CN118086131A - 一种六联益生菌冻干粉制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于益生菌制品技术领域，具体涉及一种六联益生菌冻干粉制剂及其制备方法和应用。所述六联益生菌冻干粉制剂的原料包括：鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01‑003冻干粉、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02‑009冻干粉、发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08‑016冻干粉、动物双歧杆菌乳亚种Bi‑07菌粉、动物双歧杆菌乳亚种Bb‑12菌粉、短双歧杆菌BB8菌粉、益生元、果蔬粉和甜味剂。本发明的益生菌冻干粉制剂不仅能够健胃整肠，调节儿童肠道菌群平衡，而且能够提高免疫力。
Description
技术领域
本发明属于益生菌制品技术领域，具体涉及一种六联益生菌冻干粉制剂及其制备方法和应用。
背景技术
益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收保持肠道健康的作用，从而产生有利于健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物。
肠道是人体最大的免疫器官，人体50％以上的淋巴组织分布于肠黏膜，肠道微生物对于调节人体健康有着重要的作用。并且，益生菌可以通过抑制病原微生物的生长来平衡局部微生物群，或益生菌通过分泌各种酶和酸刺激肠道黏膜和肠上皮细胞代谢，进而增强局部和全身免疫反应。益生菌通过多种方式和信号途径调节机体免疫，主要的途径包括TLRs信号通路，NF-KB，MAPKs，STAT通路等，通过益生菌的调节，可激发肠道免疫，同时影响机体整体的免疫系统。此外，乳杆菌还可通过调控免疫系统、细胞因子、肠道渗透、肠道菌群平衡和细菌定植等方式，调节机体炎症。因此，从肠道微生物入手，尝试找到调节免疫力的新方法，以克服现有治疗药物以及治疗方法副作用的缺陷。
中国发明专利CN109430407A公开了一种益生菌组合制剂，其按质量份数包括奶粉900份-1600份，甜味剂80份-180份，益生菌粉10份-28份以及益生菌保护剂800份-1000份；其中，益生菌粉包括总菌含量大于60亿cfu/g的鼠李糖乳杆菌LGG与动物双歧杆菌BB-12。上述益生菌组合制剂，适用于各种不同年龄段人士，一方面通过采用奶粉与甜味剂的搭配，使得益生菌组合制剂具有较浓的奶味口感，尤其适合儿童食用；另一方面具有调理肠道、防止腹泻、预防龋齿及提高机体免疫力等作用；再一方面有利于保护鼠李糖乳杆菌LGG与动物双歧杆菌BB-12活着抵达肠道并于其中定植，从而能够在肠道中快速增殖，且配合益生菌种的设计具有较好的防胀气效果。
中国发明专利CN109430666A公开了一种益生菌冻干粉固体饮料。该益生菌冻干粉固体饮料，含有低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、乳酸菌粉，所述乳酸菌粉，含有嗜酸乳杆菌，植物乳杆菌，鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、动物双岐杆菌，两岐双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌。经常服用该固体饮料，具有增强结肠蠕动、抑制肠内腐败、分解致癌物质、制造维生素、预防和治疗腹泻、提高身体的免疫力、调节血脂、降低血液粘稠度等保护心脑血管的作用。但是该固体饮料不适用于婴幼儿。
由于益生菌具有调节肠道菌群，改善人体健康的作用，人体肠道菌群结构复杂，导致健康人体肠道菌群差异的主要因素包括人体的基因型、饮食差异、生活方式、环境因素等。开发一款与人体肠道菌群特点相适应的益生菌产品显得尤为迫切。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种六联益生菌冻干粉制剂及其制备方法和应用。通过动物双歧杆菌乳亚种Bi-07菌粉、鼠李糖乳酪杆菌HCS01-003冻干粉、罗伊氏粘液乳杆菌HCS02-009冻干粉、短双歧杆菌BB8冻干粉、发酵粘液乳杆菌HCS08-016冻干粉、动物双歧杆菌乳亚种Bb-12菌粉之间的协同作用，能够更好的改善肠道微生态平衡、增强免疫力。
为了达到本发明的上述目的，本发明采用的具体技术方案为：
一种六联益生菌冻干粉制剂，所述六联益生菌冻干粉制剂的原料包括：鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003冻干粉、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉、发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillusfermentum HCS08-016冻干粉、动物双歧杆菌乳亚种Bi-07菌粉、动物双歧杆菌乳亚种Bb-12菌粉、短双歧杆菌BB8菌粉、益生元、果蔬粉和甜味剂。
优选地，所述鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003，分类命名为鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus，已于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.27021；罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009，分类命名为罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri，已于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.27022；发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillusfermentum HCS08-016，分类命名为发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum，已于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.27025。
优选地，按重量份数计，所述六联益生菌冻干粉制剂的原料包括：3-10份动物双歧杆菌乳亚种Bi-07菌粉、1-3份鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003冻干粉、0.2-1份罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉、0.2-1份发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016冻干粉、0.2-1份短双歧杆菌BB8菌粉、0.01-0.2份动物双歧杆菌乳亚种Bb-12菌粉、0.5-2份益生元、2-5份果蔬粉和10-20份甜味剂。
优选地，所述益生元选自水苏糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚麦芽糖、大豆低聚糖、壳聚糖和棉子糖中的一种或多种；所述果蔬粉选自蓝莓粉、草莓粉、甜橙粉、香蕉粉、苹果粉、蔓越莓粉和接骨木莓粉中的任一种；所述甜味剂选自葡萄糖、三氯蔗糖、阿斯巴甜、木糖醇、赤藓糖醇、海藻糖、结晶果糖和甜菊糖苷中的一种或多种。
进一步优选地，所述益生元为质量比为1:0.8-1:0.8-1的水苏糖、低聚果糖和低聚异麦芽糖的混合物；所述果蔬粉为甜橙粉；所述甜味剂为葡萄糖。
优选地，所述六联益生菌冻干粉制剂中有效活菌数为1-4×1010cfu/g。
优选地，所述鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003冻干粉、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉、发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016冻干粉的制备方法包括以下步骤：
(1)制备培养基，分别将鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009、发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016接种于培养基中发酵；
(2)制备菌株保护剂，发酵结束后取发酵产物，离心，离心产物与菌株保护剂混合，冻干；
(3)冻干产物粉碎、过筛，分别得到鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillusrhamnosus HCS01-003冻干粉、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉和发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016冻干粉。
进一步优选地，步骤(1)中所述培养基包括如下重量百分比的组分：葡萄糖2.0％-10％、蛋白胨0.8％-4.5％、酵母浸膏0.5％-6.0％、乙酸钠0.2％-2.0％、硫酸镁0.02％-0.15％、硫酸锰0.001％-0.5％、氯化钙0.05％-0.9％、柠檬酸氢二铵0.1％-0.9％、吐温-800.01％-0.5％、磷酸氢二钾0.1％-1.0％、L-苹果酸0.2％-2％和余量的水；培养基灭菌条件为：115℃灭菌30min。
进一步优选地，步骤(1)中接种于培养基中发酵的接种量为1％-6％；所述发酵温度为35-39℃，发酵时间为45-50h，发酵pH为5.0-6.0。
进一步优选地，步骤(2)中所述菌株保护剂包括如下重量百分比的组分：10％-25％海藻糖、1％-5％蔗糖、1％-5％谷氨酸钠、1％-5％甘油、0.1％-1％抗坏血酸钠、10％-15％麦芽糊精和余量的水。
进一步优选地，步骤(2)中所述离心的转速10000-15000rpm，离心时间1-2h，所述离心产物与菌株保护剂以1:1-3的重量比混合；步骤(3)中，粉碎后，过80-120目标准筛。
本发明还涉及上述六联益生菌冻干粉制剂的制备方法，包括如下步骤：将鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003冻干粉、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉、发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillusfermentum HCS08-016冻干粉、动物双歧杆菌乳亚种Bi-07菌粉、动物双歧杆菌乳亚种Bb-12菌粉、短双歧杆菌BB8菌粉、益生元、果蔬粉和甜味剂混合，即得所述六联益生菌冻干粉制剂。。
本发明还涉及上述六联益生菌冻干粉制剂或上述制备方法制得的六联益生菌冻干粉制剂在制备改善肠道微生态平衡的产品中的应用。
本发明还涉及上述六联益生菌冻干粉制剂或上述制备方法制得的六联益生菌冻干粉制剂在制备提高免疫力的产品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
目前研究表明，不同种的益生菌基因组差别较大，即便是同种益生菌的不同菌株之间也存在差异性，原因在于同种益生菌的不同菌株含有或表达不同的功能基因，因此可发挥不同的益生功效。本发明以动物双歧杆菌乳亚种Bi-07、鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillusreuteri HCS02-009、短双歧杆菌BB8、发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentumHCS08-016和动物双歧杆菌乳亚种Bb-12为益生菌菌种制得的益生菌冻干粉不仅能够健胃整肠，调节儿童肠道菌群平衡，而且能够提高免疫力。
生物保藏说明
鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003，分类命名为鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC；保藏编号：CGMCC No.27021，保藏时间：2023年4月6日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；该菌株的检测结果为存活。
罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009，分类命名为罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC；保藏编号：CGMCC No.27022，保藏时间：2023年4月6日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；该菌株的检测结果为存活。
发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016，分类命名为发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC；保藏编号：CGMCC No.27025，保藏时间：2023年4月6日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；该菌株的检测结果为存活。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
动物双歧杆菌乳亚种Bi-07菌粉，规格：3000亿CFU/g，生产厂家：丹尼斯克公司；
动物双歧杆菌乳亚种Bb-12菌粉，规格：300亿CFU/g，，生产厂家：杜邦营养食品配料(北京)有限公司；
短双歧杆菌BB8菌粉，规格：1.0×1010CFU/g，生产厂家：上海交大昂立股份有限公司；
低聚果糖，型号QHT-FOS-P95S，购自量子高科(广东)生物有限公司；
低聚异麦芽糖，型号IMO-90，购自保龄宝生物股份有限公司；
甜橙粉，购自天津市真如果食品工业有限公司滨海新区分公司；
蛋白胨，型号FP103，酵母浸膏，型号FM902，均购自安琪酵母股份有限公司；
吐温-80，购自江苏四新界面剂科技有限公司；
麦芽糊精，型号MD20，购自保龄宝生物股份有限公司。
实施例1
一种六联益生菌冻干粉制剂，按重量份数计，原料为：8份动物双歧杆菌乳亚种Bi-07菌粉、2份鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003冻干粉、0.6份罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉、0.5份发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016冻干粉、0.5份短双歧杆菌BB8菌粉、0.1份动物双歧杆菌乳亚种Bb-12菌粉、1.5份益生元(质量比为1:1:1的水苏糖、低聚果糖和低聚异麦芽糖)、4份甜橙粉和15份葡萄糖。
上述鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003冻干粉、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉、发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016冻干粉的制备方法为：
(1)制备培养基，按重量百分比计，培养基的组分为：葡萄糖6.0％、蛋白胨2.0％、酵母浸膏4.0％、乙酸钠1.5％、硫酸镁0.10％、硫酸锰0.2％、氯化钙0.5％、柠檬酸氢二铵0.4％、吐温-80 0.3％、磷酸氢二钾0.6％、L-苹果酸1.0％和余量的水；培养基灭菌条件为：115℃灭菌30min；
然后，分别将鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009、发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016接种于培养基中发酵，接种量为3％，发酵温度为37℃，发酵时间为48h，发酵pH为5.5；
(2)制备菌株保护剂，按重量百分比计，菌株保护剂的组分为：18％海藻糖、3％蔗糖、2％谷氨酸钠、4％甘油、0.5％抗坏血酸钠、12％麦芽糊精和余量的水；
取步骤(1)发酵结束后的发酵产物，12000rpm离心1.5h，离心产物与菌株保护剂以1:2的重量比混合，冻干；
(3)冻干产物粉碎、过100目标准筛，分别得到鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003冻干粉、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉和发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016冻干粉。
上述六联益生菌冻干粉制剂的制备方法为：
将鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003冻干粉、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉、发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016冻干粉、动物双歧杆菌乳亚种Bi-07菌粉、动物双歧杆菌乳亚种Bb-12菌粉、短双歧杆菌BB8菌粉、水苏糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖、甜橙粉和葡萄糖混合，即得所述六联益生菌冻干粉制剂。
实施例2
一种六联益生菌冻干粉制剂，按重量份数计，原料为：3份动物双歧杆菌乳亚种Bi-07菌粉、1份鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003冻干粉、0.2份罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉、0.2份发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016冻干粉、0.2份短双歧杆菌BB8菌粉、0.01份动物双歧杆菌乳亚种Bb-12菌粉、0.5份益生元(质量比为1:0.8:0.8的水苏糖、低聚果糖和低聚异麦芽糖)、2份甜橙粉和10份葡萄糖。
上述鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003冻干粉、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉、发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016冻干粉的制备方法为：
(1)制备培养基，按重量百分比计，培养基的组分为：葡萄糖2.0％、蛋白胨4.5％、酵母浸膏0.5％、乙酸钠0.2％、硫酸镁0.15％、硫酸锰0.5％、氯化钙0.05％、柠檬酸氢二铵0.1％、吐温-80 0.5％、磷酸氢二钾1.0％、L-苹果酸2％和余量的水；培养基灭菌条件为：115℃灭菌30min；
然后，分别将鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009、发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016接种于培养基中发酵，接种量为1％，发酵温度为35℃，发酵时间为50h，发酵pH为6.0；
(2)制备菌株保护剂，按重量百分比计，菌株保护剂的组分为：10％海藻糖、5％蔗糖、1％谷氨酸钠、5％甘油、0.1％抗坏血酸钠、15％麦芽糊精和余量的水；
取步骤(1)发酵结束后的发酵产物，10000rpm离心2h，离心产物与菌株保护剂以1:1的重量比混合，冻干；
(3)冻干产物粉碎、过80目标准筛，分别得到鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillusrhamnosus HCS01-003冻干粉、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉和发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016冻干粉。
上述六联益生菌冻干粉制剂的制备方法为：
将鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003冻干粉、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉、发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016冻干粉、动物双歧杆菌乳亚种Bi-07菌粉、动物双歧杆菌乳亚种Bb-12菌粉、短双歧杆菌BB8菌粉、水苏糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖、甜橙粉和葡萄糖混合，即得所述六联益生菌冻干粉制剂。
实施例3
一种六联益生菌冻干粉制剂，按重量份数计，原料为：10份动物双歧杆菌乳亚种Bi-07菌粉、3份鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003冻干粉、1份罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉、1份发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016冻干粉、1份短双歧杆菌BB8菌粉、0.2份动物双歧杆菌乳亚种Bb-12菌粉、2份益生元(质量比为1:0.9:0.9的水苏糖、低聚果糖和低聚异麦芽糖)、5份甜橙粉和20份葡萄糖。
上述鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003冻干粉、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉、发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016冻干粉的制备方法为：
(1)制备培养基，按重量百分比计，培养基的组分为：葡萄糖10％、蛋白胨0.8％、酵母浸膏6.0％、乙酸钠2.0％、硫酸镁0.02％、硫酸锰0.001％、氯化钙0.9％、柠檬酸氢二铵0.9％、吐温-80 0.01％、磷酸氢二钾0.1％、L-苹果酸0.2％和余量的水；培养基灭菌条件为：115℃灭菌30min；
然后，分别将鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009、发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016接种于培养基中发酵，接种量为6％，发酵温度为39℃，发酵时间为45h，发酵pH为5.0；
(2)制备菌株保护剂，按重量百分比计，菌株保护剂的组分为：25％海藻糖、1％蔗糖、5％谷氨酸钠、1％甘油、1％抗坏血酸钠、10％麦芽糊精和余量的水；
取步骤(1)发酵结束后的发酵产物，15000rpm离心1h，离心产物与菌株保护剂以1:3的重量比混合，冻干；
(3)冻干产物粉碎、过120目标准筛，分别得到鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003冻干粉、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉和发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016冻干粉。
上述六联益生菌冻干粉制剂的制备方法，步骤如下：
将鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003冻干粉、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉、发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016冻干粉、动物双歧杆菌乳亚种Bi-07菌粉、动物双歧杆菌乳亚种Bb-12菌粉、短双歧杆菌BB8菌粉、水苏糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖、甜橙粉和葡萄糖混合，即得所述六联益生菌冻干粉制剂。
对比例1-4
一种六联益生菌冻干粉制剂，与实施例1的区别仅在于，罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉、发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillusfermentum HCS08-016冻干粉和短双歧杆菌BB8菌粉的添加的份数不同。具体添加份数如表1所示。
表1对比例1-4中益生菌粉的添加份数
对比例5
一种六联益生菌冻干粉制剂，与实施例1的区别仅在于，原料配比不同。
按重量份数计，原料为：10份动物双歧杆菌乳亚种Bi-07菌粉、2份鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003冻干粉、3份罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉、5份发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016冻干粉、5份短双歧杆菌BB8菌粉、0.5份动物双歧杆菌乳亚种Bb-12菌粉、1.5份益生元(质量比为1:1:1的水苏糖、低聚果糖和低聚异麦芽糖)、4份甜橙粉和15份葡萄糖。
对比例6
一种六联益生菌冻干粉制剂，与实施例1的区别仅在于，制备过程中的菌株保护剂不同。
保护剂中各组分重量百分比为：18％海藻糖、3％乳糖、2％谷氨酸钠、4％甘油、0.5％柠檬酸钠、12％麦芽糊精和余量的水。
测试例1
测试实施例1-3与对比例5-6的制得的益生菌冻干粉制剂，存放于温度37±2℃，湿度75±5％的环境中，每隔30天检测一次菌数量，对制剂中的活菌数进行统计，并计算益生菌的存活率，活菌数检测方法参照GB 4789.35-2016。存活率＝检测的活菌数/第0个月末的活菌数×100％，结果见表2(单位：cfu/g)。
表2活菌存活率测试
| 编号 | 0天活菌数(cfu/g) | 30天存活率/％ | 60天存活率/％ | 90天存活率/％ |
| 实施例1 | 2.75×1010 | 99.3 | 95.5 | 92.3 |
| 实施例2 | 2.26×1010 | 99.1 | 96.1 | 90.7 |
| 实施例3 | 3.00×1010 | 99.5 | 97.0 | 91.4 |
| 对比例5 | 2.65×1010 | 97.6 | 87.9 | 79.3 |
| 对比例6 | 2.50×1010 | 78.7 | 72.2 | 65.4 |
测试例2
1.实验材料
伊红美蓝琼脂培养基、叠氮钠-结晶紫-七叶苷琼脂培养基、BBL琼脂培养基、Lbs琼脂培养基、玻璃平皿、革兰氏染液、显微镜、天平。
2.实验过程
选择昆明(KM)小鼠90只，18-22g，4-5周龄，雄性，购于辽宁长生生物技术股份有限公司；小鼠平衡饲养3d后，按体重随机分为9组，每组10只，分别为空白组、实施例1-3组和对比例1-5组；于造模前1天上午禁食不禁水24h。按人体推荐量6g/d计算，各实施例膳食纤维益生菌组合物的给药量相当于人体推荐量的4倍，受试药物配制好后按BW体积给小鼠灌胃，空白对照组灌胃予以生理盐水，每天一次，连续14天后，无菌采集粪便，检测肠道菌群。
在给予受试药品之前，无菌采取小鼠粪便0.1g，10倍系列稀释，选择合适的稀释度分别接种在各培养基上。培养后，以菌落形态、革兰氏染色镜检、生化反应等鉴定计数菌落，计算出每克湿便中的菌数，取对数后进行统计处理。最后一次给予受试样品之后24h，与实验前同样方式取直肠粪便，检测肠道菌群(n＝10，logCFU/g)。结果见表3。
表3调节肠道菌群(logCFU/g)测试结果
| 组别 | 双歧杆菌 | 肠杆菌 | 乳杆菌 | 肠球菌 |
| 空白组 | 7.71 | 13.29 | 8.26 | 13.54 |
| 实施例1组 | 13.03* | 8.57* | 10.17* | 8.12* |
| 实施例2组 | 13.47* | 9.03* | 11.23* | 8.78* |
| 实施例3组 | 13.15* | 8.65* | 11.09* | 8.92* |
| 对比例1组 | 8.52 | 12.03 | 9.33 | 11.35 |
| 对比例2组 | 8.34 | 12.41 | 8.92 | 11.92 |
| 对比例3组 | 9.05 | 11.86 | 9.05 | 12.04 |
| 对比例4组 | 9.22 | 12.40 | 9.37 | 11.43 |
| 对比例5组 | 9.34 | 11.09 | 8.96 | 12.15 |
注：与空白组相比，*P＜0.05。
实施例1-3的益生菌冻干粉制剂使得试验小鼠粪便中的双歧杆菌和乳杆菌的数量增加，降低肠杆菌、肠球菌数量，具有良好的调节肠道菌群的效果。一方面改善益生菌冻干粉制剂稳定性，另一方面罗伊氏粘液乳杆菌HCS02-009冻干粉、短双歧杆菌BB8冻干粉和发酵粘液乳杆菌HCS08-016冻干粉之间存在协同效应，有效降低肠道内大肠杆菌、肠球菌的数量，进而在肠道能释放益生菌，促进益生菌增殖，改善肠道性能。
测试例3
对小鼠NK细胞活性的影响
分组和给药：将体重在20±2g的昆明种小鼠随机分为15组，分别为空白组、实施例1-3组和对比例1-5组。空白组灌胃给予生理盐水10mL/kg，实施例1-3组和对比例1-7组给予本发明相应组制得的益生菌冻干粉制剂10g/kg，每日一次，连续15天。
实验方法为本领域常规检测方法，如无特别说明，试剂和材料均为常规市售，流程具体如下：
取培养24-48h的靶细胞，洗涤3次，最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度为105个/mL，得到靶细胞。无菌取小鼠脾脏，分离小鼠脾细胞，洗涤3次，最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度为107个/mL，得到效应细胞。
LDH混合液的配制：用pH＝8.2的Tris-HCl溶液配制含有0.05mol/L乳酸锂0.05mol/L、0.00066mol/L硝基氯化四氮唑、0.00028mol/L吩嗪二甲酯硫酸盐、0.0013mol/L氧化型辅酶I的混合溶液，得到LDH混合液。
NK细胞活性检测：
将效应细胞和靶细胞各0.1mLE/T＝100：1)加入细胞培养板的孔中，记为反应孔，每份标本设3复孔，同时设靶细胞自然释放对照组和最大释放对照组(0.1mL靶细胞+0.1mL1％NP-40液)，低速离心1000r/min，2min后，置37℃、5％CO2温箱中孵育2h。然后离心，每孔吸取上清液100μL，加入LDH混合液反应5min，然后加入2mol/LHCl溶液10μL，用酶标仪测定490nm吸光度，计算NK细胞活性，结果见表4。
NK细胞活性(％)＝(反应孔的吸光度-自然释放孔吸光度)/(最大释放孔吸光度-自然释放孔吸光度)×100％。
表4NK细胞活性检测结果
| 组别 | NK细胞活性(％) |
| 空白组 | 8.22±1.65 |
| 实施例1组 | 16.2±1.21 |
| 实施例2组 | 15.9±1.37 |
| 实施例3组 | 16.7±1.64 |
| 对比例1组 | 9.8±1.28 |
| 对比例2组 | 10.2±1.35 |
| 对比例3组 | 11.5±1.66 |
| 对比例4组 | 9.7±1.91 |
| 对比例5组 | 12.1±1.74 |
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
Claims (14)
1.一种六联益生菌冻干粉制剂，其特征在于，所述六联益生菌冻干粉制剂的原料包括：鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003冻干粉、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉、发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillusfermentum HCS08-016冻干粉、动物双歧杆菌乳亚种Bi-07菌粉、动物双歧杆菌乳亚种Bb-12菌粉、短双歧杆菌BB8菌粉、益生元、果蔬粉和甜味剂。
2.根据权利要求1所述的六联益生菌冻干粉制剂，其特征在于，所述鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003，分类命名为鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus，已于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.27021；罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillusreuteri HCS02-009，分类命名为罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri，已于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.27022；发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016，分类命名为发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum，已于2023年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.27025。
3.根据权利要求1所述的六联益生菌冻干粉制剂，其特征在于，按重量份数计，所述六联益生菌冻干粉制剂的原料包括：3-10份动物双歧杆菌乳亚种Bi-07菌粉、1-3份鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003冻干粉、0.2-1份罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉、0.2-1份发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016冻干粉、0.2-1份短双歧杆菌BB8菌粉、0.01-0.2份动物双歧杆菌乳亚种Bb-12菌粉、0.5-2份益生元、2-5份果蔬粉和10-20份甜味剂。
4.根据权利要求1所述的六联益生菌冻干粉制剂，其特征在于，所述益生元选自水苏糖、低聚果糖、低聚异麦芽糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚麦芽糖、大豆低聚糖、壳聚糖和棉子糖中的一种或多种；所述果蔬粉选自蓝莓粉、草莓粉、甜橙粉、香蕉粉、苹果粉、蔓越莓粉和接骨木莓粉中的任一种；所述甜味剂选自葡萄糖、三氯蔗糖、阿斯巴甜、木糖醇、赤藓糖醇、海藻糖、结晶果糖和甜菊糖苷中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的六联益生菌冻干粉制剂，其特征在于，所述益生元为质量比为1:0.8-1:0.8-1的水苏糖、低聚果糖和低聚异麦芽糖的混合物；所述果蔬粉为甜橙粉；所述甜味剂为葡萄糖。
6.根据权利要求1所述的六联益生菌冻干粉制剂，其特征在于，所述六联益生菌冻干粉制剂中有效活菌数为1-4×1010cfu/g。
7.根据权利要求1-6任一项所述的六联益生菌冻干粉制剂，其特征在于，所述鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003冻干粉、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉、发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillusfermentum HCS08-016冻干粉的制备方法包括以下步骤：
(1)制备培养基，分别将鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009、发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016接种于培养基中发酵；
(2)制备菌株保护剂，发酵结束后取发酵产物，离心，离心产物与菌株保护剂混合，冻干；
(3)冻干产物粉碎、过筛，分别得到鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosusHCS01-003冻干粉、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉和发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016冻干粉。
8.根据权利要求7所述的六联益生菌冻干粉制剂，其特征在于，步骤(1)中所述培养基包括如下重量百分比的组分：葡萄糖2.0％-10％、蛋白胨0.8％-4.5％、酵母浸膏0.5％-6.0％、乙酸钠0.2％-2.0％、硫酸镁0.02％-0.15％、硫酸锰0.001％-0.5％、氯化钙0.05％-0.9％、柠檬酸氢二铵0.1％-0.9％、吐温-80 0.01％-0.5％、磷酸氢二钾0.1％-1.0％、L-苹果酸0.2％-2％和余量的水；培养基灭菌条件为：115℃灭菌30min。
9.根据权利要求7所述的六联益生菌冻干粉制剂，其特征在于，步骤(1)中接种于培养基中发酵的接种量为1％-6％；所述发酵温度为35-39℃，发酵时间为45-50h，发酵pH为5.0-6.0。
10.根据权利要求7所述的六联益生菌冻干粉制剂，其特征在于，步骤(2)中所述菌株保护剂包括如下重量百分比的组分：10％-25％海藻糖、1％-5％蔗糖、1％-5％谷氨酸钠、1％-5％甘油、0.1％-1％抗坏血酸钠、10％-15％麦芽糊精和余量的水。
11.根据权利要求7所述的六联益生菌冻干粉制剂，其特征在于，步骤(2)中所述离心的转速10000-15000rpm，离心时间1-2h，所述离心产物与菌株保护剂以1:1-3的重量比混合；步骤(3)中，粉碎后，过80-120目标准筛。
12.一种权利要求1-11任一项所述的六联益生菌冻干粉制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将鼠李糖乳酪杆菌Lacticaseibacillus rhamnosus HCS01-003冻干粉、罗伊氏粘液乳杆菌Limosilactobacillus reuteri HCS02-009冻干粉、发酵粘液乳杆菌Limosilactobacillus fermentum HCS08-016冻干粉、动物双歧杆菌乳亚种Bi-07菌粉、动物双歧杆菌乳亚种Bb-12菌粉、短双歧杆菌BB8菌粉、益生元、果蔬粉和甜味剂混合，即得所述六联益生菌冻干粉制剂。
13.一种权利要求1-11任一项所述的六联益生菌冻干粉制剂或权利要求12所述制备方法制得的六联益生菌冻干粉制剂在制备改善肠道微生态平衡的产品中的应用。
14.一种权利要求1-11任一项所述的六联益生菌冻干粉制剂或权利要求12所述制备方法制得的六联益生菌冻干粉制剂在制备提高免疫力的产品中的应用。
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