CN118079063A - 一种胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵及其应用 - Google Patents
一种胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵及其应用，所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵是将胞外多糖riclin醛基化后，再与氧化石墨烯交联，之后冷冻干燥制得。本发明提供的一种胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵及其应用，所述止血海绵溶胀性强，止血效果好，吸收迅速，对机体刺激性小。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，尤其涉及一种胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵及其应用。
背景技术
在医疗实践中，止血海绵作为止血材料广泛应用于手术和外科操作。传统止血海绵通常由天然纤维素或其他合成材料制成，其目的是通过增加血液的凝固能力来促进止血过程。然而，传统止血海绵存在一些不足之处，如易引起红细胞破裂、生物相容性差、容易引发过敏反应，功能过于单一等问题，限制了其在特定临床情境下的应用。
为了克服传统止血海绵的局限性，近年来，对于多功能止血海绵的研发工作取得了一系列重要进展。通过引入新型多功能材料、改进制备工艺以及应用生物技术手段，新一代多功能止血海绵在止血效果、生物相容性和材料吸收性能等方面取得了显著提升。
先前研究报道了胞外多糖riclin及其制备方法，并指出胞外多糖riclin具有抗肿瘤活性和抗炎活性(Y.Yang,X.Sun,Y.Zhao,et al.,Anti tumor activity andimmunogenicity of a succinoglycanriclin,Carbohydr.Polym.2021Mar 1；255:117370.；R.Cheng,L.Wang,J.Li.,et al.,In vitro and in vivo antiinflammatoryactivity of a succinoglycan Riclin from Agrobacterium sp.ZCC3656,J.Appl.Microbiol.2019Dec；127(6):1716-1726.)，但是有关胞外多糖riclin用于止血材料还未见报道。这一方面是由于胞外多糖riclin的止血功效还未发现，另一方面则是由于胞外多糖riclin的高亲水性所致。石墨烯由于具有二维片层结构并且表面易于功能化，这使得石墨烯可实现多功能化复合，有利于发挥协同止血作用，但单纯的石墨烯的生物相容性较差、结构松散，限制了其在止血方面的应用。因此若是能够将胞外多糖riclin与石墨烯复合制备成止血海绵，将有望获得高效多功能的止血材料。
发明内容
基于上述技术问题，本发明提供了一种胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵及其应用，所述止血海绵溶胀性强，止血效果好，吸收迅速，对机体刺激性小。
本发明提出的一种胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵，其是将胞外多糖riclin醛基化后，再与氧化石墨烯交联，之后冷冻干燥制得。
本发明中，选择胞外多糖riclin作为基材，并与氧化石墨烯复合形成所述止血海绵，一方面，胞外多糖riclin作为一种优化的改性多糖基材料，其复合氧化石墨烯后可以进一步增强止血海绵的吸水性和稳定性；另一方面，也可以降低氧化石墨烯毒性达到无毒的效果，并且在接触血液时在短时间内快速凝血，从而更有效地实现止血效果。
优选地，所述胞外多糖riclin是土壤杆菌ZCC3656发酵产生；
优选地，所述土壤杆菌ZCC3656的保藏编号为CCTCCNO:M2018797。
本发明中，所述胞外多糖riclin的结构式为如下所示：
其中，R为-OCCH2CH2COOH或-H，n为大于0的整数。
本发明中，所述胞外多糖riclin具体是将土壤杆菌Agrobacterium sp.ZCC3656(保藏编号为CCTCC NO:M 2018797)依次经活化、种子培养、发酵培养，醇沉，得到riclin多糖粗品后，再通过碱纯法去除riclin多糖粗品中的蛋白，得到R为-OCCH2CH2COOH的胞外多糖riclin，或者通过Sevag法提纯去除riclin多糖粗品中的蛋白，同时去除riclin多糖中的琥珀酰基，得到R为-H的胞外多糖riclin。
本发明中，所述胞外多糖riclin分子链中含有大量的羟基和羧基，具有良好的生物相容性和生物降解性，分子量约为2.0×106-3.0×106Da，平均分子量为2.5×106Da。
优选地，所述“将胞外多糖riclin醛基化”具体包括：将胞外多糖riclin溶于水中，加入氧化剂进行氧化反应，得到醛基化胞外多糖riclin；
优选地，所述氧化剂为高碘酸盐、次氯酸盐或过氧化氢中的至少一种；
优选地，所述氧化剂与胞外多糖riclin的质量比为0.2-0.5:1；
优选地，所述氧化反应温度为15-30℃，时间为2-12h，pH为7-9。
优选地，所述醛基化胞外多糖riclin的醛基化率为25-50％。
本发明中，采用盐酸羟胺滴定法确定产物醛基化的程度。
优选地，所述“与氧化石墨烯交联”具体包括：将醛基化胞外多糖riclin水溶液与氧化石墨烯水溶液搅拌混合反应，得到胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合水凝胶；
优选地，所述醛基化胞外多糖riclin水溶液的浓度为5-30mg/mL，所述氧化石墨烯水溶液的浓度为1-20mg/mL；
优选地，所述氧化石墨烯与胞外多糖riclin的重量比为1:1-15；
优选地，所述搅拌混合反应的温度为4-25℃，时间为4-8h；
优选地，所述搅拌速率为1000-3000rpm。
优选地，所述氧化石墨烯水溶液是将氧化石墨烯加入水中，超声分散均匀后制得；
优选地，所述超声分散的温度为0-10℃，时间为0.5-1h，超声振幅为10-30％。
本发明中，选用适宜的制备方法和工艺参数可以制得稳定的单层氧化石墨烯溶液，其可以更好地与醛基化胞外多糖riclin共混，从而制得效果优越的止血海绵。
优选地，所述“冷冻干燥”具体包括：将胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合水凝胶透析后冷冻干燥，即得到所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵；
优选地，所述透析采用的透析袋截留分子量为500-2000Da，透析时间为0.5-2天，换水频次为3-8h/次；
优选地，所述冷冻干燥的温度为-(70-80)℃，时间为24-48h。
本发明还提出一种上述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵的制备方法，包括：
(1)将胞外多糖riclin溶于水中，加入氧化剂进行氧化反应后，得到醛基化胞外多糖riclin；
(2)将所述醛基化胞外多糖riclin水溶液与氧化石墨烯水溶液搅拌混合反应，得到胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合水凝胶；
(3)将所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合水凝胶透析后冷冻干燥，即得到所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵。
本发明中，采用醛基化胞外多糖riclin和氧化石墨烯交联复合作为止血海绵，所得止血海绵克服了传统止血海绵止血能力差、安全性低、抗菌能力弱的缺陷，同时能减少伤口的炎症反应、降低对皮肤的刺激性，并且还具有良好的生物相容性和优越的止血凝血能力，为急性大出血的治疗带来更安全、更优越的选择。
本发明同时提出一种上述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵在组织创伤止血或急性伤口大出血制品中的应用。
本发明中，发明人发现将胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合作为止血海绵使用时，其具有独特的三维网状结构，这种结构使其具有较大的表面积和高度吸收液体的能力。当止血海绵应用于出血部位时，它能够快速吸收大量的血液，有助于迅速减少出血量，降低患者失血的风险，此外结合海绵特有的快速可恢复性，能够在极小的体积下迅速填充伤口，做到高效止血。由于止血海绵中具有氧化石墨烯，这种多糖复合海绵可以与出血部位的血液相互作用，促进与凝血因子结合，加速血液凝结过程，形成血栓，从而帮助封闭创口并防止进一步出血。这使得止血过程更加简便和快速，即使在急救等紧急情况下也能有效应用。此外，由于其形状和大小可以根据需要进行调整，它们可以用于不同大小和位置的伤口。并且其具有生物相容性、与记忆性可恢复性，对环境无不利影响；总的来说，所得止血海绵的结构优势使其成为在医疗领域中常用的救治工具。它可以快速止血、促进凝血、防止感染，并在急救和手术等场景中发挥关键作用，有助于提高患者的生存率和康复效果。然而，尽管止血海绵具有这些优点，对于严重或无法控制的出血情况，仍需要寻求专业医疗救助。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
(1)本发明提供的一种胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵，通过将胞外多糖riclin进行氧化反应，将含有邻羟基的胞外多糖riclin氧化形成相邻游离醛基团，该游离醛基减少了胞外多糖riclin中的羟基，由此降低了胞外多糖riclin的水溶性，有助于后续形成止血海绵，与此同时还可以与氧化石墨烯溶液形成共混交联，得到胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合水凝胶，此后再通过真空冷冻干燥使水分子升华除去，最终形成了具备疏松多孔类蜂窝状的三维物理结构的止血海绵。本发明一方面摒弃了大量有毒化学交联剂，仅采用多糖和氧化石墨烯，最终得到的廉价易得的止血海绵；另一方面整个过程易于规模化生成，制备出的多糖基复合氧化石墨烯止血海绵价格优廉。
(2)本发明提供的一种胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵，具有良好的机械性能和液体吸附性能，赋予所述止血海绵产品以快速形状恢复性能和高效止血性能的同时，还可适应不可压迫的伤口处，能够应用到紧急情况下的特殊伤口，有效解决了现有止血海绵产品在这些方面的不足。
(3)本发明提供的一种胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵，通过改性使多糖riclin具有丰富的醛基，并用特定的比例交联结合氧化石墨烯，防止氧化石墨烯逃逸，改善了以往以来高剂量高浓度的氧化石墨烯毒性问题，对红细胞、血小板和其他血细胞有强烈的黏附能力，并且形成了凝血蛋白网络，具有优异的凝血性能，通过动物止血实验表明，该胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵在大型动物不同部位止血模型中都能快速有效的止血，止血效果明显优于商品化医用止血纱布。通过体外血液相容性实验表明，本发明还可以在使用时间内不破坏血细胞，具有良好的生物相容性。因此，本发明止血海绵是理想的实际临床创口急救止血材料，能够在内脏出血和动脉血管出血中发挥作用。
(4)本发明提供的一种胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵，其独特之处在于，这种止血海绵主要是由经过醛基化处理的胞外多糖riclin与氧化石墨烯构成，二者优势互补，具有很强的市场应用前景。此外，其制备过程简单快捷，成本效益显著，适合在紧急医疗情况下使用。
附图说明
图1为实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵表面孔隙结构的扫描电镜图；
图2为实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵粘附血小板、红细胞和全血后的扫描电镜图；
图3为实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵压缩恢复状态图；
图4为实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵的溶血率图；
图5为实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵在猪肝穿孔出血模型和猪股动脉离断出血模型中的应用图；
图6为实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵的吸收性能测试图。
具体实施方式
下面，本发明通过具体实施例对所述技术方案进行详细说明，但是应该明确提出这些实施例用于举例说明，但是不解释为限制本发明的范围。
以下所用的高碘酸钠、乙二醇均来自中国上海试剂有限公司；氧化石墨烯来自碳稀技术(深圳)有限公司；以下所用水均为去离子水。
实施例1
本实施例提出一种胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵，其制备方法包括：
(1)将土壤杆菌Agrobacterium sp.ZCC3656(保藏编号为CCTCCNO:M2018797)单菌落接种于种子培养基(LB液体培养基)中进行种子培养，16h后以2％比例接种至发酵培养基(M9培养基，碳源为3％蔗糖)中，30℃发酵培养2d，向所得发酵液中加入3倍体积预冷的95％(v/v)乙醇水溶液进行醇沉，离心(6000g，5min)收集沉淀，于40℃下烘干后，即得到胞外多糖riclin粗品；
将胞外多糖riclin粗品加入水中配制成浓度为10mg/mL的水溶液，加入NaOH水溶液调节pH＝9.0，于105℃下高压灭菌20min，离心(10000g，10min)得到上清液，加入3倍体积预冷的95％(v/v)乙醇水溶液进行醇沉，离心(6000g，10min)收集沉淀，得到胞外多糖riclin(前述结构式所示，且R为-H)；
(2)将上述胞外多糖riclin加入水中配置成2％(w/v)浓度的多糖溶液，按照胞外多糖riclin与高碘酸钠的质量比为1:0.33加入5wt％浓度的高碘酸钠溶液，室温下避光搅拌反应24h后，加入乙二醇终止反应，在去离子水中采用透析袋(Mw＝1000Da)对反应后溶液透析24h，每4h换一次水，得到浓度为20mg/mL的醛基化胞外多糖riclin水溶液；
(3)将氧化石墨烯(以GO表示)加入水中，5℃下以20％的超声振幅超声分散45min后，得到浓度为8mg/mL的氧化石墨烯水溶液；将所述氧化石墨烯水溶液按照(氧化石墨烯与胞外多糖riclin的质量比为1:8)加入上述醛基化胞外多糖riclin水溶液中，室温下以2000rpm的搅拌速率搅拌反应6h后，得到胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合水凝胶；
(4)将上述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合水凝胶在去离子水中采用透析袋(Mw＝1000Da)透析24h，每4h换一次水，再倒入相应模具中，放入冻干机中冷冻干燥，先降温至-70℃，再降压至0kPa，在该温度和压强下冻干48h，乙醇清洗10h后，干燥，即得到所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵(以ARGS表示)。
对比例1
本对比例提出一种止血海绵，其制备方法参照实施例1所述方法，除了省略步骤(2)，还在步骤(3)中以浓度为20mg/mL的胞外多糖riclin水溶液代替醛基化胞外多糖riclin水溶液，由此制得所述止血海绵。
该止血海绵易溶于水中，无法发挥止血效果。
对比例2
本对比例提出一种止血海绵，其制备方法参照实施例1所述方法，除了省略步骤(2)，还在步骤(3)中以浓度为20mg/mL的胞外多糖riclin水溶液代替醛基化胞外多糖riclin水溶液，并加入20wt％浓度的戊二醛溶液(戊二醛与胞外多糖riclin的质量比为0.2:1)。
该止血海绵同样易溶于水中，无法发挥止血效果。
对比例3
本对比例提出一种止血海绵，其制备方法参照实施例1所述方法，除了省略步骤(3)，还在步骤(4)中以浓度为20mg/mL的醛基化胞外多糖riclin水溶液代替胞外多糖riclin复合氧化石墨烯水凝胶，由此制得所述止血海绵(以AR表示)。
实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵的内部结构测试
对实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵进行喷金处理后置于扫描电子显微镜下扫描，结果如图1所示。图1为实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵表面孔隙结构的扫描电镜图。参照图1可知，实施例1所述止血海绵具有相互贯通的孔隙结构，该结构使所述止血海绵具有很大的表面积，从而增加了其吸收血液的能力。当止血海绵放置在出血部位时，孔隙能够快速吸收周围的血液，从而迅速形成凝块，并且有助于促进血小板的聚集。血小板是血液凝固过程中的重要组成部分，它们在伤口处聚集并释放血小板衍生生长因子，促进血液凝固。
实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵粘附血小板、红细胞和全血的聚集形态测试
由于血液成分主要是由血小板(PLTs)、红细胞(RBCs)和凝血因子等组成，因此探讨血液成分与实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵的相互作用至关重要。分别将实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵对红细胞(RBCs)、血小板(PLTS)和全血(WB)粘附后的聚集形态于扫描电子显微镜下扫描，结果如图2所示。图2为实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵粘附血小板、红细胞和全血后的扫描电镜图，参照图2可知，实施例1所述止血海绵上粘附并聚集了大量的血小板(PLTS)，红细胞(RBCs)和全血(WB)，由此表明了所述止血海绵对PLTS、RBCs与WB具有较强的吸附、聚集与粘附作用。
实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵的快速可恢复性测试
将实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵制成长*高*宽为1cm*1cm*1cm的圆柱型，将初始长度记为L1，形变三分之二时记为L2，再将水完全从吸收的止血海绵中挤出时，并将压缩标距长度记为L3，负载保持在止血海绵达最低端时，开始抬手，当止血海绵再次形变三分之二时，将压缩标距长度记为L4，将止血海绵上的压力完全释放时，测定回收标尺长度记为L5；分别测试L1-L5的大小，结果如图3所示。图3为实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵压缩恢复状态图，参照图3可以看出L1与L5的长度相等，L2与L4的长度相等，由此说明实施例1所述止血海绵具有显著的形状记忆性以及快速可恢复性。
实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵的溶血率测试
将来自健康志愿者的新鲜抗凝血液(5mL)加入10mL磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.2-7.4)中，并以500g离心10分钟从血清中分离红细胞。重复该纯化步骤四次，然后将收集的红细胞在PBS中稀释至50mL。将0.2mL稀释的红细胞添加到0.8mL溶有测试样品(包括ARGS、GO、AR)的悬浮溶液中，范围为7.8至500μg/mL。为了获得溶有测试样品的悬浮溶液，将测试样品粉末加入PBS中并超声处理2h，OD值为(ODexperiment)，并且以添加PBS为阴性对照(ODnegative)，添加2％的曲拉通X-100(Triton X-100)为阳性对照。将所有样品置于37℃摇床中3h。孵育后，将这些样品以1000g离心10分钟。用酶标仪(bio-tek US)在540nm处测量血红蛋白吸光度。
溶血百分比(溶血率)由以下公式计算：
根据不同浓度的溶血率，绘制溶血率示意图，结果如图4所示，图4为实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵的溶血率图。参照图4可知，实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵有着良好的血液相容性，溶血率低于1％，几乎不会对红细胞产生有害作用。
实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵的止血能力测试
(1)动物肝穿孔止血能力测试：将雄性健康小猪(10-15kg)用戊巴比妥钠(3％浓度，1mL·kg-1)腹腔注射麻醉猪，完全麻醉后，在上腹部剑突附近做一个切口，暴露肝脏最大叶于滤纸上，部分动物制作时血管用止血钳止住夹住，同时在载肝滤纸正下方铺垫纱布记录流出滤纸的出血量，同时底层放置塑料薄膜防止腹腔液渗出，去除非肝脏出血干扰，用打孔器(直径20mm)穿孔，取处穿孔处内脏块，直到出血；为了封闭这个洞口上方，立即用ARGS(～0.3g)按压5秒；通过血液在材料上停止持续渗出，滤纸上的血液不再流动和滴落来判断止血时间，记录止血时间；出血5-10min后将材料从伤口上移除，记录失血量，止血过程由相机记录；
(2)动物股动脉离断止血能力测试：将雄性健康小猪(10-15kg)用戊巴比妥钠(3％浓度，1mL·kg-1)腹腔注射麻醉猪，完全麻醉，术前除去毛发，在腹股沟区域切开上覆肌层暴露股动脉，切断股动脉造成动脉出血，自然出血10s后，用纱布擦拭前10s溢出血液，将ARGS(～1g)手动按压在伤口上，止血成功后，结束压迫，这段按压期为材料的止血时间，移除手部压力再观察，记录时间观察伤口情况；出血5-10min后将材料从伤口上移除，观察股动脉断裂处情况，同时记录失血量，止血过程由相机记录，其余用医用止血纱布(Gauze，国药集团公司，～8g)治疗。
测试结果如图5所示，图5为实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵在猪肝穿孔出血模型和猪股动脉离断出血模型中的应用图。参照图5b-c可知，在猪肝穿孔出血模型中，实施例1所述止血海绵在相对低用量的情况下的肝穿孔平均失血量为5g以内，无压迫止血时间降低至100s以内；参照图5d-e可知，在猪股动脉离断出血模型中，实施例1所述止血海绵平均失血量为10g以内，无压迫止血时间降低至100s以内。
实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵的吸收性能测试
将ARGS以及Gauze、Celox(壳聚糖，美国SAM Medical)、Chito SAM(壳聚糖，美国SAM Medical)、Surgicel(氧化纤维素，美国强生(深圳代理)医疗公司)和gelatin(止血明胶海绵，中国江西省祥恩医疗科技发展公司)分别称重(W0，g)，室温下分别浸没在血液、模拟体液SBF、生理盐水中60s，在滤纸上放置除去表面多余液体，然后分别称重(W，g)。对不同液体的吸附率按以下公式计算液体吸附率：
LAR(％)＝[(W-W0)/W0]×100％
结果如图6所示，图6为实施例1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵的吸收性能测试图。参照图6可知，上表1可知，相比于Gauze、Celox、Chito SAM、Surgicel和gelatin，ARGS(即实施例1所述止血海绵)无论在血液、模拟体液SBF还是生理盐水中，其液体吸附率都最高，止血效果也必将最为优异。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵，其特征在于，其是将胞外多糖riclin醛基化后，再与氧化石墨烯交联，之后冷冻干燥制得。
2.根据权利要求1所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵，其特征在于，所述胞外多糖riclin是土壤杆菌ZCC3656发酵产生；
优选地，所述土壤杆菌ZCC3656的保藏编号为CCTCCNO:M2018797。
3.根据权利要求1或2所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵，其特征在于，所述胞外多糖riclin的结构式为如下所示：
其中，R为-OCCH2CH2COOH或-H，n为大于0的整数。
4.根据权利要求1-3任一项所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵，其特征在于，所述“将胞外多糖riclin醛基化”具体包括：将胞外多糖riclin溶于水中，加入氧化剂进行氧化反应，得到醛基化胞外多糖riclin；
优选地，所述氧化剂为高碘酸盐、次氯酸盐或过氧化氢中的至少一种；
优选地，所述氧化剂与胞外多糖riclin的质量比为0.2-0.5:1；
优选地，所述氧化反应温度为15-30℃，时间为2-12h，pH为7-9。
5.根据权利要求4所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵，其特征在于，所述醛基化胞外多糖riclin的醛基化率为25-50％。
6.根据权利要求4或5所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵，其特征在于，所述“与氧化石墨烯交联”具体包括：将醛基化胞外多糖riclin水溶液与氧化石墨烯水溶液搅拌混合反应，得到胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合水凝胶；
优选地，所述醛基化胞外多糖riclin水溶液的浓度为5-30mg/mL，所述氧化石墨烯水溶液的浓度为1-20mg/mL；
优选地，所述氧化石墨烯与胞外多糖riclin的质量比为1:1-15；
优选地，所述搅拌混合反应的温度为4-25℃，时间为4-8h；
优选地，所述搅拌速率为1000-3000rpm。
7.根据权利要求6所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵，其特征在于，所述氧化石墨烯水溶液是将氧化石墨烯加入水中，超声分散均匀后制得；
优选地，所述超声分散的温度为0-10℃，时间为0.5-1h，超声振幅为10-30％。
8.根据权利要求6或7所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵，其特征在于，所述“冷冻干燥”具体包括：将胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合水凝胶透析后冷冻干燥，即得到所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵；
优选地，所述透析采用的透析袋截留分子量为500-2000Da，透析时间为0.5-2天，换水频次为3-8h/次；
优选地，所述冷冻干燥的温度为-(70-80)℃，时间为24-48h。
9.一种权利要求1-8任一项所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵的制备方法，其特征在于，包括：
(1)将胞外多糖riclin溶于水中，加入氧化剂进行氧化反应后，得到醛基化胞外多糖riclin；
(2)将所述醛基化胞外多糖riclin水溶液与氧化石墨烯水溶液搅拌混合反应，得到胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合水凝胶；
(3)将所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合水凝胶透析后冷冻干燥，即得到所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵。
10.一种权利要求1-9任一项所述胞外多糖riclin/氧化石墨烯复合止血海绵在组织创伤止血或急性伤口大出血制品中的应用。
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2024
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