CN118086200A - 一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于细胞工程技术领域，具体涉及一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法。为了找一种适用于食蟹猴骨髓单个核细胞的简便分离方法，本发明使用含有肝素钠的RPMI‑1640培养基稀释食蟹猴骨髓样本，并优化Ficoll‑Paque PREMIUM分离液与骨髓样品的比例，优化出一种适用于食蟹猴骨髓单个核细胞分离的方法。利用本发明方法分离的食蟹猴骨髓单个核细胞具有更好的细胞活性，且操作简单方便，从而克服了目前常用的骨髓单个核细胞分离法对技术人员的操作要求高，且分离后的细胞存活率较低的问题。
Description
技术领域
本发明属于细胞工程技术领域，具体涉及一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法。
背景技术
食蟹猴(Macaca fascicularis Raffles)，又名长尾猴、爪哇猴，属于灵长目猴科属动物。食蟹猴作为非人灵长类动物，在组织结构、病理、生理、代谢及免疫调节等方面与人类高度相似，是研究人类疾病病理生理特征及诊疗手段的理想模式动物。
骨髓单个核细胞(Bone Marrow Mononuclear Cells，BMMNCs)是一群混合细胞，其中包含众多目前研究证实具有重要治疗潜力及生物学功能的细胞类型，如间充质干细胞、造血干细胞、内皮祖细胞、单核细胞和T细胞等，这些细胞正被广泛应用于人类疾病机理及诊疗方法的研究中。
目前报道的单个核细胞的分离方法多是以外周血为主体展开的，主要有密度梯度离心法、流式细胞仪分选法及免疫磁珠法等。此外，近年来也出现了一些基于上述分离方法的单个核细胞分离试剂盒。其中，流式细胞仪分选法及免疫磁珠法对细胞损伤较大，且价格成本相对较高，而密度梯度离心法相对而言成本更低，因而得到了广泛应用。但目前常用的骨髓单个核细胞分离法对技术人员的操作要求较高，且由于骨髓与外周血的密度等理化特征并不完全一致，导致基于外周血分离得到的单个核细胞存活率较低。比如，中国发明专利CN104774805A公开了一种分离骨髓单个核细胞的方法，利用明胶溶液破坏红细胞表面电荷而加速红细胞的沉积，进而避免MNCs可能混杂红细胞，不利于MNCs收集的问题。但该方法对于单个核细胞的存活率没有显著影响，不能有效提高单个核细胞的存活率。同时，目前尚无专门针对食蟹猴骨髓单个核细胞分离方法的报道。因此，寻找一种适用于食蟹猴骨髓单个核细胞的简便分离方法具有十分重要的现实意义。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法，解决了目前常用的骨髓单个核细胞分离法对技术人员的操作要求高，且分离后的细胞存活率较低的问题。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供了一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法，所述分离方法包括以下步骤：
S1、将食蟹猴新鲜骨髓与含肝素钠RPMI-1640培养基混匀，再将其加入Ficoll-Paque PREMIUM分离液中，室温静置后离心弃上层液体，并吸取中间白色层细胞，即为骨髓单个核细胞；
S2、将骨髓单个核细胞与RPMI-1640培养基混合均匀，离心弃上清后即得到食蟹猴骨髓单个核细胞。
优选地，步骤S1中，所述食蟹猴新鲜骨髓与Ficoll-Paque PREMIUM分离液的体积比为3:3-7。食蟹猴新鲜骨髓与Ficoll-Paque PREMIUM分离液的体积比更优选为3:3-5。
本发明使用含有肝素钠的RPMI-1640培养基稀释食蟹猴骨髓样本，并优化Ficoll-Paque PREMIUM分离液与骨髓样品的比例，使分离得到的食蟹猴骨髓单个核细胞具有更好的细胞活性，且操作简单方便，是一种适用于食蟹猴骨髓单个核细胞分离的方法，有望解决目前常用的骨髓单个核细胞分离法对技术人员的操作要求高，且分离后的细胞存活率较低的问题。
优选地，步骤S1中，所述食蟹猴新鲜骨髓与含肝素钠RPMI-1640培养基的体积比为3:2-5。食蟹猴新鲜骨髓与含肝素钠RPMI-1640培养基的体积比更优选为3:2-3
优选地，步骤S1中，所述含肝素钠RPMI-1640培养基的肝素钠浓度为9000-12000U/mL。含肝素钠RPMI-1640培养基的肝素钠浓度更优选为10000U/mL。
优选地，步骤S1中，所述Ficoll-Paque PREMIUM分离液的密度为1.085g/mL。
优选地，步骤S1中，所述离心为18-20℃恒温条件下，800g升速5-9降速2-5条件下离心20-30min。
优选地，步骤S2中，所述离心为18-20℃恒温条件下，200-500g离心4-10min。
优选地，步骤S1、S2均在室温(23-25℃)条件下、生物安全柜内操作(离心除外)，并严格遵守无菌操作。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明使用含有肝素钠的RPMI-1640培养基稀释食蟹猴骨髓样本，并优化Ficoll-Paque PREMIUM分离液与骨髓样品的比例，优化出一种适用于食蟹猴骨髓单个核细胞分离的方法。利用本发明方法分离的食蟹猴骨髓单个核细胞具有更好的细胞活性，且操作简单方便，克服了目前常用的骨髓单个核细胞分离法对技术人员的操作要求高，且分离后的细胞存活率较低的问题。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
实施例1一种简便的食蟹猴骨髓单个核细胞分离方法
该分离方法包括如下步骤：
(1)取食蟹猴新鲜骨髓3mL，并迅速转移至盛有3mL含肝素钠RPMI-1640培养基(含10000U/mL肝素钠)的无菌EP管中，上下颠倒使骨髓与含有肝素钠的培养基充分混合。
(2)取Ficoll-Paque PREMIUM(Cytiva，17544602)分离液(Cytiva，货号17544602，试剂的密度为1.085g/mL)5mL加至15mL无菌离心管中，室温(23～25℃)静置1min。
(3)取步骤(1)中的稀释后的骨髓样本5mL贴壁缓慢加入到步骤(2)中盛有Ficoll-Paque PREMIUM分离液的离心管中，室温静置2min。
(4)室温(23～25℃)条件下，800g升速6降速2条件下离心20min，吸弃离心管中的上层液体。
(5)小心吸取中间白色层细胞并转移至15mL无菌离心管中。
(6)取RPMI-1640培养基10mL(过量即可)加至步骤(5)的离心管中，轻轻旋转使骨髓单个核细胞与培养基混合均匀，以进一步洗去上一步可能混入的其他溶剂。
(7)室温(23～25℃)条件下，300g离心5min，弃上清，得到的沉淀即为食蟹猴骨髓单个核细胞。
(8)重悬细胞沉淀，取部分用于台盼蓝染色计数及活力检测。
步骤(1)-步骤(8)均在室温(23～25℃)条件下的生物安全柜内操作(离心除外)，并严格遵守无菌操作。
实施例2一种简便的食蟹猴骨髓单个核细胞分离方法
该分离方法包括如下步骤：
(1)取食蟹猴新鲜骨髓3mL，并迅速转移至盛有2mL含肝素钠RPMI-1640培养基(含10000U/mL肝素钠)的无菌EP管中，上下颠倒使骨髓与含有肝素钠的培养基充分混合。
(2)取Ficoll-Paque PREMIUM(Cytiva，17544602)分离液3.75mL加至15mL无菌离心管中，室温(23～25℃)静置1min。
(3)取步骤(1)中的稀释后的骨髓样本5mL贴壁缓慢加入到步骤(2)中盛有Ficoll-Paque PREMIUM分离液的离心管中，室温静置2min。
(4)室温(23～25℃)条件下，800g升速6降速2条件下离心20min，吸弃离心管中上层液体。
(5)小心吸取中间白色层细胞并转移至15mL无菌离心管中。
(6)取RPMI-1640培养基10mL(过量即可)加至步骤(5)的离心管中，轻轻旋转使骨髓单个核细胞与培养基混合均匀，以进一步洗去上一步可能混入的其他溶剂。
(7)室温(23～25℃)条件下，300g离心5min，弃上清，得到的沉淀即为食蟹猴骨髓单个核细胞。
(8)重悬细胞沉淀，取部分用于台盼蓝染色计数及活力检测。
步骤(1)-步骤(8)均在室温(23～25℃)条件下的生物安全柜内操作(离心除外)，并严格遵守无菌操作。
对比例1依据目前人或其他实验动物常用分离外周血单个核细胞的方法分离食蟹猴骨髓单个核细胞
该分离方法包括如下步骤：
(1)取食蟹猴新鲜骨髓3mL，并迅速转移至5mL肝素钠抗凝管中，上下颠倒使骨髓与抗凝管内的肝素钠充分混合。
(2)将步骤(1)抗凝管中的骨髓(3mL)转移至盛有3mL无菌生理盐水的无菌离心管中，轻轻旋转使骨髓与生理盐水混合均匀，静置1min。
(3)取淋巴细胞分离液LymphoprepTM5mL(密度为1.077g/mL)加至15mL无菌离心管中，室温(23～25℃)静置1min。
(4)取步骤(2)中的稀释后的骨髓样本5mL贴壁缓慢加到步骤(3)盛有淋巴细胞分离液LymphoprepTM的离心管中，室温静置2min。
(5)室温(23～25℃)条件下，800g升速6降速2条件下离心20min，吸弃离心管中上层液体。
(6)小心吸取中间白色层细胞并转移至15mL无菌离心管中。
(7)取RPMI-1640培养基10mL加至步骤(5)的离心管中，轻轻旋转使骨髓单个核细胞与培养基混合均匀。
(8)室温(23～25℃)条件下，300g离心5min，弃上清，得到的沉淀即为食蟹猴骨髓单个核细胞。
(9)重悬细胞沉淀，取部分用于台盼蓝染色计数及活力检测。
实验例1统计学处理
以实施例1、2，对比例1的方法分离提取食蟹猴骨髓单个核细胞，利用台盼蓝染色计数及活力检测方法测定各组细胞的相对活力，并在GrapPad Prism 9.3软件上对所得实验数据进行分析。数值型数据采用均数±标准差(Mean±SD)表示，两组间比较采用t检验，P<0.05被认为具有统计学意义。其中，细胞活力(％)＝分离后活细胞数/分离后总细胞数。
实验结果如表1所示，不难看出，根据实施例1、2获取的食蟹猴骨髓单个核细胞的细胞活力较对照例1组显著增加(P<0.05)。可见，使用本发明方法分离得到的食蟹猴骨髓单个核细胞具有更好的细胞活性，且操作简单方便，是一种适用于食蟹猴骨髓单个核细胞分离的方法，具有非常重要的应用前景。
表1不同分离方法获取的食蟹猴骨髓单个核细胞的细胞活力
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将食蟹猴新鲜骨髓与含肝素钠RPMI-1640培养基混匀，再将其加入Ficoll-PaquePREMIUM分离液中，室温静置后离心弃上层液体，并吸取中间白色层细胞，即为骨髓单个核细胞；
S2、将骨髓单个核细胞与RPMI-1640培养基混合均匀，离心弃上清后即得到食蟹猴骨髓单个核细胞。
2.根据权利要求1所述的一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法，其特征在于，步骤S1中，所述食蟹猴新鲜骨髓与含肝素钠RPMI-1640培养基的体积比为3:2-5。
3.根据权利要求1所述的一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法，其特征在于，步骤S1中，所述含肝素钠RPMI-1640培养基的肝素钠浓度为9000-12000U/mL。
4.根据权利要求1所述的一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法，其特征在于，步骤S1中，所述食蟹猴新鲜骨髓与Ficoll-Paque PREMIUM分离液的体积比为3:3-7。
5.根据权利要求1所述的一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法，其特征在于，步骤S1中，所述Ficoll-Paque PREMIUM分离液的密度为1.085g/mL。
6.根据权利要求1所述的一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法，其特征在于，步骤S1中，所述离心为室温条件下，800g升速5-9降速2-5条件下离心20-30min。
7.根据权利要求1所述的一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法，其特征在于，步骤S2中，所述离心为室温条件下，200-500g离心4-10min。
8.根据权利要求1所述的一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法，其特征在于，步骤S1、S2均在室温条件下、生物安全柜内操作，并严格遵守无菌操作。
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| CN202410357042.4A CN118086200A (zh) | 2024-03-27 | 2024-03-27 | 一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法 |
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| CN202410357042.4A CN118086200A (zh) | 2024-03-27 | 2024-03-27 | 一种食蟹猴骨髓单个核细胞的分离方法 |
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