CN118064504A - 一种靶向fgfr1的pd1重组病毒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向FGFR1的PD1重组病毒及其制备方法和应用。本发明借助该复方重组病毒(vFR1sPD1)发挥可溶性PD1(sPD1)的清除免疫抑制的作用，并巧妙借助FGFR1病毒重组子(vFR1)靶向作用使整个重组病毒更精确地靶向肿瘤细胞(和/或肿瘤新生血管)进而诱导更强力更持久的特异性免疫反应。加之FGFR1本身抗肿瘤血管生成作用的协同/叠加作用，极大增强它们对肿瘤细胞和/或肿瘤新生血管特异性靶向杀伤作用。因此，本发明所述靶向FGFR1的PD1重组病毒将具肿瘤靶向性、抗肿瘤血管生成(vFR1)和清除免疫抑制作用(sPD1)的多重功效。

Description

一种靶向FGFR1的PD1重组病毒及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向FGFR1的PD1重组病毒及其制备方法和应用。
背景技术
以树突状细胞(DC)疫苗为代表的肿瘤免疫治疗成为研究的热点。传统制备DC疫苗往往需要通过体外扩增DC细胞，再把患者的肿瘤细胞或人工制备的抗原和扩增的DC细胞进行体外共同培养，让这些DC细胞在体外对抗原进行适当处理修饰后再回输患者体内，然而这种DC疫苗体外制备方法存在操作复杂、成本高、规范难等不足。此外，传统DC疫苗免疫治疗还存在细胞数量少、功能障碍和单次致敏效能低等诸多瓶颈问题。因此，寻找一种更加简单高效的“体内”DC疫苗显得尤为重要。
而如何有效激活T细胞的抗肿瘤活性，进而提高其免疫应答率是目前肿瘤免疫治疗亟待解决的瓶颈问题。新近针对肿瘤免疫检查点的靶向治疗研究为解决该瓶颈问题带来新的希望。程序性细胞死亡蛋白1(Programmed Cell Death Protein 1，PD1)是一种负性共刺激分子，与其配体PDL1相结合对淋巴细胞的活化产生抑制作用，从而抑制肿瘤微环境中免疫细胞的活性。而免疫检查点PD1/PDL1单克隆抗体药物对多种肿瘤有效，通过阻断PD1/PDL1信号通路能够有效清除肿瘤微环境的免疫抑制作用，显著提高T细胞的抗肿瘤免疫活性并诱导出持久的免疫应答。但是现有手段的抗原递送效率低、靶向性差、免疫T细胞激活能力弱等因素会影响PD1解除免疫抑制作用。
FGFR1是肿瘤血管生成的标志性分子，其通过与其高亲和力配体bFGF结合而发挥生物学活性，促进肿瘤新生血管生成。研究表明，bFGF/FGFR1信号传递与肿瘤发生发展关系极为密切，以过量表达bFGF和FGFR1为特征的自分泌信号环路是肿瘤细胞恶性增生的重要条件。目前，国内外已有许多采用FGFR1蛋白或其单克隆抗体进行肿瘤靶向治疗的研究报道，然而，现有的肿瘤靶向肿瘤的手段肿瘤组织靶向性和穿透力不够，导致抗肿瘤免疫活性和持久性应答能力较差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向FGFR1的PD1重组病毒及其制备方法和应用，所述PD1重组病毒可以明显增强其对肿瘤组织靶向性和穿透力，极大地提高其抗肿瘤免疫活性和持久性应答能力，具有更好地抗肿瘤功效。
本发明提供了表达可溶性PD1和FGFR1的重组慢病毒载体，包括PD1蛋白的胞外域编码基因、FGFR1的编码基因和慢病毒载体，所述PD1蛋白的胞外域编码基因和FGFR1的编码基因插入到所述慢病毒载体的开放阅读框中。
优选的，所述PD1蛋白的胞外域编码基因和FGFR1的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
优选的，所述PD1蛋白的胞外域编码基因和FGFR1的编码基因的下游包括标记蛋白。
优选的，所述标记蛋白包括荧光蛋白。
优选的，所述慢病毒载体包括pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO。
本发明还提供了一种靶向FGFR1的PD1重组病毒，所述靶向FGFR1的PD1重组病毒的制备方法包括：对上述技术方案所述的重组慢病毒载体进行慢病毒包装，得到所述靶向FGFR1的PD1重组病毒。
本发明还提供了上述技术方案所述的重组慢病毒载体或上述技术方案所述的靶向FGFR1的PD1重组病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选的，所述抗肿瘤药物包括具有肿瘤靶向性、抗肿瘤血管生成、清除免疫抑制、抑制肿瘤增殖和促进肿瘤凋亡中一种或多种功效的抗肿瘤药物。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物的有效成分包括上述技术方案中所述的靶向FGFR1的PD1重组病毒。
有益效果：
本发明提供了表达可溶性PD1和FGFR1的重组慢病毒载体，包括PD1蛋白的胞外域编码基因、FGFR1的编码基因和慢病毒载体，所述PD1蛋白的胞外域编码基因和FGFR1的编码基因插入到所述慢病毒载体的开放阅读框中。在此基础上，本发明还提供了一种靶向FGFR1的PD1重组病毒，所述靶向FGFR1的PD1重组病毒的制备方法包括：对上述技术方案所述的重组慢病毒载体进行慢病毒包装，得到所述靶向FGFR1的PD1重组病毒(vFR1sPD1)。本发明将PD1蛋白的胞外域基因和FGFR1的编码基因插入慢病毒表达后分泌出可溶性PD1(sPD1)和FGFR1(vFR1)，通过sPD1与肿瘤细胞上的PDL1结合，以阻止与T细胞上PD1结合而避免T细胞耗竭，将可能大大提高其抗肿瘤免疫活性；并巧妙借助vFR1靶向作用使整个重组病毒更精确地靶向肿瘤细胞(和/或肿瘤新生血管)进而诱导更强力更持久的特异性免疫反应。加之FGFR1(vFR1)本身抗肿瘤血管生成作用的协同/叠加作用，极大增强它们对肿瘤细胞和/或肿瘤新生血管特异性靶向杀伤作用。因此，本发明所述靶向FGFR1的PD1重组病毒具有肿瘤靶向性、抗肿瘤血管生成(vFR1)和清除免疫抑制作用(sPD1)的多重功效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中LV-h-RGFR1-PDCD1慢病毒载体的图谱；
图2为测试例1中重组病毒感染小鼠Hepa1-6细胞中FGFR1、sPD1的mRNA水平检测结果；
图3为测试例1中重组病毒感染小鼠Hepa1-6细胞中FGFR1、sPD1的蛋白水平检测结果；
图4为测试例2中重组病毒vFR1sPD1感染肝细胞的增殖能力检测结果；
图5为测试例3中vFR1sPD1重组病毒肿瘤组织特异性和血管靶向性观察结果；
图6为应用例1中vFR1sPD1抑制肿瘤生长体积曲线图；
图7为应用例2中vFR1sPD1重组病毒抗肿瘤血管生成作用结果；
图8为应用例3中vFR1sPD1重组病毒抗肿瘤凋亡情况；
图9为应用例4中vFR1sPD1重组病毒抗肿瘤增殖情况；
图10为应用例5中vFR1sPD1重组病毒治疗后细胞毒性T细胞数量的改变。
具体实施方式
本发明提供了表达可溶性PD1和FGFR1的重组慢病毒载体(vFR1sPD1)，包括PD1蛋白的胞外域编码基因、FGFR1的编码基因和慢病毒载体，所述PD1蛋白的胞外域编码基因和FGFR1的编码基因插入到所述慢病毒载体的开放阅读框中。
本发明所述PD1蛋白的胞外域编码基因和FGFR1的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，具体为5'-ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGTGCACCTAGGCCGTCCCCGACCTTGCCTGAACAAGCCCAGCCCTGGGGAGCCCCTGTGGAAGTGGAGTCCTTCCTGGTCCACCCCGGTGACCTGCTGCAGCTTCGCTGTCGGCTGCGGGACGATGTGCAGAGCATCAACTGGCTGCGGGACGGGGTGCAGCTGGCGGAAAGCAACCGCACCCGCATCACAGGGGAGGAGGTGGAGGTGCAGGACTCCGTGCCCGCAGACTCCGGCCTCTATGCTTGCGTAACCAGCAGCCCCTCGGGCAGTGACACCACCTACTTCTCCGTCAATGTTTCAGATGCTCTCCCCTCCTCGGAGGATGATGATGATGATGATGACTCCTCTTCAGAGGAGAAAGAAACAGATAACACCAAACCAAACCGTATGCCCGTAGCTCCATATTGGACATCCCCAGAAAAGATGGAAAAGAAATTGCATGCAGTGCCGGCTGCCAAGACAGTGAAGTTCAAATGCCCTTCCAGTGGGACCCCAAACCCCACACTGCGCTGGTTGAAAAATGGCAAAGAATTCAAACCTGACCACAGAATTGGAGGCTACAAGGTCCGTTATGCCACCTGGAGCATCATAATGGACTCTGTGGTGCCCTCTGACAAGGGCAACTACACCTGCATTGTGGAGAATGAGTACGGCAGCATCAACCACACATACCAGCTGGATGTCGTGGAGCGGTCCCCTCACCGGCCCATCCTGCAAGCAGGGTTGCCCGCCAACAAAACAGTGGCCCTGGGTAGCAACGTGGAGTTCATGTGTAAGGTGTACAGTGACCCGCAGCCGCACATCCAGTGGCTAAAGCACATCGAGGTGAATGGGAGCAAGATTGGCCCAGACAACCTGCCTTATGTCCAGATCTTGAAGACTGCTGGAGTTAATACCACCGACAAAGAGATGGAGGTGCTTCACTTAAGAAATGTCTCCTTTGAGGACGCAGGGGAGTATACGTGCTTGGCGGGTAACTCTATCGGACTCTCCCATCACTCTGCATGGTTGACCGTTCTGGAAGCCCTGGAAGAGAGGCCGGCAGTGATGACCTCGCCCCTGTACCTGGAGGGTGGAGGTTCGGGTGGAGGTTCAGGTGGAGGTTCTGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTG-3'。
本发明所述PD1蛋白的胞外域编码基因和FGFR1的编码基因的下游优选包括标记蛋白，进一步优选包括荧光标记蛋白，更优选为ZsGreen(又名zoanGFP)。本发明所述慢病毒载体优选包括pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO，所述pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO各元件的顺序如图1所示。本发明所述PD1蛋白的胞外域编码基因和FGFR1的编码基因优选插入到pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO的Bam HⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间。本发明对所述重组慢病毒载体的构建过程没有特殊限定，采用本领域中常规构建方式即可。
本发明还提供了一种靶向FGFR1的PD1重组病毒，所述重组慢病毒的制备方法包括：对上述技术方案所述的重组慢病毒载体进行慢病毒包装，得到所述靶向FGFR1的PD1重组病毒。
本发明对所述慢病毒载体的包装过程没有特殊限定，采用本领域中常规慢病毒包装的步骤或委托第三方公司进行包装均可。
本发明构建FGFR1蛋白与表达清除免疫抑制作用的可溶性PD1(sPD1)的重组慢病毒载体(vFR1sPD1)，借助该重组病毒子发挥sPD1的清除免疫抑制的作用并巧妙借助vFR1靶向作用使整个重组病毒更精确地靶向肿瘤细胞(和/或肿瘤新生血管)进而诱导更强力更持久的特异性免疫反应；加之vFR1本身抗肿瘤血管生成作用的协同/叠加作用，极大增强它们对肿瘤细胞和/或肿瘤新生血管特异性靶向杀伤作用。因此，本发明所述PD1重组病毒将具肿瘤靶向性(vFR1)、抗肿瘤血管生成(vFR1)和清除免疫抑制作用(sPD1)的多重功效。
基于上述技术优势，本发明还提供了上述技术方案所述的重组慢病毒载体或上述技术方案所述的vFR1sPD1重组病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明所述抗肿瘤药物优选包括具有肿瘤靶向性、抗肿瘤血管生成、清除免疫抑制、抑制肿瘤增殖和促进肿瘤凋亡、提高细胞毒性T细胞数量中一种或多种功效的抗肿瘤药物，更优选为具有肿瘤靶向性、抗肿瘤血管生成、清除免疫抑制、抑制肿瘤增殖和促进肿瘤凋亡功效的抗肿瘤药物。本发明所述抗肿瘤药物的类型优选包括DC疫苗。本发明所述肿瘤优选包括但不限于肝癌。本发明以FGFR1为抗肿瘤血管生成的有效靶点的原因在于：(1)特异性和天然靶向性：FGFR1在肿瘤新生血管的内皮细胞高效表达，而在正常的细胞及血管内皮细胞表面并无表达；(2)重要性：FGFR1对于肿瘤的恶性表型具有关键性作用，与恶性肿瘤的生长、侵袭以及转移高度相关；(3)可检测性：肿瘤组织标本可以用简便的免疫组织学方法进行检测；(4)遗传稳定性：血管内皮细胞遗传稳定，突变率低，故针对肿瘤血管内皮细胞的治疗策略不会或只会引起微乎其微的抗药性。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物的有效成分包括上述技术方案所述的靶向FGFR1的PD1重组病毒(vFR1sPD1)。本发明对所述抗肿瘤药物中的靶向FGFR1的PD1重组病毒的剂量没有特殊限定，依据需要进行调整即可。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
表达可溶性PD1和FGFR1的重组慢病毒载体，步骤如下：
1)扩增PD1蛋白的胞外域编码基因(PDCD1)和FGFR1的编码基因：
引物设计：
LV-h-FGFR1-PDCD1-E/B-F：5'-CTAGAGGATCTATTTCCGGTGAATTCGCCACCATGTACAGGATGCAACT-3'(SEQ ID NO.2)；
LV-h-FGFR1-PDCD1-E/B-R：5'-ACTTAAGCTTGGTACCGAGGATCCCACCAGGGTTTGGAACTGGCCGGCT-3'(SEQ ID NO.3)。
以合成带有目的基因的片段的质粒的DNA为模板，通过PCR扩增出PD1蛋白的胞外域编码基因(PDCD1)和FGFR1的编码基因的核苷酸片段，如SEQ ID NO.1所示，退火温度为55-72℃。
2)HB infusionTM一步克隆连接体系将PD1蛋白的胞外域编码基因与线性化的pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO载体(来源于汉恒生物)进行连接，酶切位点为Bam HⅠ和EcoRⅠ酶，连接后的重组质粒(LV-h-RGFR1-PDCD1)的图谱如图1所示。
3)将步骤2)得到的连接载体进行大肠杆菌转化并筛选阳性克隆，并将筛选出来的阳性克隆记性测序，测序得到的核苷酸序列为
加粗部分为与目的序列匹配部分。
4)以质粒抽提试剂盒对测序成功的阳性克隆质粒进行质粒抽提，得到表达可溶性PD1和FGFR1的慢病毒载体质粒，且质检验证合格之后进行后续的细胞转染，质粒质检合格的标准为浓度大于200ng/μL，OD260-280在1.8-2.0之间。
上述表达可溶性PD1和FGFR1的重组慢病毒载体的构建过程委托汉恒生物进行。
实施例2
构建靶向FGFR1的PD1重组病毒vFR1sPD1：
1)将实施例1中制备得到的表达可溶性PD1和FGFR1的重组慢病毒载体vFR1sPD1质粒进行慢病毒包装，得到vFR1sPD1慢病毒颗粒：
此慢病毒包装过程委托汉恒生物进行，具体如下：采用的是三质粒慢病毒系统进行病毒包装过程，三质粒慢病毒系统包括以下质粒：实施例1中制备得到的表达可溶性PD1和FGFR1的重组慢病毒载体质粒、psPAX2载体和pMD2G载体。
三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提后，采用汉恒的LipofiterTM转染试剂将三质粒共转染293T细胞。转染后72h收集病毒上清液，而后进行病毒纯化，得到重组慢病毒，即靶向FGFR1的PD1重组病毒vFR1sPD1，记为vFGFR1-sPD1。
将得到的重组慢病毒进行无菌检测、支原体检测及病毒滴度检测，结果发现培养基澄清透明，细胞间隙无明显颗粒，且无任何细菌、真菌及支原体污染；vFR1sPD1的滴度为2.0×108TU/mL。
2)参照步骤1)中的步骤，将未转入目的基因的pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO载体进行慢病毒包装，得到仅表达有标记基因ZsGreen的重组慢病毒颗粒，记为vZsgreen；
将得到的仅表达有标记基因ZsGreen的重组慢病毒颗粒进行无菌检测、支原体检测及病毒滴度检测，结果发现培养基澄清透明，细胞间隙无明显颗粒，且无任何细菌、真菌及支原体污染；vZsgreen的滴度为3.0×108TU/mL。
3)参照步骤1)中的步骤，将仅转入FGFR1基因的重组慢病毒载体(将FGFR1基因转入慢病毒质粒的方法同实施例1)进行慢病毒包装，得到仅表达FGFR1的重组慢病毒颗粒，记为vFGFR1；转入的FGFR1基因的核苷酸序列为5'-ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGTGCACCTAGGCCGTCCCCGACCTTGCCTGAACAAGCCCAGCCCTGGGGAGCCCCTGTGGAAGTGGAGTCCTTCCTGGTCCACCCCGGTGACCTGCTGCAGCTTCGCTGTCGGCTGCGGGACGATGTGCAGAGCATCAACTGGCTGCGGGACGGGGTGCAGCTGGCGGAAAGCAACCGCACCCGCATCACAGGGGAGGAGGTGGAGGTGCAGGACTCCGTGCCCGCAGACTCCGGCCTCTATGCTTGCGTAACCAGCAGCCCCTCGGGCAGTGACACCACCTACTTCTCCGTCAATGTTTCAGATGCTCTCCCCTCCTCGGAGGATGATGATGATGATGATGACTCCTCTTCAGAGGAGAAAGAAACAGATAACACCAAACCAAACCGTATGCCCGTAGCTCCATATTGGACATCCCCAGAAAAGATGGAAAAGAAATTGCATGCAGTGCCGGCTGCCAAGACAGTGAAGTTCAAATGCCCTTCCAGTGGGACCCCAAACCCCACACTGCGCTGGTTGAAAAATGGCAAAGAATTCAAACCTGACCACAGAATTGGAGGCTACAAGGTCCGTTATGCCACCTGGAGCATCATAATGGACTCTGTGGTGCCCTCTGACAAGGGCAACTACACCTGCATTGTGGAGAATGAGTACGGCAGCATCAACCACACATACCAGCTGGATGTCGTGGAGCGGTCCCCTCACCGGCCCATCCTGCAAGCAGGGTTGCCCGCCAACAAAACAGTGGCCCTGGGTAGCAACGTGGAGTTCATGTGTAAGGTGTACAGTGACCCGCAGCCGCACATCCAGTGGCTAAAGCACATCGAGGTGAATGGGAGCAAGATTGGCCCAGACAACCTGCCTTATGTCCAGATCTTGAAGACTGCTGGAGTTAATACCACCGACAAAGAGATGGAGGTGCTTCACTTAAGAAATGTCTCCTTTGAGGACGCAGGGGAGTATACGTGCTTGGCGGGTAACTCTATCGGACTCTCCCATCACTCTGCATGGTTGACCGTTCTGGAAGCCCTGGAAGAGAGGCCGGCAGTGATGACCTCGCCCCTGTACCTGGAG-3'(SEQ ID NO.5)。
将得到的vFGFR1进行无菌检测、支原体检测及病毒滴度检测，结果发现培养基澄清透明，细胞间隙无明显颗粒，且无任何细菌、真菌及支原体污染；vFGFR1的滴度为1.5×108TU/mL。
4)参照步骤1)中的步骤，将仅转入sPD1基因的重组慢病毒载体(将sPD1基因转入慢病毒质粒的方法同实施例1)进行慢病毒包装，得到仅表达sPD1的重组慢病毒颗粒，记为sPD1；转入的sPD1基因的核苷酸序列为5'-ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTG-3'(SEQ ID NO.6)；
将得到的sPD1进行无菌检测、支原体检测及病毒滴度检测，结果发现培养基澄清透明，细胞间隙无明显颗粒，且无任何细菌、真菌及支原体污染；sPD1的滴度为1.5×108TU/mL。
测试例1重组病毒感染Hepa1-6细胞中FGFR1、sPD1的mRNA和蛋白水平检测
将实施例2中包装得到的vFGFR1-sPD1、vZsgreen、sFGFR1和sPD1重组病毒分别转染至小鼠肝癌细胞Hepa1-6，并测定重组病毒对小鼠肝癌细胞Hepa1-6的转染效率。
转染方法和试剂具体如下：
1)细胞：Hepa1-6细胞由凯基生物技术股份有限公司提供(KG256)，完全培养基为DMEM+10％FBS+1％P/S，于37℃5％CO2培养箱中培养。
2)主要试剂与耗材：
细胞培养瓶(美国FALCON 353014)；
PBS(中国江苏凯基生物技术股份有限公司KGB500)；
6 well cell culture plate(美国Corning Incorporated 3516)。
3)主要仪器与设备：
二级生物安全柜(美国Thermo 1300)；
CO2培养箱(日本SANYO XD-101)；
生物倒置显微镜(日本OLYMPUS IX51)；
台式低速离心机(中国上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂80-2)；
2.5μL、10μL、200μL、1000μL移液器(德国eppendorf)。
4)方法：
病毒转染细胞
1细胞消化、计数、配制成浓度为5×105个/mL的细胞悬液，6孔板细胞板中每孔加入1mL细胞悬液；
2每孔加入200μL ENI.S培养基，待第二天细胞贴壁后开始转染；
3用ENI.S培养基将病毒原液稀释至终浓度为1×108TU/mL，每孔加入10μL病毒工作液；
4每孔加入Polybrene(增强转染试剂，聚凝胺)10mg/mL至终浓度为5μg/mL，混匀；
5置于培养箱中孵育24h后，更换新鲜培养基继续培养72h后用于后期检测。
为了测试重组病毒对小鼠肝癌细胞Hepa1-6的转染效率，使用定量PCR检测靶细胞中FGFR1和sPD1的表达水平，其中用于检测FGFR1的引物序列如下：上游引物：5'-ACCAAACCAAACCGTATGCC-3'(SEQ ID NO.7)，下游引物：5'-TAACGGACCTTGTAGCCTCC-3'(SEQID NO.8)；用于检测sPD1的引物序列如下：上游引物：5'-AGCTTCTCCAACACATCGGA-3'(SEQID NO.9)，下游引物：5'-GTTGGGCAGTTGTGTGACA-3'(SEQ ID NO.10)。
结果显示，和对照组相比，重组病毒vFR1-sPD1感染的Hepa1-6中FGFR1和sPD1的mRNA水平显著上调(图2)。接着，采用ELISA检测上述细胞分泌到上清液中的FGFR1、sPD1的蛋白含量，结果显示，被vFR1sPD1病毒感染的细胞上清中，FGFR1和sPD1均能被检测到(图3)。其中图2和图3中的Mock组为PBS对照组。
由图2和图3可以得出：vFR1sPD1重组病毒构建成功，目的基因过表达效果良好。
测试例2重组病毒vFR1sPD1感染Hepa1-6肝细胞的增殖能力检测
采用CCK8检测上述细胞的活力变化，结果显示和对照组细胞相比，vFR1sPD1病毒感染的细胞的增殖能力显著减弱(图4)。
测试例3
vFR1sPD1重组病毒肿瘤组织特异性和靶向性检测
用抗FGFR1抗体，通过免疫荧光染色法检测肿瘤组织中FGFR1，该vFR1sPD1重组病毒包含FGFR1基因，理论上FGFR1是肿瘤微血管上的特异性受体，可以识别肿瘤微血管(荧光信号沉积)就说明vFR1sPD1重组病毒构建成功，结果如图5所示。
由图5中的抗FGFR1抗体免疫荧光染色发现，vFR1sPD1组可以特异性识别肿瘤组织中的微血管(红色荧光信号沉积)(图5中A)，其他非微血管组织成份没有明显荧光信号(图5中B)，说明所制备的vFR1sPD1重组病毒具有较高的肿瘤组织特异性和血管靶向性。
应用例1
vFR1sPD1重组病毒抗肿瘤作用观察
建立小鼠肝癌Hepa1-6原位瘤模型进行抗肿瘤作用观察：
肝癌Hepa1-6原位瘤小鼠模型的构建方法如下：
肝癌Hepa1-6原位瘤小鼠模型构建方法：在4W龄雄性的C57BL/6小鼠尾静脉注射2×107个Hepa1-6肝癌细胞，每只50μL接种于小鼠肝脏原位。细胞接种14天后，将动物随机分组，每组5只；同时，各组小鼠开始给药，1×1011vg/只，共一次，持续观察5周。五组分别记为Mock(注射等量的PBS)、vZsgreen、vFR1sPD1、sPD1、vFR1。
结果发现单独vFR1、sPD1和vFR1sPD1治疗组均具有一定的抗肿瘤作用，但是vFR1sPD1组可以有效治疗肿瘤，明显抑制肿瘤生长(图6)，延长荷瘤小鼠的生存时间。
应用例2
vFR1sPD1重组病毒抗肿瘤血管生成作用观察
采用应用例1中方法构建肝癌Hepa1-6原位瘤小鼠模型，并进行相同的分组和处理，分别记为Mock、vZsgreen、vFR1sPD1、sPD1、vFR1组，对五组小鼠进行抗体CD31免疫组化检测，结果如图6所示。
结果表明：Hepa1-6模型中vFR1sPD1组肿瘤组织微血管密度明显少于其他对照组(P＜0.001)，vFR1、sPD1组也显示出一定的抑制肿瘤血管生成作用(图7)。
应用例3
vFR1sPD1重组病毒抗肿瘤细胞凋亡作用观察
以应用例1中方法构建的肝癌Hepa1-6原位瘤小鼠模型，并进行相同的处理，得到各处理后的小鼠进行抗肿瘤细胞凋亡作用观察。
TUNE方法检测各组小鼠肿瘤组织中的肿瘤细胞凋亡情况，并计算其凋亡指数，比较各组小鼠肿瘤组织细胞凋亡的差异。
结果发现：肝癌Hepa1-6模型中vFR1sPD1组的凋亡指数明显高于其他对照组(P＜0.0001)，vFR1、sPD1组也显示出一定的促肿瘤凋亡作用(图8)。
应用例4
vFR1sPD1重组病毒抗肿瘤细胞增殖作用观察
以应用例1中方法构建的肝癌Hepa1-6原位瘤小鼠模型，并进行相同的处理，得到各处理后的小鼠进行抗肿瘤细胞增殖作用观察。
PCNA抗体免疫组化方法检测各组小鼠肿瘤组织中的肿瘤细胞增殖情况，并计算其增殖指数，比较各组小鼠肿瘤组织细胞增殖的差异。
结果发现：肝癌Hepa1-6模型中vFR1sPD1组的增殖指数明显低于其他对照组(P＜0.0001)，vFR1、sPD1组也显示出一定的抑制肿瘤细胞增殖作用(图9)。
应用例5
vFR1sPD1重组病毒治疗后细胞毒性T细胞数量的改变
采用应用例1中的方法构建的肝癌Hepa1-6原位瘤小鼠模型，慢病毒处理7天后，取肿瘤组织流式检测。结果显示vFR1sPD1治疗组的细胞毒性T细胞(CD8+ T细胞)数量较对照组明显增多(P＜0.001)，vFR1、sPD1组CD8+ T细胞数量均有不同程度增加(P＜0.01)(图10)。
由以上实施例和应用例可以得出：本发明发现重组病毒vFR1sPD1体外能够转染表达分泌sPD1、FGFR1并具有生物活性；发现vFR1sPD1重组病毒具有较高的肿瘤组织特异性和血管靶向性，能够有效抑制肿瘤细胞生长；vFR1sPD1治疗组微血管密度明显减少、肿瘤凋亡指数增加、增殖指数减少，而且细胞毒性T细胞数量明显增多。
上述结果初步说明重组病毒子vFR1sPD1抗肿瘤作用机制与FGFR1靶向抗肿瘤血管生成和sPD1清除免疫抑制作用协同有关。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.表达可溶性PD1和FGFR1的重组慢病毒载体，其特征在于，包括PD1蛋白的胞外域编码基因、FGFR1的编码基因和慢病毒载体，所述PD1蛋白的胞外域编码基因和FGFR1的编码基因插入到所述慢病毒载体的开放阅读框中。
2.根据权利要求1所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述PD1蛋白的胞外域编码基因和FGFR1的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述重组慢病毒载体，其特征在于，所述PD1蛋白的胞外域编码基因和FGFR1的编码基因的下游包括标记蛋白。
4.根据权利要求3所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述标记蛋白包括荧光蛋白。
5.根据权利要求1～4任一项所述重组慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体包括pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO。
6.一种靶向FGFR1的PD1重组病毒，其特征在于，所述靶向FGFR1的PD1重组病毒的制备方法包括：对权利要求1～5任一项所述的重组慢病毒载体进行慢病毒包装，得到所述靶向FGFR1的PD1重组病毒。
7.权利要求1～5任一项所述的重组慢病毒载体或权利要求6所述的靶向FGFR1的PD1重组病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物包括具有肿瘤靶向性、抗肿瘤血管生成、清除免疫抑制、抑制肿瘤增殖和促进肿瘤凋亡中一种或多种功效的抗肿瘤药物。
9.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物的有效成分包括权利要求6中所述靶向FGFR1的PD1重组病毒。
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