利要求8所述的饲料添加剂。

10.一种消毒剂，其特征在于，所述消毒剂的有效成分包括如权利要求1所述的空肠弯曲杆菌噬菌体RDP-CJ-22003。