CN118076747A - 皂苷类化合物在核酸测序中的用途 - Google Patents
皂苷类化合物在核酸测序中的用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118076747A CN118076747A CN202180103015.9A CN202180103015A CN118076747A CN 118076747 A CN118076747 A CN 118076747A CN 202180103015 A CN202180103015 A CN 202180103015A CN 118076747 A CN118076747 A CN 118076747A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- scanning
- ginsenoside
- reagent
- sequencing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 89
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 87
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 87
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 title claims abstract description 75
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 title claims abstract description 23
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 title claims abstract description 23
- -1 saponins compounds Chemical class 0.000 title claims description 26
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 100
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 claims abstract description 10
- LOUPRKONTZGTKE-WZBLMQSHSA-N Quinine Chemical compound C([C@H]([C@H](C1)C=C)C2)C[N@@]1[C@@H]2[C@H](O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-WZBLMQSHSA-N 0.000 claims description 30
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 29
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 24
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 23
- YURJSTAIMNSZAE-HHNZYBFYSA-N ginsenoside Rg1 Chemical compound O([C@@](C)(CCC=C(C)C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@]([C@@]3(C[C@@H]([C@H]4C(C)(C)[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3C[C@H]2O)O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)C)(C)CC1)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O YURJSTAIMNSZAE-HHNZYBFYSA-N 0.000 claims description 23
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- YURJSTAIMNSZAE-UHFFFAOYSA-N UNPD89172 Natural products C1CC(C2(CC(C3C(C)(C)C(O)CCC3(C)C2CC2O)OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C)(C)C2C1C(C)(CCC=C(C)C)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O YURJSTAIMNSZAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- CBEHEBUBNAGGKC-UHFFFAOYSA-N ginsenoside Rg1 Natural products CC(=CCCC(C)(OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O)C2CCC3(C)C2C(O)CC4C5(C)CCC(O)C(C)(C)C5CC(OC6OC(CO)C(O)C(O)C6O)C34C)C CBEHEBUBNAGGKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 21
- LLPWNQMSUYAGQI-OOSPGMBYSA-N notoginsenoside R1 Chemical compound O([C@@](C)(CCC=C(C)C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@]([C@@]3(C[C@@H]([C@H]4C(C)(C)[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3C[C@H]2O)O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO2)O)C)(C)CC1)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LLPWNQMSUYAGQI-OOSPGMBYSA-N 0.000 claims description 20
- 230000008832 photodamage Effects 0.000 claims description 18
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 18
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 18
- UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical class [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 17
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 16
- 235000001258 Cinchona calisaya Nutrition 0.000 claims description 15
- LOUPRKONTZGTKE-UHFFFAOYSA-N cinchonine Natural products C1C(C(C2)C=C)CCN2C1C(O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229960000948 quinine Drugs 0.000 claims description 15
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 claims description 14
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 12
- QFUMGPMULRUDNL-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;ethane-1,2-diamine;tetraacetate;dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.NCCN QFUMGPMULRUDNL-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 12
- VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N L-1,4-dithiothreitol Chemical compound SC[C@H](O)[C@@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-IMJSIDKUSA-N 0.000 claims description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 11
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 8
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 claims description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 7
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 7
- TXEWRVNOAJOINC-UHFFFAOYSA-N ginsenoside Rb2 Natural products CC(=CCCC(OC1OC(COC2OCC(O)C(O)C2O)C(O)C(O)C1O)C3CCC4(C)C3C(O)CC5C6(C)CCC(OC7OC(CO)C(O)C(O)C7OC8OC(CO)C(O)C(O)C8O)C(C)(C)C6CCC45C)C TXEWRVNOAJOINC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FBFMBWCLBGQEBU-GYMUUCMZSA-N 20-gluco-ginsenoside-Rf Natural products O([C@](CC/C=C(\C)/C)(C)[C@@H]1[C@H]2[C@H](O)C[C@H]3[C@](C)([C@]2(C)CC1)C[C@H](O[C@@H]1[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)[C@H]1C(C)(C)[C@@H](O)CC[C@]31C)[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 FBFMBWCLBGQEBU-GYMUUCMZSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- PFSIGTQOILYIIU-UHFFFAOYSA-N ginsenoside Rb3 Natural products CC(=CCCC(C)(O)C1CCC2(C)C3CCC4C(C)(C)C(CCC4(C)C3CC(OC5OC(COC6OCC(O)C(O)C6O)C(O)C(O)C5O)C12C)OC7OC(CO)C(O)C(O)C7OC8OC(CO)C(O)C(O)C8O)C PFSIGTQOILYIIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 3
- FBFMBWCLBGQEBU-RXMALORBSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[[(3s,5r,6s,8r,9r,10r,12r,13r,14r,17s)-3,12-dihydroxy-4,4,8,10,14-pentamethyl-17-[(2s)-6-methyl-2-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyhept-5-en-2-yl]-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-dodecah Chemical compound O([C@@](C)(CCC=C(C)C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@]([C@@]3(C[C@@H]([C@H]4C(C)(C)[C@@H](O)CC[C@]4(C)[C@H]3C[C@H]2O)O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)C)(C)CC1)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O FBFMBWCLBGQEBU-RXMALORBSA-N 0.000 claims description 2
- HYPFYJBWSTXDAS-UHFFFAOYSA-N Ginsenoside Rd Natural products CC(=CCCC(C)(OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O)C2CCC3(C)C4CCC5C(C)(C)C(CCC5(C)C4CC(O)C23C)OC6OC(CO)C(O)C(O)C6OC7OC(CO)C(O)C(O)C7O)C HYPFYJBWSTXDAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- UZIOUZHBUYLDHW-MSJHMJQNSA-N Ginsenoside Rf Natural products O([C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H]2C(C)(C)[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@](C)([C@@]3(C)[C@H]([C@@H](O)C2)[C@@H]([C@@](O)(CC/C=C(\C)/C)C)CC3)C1)[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1 UZIOUZHBUYLDHW-MSJHMJQNSA-N 0.000 claims description 2
- YQKCHRBAJSATCG-UHFFFAOYSA-N UNPD30744 Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC(C)(CCC=C(C)C)C2C3C(C4(CCC5C(C)(C)C(OC6C(C(O)C(O)C(CO)O6)OC6C(C(O)C(O)C(CO)O6)O)CCC5(C)C4CC3O)C)(C)CC2)O1 YQKCHRBAJSATCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- CNHRRMQBWQJRPN-UHFFFAOYSA-N chikusetsusaponin LM5 Natural products C1CC(C2(CC(O)C3C(C)(C)C(OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)CCC3(C)C2CC2O)C)(C)C2C1C(C)(CCC=C(C)C)OC(C(C(O)C1O)O)OC1COC1OC(CO)C(O)C1O CNHRRMQBWQJRPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NODILNFGTFIURN-GZPRDHCNSA-N ginsenoside Rb2 Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H](O)[C@@H]1O)O)O[C@@](C)(CCC=C(C)C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@]([C@@]3(CC[C@H]4C(C)(C)[C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)CC[C@]4(C)[C@H]3C[C@H]2O)C)(C)CC1)O[C@@H]1OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NODILNFGTFIURN-GZPRDHCNSA-N 0.000 claims description 2
- NODILNFGTFIURN-USYOXQFSSA-N ginsenoside Rb3 Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H](O)[C@@H]1O)O)O[C@@](C)(CCC=C(C)C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@]([C@@]3(CC[C@H]4C(C)(C)[C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)CC[C@]4(C)[C@H]3C[C@H]2O)C)(C)CC1)O[C@@H]1OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NODILNFGTFIURN-USYOXQFSSA-N 0.000 claims description 2
- JDCPEKQWFDWQLI-LUQKBWBOSA-N ginsenoside Rc Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H](O)[C@@H]1O)O)O[C@@](C)(CCC=C(C)C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@]([C@@]3(CC[C@H]4C(C)(C)[C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)CC[C@]4(C)[C@H]3C[C@H]2O)C)(C)CC1)O[C@@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@H]1O JDCPEKQWFDWQLI-LUQKBWBOSA-N 0.000 claims description 2
- PWAOOJDMFUQOKB-WCZZMFLVSA-N ginsenoside Re Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@@H]2[C@H]3C(C)(C)[C@@H](O)CC[C@]3(C)[C@@H]3[C@@]([C@@]4(CC[C@@H]([C@H]4[C@H](O)C3)[C@](C)(CCC=C(C)C)O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)C)(C)C2)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O PWAOOJDMFUQOKB-WCZZMFLVSA-N 0.000 claims description 2
- UZIOUZHBUYLDHW-XUBRWZAZSA-N ginsenoside Rf Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H]2C(C)(C)[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@H]2C[C@@H](O)[C@H]3[C@@]([C@@]2(C1)C)(C)CC[C@@H]3[C@@](C)(O)CCC=C(C)C)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZIOUZHBUYLDHW-XUBRWZAZSA-N 0.000 claims description 2
- UVBLDLGZDSGCSN-UHFFFAOYSA-N ginsenoside-Rb3 Natural products C1=CC2C3(C)CCC(O)C(C)(C)C3CCC2(C)C2(C)CCC34CCC(C)C(C)C4C21OC3=O UVBLDLGZDSGCSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- SPFXZQZPHXUJSR-UHFFFAOYSA-N ginsenoside-Rc Natural products CC(=CCCC(C)(OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC2OC(CO)C(O)C2O)C3CCC4(C)C3C(O)CC5C6(C)CCC(OC7OC(CO)C(O)C(O)C7OC8OC(CO)C(O)C(O)C8O)C(C)(C)C6CCC45C)C SPFXZQZPHXUJSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ZTQSADJAYQOCDD-UHFFFAOYSA-N ginsenoside-Rd2 Natural products C1CC(C2(CCC3C(C)(C)C(OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)CCC3(C)C2CC2O)C)(C)C2C1C(C)(CCC=C(C)C)OC(C(C(O)C1O)O)OC1COC1OCC(O)C(O)C1O ZTQSADJAYQOCDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- AOGZLQUEBLOQCI-UHFFFAOYSA-N ginsenoside-Re Natural products CC1OC(OCC2OC(OC3CC4(C)C(CC(O)C5C(CCC45C)C(C)(CCC=C(C)C)OC6OC(CO)C(O)C(O)C6O)C7(C)CCC(O)C(C)(C)C37)C(O)C(O)C2O)C(O)C(O)C1O AOGZLQUEBLOQCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 2
- KSYNLCYTMRMCGG-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate;dihydrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O KSYNLCYTMRMCGG-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 2
- UOJAEODBOCLNBU-UHFFFAOYSA-N vinaginsenoside R4 Natural products C1CC(C2(CC(O)C3C(C)(C)C(OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)OC4C(C(O)C(O)C(CO)O4)O)CCC3(C)C2CC2O)C)(C)C2C1C(C)(CCC=C(C)C)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O UOJAEODBOCLNBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 21
- LLPWNQMSUYAGQI-QBQUQATFSA-N Ginsenoside R1 Natural products O([C@](CC/C=C(\C)/C)(C)[C@@H]1[C@H]2[C@@H](O)C[C@H]3[C@](C)([C@]2(C)CC1)C[C@H](O[C@@H]1[C@H](O[C@@H]2[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CO2)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)[C@H]1C(C)(C)[C@@H](O)CC[C@]31C)[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1 LLPWNQMSUYAGQI-QBQUQATFSA-N 0.000 description 19
- JURZHOVRCOWZFN-UHFFFAOYSA-N notoginsenoside R1 Natural products CC(=CCCC(C)(OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O)C2CCC3(C)C2C(O)CC4C5(C)CCC(O)C(C)(C)C5C(CC34C)OC6OC(COC7OCC(O)C(O)C7O)C(O)C(O)C6O)C JURZHOVRCOWZFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- GLEVLJDDWXEYCO-UHFFFAOYSA-N Trolox Chemical compound O1C(C)(C(O)=O)CCC2=C1C(C)=C(C)C(O)=C2C GLEVLJDDWXEYCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 239000002077 nanosphere Substances 0.000 description 16
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 14
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 14
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 5
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 4
- 241000180649 Panax notoginseng Species 0.000 description 3
- 235000003143 Panax notoginseng Nutrition 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N quinolin-2-ol Chemical compound C1=CC=C2NC(=O)C=CC2=C1 LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical class NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 4-sulfanylidene-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound SC=1C=CNC(=O)N=1 OVONXEQGWXGFJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 5-(hydroxymethyl)cytosine Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1CO RYVNIFSIEDRLSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKLKXUYJIUGECX-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-1h-pyrimidine-2,4-dione;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.CC1=CNC(=O)NC1=O ZKLKXUYJIUGECX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HCGHYQLFMPXSDU-UHFFFAOYSA-N 7-methyladenine Chemical class C1=NC(N)=C2N(C)C=NC2=N1 HCGHYQLFMPXSDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N GDP Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000131316 Panax pseudoginseng Species 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical class O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N Uridine-5'-Diphosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N Uridinemonophosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- DAEAPNUQQAICNR-RRKCRQDMSA-K dADP(3-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)O1 DAEAPNUQQAICNR-RRKCRQDMSA-K 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N dCTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- CIKGWCTVFSRMJU-KVQBGUIXSA-N dGDP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 CIKGWCTVFSRMJU-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- QHWZTVCCBMIIKE-SHYZEUOFSA-N dUDP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 QHWZTVCCBMIIKE-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical class 0.000 description 2
- 230000001909 effect on DNA Effects 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 2
- 229930182494 ginsenoside Natural products 0.000 description 2
- 229940089161 ginsenoside Drugs 0.000 description 2
- QGWNDRXFNXRZMB-UHFFFAOYSA-N guanidine diphosphate Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O QGWNDRXFNXRZMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 235000013928 guanylic acid Nutrition 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N isoguanine Chemical compound NC1=NC(=O)NC2=C1NC=N2 DRAVOWXCEBXPTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 239000011807 nanoball Substances 0.000 description 2
- 102000044158 nucleic acid binding protein Human genes 0.000 description 2
- 108700020942 nucleic acid binding protein Proteins 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical class 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N uridine 5'-monophosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- PMJWDPGOWBRILU-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCC(C=C1)=CC=C1N1C(=O)C=CC1=O PMJWDPGOWBRILU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N (3-aminopropyl)triethoxysilane Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCN WYTZZXDRDKSJID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyadenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CWGFSQJQIHRAAE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol tetrahydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.OCC(N)(CO)CO CWGFSQJQIHRAAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HTOVHZGIBCAAJU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-propyl-1h-purin-6-one Chemical compound CCCC1(N)NC(=O)C2=NC=NC2=N1 HTOVHZGIBCAAJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-hydroxypyrimidine Chemical compound NC1=NC=CC(O)=N1 XQCZBXHVTFVIFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 2-aminopurine Chemical compound NC1=NC=C2N=CNC2=N1 MWBWWFOAEOYUST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USCCECGPGBGFOM-UHFFFAOYSA-N 2-propyl-7h-purin-6-amine Chemical compound CCCC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 USCCECGPGBGFOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZIDPTARTNUQSR-UHFFFAOYSA-N 3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoic acid;1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O.OC(=O)C1=CC=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=C1 AZIDPTARTNUQSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SJECZPVISLOESU-UHFFFAOYSA-N 3-trimethoxysilylpropan-1-amine Chemical compound CO[Si](OC)(OC)CCCN SJECZPVISLOESU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQILVUYCDHSGEU-UHFFFAOYSA-N 4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexane-1-carboxylic acid Chemical compound C1CC(C(=O)O)CCC1CN1C(=O)C=CC1=O LQILVUYCDHSGEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NQXOUNOJWFMRLG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]butanoic acid;pyrrolidine-2,5-dione Chemical compound O=C1CCC(=O)N1.C1=CC(CCCC(=O)O)=CC=C1N1C(=O)C=CC1=O NQXOUNOJWFMRLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SWDDLRSGGCWDPH-UHFFFAOYSA-N 4-triethoxysilylbutan-1-amine Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)CCCCN SWDDLRSGGCWDPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHASLLQCJNEMQG-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-1h-pyrimidine-2,4-dione;phosphono dihydrogen phosphate Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O.OP(O)(=O)OP(O)(O)=O AHASLLQCJNEMQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2-sulfanylidene-1h-pyrimidin-4-one Chemical compound CC1=CNC(=S)NC1=O ZLAQATDNGLKIEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UJBCLAXPPIDQEE-UHFFFAOYSA-N 5-prop-1-ynyl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CC#CC1=CNC(=O)NC1=O UJBCLAXPPIDQEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 6-amino-1h-pyrimidine-2-thione Chemical compound NC1=CC=NC(S)=N1 DCPSTSVLRXOYGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNNARSZPGNJZIX-UHFFFAOYSA-N 6-amino-5-prop-1-ynyl-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound CC#CC1=CNC(=O)N=C1N QNNARSZPGNJZIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 6-methyladenine Chemical compound CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PFUVOLUPRFCPMN-UHFFFAOYSA-N 7h-purine-6,8-diamine Chemical compound C1=NC(N)=C2NC(N)=NC2=N1 PFUVOLUPRFCPMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRYKDUPGBWLLHO-UHFFFAOYSA-N 8-azaadenine Chemical class NC1=NC=NC2=NNN=C12 HRYKDUPGBWLLHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 8-oxoadenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1NC(=O)N2 RGKBRPAAQSHTED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000178 Acrylic resin Polymers 0.000 description 1
- 239000004925 Acrylic resin Substances 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- ZWIADYZPOWUWEW-XVFCMESISA-N CDP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 ZWIADYZPOWUWEW-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 102100033620 Calponin-1 Human genes 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010036364 Deoxyribonuclease IV (Phage T4-Induced) Proteins 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 101000945318 Homo sapiens Calponin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229930189092 Notoginsenoside Natural products 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000003181 Panax pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Chemical class 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- BZDVTEPMYMHZCR-JGVFFNPUSA-N [(2s,5r)-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 BZDVTEPMYMHZCR-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N [[5-(2,4-dioxopyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- IRLPACMLTUPBCL-FCIPNVEPSA-N adenosine-5'-phosphosulfate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@@H](CO[P@](O)(=O)OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O IRLPACMLTUPBCL-FCIPNVEPSA-N 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical class N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 229960004050 aminobenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- UETQVDZZPKAQIC-UHFFFAOYSA-N chlorane Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl UETQVDZZPKAQIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- JSRLJPSBLDHEIO-SHYZEUOFSA-N dUMP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 JSRLJPSBLDHEIO-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- LTFMZDNNPPEQNG-UHFFFAOYSA-N deoxyguanylic acid Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1CC(O)C(COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229910001648 diaspore Inorganic materials 0.000 description 1
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N dihydromaleimide Natural products O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VQRWLYMKQQBDFK-UHFFFAOYSA-N diphosphono hydrogen phosphate;5-methyl-1h-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O.OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O VQRWLYMKQQBDFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Chemical class 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Chemical class 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 239000005060 rubber Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical class CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J17/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, having an oxygen-containing hetero ring not condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton
- C07J17/005—Glycosides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
- C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
- C12Q2521/101—DNA polymerase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及核酸测序领域。特别地,本发明涉及包含皂苷类化合物的扫描试剂,包含所述扫描试剂的试剂盒,以及使用所述扫描试剂进行核酸测序的方法。
Description
本发明涉及核酸测序领域。特别地,本发明涉及包含皂苷类化合物的扫描试剂,皂苷类化合物在核酸测序中作为光损伤保护剂的用途,以及一种核酸测序方法。
边合成边测序是多核酸测序的理论基础,在测序的过程中对于碱基的识别至关重要。一般情况下,碱基的识别是通过识别标记在不同碱基上的荧光染料类型来确定的,过程包括:使核苷酸暴露于紫外-可见光的照射之下,荧光染料中的生色团发出荧光,之后荧光信号被检测并拍照,进而可以确定荧光染料的类型。
可以使用波长在紫外-可见光范围内的激光作为光源。但是,激光会对模板核苷酸产生损伤,这会严重影响多核酸测序的质量。
在碱基识别过程中所使用的缓冲溶液被称为扫描试剂或拍照试剂。可以通过向扫描试剂中添加光损伤保护剂来阻止激光对模板核苷酸的损伤。然而,现有技术中,扫描试剂中光损伤保护剂成分的浓度较高。高浓度光损伤保护剂的使用使得扫描试剂在低温保存时或者在长时间的测序过程出现盐析出的现象。此外,在长时间储放过程中,有些光损伤保护成分被氧化后会出现变色现象,从而影响扫描质量,进而影响多核苷酸的测序质量。另外,高浓度的光损伤保护剂的使用会使得产品成本增加。
发明内容
本发明使用皂苷类化合物(例如三七皂苷和人参皂苷)作为光损伤保护剂,在很低的工作浓度下,也可以达到对模板核苷酸的保护。本发明使用的皂苷类化合物在紫外可见光区没有吸收,不存在对碱基识别信号干扰,即使长期储存过程中被氧化也不会出现变色现象。
本申请提供了以下发明:
在一个方面,本申请提供了一种扫描试剂,其包含皂苷类化合物,以及Tris缓冲溶液,所述皂苷类化合物选自以下化合物中的一个或多个:
本发明中,Tris缓冲溶液指的是以三羟甲基氨基甲烷(Tris)作为缓冲体系的缓冲溶液。
Tris被广泛用于生物化学和分子生物学的缓冲溶液的制备。Tris为弱碱,其碱的水溶液pH在10.5左右,加入盐酸调节pH值至所需值,即可获得该pH值的缓冲液。也可使用Tris与其盐酸盐(Tris-HCl)配制缓冲溶液。
Tris缓冲溶液的有效缓冲范围在pH7.0到9.2之间。Tris缓冲溶液可用作溶解核酸的溶剂。
本发明中,皂苷类化合物在很低的使用浓度下,也可以达到对模板核苷酸的保护。在某些实施方案中,所述皂苷类化合物的浓度为0.01-10mM或10-100mM,例如0.01-0.02mM、0.02-0.03mM、0.03-0.04mM、0.04-0.05mM、0.05-0.06mM、0.06-0.07mM、0.07-0.08mM、0.08-0.09mM、0.09-0.1mM、0.1-0.2mM、0.2-0.3mM、0.3-0.4mM、0.4-0.5mM、0.5-0.6mM、0.6-0.7mM、0.7-0.8mM、0.8-0.9mM、0.9-1.0mM、1-2mM、2-3mM、3-4mM、4-5mM、5-6mM、6-7mM、7-8mM、8-9、9-10mM、10-20mM、20-30mM、30-40mM、40-50mM、50-60mM、60-70mM、70-80mM、80-90或90-100mM。
在某些实施方案中,三七皂苷R1(Notoginsenoside R1)的浓度可以为0.01-10mM,例如0.01-0.5mM、0.5-1mM、1-2mM、2-3mM、3-4mM、4-5mM、5-6mM、6-7mM、7-8mM、8-9或9-10mM。
在某些实施方案中,人参皂苷Rg1的浓度可以为10-100mM,例如10-20mM、20-30mM、 30-40mM、40-50mM、50-60mM、60-70mM、70-80mM、80-90或90-100mM。
在某些实施方案中,所述扫描试剂还包含其他光损伤保护剂,例如奎诺二甲基丙烯酸酯((±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid)、乙二胺四乙酸四钠盐二水合物(Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate)、L-二硫苏糖醇(L-Dithiothreitol)或其任意组合。一种以上的光损伤保护剂加入到扫描试剂中将更利于DNA测序质量的提高。
在某些实施方案中,所述扫描试剂包含奎诺二甲基丙烯酸酯,例如,包含三七皂苷R1和奎诺二甲基丙烯酸酯,或包含人参皂苷Rg1和奎诺二甲基丙烯酸酯。
在某些实施方案中,所述扫描试剂包含奎诺二甲基丙烯酸酯和乙二胺四乙酸四钠盐二水合物,例如,包含三七皂苷R1、奎诺二甲基丙烯酸酯和乙二胺四乙酸四钠盐二水合物,或包含人参皂苷Rg1、奎诺二甲基丙烯酸酯和乙二胺四乙酸四钠盐二水合物。
在某些实施方案中,所述扫描试剂包含奎诺二甲基丙烯酸酯、乙二胺四乙酸四钠盐二水合物和L-二硫苏糖醇,例如包含三七皂苷R1、奎诺二甲基丙烯酸酯、乙二胺四乙酸四钠盐二水合物和L-二硫苏糖醇,或包含人参皂苷Rg1、奎诺二甲基丙烯酸酯、乙二胺四乙酸四钠盐二水合物和L-二硫苏糖醇。
在某些实施方案中,所述扫描试剂中的奎诺二甲基丙烯酸酯、乙二胺四乙酸四钠盐二水合物或L-二硫苏糖醇的浓度各自独立地为5-50mM,例如各自独立地选自5-10mM、10-20mM、20-30mM、30-40mM、40-50mM。
在某些实施方案中,所述扫描试剂还包含氯化钠和/或DNA的稳定剂(例如吐温-20)。氯化钠的作用是提供盐溶液背景,保护测序中的引物。
在某些实施方案中,所述Tris缓冲溶液包含水,三羟甲基氨基甲烷(Tris Base),氯化钠,吐温-20和三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)。
在某些实施方案中,所述Tris缓冲溶液通过以下方法制得:将Tris Base(粉末),氯化钠(粉末),Tween-20,Tris-HCl(粉末)按一定的配比溶解在超纯水中。
在某些实施方案中,本发明的扫描试剂中,各组分的浓度如下表所示。
在另一个方面,本申请提供了皂苷类化合物(例如三七皂苷或人参皂苷)在核酸测序中作为光损伤保护剂的用途,所述皂苷类化合物选自三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rc、人参皂苷Rf、人参皂苷Re,各化合物结构式如上文所示。
在另一个方面,本申请提供了一种试剂盒,其包含本发明的扫描试剂。
在某些实施方案中,本发明的试剂盒还可以包含:用于将待测序的核酸分子与支持物固定(例如,通过共价或非共价连接进行固定)的试剂;用于起始核苷酸聚合反应的引物;用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶;一种或多种缓冲溶液;一种或多种洗涤溶液;或其任何组合。
在某些实施方案中,本发明的试剂盒还可以包含,用于从样品中提取核酸分子的试剂和/或装置。用于从样品中提取核酸分子的方法是本领域熟知的。因此,可根据需要,在本发明的试剂盒中配置各种用于提取核酸分子的试剂和/或装置,例如用于破碎细胞的试剂,用于沉淀DNA的试剂,用于洗涤DNA的试剂,用于溶解DNA的试剂,用于沉淀RNA的试剂,用于洗涤RNA的试剂,用于溶解RNA的试剂,用于去除蛋白的试剂,用于去除DNA的试剂(例如当目的核酸分子为RNA时),用于去除RNA的试剂(例如当目的核酸分子为DNA时),及其任何组合。
在某些实施方案中,本发明的试剂盒还包含,用于预处理核酸分子的试剂。在本发明的试剂盒中,用于预处理核酸分子的试剂不受额外限制,并且可根据实际需要选择。所述用于预处理核酸分子的试剂包括例如,用于核酸分子片段化的试剂(例如DNA酶I),用于补齐核酸分子末端的试剂(例如DNA聚合酶,例如T4DNA聚合酶,Pfu DNA聚合酶,Klenow DNA聚合酶),接头分子,标签分子,用于将接头分子与目的核酸分子相连接的试剂(例如连接酶,例如T4DNA连接酶),用于修复核酸末端的试剂(例如,丧失3'-5'核酸外切酶活性但显示5'-3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶),用于扩增核酸分子的试剂(例如,DNA聚合酶,引物,dNTP),用于分离和纯化核酸分子的试剂(例如层析柱),以及其任何组合。
在某些实施方案中,本发明的试剂盒还包含用于固定待测序的核酸分子的支持物。在通常情况下,用于固定待测序的核酸分子的支持物呈固相,以便于操作。因此,在本公开内容中,“支持物”有时也被称为“固体支持物”或“固相支持物。”然而,应当理解的是,本文 所提及的“支持物”并不限于固体,其还可以是半固体(例如凝胶)。
如本文所用的,术语“装载、”“固定”和“附着”当提及核酸使用时,意指经由共价键或非共价键直接或间接附接至固体支持物。在本公开内容的某些实施方案中,本发明的方法包括经由共价附接将核酸固定在固体支持物上。但是通常地,仅需要的是在期望使用固体支持物的条件下(例如在需要核酸扩增和/或测序的应用中),核酸保持固定或附接至固体支持物。在某些实施方案中,将核酸固定在固体支持物上可以包括将待用作捕获引物或扩增引物的寡核苷酸固定在固体支持物上,使得3'末端对于酶促延伸是可利用的并且该引物序列的至少一部分能够杂交至互补核酸序列;然后将待固定的核酸杂交至所述寡核苷酸,在这种情况下固定的寡核苷酸或多核苷酸可以为3'-5'方向。在某些实施方案中,将核酸固定在固体支持物上可以包括通过氨基化修饰将核酸结合蛋白质结合在固体支持物上,并通过核酸结合蛋白质捕获核酸分子。可选地,装载可以通过除碱基配对杂交之外的其他方式发生,例如上文描述的共价附接。核酸与固体支持物附接方式的非限制性示例包括核酸杂交、生物素链霉亲和素结合、巯基结合、光活化结合、共价结合、抗体-抗原、经由水凝胶或其他多孔聚合物的物理限制等。用于将核酸固定在固体支持物上的各种示例性方法可参见例如G.Steinberg-Tatm an等人,Bioconjugate Chemistry 2006,17,841-848;Xu X.等人Journal of the Ame rican Chemical Society 128(2006)9286-9287;美国专利申请US 5639603、US 5641658、US2010248991;国际专利申请WO 2001062982、WO 2001012862、WO 2007111937、WO0006770,为了所有目的,特别是为了与制备形成其上固定有核酸的固体支持物有关的全部教导,以上文献均通过引用全文并入本文。
在本发明中,所述支持物可以由各种合适的材料制成。此类材料包括例如:无机物、天然聚合物、合成聚合物,以及其任何组合。具体的例子包括但不限于:纤维素、纤维素衍生物(例如硝化纤维素)、丙烯酸树脂、玻璃、硅胶、二氧化硅、聚苯乙烯、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯基和丙烯酰胺的共聚物、与二乙烯基苯等交联的聚苯乙缔(参见例如,Merrifield Biochemistry 1964,3,1385-1390)、聚丙烯酰胺、乳胶、葡聚糖、橡胶、硅、塑料、天然海绵、金属塑料、交联的葡聚糖(例如,Sephadex
TM)、琼脂糖凝胶(Sepharose
TM),以及本领域技术人员已知的其他支持物。
在某些优选的实施方案中,用于固定待测序的核酸分子的支持物可以是包括惰性基底或基质(例如,载玻片、聚合物珠等)的固体支持物,所述惰性基底或基质已例如通过应用含有活性基团的中间材料而被功能化,所述活性基团允许共价连接诸如多核苷酸的生物 分子。此类支持物的实例包括但不限于,负载于诸如玻璃的惰性基底上的聚丙酰胺水凝胶,特别是WO 2005/065814和US 2008/0280773中描述的聚丙烯酰胺水凝胶,其中,所述专利申请的内容通过引用以其全文并入本文。在此类实施方案中,生物分子(例如多核苷酸)可被直接地共价地连接至中间材料(例如水凝胶),而中间材料其自身可被非共价地连接至基底或基质(例如,玻璃基底)。在某些优选的实施方案中,所述支持物为表面修饰了一层亲和素、氨基、丙烯酰胺硅烷或醛基化学基团的玻片或硅片。
在本发明中,支持物或固体支持物不受限于其大小、形状和构造。在一些实施方案中,支持物或固体支持物是平面结构,例如载片、芯片、微芯片和/或阵列。此类支持物的表面可以是平面层的形式。
在某些优选的实施方案中,用于固定待测序的核酸分子的支持物为珠或孔的阵列(其也被称为芯片)。所述阵列可以使用本文概述的用于制备固体支持物的任何材料来制备,并且优选地,阵列上的珠或孔的表面进行了官能化,以利于核酸分子的固定。阵列上的珠或孔的数目不受限制。例如,每一个阵列可包含10-10
2、10
2-10
3、10
3-10
4、10
4-10
5、10
5-10
6、10
6-10
7、10
7-10
8、10
8-10
9、10
10-10
11、10
11-10
12或更多个珠或孔。在某些示例性实施方案中,每个珠或孔的表面可固定一个或多个核酸分子。相应地,每一个阵列可固定10-10
2、10
2-10
3、10
3-10
4、10
4-10
5、10
5-10
6、10
6-10
7、10
7-10
8、10
8-10
9、10
10-10
11、10
11-10
12或更多个核酸分子。因此,此类阵列可特别有利地用于核酸分子的高通量测序。
在某些优选的实施方案中,本发明的试剂盒还包含用于将待测序的核酸分子与支持物固定(例如,通过共价或非共价连接进行固定)的试剂。此类试剂包括例如对核酸分子(例如其5'端)进行活化或修饰的试剂,例如磷酸、硫醇、胺、羧酸或醛;对支持物的表面进行活化或修饰的试剂,例如氨基-烷氧基硅烷(例如氨基丙基三甲氧基硅烷、氨基丙基三乙氧基硅烷、4-氨基丁基三乙氧基硅烷等);交联剂,例如琥珀酰酐、苯基二异硫氰酸盐(Guo等人,1994)、马来酸酐(Yang等人,1998)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)、间-马来酰亚胺基苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-琥珀酰亚胺基[4-碘代乙酰基]氨基苯甲酸(SIAB)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺(SMCC)、N-γ-马来酰亚胺基丁酰氧基-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺(SMPB);以及其任何组合。
在某些优选的实施方案中,本发明的试剂盒还包含用于起始核苷酸聚合反应的引物。在本发明中,引物不受额外的限制,只要它能够特异性地退火到目标核酸分子的一个区域上。在一些示例性实施方案中,所述引物的长度可以为5-50bp,例如5-10、10-15、15-20、 20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50bp。在一些示例性实施方案中,所述引物可包含天然存在或非天然存在的核苷酸。在一些示例性实施方案中,所述引物包含天然存在的核苷酸或者由天然存在的核苷酸组成。在一些示例性实施方案中,所述引物包含经修饰的核苷酸,例如锁核酸(LNA)。在某些优选的实施方案中,所述引物包含通用引物序列。
在某些优选的实施方案中,本发明的试剂盒还包含用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶。在本发明中,可使用各种合适的聚合酶进行聚合反应。在一些示例性实施方案中,所述聚合酶能够以DNA为模板合成新的DNA链(例如DNA聚合酶)。在一些示例性实施方案中,所述聚合酶能够以RNA为模板合成新的DNA链(例如反转录酶)。在一些示例性实施方案中,所述聚合酶能够以DNA或RNA为模板合成新的RNA链(例如RNA聚合酶)。因此,在某些优选的实施方案中,所述聚合酶选自DNA聚合酶,RNA聚合酶,和反转录酶。
在某些优选的实施方案中,本发明的试剂盒还包含一种或多种切除试剂。在某些实施方案中,所述切除试剂选自内切酶IV和碱性磷酸酶。
在某些优选的实施方案中,本发明的试剂盒还包含一种或多种缓冲溶液。此类缓冲液包括但不限于,用于DNA酶I的缓冲溶液,用于DNA聚合酶的缓冲溶液,用于连接酶的缓冲溶液,用于洗脱核酸分子的缓冲溶液,用于溶解核酸分子的缓冲溶液,用于进行核苷酸聚合反应(例如PCR)的缓冲溶液,和用于进行连接反应的缓冲溶液。本发明的试剂盒可包含上述缓冲溶液的任一种或多种。
在某些实施方案中,所述用于DNA聚合酶的缓冲溶液包含一价盐离子(例如钠离子、氯离子)和/或二价盐离子(例如镁离子、硫酸根离子,锰离子)。在某些实施方案中,所述一价盐离子或二价盐离子在所述缓冲溶液中的浓度为10μM-200mM,例如10μM、50μM、100μM、200μM、500μM、1mM、3mM、10mM、20mM、50mM、100mM、150mM或200mM。
在某些实施方案中,所述用于DNA聚合酶的缓冲溶液包含三羟甲基氨基甲烷(Tris)。在某些实施方案中,Tris在所述缓冲溶液中的浓度为10mM-200mM,例如10mM、20mM、50mM、100mM、150mM或200mM。
在某些实施方案中,所述用于DNA聚合酶的缓冲溶液包含有机溶剂,例如DMSO或丙三醇(甘油)。在某些实施方案中,所述有机溶剂在所述缓冲溶液中的质量含量为0.01%-10%,例如0.01%、0.02%、0.05%、1%、2%、5%或10%。
在某些实施方案中,所述用于DNA聚合酶的缓冲溶液的pH为7.0-9.0,例如7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9 或9.0。
在某些实施方案中,所述用于DNA聚合酶的缓冲溶液包含:一价盐离子(例如钠离子、氯离子)、二价盐离子(例如镁离子、硫酸根离子、锰离子)、Tris和有机溶剂(例如DMSO或甘油)。在某些实施方案中,所述缓冲溶液相的pH为8.8。
在某些优选的实施方案中,本发明的试剂盒还包含一种或多种洗涤溶液。此类洗涤溶液的实例包括但不限于,磷酸盐缓冲液,柠檬酸盐缓冲液,Tris-HCl缓冲液,醋酸盐缓冲液,碳酸盐缓冲液等。本发明的试剂盒可包含上述洗涤溶液的任一种或多种。
在另一个方面,本申请提供了本发明的扫描试剂或试剂盒用于测定目标多核苷酸的序列的用途。
在另一个方面,本申请提供了制备本发明的扫描试剂的方法,包括将扫描试剂的各成分溶解在超纯水中,制成透明均一的溶液,之后对溶液进行过滤,得到本发明的扫描试剂。可使用超声辅助溶解。
在另一个方面,本申请提供了一种核酸测序的方法,所述方法包括使用本发明的扫描试剂。在某些实施方案中,本发明的测序方法包括一边合成目标单链多核苷酸互补的生长的多核苷酸,一边进行扫描拍照检测。
在某些实施方案中,所述测定目标单链多核苷酸的序列的方法包括:
(a)提供双链体、核苷酸、聚合酶和切除试剂;所述双链体包含生长的核酸链以及待测序的核酸分子;
(b)进行包含以下步骤(i)、(ii)和(iii)的反应循环:
步骤(i):使用聚合酶,使核苷酸并入生长的核酸链,形成包含阻断基团和可检测标记的核酸中间体;
步骤(ii):对所述核酸中间体上的可检测标记进行检测;
步骤(iii):使用切除试剂将核酸中间体上的阻断基团除去。
在某些实施方案中,所述反应循环还包括步骤(iv):使用切除试剂将核酸中间体上的可检测标记除去。
在某些实施方案中,所述方法包括以下步骤:
第一步,将DNA纳米球(DNA nanoball,简称DNB)加载到准备好的测序芯片上;
第二步,将准备好的dNTP分子混合溶液泵入芯片用DNA聚合酶将dNTP加入到待测DNA的互补链上;
第三步,拍照扫描,由于dNTP是被修饰的带有荧光基团分子,用激光作为激发波长 进行拍照;由于激光对于DNA有光损伤作用,因此在拍照这一步骤加入包含光损伤保护剂的扫描试剂进行拍照;
第四步,通过切除试剂将碱基端荧光基团和3’的阻断切除并洗脱干净,使得3’-OH裸露从而进行下一轮反应;
第五步,通过对拍照结果进行分析,确定待测核酸分子的碱基序列。
本发明中,核酸可以包括核苷酸或核苷酸类似物。核苷酸通常含有糖、核碱基和至少一个磷酸基。核苷酸包括脱氧核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、肽核苷酸、修饰的肽核苷酸、修饰磷酸盐糖主链核苷酸及其混合物。核苷酸的实例包括(例如)腺苷一磷酸(AMP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷三磷酸(ATP)、胸苷一磷酸(TMP)、胸苷二磷酸(TDP)、胸苷三磷酸(TTP)、胞苷酸(CMP)、胞苷二磷酸(CDP)、胞苷三磷酸(CTP)、鸟苷一磷酸(GMP)、鸟苷二磷酸(GDP)、鸟苷三磷酸(GTP)、尿苷一磷酸(UMP)、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷三磷酸(UTP)、脱氧腺苷酸(dAMP)、脱氧腺苷二磷酸(dADP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胸腺嘧啶核苷一磷酸(dTMP)、脱氧胸腺嘧啶核苷二磷酸(dTDP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、去氧胞二磷(dCDP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷一磷酸(dGMP)、脱氧鸟苷二磷酸(dGDP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧尿苷一磷酸(dUMP)、脱氧尿苷二磷酸(dUDP)和脱氧尿苷三磷酸(dUTP)。还可以在本文所述的方法中使用包含修饰的核碱基的核苷酸类似物。无论是具有天然主链还是类似结构,可以包含在多核苷酸中的示例性修饰的核碱基包括(例如)肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫脲嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶、15-卤代脲嘧啶、15-卤代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤或鸟嘌呤、8-氨基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫烷基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-羟基腺嘌呤或鸟嘌呤、5-卤素取代的尿嘧啶或胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-去氮鸟嘌呤、7-去氮腺嘌呤、3-去氮鸟嘌呤、3-去氮腺嘌呤等。如本领域中已知的,某些核苷酸类似物不能引入多核苷酸,例如,核苷酸类似物,如腺苷5′-磷酰硫酸。
在本发明的方法中,待测序的核酸分子不受其长度的限制。在某些优选的实施方案中,待测序的核酸分子的长度可以为至少10bp,至少20bp,至少30bp,至少40bp,至少50bp,至少100bp,至少200bp,至少300bp,至少400bp,至少500bp,至少1000bp,或者至 少2000bp。在某些优选的实施方案中,待测序的核酸分子的长度可以为10-20bp,20-30bp,30-40bp,40-50bp,50-100bp,100-200bp,200-300bp,300-400bp,400-500bp,500-1000bp,1000-2000bp,或者超过2000bp。在某些优选的实施方案中,待测序的核酸分子可具有10-1000bp的长度,以利于进行高通量测序。
在某些优选的实施方案中,在将核酸分子固定于支持物之前,可以对核酸分子进行预处理。此类预处理包括但不限于,核酸分子的片段化,末端的补齐,接头的添加,标签的添加,核酸分子的扩增,核酸分子的分离和纯化,以及其任何组合。
如本文所用的术语“纳米球”一般表示大分子或复合体,其具有紧凑的,例如内径范围典型地在大约1nm与大约1000nm之间,优选地大约50nm与大约500nm之间的(近似)球形形状。
如本文所用的术语“核酸纳米球”通常是包含多拷贝的靶核酸分子的多联体。这些核酸拷贝典型地一个接一个地布置在核苷酸的连续线型链中,但是本发明的核酸纳米球还可以利用本文描述的方法由任何核酸分子制成。该串联重复结构连同DNA的单链性质引起纳米球折叠(folding)配置。一般而言,核酸纳米球中的多拷贝的靶核酸分子各自包含序列已知的接头序列,以便于对其进行扩增或测序。各靶核酸分子的接头序列通常是相同的,但也可以不同。核酸纳米球通常包括DNA纳米球,在本文中也称为DNB(DNA nanoball)。
核酸纳米球可以使用例如滚环复制(RCA)来产生。RCR过程曾被用于制备多个连续拷贝的M13基因组(Blanco等人,(1989)J Biol Chem 264:8935-8940)。在这种方法中,核酸经线性多联体化复制。本领域技术人员可以在许多参考文献中找到关于选择RCR反应的条件和试剂的指南,包括美国专利US5,426,180、US5,854,033、US6,143,495和US5,871,921,为了所有目的,特别是为了与利用RCR或其他方法制备核酸纳米球有关的全部教导,这些文献均通过引用全文并入本文。
核酸纳米球可以装载在如本文所述的固体支持物的表面上。纳米球可以通过任何合适的方法附着到固体支持物的表面,这样的方法的非限制性示例包括核酸杂交、生物素链霉亲和素结合、巯基结合、光活化结合、共价结合、抗体-抗原、经由水凝胶或其他多孔聚合物的物理限制等,或它们的组合。在一些情况下,纳米球可以用核酸酶(例如,DNA核酸酶)消化,以便从纳米球产生较小的纳米球或片段。
某些实施方案中,固体支持物表面可能带有反应性官能团,所述反应性官能团与多核苷酸分子上的互补官能团反应形成共价键,例如采用与附着cDNA到微阵列上所 用的技术相同的方式进行,例如参见Smirnov等人(2004),Genes,Chromosomes&Cancer,4 0:72-77和Beaucage(2001),Current Medicinal Chemistry,8:1213_1244,这两份文献通过引用并入本文。DNB还可以有效地附着到疏水性表面,例如带有低浓度的各种反应官能团(例如-OH基团)的干净的玻璃表面。经由多核苷酸分子和表面上的反应性官能团之间形成的共价键的附着在本文中又称为“化学附着”。
在其他实施方案中,多核苷酸分子可以吸附到表面上。在这种实施方式中,多核苷酸通过与表面的非特异性相互作用,或者通过诸如氢键、范德华力等的非共价相互作用被固定。
在其它实施方案中,核酸文库可以是双链核酸片段,通过与固定在固体支持物表面的寡核酸发生连接反应固定在固体支持物表面,然后进行桥式扩增反应制备测序文库。
本发明可以实现以下有益效果:
本发明使用皂苷类化合物作为核酸的光损伤保护剂,即使用很低的浓度也可以达到对模板核苷酸的保护。本发明使用的皂苷类化合物在紫外可见光区没有吸收,即使在多轮测序反应之后,数据质量依然很高,不存在对碱基识别信号干扰,而且长期储存过程中被氧化也不会出现变色现象。通过使用本发明优化的扫描试剂可以大大提高核酸测序,特别是多核苷酸测序的质量。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是,本领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
图1显示了实施例中扫描试剂组成对测序质量的影响。
图2显示了实施例中三七皂苷R1的浓度对测序质量的影响。
图3显示了实施例中Trolox的浓度对测序质量的影响。
图4显示了实施例中EDTA-4Na的浓度对测序质量的影响。
图5显示了实施例中DTT的浓度对测序质量的影响。
图6显示了实施例中不同浓度的人参皂苷Rg1测序质量的影响。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例
1.实验器材
MGISEQ-2000RS测序仪,MGIDL-200H加载仪,MGISEQ-2000RS测序载片,仪器的激发波长:分别为532nm,650nm。
2.实验所用试剂和原料
Tris Base(粉末),氯化钠(粉末),Tween-20,Tris-HCl(粉末),三七皂苷R1,奎诺二甲基丙烯酸酯(Trolox),乙二胺四乙酸四钠盐二水合物,L-二硫苏糖醇,人参皂苷Rg1.以上试剂均购于合规化学试剂供应公司。MGISEQ-2000RS高通量测序试剂盒,货号为1000012536,品牌为MGI。大肠杆菌单链环DNA为模板即标准文库试剂V3.0,引物序列:CAACTCCTTGGCTCACAGAACATGGCTACGATCCGACTT。dATP-1,其是指同时具有可逆阻断基团修饰和Cy5荧光修饰的腺嘌呤核苷酸;dTTP-1,其是指同时具有可逆阻断基团修饰和ROX荧光修饰的胸腺嘧啶核苷酸;dGTP-1,其是指同时具有可逆阻断基团修饰和Cy3荧光修饰的鸟嘌呤核苷酸;以及dCTP-1,其是指同时具有可逆阻断基团修饰和EF700荧光修饰的胞嘧啶核苷酸,均来自MGISEQ-2000RS高通量测序试剂盒MGI。
3.实验方法:
(a)扫描试剂的配制
将Tris Base(粉末),氯化钠(粉末),Tween-20,Tris-HCl(粉末),三七皂苷R1,奎诺二甲基丙烯酸酯,乙二胺四乙酸四钠盐二水合物,L-二硫苏糖醇,人参皂苷Rg1按照每组实验的所需配比溶解在超纯水中。超声溶解20分钟,将上述试剂溶解成透明均一的溶液,经过0.22微米的滤膜过滤以待备用。
(b)DNA测序方法:
测序流程:第一步,将DNB纳米球加载到准备好的测序芯片上。
第二步,将准备好的dNTP分子混合溶液泵入芯片用DNA聚合酶将dNTP加入到 DNA母链的互补链上。
第三步,拍照扫描,由于dNTP是被修饰的带有荧光基团分子,用激光作为激发波长进行拍照。由于激光对于DNA有光损伤作用,因此在拍照这一步骤应用扫描试剂作为保护剂进行拍照,拍照结束后进行碱基类型的确认。
第四步,通过切除试剂将碱基端荧光基团和3’的阻断切除并洗脱干净,使得3’-OH裸露从而进行下一轮反应。
使用MGISEQ-2000RS高通量测序试剂盒,试剂盒中#10号孔试剂作为扫描试剂的对照品,按照上述的实验流程在MGISEQ-2000RS测序平台进行PE100+70测序,简言之,每次将配制好的扫描试剂作为实验组将试剂盒中#10号的扫描试剂替换作为考察对象,然后统计每个循环的Q30下降幅度,每个循环的测序错误率曲线来评估测序质量。
实验1评价扫描试剂组成对测序质量的影响
按照表1所示的组成配制Base缓冲溶液,总体积为1L,pH为7.03。向Base缓冲液中加入不同的化合物,配制扫描试剂,之后进行测序。各组测序实验所使用的扫描试剂的组成如表2所示,其中,三七皂苷R1的浓度均为1.7MM,Trolox的浓度均为8MM,EDTA-4Na的浓度均为10MM,L-二硫苏糖醇的浓度为8MM。图1显示了扫描试剂组成对测序质量的影响。
表1
化合物 | 添加量 | 工作液浓度 | |
1 | Tris-Base | 9.40g | 0.077M |
2 | 氯化钠 | 12.17g | 0.200M |
3 | 10%Tween | 5.00mL | 0.05%(体积比) |
4 | Tris-HCl | 72.50g | 0.4600M |
表2
图1中,横坐标为测序循环反应数,纵坐标为碱基准确率大于99.9%的概率,曲线的 中数据纵坐标值越大说明测序的质量越高,也就是趋势越往上走说明数据越好。在溶液为Base缓冲溶液的条件下,将每一个单因素实验(见实验2-6)优化的结果叠加一起进行测试,结果发现,在优化的浓度条件下,Base+S+T+EDTA-4Na的测序质量最好,一链二链Q30以及保持的时间都是最好的。
实验2-6用单因素实验考察了不同添加物的浓度对测序质量的影响,所使用的Base缓冲溶液的组成均与实施例1相同。
实验2评价三七皂苷R1的浓度对测序质量的影响
向Base缓冲溶液中加入不同浓度的三七皂苷R1得到扫描试剂,进行测序。各组测序实验中,使用的扫描试剂的组成如表3所示。
表3
组别 | 扫描试剂的组成 |
1.70mM三七皂苷R1 | Base缓冲溶液+1.7mM三七皂苷R1 |
2.00mM三七皂苷R1 | Base缓冲溶液+2.0mM三七皂苷R1 |
图2显示了三七皂苷R1的浓度对测序质量的影响。从图2中可以看出,在三七皂苷R1的浓度为1.70mM的条件下测序质量更高,二连下降缓慢。因此,三七皂苷R1的浓度为1.70mM对于提高测序质量更为适宜。
实验3评价Trolox的浓度对测序质量的影响
向Base缓冲溶液中加入不同浓度的Trolox得到扫描试剂,进行测序。各组测序实验中,使用的扫描试剂的组成如表4所示。
表4
组别 | 扫描试剂的组成 |
8mM Trolox | Base缓冲溶液+8.00mM Trolox |
10mM Trolox | Base缓冲溶液+10.00mM Trolox |
图3显示了Trolox的浓度对测序质量的影响。从图3可以看出,在Trolox浓度为8mM的条件下测序质量更高,二连下降缓慢。因此,Trolox的浓度为8mM对于提高测序质量更为适宜。
实验4评价EDTA-4Na的浓度对测序质量的影响
向Base缓冲溶液中加入8mM Trolox、1.7mM三七皂苷R1以及不同浓度的 EDTA-4Na得到扫描试剂,进行测序。EDTA-4Na的浓度分别为0mM,7mM,10mM,20mM,30mM,50mM。各组测序实验中,使用的扫描试剂的组成如表5所示。
表5
图4显示了EDTA-4Na对测序质量的影响。从图4中可以看出,EDTA-4Na浓度为10mM的条件下测序质量更高,一链Q30最高,二链Q30下降缓慢。因此EDTA-4Na的浓度为10mM对于提高测序质量更为适宜。
实验5评价DTT的浓度对测序质量的影响
向Base缓冲溶液中加入8.00mM Trolox、1.70mM三七皂苷R1以及不同浓度的DTT得到扫描试剂,进行测序。DTT的浓度分别为0mM,5Mm,8mM,10mM,20mM。各组测序实验中,使用的扫描试剂的组成如表6所示。
表6
图5显示了DTT浓度对测序质量的影响。从图5中可以看出,DTT的浓度为10mM的条件下测序质量更高。综合一链、二链Q30数值,DTT的浓度为8mM对于提高测序质量更为适宜。
实验6评价不同浓度的人参皂苷Rg1测序质量的影响
以Base+S+T+EDTA-4Na+D溶液(Base缓冲溶液+1.70mM三七皂苷R1+8.00mM Trolox+10.00mM乙二胺四乙酸四钠盐二水合物+8.00mM L-二硫苏糖醇)为基础,向溶液中添加不同浓度的人参皂苷Rg1,得到扫描试剂,进行测序。人参皂苷Rg1的浓度分别为10mM,15mM,40mM,60mM。各组测序实验中,使用的扫描试剂的组成如表7所示。标准上市试剂盒中维生素C钠盐作为光损伤保护剂。本实验以标准试剂盒中10#号孔位作为对照。
表7
组别 | 扫描试剂的组成 |
10mM人参皂苷Rg1 | Base+S+T+EDTA-4Na+D+10.00mM人参皂苷Rg1 |
15mM人参皂苷Rg1 | Base+S+T+EDTA-4Na+D+15.00mM人参皂苷Rg1 |
40mM人参皂苷Rg1 | Base+S+T+EDTA-4Na+D+40.00mM人参皂苷Rg1 |
40mM维生素C钠盐 | 标准试剂盒中10#号孔位 |
60mM人参皂苷Rg1 | Base+S+T+EDTA-4Na+D+60.00mM人参皂苷Rg1 |
图6显示了人参皂苷Rg1浓度对测序质量的影响。从图6中可以看出,在人参皂苷Rg1的浓度为60.00mM的条件下,使用本发明的扫描试剂的测序质量已经超越了使用维生素C钠盐作为光损伤保护剂的效果,一链、二链Q30以及保持的时间均高于对照组维生素C钠盐。
结论:最终优化的扫描试剂组成如表8示。
表8
化合物 | 添加量 | 工作浓度 |
Tris-Base | 9.40g | 0.077M |
氯化钠 | 12.17g | 0.20M |
10%Tween | 5.00mL | 0.05%(体积比) |
Tris-HCl | 72.50g | 0.46M |
Trolox | 2.00g | 8.00mM |
DTT | 1.23g | 8.00mM |
EDTA-4Na | 4.16g | 10.0mM |
三七皂苷R1 | 1.55g | 1.70mM |
人参皂苷Rg1 | 48.00g | 60.00mM |
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围的,其均应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
- 一种扫描试剂,其包含皂苷类化合物,以及Tris缓冲溶液,所述皂苷类化合物选自以下化合物中的一个或多个:
- 权利要求1的扫描试剂,所述皂苷类化合物的浓度为0.01-10mM或10-100mM。
- 权利要求1或2的扫描试剂,所述扫描试剂还包含其他光损伤保护剂,例如奎诺二甲基丙烯酸酯、乙二胺四乙酸四钠盐二水合物、L-二硫苏糖醇或其任意组合;优选地,所述扫描试剂包含奎诺二甲基丙烯酸酯;优选地,所述扫描试剂包含奎诺二甲基丙烯酸酯和乙二胺四乙酸四钠盐二水合物;优选地,所述扫描试剂包含奎诺二甲基丙烯酸酯、乙二胺四乙酸四钠盐二水合物和 L-二硫苏糖醇;优选地,所述扫描试剂中的奎诺二甲基丙烯酸酯、乙二胺四乙酸四钠盐二水合物或L-二硫苏糖醇的浓度各自独立地为5-50mM。
- 权利要求1-3任一项的扫描试剂,所述扫描试剂还包含氯化钠和/或DNA的稳定剂(例如吐温-20);优选地,所述Tris缓冲溶液包含水,三羟甲基氨基甲烷,氯化钠,吐温-20和三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。
- 一种核酸测序的方法,所述方法包括使用权利要求1-4任一项的扫描试剂。
- 皂苷类化合物在核酸测序中作为光损伤保护剂的用途,所述皂苷类化合物选自三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rc、人参皂苷Rf、人参皂苷Re,其结构式如权利要求1所示。
- 一种试剂盒,所述试剂盒包含权利要求1-4任一项的扫描试剂。
- 权利要求7的试剂盒,还包含:用于将待测序的核酸分子与支持物固定的试剂;用于起始核苷酸聚合反应的引物;用于进行核苷酸聚合反应的聚合酶;一种或多种缓冲溶液;一种或多种洗涤溶液;或其任何组合。
- 权利要求1-4任一项的扫描试剂或权利要求7或8的试剂盒用于测定目标多核苷酸的序列的用途。
- 制备权利要求1-4任一项的扫描试剂的方法,包括将扫描试剂的各成分溶解在超纯水中,制成透明均一的溶液,之后对溶液进行过滤。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2021123011 | 2021-10-11 | ||
CNPCT/CN2021/123011 | 2021-10-11 | ||
PCT/CN2021/123966 WO2023060527A1 (zh) | 2021-10-11 | 2021-10-15 | 皂苷类化合物在核酸测序中的用途 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN118076747A true CN118076747A (zh) | 2024-05-24 |
Family
ID=85987203
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202180103015.9A Pending CN118076747A (zh) | 2021-10-11 | 2021-10-15 | 皂苷类化合物在核酸测序中的用途 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP4417703A1 (zh) |
KR (1) | KR20240089491A (zh) |
CN (1) | CN118076747A (zh) |
AU (1) | AU2021468756A1 (zh) |
CA (1) | CA3237789A1 (zh) |
WO (1) | WO2023060527A1 (zh) |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5426180A (en) | 1991-03-27 | 1995-06-20 | Research Corporation Technologies, Inc. | Methods of making single-stranded circular oligonucleotides |
US5639603A (en) | 1991-09-18 | 1997-06-17 | Affymax Technologies N.V. | Synthesizing and screening molecular diversity |
SE9400522D0 (sv) | 1994-02-16 | 1994-02-16 | Ulf Landegren | Method and reagent for detecting specific nucleotide sequences |
US5641658A (en) | 1994-08-03 | 1997-06-24 | Mosaic Technologies, Inc. | Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support |
US5854033A (en) | 1995-11-21 | 1998-12-29 | Yale University | Rolling circle replication reporter systems |
AU714486B2 (en) | 1995-11-21 | 2000-01-06 | Yale University | Unimolecular segment amplification and detection |
JP2002521064A (ja) | 1998-07-30 | 2002-07-16 | ソレックサ リミテッド | アレイ生体分子およびシークエンシングにおけるその使用 |
AU775380B2 (en) | 1999-08-18 | 2004-07-29 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for preparing oligonucleotide solutions |
WO2001062982A2 (en) | 2000-02-25 | 2001-08-30 | Mosaic Technologies, Inc. | Methods for multi-stage solid phase amplification of nucleic acids |
EP2789383B1 (en) | 2004-01-07 | 2023-05-03 | Illumina Cambridge Limited | Molecular arrays |
GB0427236D0 (en) | 2004-12-13 | 2005-01-12 | Solexa Ltd | Improved method of nucleotide detection |
TW200713076A (en) | 2005-07-18 | 2007-04-01 | Tyfone Inc | Electronic stripe cards |
CN101385519B (zh) * | 2007-09-11 | 2011-03-09 | 金凤燮 | 皂苷或甙糖苷酶活性高的谷物芽及其用途 |
EP2252625B1 (en) * | 2008-02-07 | 2017-12-20 | Pacific Biosciences of California, Inc. | Cis reactive oxygen quenchers integrated into linkers |
US9347092B2 (en) | 2009-02-25 | 2016-05-24 | Roche Molecular System, Inc. | Solid support for high-throughput nucleic acid analysis |
US8834847B2 (en) * | 2010-08-12 | 2014-09-16 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Photodamage mitigation compounds and systems |
CN104830898B (zh) * | 2015-05-15 | 2018-06-05 | 湖南工程学院 | 一种提高人参根中人参皂苷Rg1含量的方法与应用 |
EP3538093B1 (en) * | 2016-11-09 | 2023-10-25 | Qiagen Sciences, LLC | Photoprotective mixtures as imaging reagents in sequencing-by-synthesis |
-
2021
- 2021-10-15 WO PCT/CN2021/123966 patent/WO2023060527A1/zh active Application Filing
- 2021-10-15 CA CA3237789A patent/CA3237789A1/en active Pending
- 2021-10-15 AU AU2021468756A patent/AU2021468756A1/en active Pending
- 2021-10-15 EP EP21960263.8A patent/EP4417703A1/en active Pending
- 2021-10-15 CN CN202180103015.9A patent/CN118076747A/zh active Pending
- 2021-10-15 KR KR1020247015404A patent/KR20240089491A/ko active Search and Examination
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2021468756A1 (en) | 2024-05-02 |
WO2023060527A1 (zh) | 2023-04-20 |
EP4417703A1 (en) | 2024-08-21 |
CA3237789A1 (en) | 2023-04-20 |
KR20240089491A (ko) | 2024-06-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4551216B2 (ja) | 核酸の断片化、標識および固定化の方法 | |
CA2694745C (en) | Miniaturized, high-throughput nucleic acid analysis | |
EP3631001A1 (en) | Methods for performing spatial profiling of biological molecules | |
US20100143932A1 (en) | Single molecule sequencing of captured nucleic acids | |
BG105363A (bg) | Методи за секвениране и амплифициране на нуклеинова киселина | |
JP2010537643A (ja) | 代替的な核酸配列決定法 | |
EP3277839A1 (en) | Surface concatamerization of templates | |
CA3196800A1 (en) | Reagents for massively parallel nucleic acid sequencing | |
CN113528628A (zh) | 用于基因组应用和治疗应用的核酸分子的克隆复制和扩增的系统和方法 | |
JP2011507493A (ja) | 固定化されたペプチド核酸プローブを使用した標的核酸の選択的標識及び検出方法{Methodforselectivelabelinganddetectionoftargetnucleicacidsusingimmobilizedpeptidenucleicacidprobes} | |
US9145582B2 (en) | Microarray techniques for nucleic acid expression analyses | |
AU2019445584B2 (en) | Single-channel sequencing method based on self-luminescence | |
JP2002500362A (ja) | 固相チップおよびそれに関する使用 | |
EP3555314A1 (en) | Loading molecules into sample wells for analysis | |
WO2021031109A1 (zh) | 一种基于发光标记物光信号动力学及二次发光信号对多核苷酸进行测序的方法 | |
JP7206424B2 (ja) | mRNAを増幅する方法及び完全長mRNAライブラリを調製する方法 | |
WO2023060527A1 (zh) | 皂苷类化合物在核酸测序中的用途 | |
WO2024050817A1 (zh) | 甘草酸或其衍生物在核酸检测中的用途 | |
WO2024050820A1 (zh) | 抗氧化剂组合物及其在核酸检测中的用途 | |
JP2007300829A (ja) | Dnaマイクロアレイ等に供する検体の調製方法 | |
JP5218944B2 (ja) | 核酸を配列特異的に標識する方法、およびそれを利用した新規核酸検出法 | |
RU2794177C1 (ru) | Способ одноканального секвенирования на основе самолюминесценции | |
KR102013786B1 (ko) | cDNA 또는 앰플리콘 및 이를 담지한 담체를 포함하는 구조체 | |
WO2024050815A1 (zh) | 杂芳环化合物在核酸检测中的用途 | |
JP2002360246A (ja) | 核酸固定化物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |