CN118064461A - 一种新型5-氨基戊酸环化酶基因、由此制备而来的基因工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型5‑氨基戊酸环化酶基因(5‑aminovaleric acid cyclase gene，avaC)、基因工程菌及其应用，所述新型5‑氨基戊酸环化酶基因包括以下四种基因中的任意一种：5‑氨基戊酸环化酶1基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；5‑氨基戊酸环化酶2基因，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；5‑氨基戊酸环化酶3基因，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；5‑氨基戊酸环化酶4基因，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。本发明在肠道菌群中发现可以将5‑氨基戊酸转化为2‑哌啶酮的四种新型5‑氨基戊酸环化酶基因，为工业上生物合成2‑哌啶酮提供了新思路。

Description

一种新型5-氨基戊酸环化酶基因、由此制备而来的基因工程 菌及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地涉及一种新型5-氨基戊酸环化酶基因、由此制备而来的基因工程菌及其应用。

背景技术

2-哌啶酮(2-piperidone)是合成各种化学产品的基本骨架，包括高价值的尼龙-5和尼龙-6,5。2-哌啶酮通常由5-氨基戊酸(5-aminovaleric acid,5AVA)作为生物合成途径的前体物质制备而成。目前主要用于生产2-哌啶酮的酶包括ORF26、Act和CaiC，它们均来自细菌。ORF26是由链霉菌(Streptomyces aizunensis)编码的一种酶，它可以通过ATP介导5AVA转化形成2-哌啶酮。Act属于丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的β-丙氨酸CoA转移酶家族(β-alanine CoAtransferase family)，它可以利用酰基辅酶A(Acyl-CoA)作为辅酶催化诱导5AVA环化为2-哌啶酮。CaiC是一种巴豆甜菜碱CoA连接酶(crotonobetaine CoAligase)，由大肠杆菌(E.coli)编码，能够催化5AVA环化为2-哌啶酮。从5AVA到2-哌啶酮这一步的环化步骤是2-哌啶酮生物合成的限速步骤。阐明肠道菌群产生2-哌啶酮的代谢途径或许能为工业上生物合成2-哌啶酮提供新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型5-氨基戊酸环化酶基因、由此制备而来的基因工程菌及其应用，从而解决现有技术亟待开发一种工业上生物合成2-哌啶酮的新方法的问题。

为了解决上述问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种新型5-氨基戊酸环化酶基因，所述新型5-氨基戊酸环化酶基因包括以下四种基因中的任意一种：来自Collinsella aerofaciens_USA_TW14.1_LFYP39的5-氨基戊酸环化酶1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；来自Collinsella intestinalis_USA_TW14.1_LFYP54的5-氨基戊酸环化酶2基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；来自Clostridium bolteae_USA_TW14.1_LFYP116的5-氨基戊酸环化酶3基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；来自Clostridium hathewayi_USA_TW14.1_LFYP18的5-氨基戊酸环化酶4基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

根据本发明的第二方面，提供一种如所述新型5-氨基戊酸环化酶基因编码的新型5-氨基戊酸环化酶，所述新型5-氨基戊酸环化酶包括以下四种酶中的任意一种：由5-氨基戊酸环化酶1基因编码的5-氨基戊酸环化酶1，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；由5-氨基戊酸环化酶2基因编码的5-氨基戊酸环化酶2，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示；由5-氨基戊酸环化酶3基因编码的5-氨基戊酸环化酶3，其氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；由5-氨基戊酸环化酶4基因编码的5-氨基戊酸环化酶4，其氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。

根据本发明的第三方面，提供一种包含任意一种新型5-氨基戊酸环化酶基因的重组载体质粒。

根据本发明的一个优选方案，所述重组载体质粒采用如下方法构建所得：将PCR扩增得到的4种新型5-氨基戊酸环化酶基因中的任意一种与PCR扩增得到的pZE12线性化载体一步克隆连接，即可得到重组载体质粒。

根据本发明的第四方面，提供一种包含任意一种新型5-氨基戊酸环化酶基因的基因工程菌。

根据本发明的一个优选方案，所述基因工程菌采用如下方法构建所得：将所述重组载体质粒分别化学转化进携带有pLacSens质粒的E.coli DH10B化学感受态细胞中，用同时含有100μg/mL氨苄青霉素和100μg/mL卡那霉素的LB培养基进行筛选，分别得到4种携带有双质粒的重组E.coli DH10B菌株。

根据本发明的第五方面，提供一种新型5-氨基戊酸环化酶在催化5-氨基戊酸制备2-哌啶酮中的应用。

根据本发明的一个优选方案，将包含任意一种新型5-氨基戊酸环化酶基因的基因工程菌接种到添加有5-氨基戊酸的LB培养基中培养，实现2-哌啶酮的合成。

根据本发明，为了确定2-哌啶酮的代谢途径，发明人选择了从婴儿肠道内分离出的51株肠道菌，将它们分别在含有或不含5AVA的条件下进行体外培养，并通过LC-MS/MS检测它们的培养物上清液有无2-哌啶酮，最终共鉴定出4株能够将5AVA转化为2-哌啶酮的肠道菌，这4株肠道菌的编号分别为：Collinsella aerofaciens_USA_TW14.1_LFYP39、Collinsella intestinalis_USA_TW14.1_LFYP54、Clostridium bolteae_USA_TW14.1_LFYP116、以及Clostridium hathewayi_USA_TW14.1_LFYP18。随后，发明人通过基因组DNA文库筛选和生物信息学分析的手段，从上述4个菌株中鉴定出能够将5AVA转化为2-哌啶酮的4种5-氨基戊酸环化酶基因。最后，发明人还分别将所述5-氨基戊酸环化酶基因经过重组构建得到相应的重组载体质粒、基因工程菌，并通过实验验证其可成功用于2-哌啶酮的生物合成。

综上所述，根据本发明提供的一种新型5-氨基戊酸环化酶基因、由此制备而来的基因工程菌及其应用，通过在肠道菌群中鉴定得到4种新型5-氨基戊酸环化酶基因，为工业上生物合成2-哌啶酮提供了新思路。

附图说明

图1示出了从51株肠道菌中筛选到的4株能够将5AVA转化为2-哌啶酮的肠道菌的转化结果；(a)PBS对照组和四株肠道菌(不添加或添加有1mM 5AVA)孵育液的上清液中2-哌啶酮的浓度；(b)PBS对照组和四株肠道菌(不添加或添加有1mM 5AVA)孵育液的上清液中5-氨基戊酸的浓度；

图2示出了将5AVA转化为2-哌啶酮的C.intestinalis LFYP54中基因组序列的鉴定；(a)说明双质粒生物传感器筛选系统原理的示意图；(b)E.coli单菌落的[GFP(AU)/OD₆₀₀]值的倍数变化；倍数变化值显著高于平均值的单克隆用箭头标注(ZQD4和ZQD5)；(c)阴性对照菌株(携带双质粒系统的E.coli中的产物质粒为pZE12空载体)，阳性对照菌株(携带双质粒系统的E.coli中的产物质粒异源表达orf26)，ZQD4和ZQD5的[GFP(AU)/OD₆₀₀]值的倍数变化；(d)当菌株在不添加或添加有5mM5AVA的情况下培养时，上清液中每OD₆₀₀细菌产生2-哌啶酮的浓度，误差线代表三个生物重复的平均值的标准误差；

图3示出了在C.intestinalisLFYP54中鉴定到的5-氨基戊酸环化酶基因将5AVA转化为2-哌啶酮；(a)示意图显示插入菌株ZQD4产物质粒中的2931bp DNA序列，CILFYP54_00697被注释为编码假定蛋白的基因，ypdA编码传感器组氨酸激酶(sensor histidinekinase,YpdA)；(b)异源表达不同DNA序列的携带双质粒系统的E.coli菌株的[GFP(AU)/OD₆₀₀]倍数变化；(c)当菌株在不添加或添加5mM 5AVA的情况下培养时，上清液中每OD₆₀₀E.coli产生的2-哌啶酮浓度；误差线代表三个生物重复的平均值的标准误差；

图4示出了其他肠道细菌中5-氨基戊酸环化酶的同源基因；(a)含有来自其他肠道细菌的5-氨基戊酸环化酶基因的同源基因簇，yhdG编码假定的氨基酸通透酶，CILFYP54_00697是本研究中鉴定到的5-氨基戊酸环化酶基因，相似性得分通过核苷酸基本局部比对搜索工具(BLAST)计算，(b)表达同源基因的双质粒生物传感器系统的E.coli的[GFP(AU)/OD₆₀₀]倍数变化，(c)表达同源基因的E.coli菌株上清液中每OD₆₀₀细胞在不添加或添加5mM5AVA的条件下孵育后产生的2-哌啶酮浓度；

图5示出了pZE12载体的质粒图谱信息；

图6示出了pLacSens载体的质粒图谱信息。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。如非特殊说明，实施例中所用的技术手段为本领域常规操作，或按照试剂盒及仪器设备厂商所建议的实验方法。实施例中使用的试剂和材料如无特殊说明均可从商业途径获得。

菌株的培养条件

将先前源自健康婴儿的51种肠道细菌菌株冻存在2mL玻璃冻存管中，其中含有细胞冻存液(30％甘油、7％10*PBS、0.5g/L半胱氨酸-HCl)，储存在-80℃直至使用。51株菌在LYHBHI培养基(37g/L BHI、5g/L酵母提取物、1g/L纤维二糖、1g/L麦芽糖、0.5g/L L-半胱氨酸-HCl、5mg/L氯化血红素)或补充有0.1％(w/v)可溶性淀粉和0.5％(w/v)纯化的猪胃粘蛋白的LYHBHI培养基中培养，培养于37℃厌氧箱(Coy Laboratory Products)中。厌氧箱中使用的气体成分为75％氮气、20％二氧化碳和5％氢气，厌氧箱中氢气浓度维持在～2％。

本实施例部分中使用的所有大肠杆菌均为E.coliDH10B，均在LB(Luria-Bertani)肉汤或琼脂中于37℃下有氧培养，并根据需要补充卡那霉素(100mg/L)、氨苄青霉素(100mg/L)或两者均补充。

应当知晓的是，本发明过程中使用的肠道菌的全基因组信息均可以在文献“Identifying determinants of bacterial fitness in a modelof human gutmicrobial succession”中找到。

实施例1可利用5AVA产生2-哌啶酮的四株肠道菌的筛选和鉴定

根据2-哌啶酮的分子结构和前人的研究报道，研究推测5-氨基戊酸(5AVA)是2-哌啶酮的前体。为了确定在实验室保存的从人类婴儿肠道中分离到的菌株中，哪些菌株可以代谢5AVA产生2-哌啶酮，发明人选择了隶属于五个主要肠道菌门中的共51株肠道菌，将它们分别在含有或没有5AVA的条件下体外培养，并通过LC-MS/MS检测上清液中有无2-哌啶酮。

结果发现其中有这样四株菌在与5AVA一起孵育时可以产生2-哌啶酮(图1中的(a)、(b)所示)。这四株菌包括Collinsella aerofaciens_USA_TW14.1_LFYP39，Collinsella intestinalis_USA_TW14.1_LFYP54，Clostridium bolteae_USA_TW14.1_LFYP116，Clostridium hathewayi_USA_TW14.1_LFYP18(参见文献“Identifyingdeterminants of bacterial fitness in a modelof human gut microbialsuccession”的补充材料，为了方便描述，下文中将这些菌株名分别简写为C.aerofaciensLFYP39、C.intestinalis LFYP54、C.bolteae LFYP116、C.hathewayi LFYP18)。结果显示，与5AVA共孵育后，C.intestinalis LFYP54、C.bolteae LFYP116、C.aerofaciens LFYP39、以及C.hathewayi LFYP18分别产生21.30±6.02μM(n＝3,mean±SD),15.99±2.79μM(n＝3,mean±SD),10.71±4.10μM(n＝3,mean±SD),and 21.09±5.00μM(n＝3,mean±SD)2-哌啶酮(图1中的(a)所示)。

实施例2来自C.intestinalis LFYP54的5-氨基戊酸环化酶基因将5AVA环化为2-哌啶酮

实施例1阐述了本研究发现有4株肠道菌可以将5AVA环化为2-哌啶酮，这在之前从未有过相关报道，接下来的目的是鉴定负责催化该反应的酶基因。如背景技术部分所述，目前已报道的ORF26、Act和CaiC可以环化5AVA形成2-哌啶酮，然而发明人将orf26、act和caiC核酸序列分别与筛选到的四株肠道菌的全基因组DNA测序数据进行比对后，并没有发现同源序列，由此表明这四种新鉴定到的肠道菌株使用一种(或几种)全新的催化酶。

接下来，由于4株菌转化5AVA为2-哌啶酮的效率相似，本研究随机选择了其中的C.intestinalis LFYP54作为目的基因筛选对象。将C.intestinalis LFYP54的基因组DNA片段随机插入产物质粒中。

首先，用苯酚-氯仿法从在LYHBHI中生长至早期稳定期的C.intestinalis LFYP54中提取基因组DNA。将粗提的DNA用RNase A(Takara)处理以去除DNA溶液中的RNA杂质，并使用PCR纯化试剂盒(QIAquick)进行纯化，最后用Nanodrop测量记录纯化后DNA浓度。取10μg纯化后的基因组DNA用超声仪(Diagenode)进行剪切。将超声处理后的DNA样品进行凝胶电泳后，使用QIAquick凝胶提取试剂盒从0.7％琼脂糖凝胶中提取2-8kb的DNA片段。将凝胶回收的片段通过平末端连接酶(Epicentre FastLinkTM试剂盒)克隆到PCR线性化的pZE12载体中，然后使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从0.7％琼脂糖凝胶中提取4-10kb范围内的连接产物。将回收的连接产物电转进携带有pLacSens的E.coli中，铺板在含有100mg/L卡那霉素和100mg/L氨苄青霉素的LB平板上。应当知晓的是，pZE12载体和pLacSens载体均为实验室构建获得，其中，pZE12载体的质粒图谱如图5所示，其序列如SEQ ID No.9所示；pLacSens载体的质粒图谱如图6所示，其序列如SEQ ID No.10所示。

筛选了1811个生长在含有抗生素平板上的单克隆，将单克隆挑取在384孔板上过夜培养，然后将培养物以1:100(v/v)的比例转接到含有LB培养基(含或不含5AVA)的96孔板中。此外，96孔板中的LB培养基还补充有500μM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)、100mg/L卡那霉素和100mg/L氨苄青霉素。随后，在37℃下孵育24小时。使用Synergy LX MultimodeReader测量每孔培养物的GFP信号和OD₆₀₀值。计算每个单克隆在添加和不添加有5AVA的培养基中培养后的GFP倍数变化。在这1811个单克隆中，发现ZQD4和ZQD5这两个单克隆的GFP值显著更高(约3倍的倍数变化)(如图2中的(b))。将ZQD4和ZQD5重新培养起来，重复实验证实了筛选结果(如图2中的(c))。随后的LC-MS/MS分析证实ZQD4和ZQD5的确可以产生2-哌啶酮，出人意料的是，只有ZQD4在和5AVA共培养后产生2-哌啶酮(图2中的(d))。值得一提的是，ZQD4与5mM 5AVA共孵育后，产生的2-哌啶酮量为1.01±0.15mM(n＝3,mean±SD)，是同批实验中阳性对照菌株的50倍，表明ZQD4携带的基因与之前报道的基因orf26相比，转化5AVA为2-哌啶酮的能力强得多。

本研究对ZQD4产物质粒中插入的DNA序列进行测序分析，并与C.intestinalisLFYP54的全基因组序列进行比对。结果显示，ZQD4中插入的2931bp DNA片段主要包括CILFYP54_00697基因和一段不完整的ypdA基因序列(图3中的(a))。其中CILFYP54_00697被注释为酰胺水解酶家族的假定酶基因，ypdA编码传感器组氨酸激酶(YpdA)，应当知晓的是，该ypdA基因相关信息也可从文献“Identifying determinants of bacterial fitness ina modelof human gut microbial succession”中找到。

为了进一步确定是哪个基因可以将5AVA转化为2-哌啶酮，发明人将它们各自克隆到产物质粒中，在携带双质粒传感系统的E.coli中进行表达。表达CILFYP54_00697的E.coli在含有5AVA的培养基中生长后的GFP信号是在不含有5AVA的培养基中生长时的约3倍，类似于表达2931bp序列或同时表达CILFYP54_00697和ypdA的E.coli，表达完整ypdA基因的E.coli的GFP变化相对较小(图3中的(b))。LC-MS/MS分析显示，当在培养基中添加5mM5AVA后，表达CILFYP54_00697的E.coli产生了2.17±0.36mM(n＝3,mean±SD)的2-哌啶酮，而单独表达ypdA的E.coli几乎不产生2-哌啶酮(图3中的(c))。因此，本研究最终确定基因CILFYP54_00697的产物能够催化5AVA脱水环化生成2-哌啶酮，并将基因CILFYP54_00697命名为5-氨基戊酸环化酶基因(5-aminovaleric acid cyclase,avaC)。

实施例3肠道菌中将5AVA转化为2-哌啶酮的其他5-氨基戊酸环化酶基因

实施例2已经在C.intestinalis LFYP54中鉴定出可以将5AVA转化为2-哌啶酮的5-氨基戊酸环化酶基因。接下来的目标是找出C.aerofaciens LFYP39、C.Bolteae LFYP116和C.hathewayi LFYP18中与5-氨基戊酸环化酶基因功能相同的基因。发明人将来自C.intestinalis LFYP54的5-氨基戊酸环化酶基因的核苷酸序列与其他三个菌株的全基因组序列进行了比对。C.aerofaciens LFYP39和LFYP54亲缘关系很近，它包含一个与已鉴定到的5-氨基戊酸环化酶基因具有高度相似序列的基因(CALFYP39_00071)。C.hathewayiLFYP18和C.bolteae LFYP116与C.intestinalis LFYP54的亲缘关系相对较远，它们所携带的5-氨基戊酸环化酶同源基因(分别为CHLFYP18_04700和CBLFYP116_02895)表现出稍大的差异性(图4中的(a))。蛋白序列比对结果显示，3个同源基因的蛋白序列与5-氨基戊酸环化酶基因编码的蛋白序列都高度相似。

实施例4四种5-氨基戊酸环化酶基因的功能验证

为了测试这些5-氨基戊酸环化酶同源基因的功能，本实施例进一步将已鉴定到的5-氨基戊酸环化酶基因及其3种同源基因克隆到产物质粒中，因为ypdA在E.coli中异源表达时几乎不转化5AVA形成2-哌啶酮，所以接下的实验将异源表达的ypdA基因作为阴性对照。

使用Plasmid DNA Mini Kit I(Omega)试剂盒分离质粒。使用SnapGene软件设计引物，引物在生工生物科技公司订购。PCR反应使用高保真DNA聚合酶(AB clonal)进行。使用一步克隆试剂盒(Novo Protein)连接不同片段构建质粒，并化学转化至E.coliDH10B。

产物质粒(production plasmid)的构建。通过将PCR线性化的目标DNA序列分别连接到PCR线性化的pZE12载体中来构建其他的产物质粒。从菌株基因组DNA中克隆目标DNA序列，包括来自C.intestinalis LFYP54的“CILFYP54_00697”；来自C.aerofaciens LFYP39的“CALFYP39_00071”；来自C.hathewayi LFYP18的“CHLFYP18_04700”；来自C.bolteaeLFYP116的“CBLFYP116_02895”。在补充有100mg/L氨苄青霉素的LB平板上筛选携带产物质粒的E.coli。

具体方法如下：

4.1肠道菌株基因组抽提

首先分别活化-80℃保藏的C.aerofaciens LFYP39、C.intestinalis LFYP54、C.bolteae LFYP116、C.hathewayi LFYP18这4株肠道菌于LYHBHI培养基。培养至稳定期后，分别取1.5mL菌液用苯酚-氯仿法提取菌株基因组DNA。将粗提的基因组DNA用RNase A(Takara)处理以去除DNA溶液中的RNA杂质，并使用PCR纯化试剂盒(QIAquick)进行纯化，最后用Nanodrop测量记录纯化后DNA浓度。

4.2设计实验所需引物

根据不同的5-氨基戊酸环化酶基因基因序列设计引物(SEQ ID No.11-20)如下(后续用一步克隆法连接目的序列和载体，故设计的引物从5’开始的前20个核酸序列来自pZE12线性化载体)：

从C.aerofaciens LFYP39中克隆5-氨基戊酸环化酶基因序列(CALFYP39_00071)的引物，Tm均值＝60℃：

PZE12_39_avaC-F:5’-TTTTATTTGATGCCTCTAGAttaggcgctgtatttgttggcctc-3’；

PZE12_39_avaC-R:5’-TTAAAGAGGAGAAAGGTACCatgtccactcagtatgcaatcgttg-3’。

从C.intestinalis LFYP54中克隆5-氨基戊酸环化酶基因序列(CILFYP54_00697)的引物，Tm均值＝58℃：

PZE12_54_avaC-F:5’-TTAAAGAGGAGAAAGGTACCatgggtaagaagtatgcaatcgt-3’；

PZE12_54_avaC-R:5’-TTTTATTTGATGCCTCTAGAttactcggagtacttgttgccct-3’。

从C.bolteae LFYP116中克隆5-氨基戊酸环化酶基因序列(CBLFYP116_02895)的引物，Tm均值＝58℃：

PZE12_116_avaC-F:5’-TTAAAGAGGAGAAAGGTACCatgaagaaggtagcttttaaaggcg-3’；

PZE12_116_avaC-R:5’-TTTTATTTGATGCCTCTAGAtcagcgttttacaaaatatccttctttcatg-3’。

从C.hathewayi LFYP18中克隆5-氨基戊酸环化酶基因序列(CHLFYP18_04700)的引物，Tm均值＝57℃：

PZE12_18_avaC-F:5’-TTTTATTTGATGCCTCTAGAttagtggcgttttacgaaacgtc-3’；

PZE12_18_avaC-R:5’-TTAAAGAGGAGAAAGGTACCatgaagaaagaattaaaagataccgcatttg-3’。

PCR扩增pZE12线性化载体作为重组质粒的骨架，设计质粒载体的引物如下，Tm均值＝60℃：

pZE12_DL-F:5’-tctagaggcatcaaataaaacgaaaggctc-3’；

pZE12_DL-R:5’-ggtacctttctcctctttaatgaattctgtgc-3’。

PCR扩增4种5-氨基戊酸环化酶基因序列并纯化：

使用AB clonal高保真酶分别扩增4株肠道菌中的5-氨基戊酸环化酶基因序列：

PCR体系：

PCR程序：

备注：退火温度按上下游引物的Tm均值计算。

4.3PCR产物去杂DNA并电泳切胶

(1)每50μLPCR产物中加入1μLDpnΙ酶，PCR仪中37℃孵育1h去除细菌中内源性DNA片段杂质。

(2)用1％的琼脂糖凝胶以120V，25min的程序进行电泳，在目标片段长度位置切下所需的PCR产物条带。

按QIAquick Gel Extraction Kit中的说明书进行胶回收。

4.4提取pZE12质粒

挑取携带pZE12质粒的E.coli单克隆至6mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，220rpm,37℃摇床孵育12-16h，按照Omaga的E.Z.N.A.Plasmid DNA mini KitΙ中的说明书进行质粒提取。

4.5线性化载体扩增

反应体系：

PCR程序：

4.6线性化载体PCR产物去杂DNA并切胶回收

(1)每50μLPCR产物中加入1μLDpnΙ酶，PCR仪中37℃孵育1h去除细菌中内源性DNA片段。

(2)用1％的琼脂糖凝胶以120V,25min的程序进行电泳，在目标片段长度位置切下所需的PCR产物条带。

(3)按QIAquick Gel Extraction Kit中的说明书进行胶回收。

4.7一步克隆构建产物质粒

将5-氨基戊酸环化酶基因和pZE12线性化载体连接构成的重组质粒称为产物质粒(production plasmid)。将PCR扩增得到的来自4种肠道菌株的4种5-氨基戊酸环化酶基因与PCR扩增得到的pZE12线性化载体按照近岸蛋白的NovoRec plus One step PCR CloningKit说明书进行一步克隆连接，将得到的4种一步克隆产物置于-20℃冰箱保存。

4.8转化一步克隆产物

按照近岸蛋白的NovoRec plus One step PCR Cloning Kit的说明书中一步克隆产物转化方法，将得到的4种一步克隆产物分别化学转化进携带有pLacSens质粒的E.coliDH10B化学感受态细胞中，用同时含有100μg/mL氨苄青霉素和100μg/mL卡那霉素的LB培养基进行筛选，分别得到4种携带有双质粒的重组E.coli DH10B(pLacSens-productionplasmid)菌株。

4.9将4种不同的E.coli DH10B(pLacSens-production plasmid)菌株按照如下方法活化：

将E.coli DH10B(pLacSens-production plasmid)重组菌株接种在5mL含有100μg/mL氨苄青霉素和100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，220rpm，37℃摇床过夜活化。在过夜活化的菌液中加入新鲜LB培养液稀释成OD₆₀₀＝1的菌液，然后以1：100的比例分别转接至含有0mM，5mM 5AVA的5mL含有100μg/mL氨苄青霉素，100μg/mL卡那霉和500μmol/L IPTG的新鲜LB液体培养基中，220rpm，37℃摇床孵育24小时。

4.10通过重组菌株绿色荧光信号表达验证5-氨基戊酸环化酶表达2-哌啶酮的功能。对收集的菌液培养物用BioTek的Synergy LX多功能酶标仪进行OD₆₀₀和绿色荧光信号检测，计算4种E.coli DH10B(pLacSens-production plasmid)菌株的GFP/OD₆₀₀倍数变化，将菌株培养物的GFP/OD₆₀₀倍数变化指(含有5AVA的培养物的[GFP/OD₆₀₀])/(不含5AVA的培养物的[GFP/OD₆₀₀])。重组E.coli DH10B(pLacSens-production plasmid)菌株感应2-哌啶酮产生发绿色荧光。

4.11通过靶向液相质谱技术检测5-氨基戊酸环化酶在重组菌株中转化5AVA产生2-哌啶酮的效率。将菌液按17000xg高速离心20min取菌液上清，对收集的菌液上清进行2-哌啶酮靶向液相质谱检测。

正如预期的那样，其他三个基因与来自C.intestinalis LFYP54的5-氨基戊酸环化酶基因产生类似的GFP信号和相近的2-哌啶酮含量(如图4中的(b)(c)所示)。因此，发明人将CALFYP39_00071、CHLFYP18_04700和CBLFYP116_02895均命名为5-氨基戊酸环化酶基因。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

Claims (8)

1.一种新型5-氨基戊酸环化酶基因，其特征在于，所述新型5-氨基戊酸环化酶基因包括以下四种基因中的任意一种：

5-氨基戊酸环化酶1基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

5-氨基戊酸环化酶2基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

5-氨基戊酸环化酶3基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

5-氨基戊酸环化酶4基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.一种如权利要求1所述的新型5-氨基戊酸环化酶基因编码的新型5-氨基戊酸环化酶，其特征在于，所述新型5-氨基戊酸环化酶包括以下四种酶中的任意一种：

由所述5-氨基戊酸环化酶1基因编码的5-氨基戊酸环化酶1，其氨基酸序列如SEQIDNo.5所示；

由所述5-氨基戊酸环化酶2基因编码的5-氨基戊酸环化酶2，其氨基酸序列如SEQIDNo.6所示；

由所述5-氨基戊酸环化酶3基因编码的5-氨基戊酸环化酶3，其氨基酸序列如SEQIDNo.7所示；

由所述5-氨基戊酸环化酶4基因编码的5-氨基戊酸环化酶4，其氨基酸序列如SEQIDNo.8所示。

3.一种包含如权利要求1所述的任意一种新型5-氨基戊酸环化酶基因的重组载体质粒。

4.根据权利要求3所述的重组载体质粒，其特征在于，采用如下方法构建所得：将PCR扩增得到的4种新型5-氨基戊酸环化酶基因中的任意一种与PCR扩增得到的pZE12线性化载体一步克隆连接，即可得到重组载体质粒。

5.一种包含如权利要求1所述的任意一种新型5-氨基戊酸环化酶基因的基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，采用如下方法构建所得：将根据权利要求4所述的重组载体质粒分别化学转化进携带有pLacSens质粒的E.coli DH10B化学感受态细胞中，用同时含有100μg/mL氨苄青霉素和100μg/mL卡那霉素的LB培养基进行筛选，即可分别得到4种携带有双质粒的重组E.coliDH10B菌株。

7.一种如权利要求2所述的新型5-氨基戊酸环化酶在催化5-氨基戊酸制备2-哌啶酮中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将一种包含如权利要求1所述的任意一种新型5-氨基戊酸环化酶基因的基因工程菌接种到添加有5-氨基戊酸的LB培养基中培养，实现2-哌啶酮的合成。