CN118064336A - 除磷菌的菌株、种子液、固定化体以及它们的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于废水除磷的技术领域，公开了一种除磷性能优异的除磷菌的菌株、种子液、固定化体以及它们的应用。除磷菌的菌株，所述菌株为鞘氨醇单胞菌Sphingobium yanoikuyae NBRC 15102 DQ002，于2023年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20232608。除磷菌的种子液由上述的除磷菌菌株经活化培养后制备得到。除磷菌的固定化体包括活性炭和附着于活性炭孔隙表面的生物膜，所述生物膜包括上述述的除磷菌的菌株。本发明的除磷菌的菌株表现出较高的除磷活性，对应的固定化体对总磷含量为10mg/L左右和50mg/L左右的水体，均能在24小时以内实现95%以上的除磷率，远高于纯活性炭的除磷率，具有较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及废水除磷的技术领域，具体而言，涉及除磷菌的菌株、种子液、固定化体以及它们的应用。
背景技术
废水处理中磷是以正磷酸盐、次磷酸盐、亚磷酸盐和有机磷等形式存在。常规除磷方法包括化学除磷和生物除磷。化学除磷实质是利用化学试剂和水体中不同存在形式的磷发生化学反应，生成沉淀，应用到实际生产不仅成本较高，而且容易产生大量含磷污泥，容易造成二次污染。生物除磷是利用除磷菌对有机磷和部分磷酸盐的消化分解作用，一部分磷被微生物吸收，通过活性污泥被排出，另一部分被分解，转化为小分子的正磷分子。相比之下，生物除磷技术有操作简单、运行成本低、除磷效果好、无二次污染等优势，也是当下应用最为广泛，最具发展前景的方法之一。
传统生物除磷方式为直接将菌株以种子液（自由悬浮细胞）的形式加入到废水中，虽然使用方便，但是存在细胞密度低、生物除磷反应启动时间长、稳定性差、寿命短等缺陷。微生物固定化是一种通过物理或化学手段将浮游微生物定位在有限的空间区域内，从而提高微生物的活性并使其再利用的生物技术。固定化载体的应用不仅可以提高微生物的活性和稳定性，还可以保持微生物的高纯度和丰度。与自由悬浮细胞相比，采用微生物固定化可以提供更高的细胞密度，更短的生物反应器启动时间和更高的稳定性，保护细胞免受有毒化合物的直接暴露；同时促进细胞长期储存而不失去其降解能力，降低使用成本，为废水磷酸盐的降解提供了新的途径。
活性炭作为一种具有大比表面积的多孔碳质材料，在固定化载体中广泛应用。因此，通过分离纯化筛选出一株具备高效除磷活性的菌株并固定化在活性炭上对废水总磷污染的治理具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种除磷性能优异的除磷菌的菌株、种子液、固定化体以及它们的应用。
为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了除磷菌的菌株，技术方案如下：
除磷菌的菌株，所述菌株为鞘氨醇单胞菌Sphingobium yanoikuyae NBRC 15102DQ002，于2023年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20232608。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了除磷菌的种子液，技术方案如下：
除磷菌的种子液，由上述第一方面所述的除磷菌菌株经活化培养后制备得到。
为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了除磷菌的种子液的制备方法，技术方案如下：
除磷菌的种子液的制备方法，包括以下步骤：将除磷菌的菌株接种到缺磷液体培养基中震荡培养至OD600≥1.0，然后将经过生理盐水离心清洗后的菌株保存于生理盐水中，将即得到除磷菌的种子液。
为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了除磷菌的固定化体，技术方案如下：
除磷菌的固定化体，包括活性炭和附着于活性炭孔隙表面的生物膜，所述生物膜包括上述第一方面所述的除磷菌的菌株。
为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了除磷菌的固定化体的制备方法，技术方案如下：
除磷菌的固定化体的制备方法，包括以下步骤：将活性炭和除磷菌种子液接触一段时间，然后烘干，即得到除磷菌的固定化体。
为了实现上述目的，根据本发明的第五个方面，提供了除磷菌的菌株在污水除磷处理中的应用。
为了实现上述目的，根据本发明的第六个方面，提供了除磷菌的种子液在污水除磷处理中的应用。
为了实现上述目的，根据本发明的第七个方面，提供了除磷菌的固定化体在污水除磷处理中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点主要在于：本发明的除磷菌的菌株表现出较高的除磷活性，对应的固定化体对总磷含量为10mg/L左右和50mg/L左右的水体，均能在24小时以内实现95%以上的除磷率，远高于纯活性炭的除磷率，具有较高的应用价值。
下面结合附图和具体实施方式对本说明书提供的发明创造的实施例做进一步的说明.本说明书提供的发明创造的实施例附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本说明书提供的发明创造的实施例的实践了解到。
附图说明
构成本说明书提供的发明创造的实施例的一部分的附图用来辅助对本说明书提供的发明创造的实施例的理解，附图中所提供的内容及其在本说明书提供的发明创造的实施例中有关的说明可用于解释本说明书提供的发明创造的实施例，但不构成对本说明书提供的发明创造的实施例的不当限定。在附图中：
图1为本发明的除磷菌的菌株的PHB颗粒染色试验镜检图片。
图2为本发明的除磷菌的菌株的异染颗粒染色试验镜检图片。
图3为本发明实施例中低温除磷菌菌株的同源性分析图。
图4为本发明的除磷菌的固定化体的SEM照片。
图5为本发明的竹质活性炭和除磷菌的固定化体的除磷性能测试结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本说明书提供的发明创造的实施例进行清楚、完整的说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本说明书提供的发明创造的实施例。在结合附图对本说明书提供的发明创造的实施例进行说明前，需要特别指出的是：
本说明书提供的发明创造的实施例中在包括下述说明在内的各部分中所提供的技术方案、技术特征，在不冲突的情况下，这些技术方案、技术特征可以相互组合。
此外，下述说明中涉及到的本说明书提供的发明创造的实施例的实施例通常仅是本说明书提供的发明创造的实施例的一分部实施例而不是全部实施例，因此，基于本说明书提供的发明创造的实施例中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本说明书提供的发明创造的实施例保护的范围。
关于本说明书提供的发明创造的实施例中术语和单位：本说明书提供的发明创造的实施例的说明书和权利要求书及有关的部分中的术语“包括”、“包含”、“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。此外，本说明书提供的发明创造的实施例中的其他相关术语和单位，均可基于本说明书提供的发明创造的实施例相关内容得到合理的解释。
（一）本发明的除磷菌的菌株的具体实施方式为所述菌株为鞘氨醇单胞菌Sphingobium yanoikuyae NBRC 15102 DQ002，于2023年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20232608。
上述除磷菌的菌株的筛选方法包括以下步骤：
称取成都科雅污水处理处理有限公司的0.5g新鲜污泥，用无菌水水洗离心3次；然后将其接种到已灭菌的150mL聚磷菌分离培养基中，置于振荡器中于30℃、150rpm下培养48h，形成泥水混合液。
取1mL泥水混合液到装有9mL生理盐水的三角瓶中，充分振荡使其混合均匀，然后按比例稀释，分别得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度的菌悬液。然后分别取0.1mL不同梯度的菌悬液接种到聚磷菌分离培养基中，在恒温培养箱中、30℃条件下涂布培养48h。
选择菌落分布清晰均匀、菌落数在30～300个的菌落，标记并挑取单个菌落在固体培养基上进行三区划线分离，重复该步骤直至得到菌落特征一致的单菌落，最后用接种环挑取单一菌落，转接到准备好的固体培养基上以备用。
挑取形态特殊的单菌落进行PHB颗粒染色试验和异染颗粒染色试验，确定是否含有PHB颗粒和异染颗粒的菌落，符合该条件的菌株即为本发明的除磷菌的菌株，所得菌株保存于聚磷菌分离培养基中。其中，PHB颗粒染色试验过程如下：制作菌体涂片→3%苏丹黑染色10分钟→水洗后滤纸吸干水分→二甲苯冲洗洗脱色素→蕃红复染→水洗后滤纸吸干水分→镜检，染为蓝黑色的即为PHB颗粒。异染颗粒染色试验试验过程如下：制作菌体涂片→甲苯胺蓝染色→冲去甲苯胺蓝→碘化钾染色→水洗后滤纸吸干水分→镜检，染为黑色的即为异染颗粒。
图1为本发明的除磷菌的菌株的PHB颗粒染色试验镜检图片。如图1所示，菌株经脂溶性染料苏丹黑着色后可观察到菌体内包覆许多颗粒，说明该菌株含有PHB颗粒。
图2为本发明的除磷菌的菌株的异染颗粒染色试验镜检图片。如图2所示，异染颗粒染色结果显示菌株含有异染颗粒。
以上结果说明，本发明的菌株是聚磷菌，在缺磷培养基中，它能以PHB颗粒作为碳源和氮源，并将异染颗粒中储存的磷释放出来的作为磷源使用。
采用16S rDNA基因作为序列分析对象对微生物进行测序分析，用于判定细菌的种属。将菌株的16S rDNA序列在GenBank数据库中进行BLAST比对，结果如图3所示，菌株与鞘氨醇单胞菌（Sphingobium yanoikuyae NBRC 15102）的同源度高达99.56%，因此将其命名为Sphingobium yanoikuyae NBRC 15102 DQ002。
（二）本发明的除磷菌的种子液的制备方法的具体实施方式为：从保存的聚磷菌分离培养基上挑取菌株接种于50mL缺磷液体培养基中，于170r/min、30℃条件下培养至OD600≥1.0（紫外分光光度计测定）；离心收集菌体(12000r/min、3min），用生理盐水洗涤三次去除游离细胞，最后将其置于200mL生理盐水中，记为种子液（OD600≥1.0）。
（三）本发明的除磷菌的固定化体的制备方法的具体实施方式为：将1～5g竹质活性炭置于反应器中，在30℃下将10～600mL上述的除磷菌的种子液以1～10mL/min的速度自上而下循环流过反应器，使种子液与竹质活性炭充分接触12～96h直至除磷菌吸附在竹质活性炭孔隙表面上形成固定化生物膜。然后用无菌水洗涤后在20～30℃低温烘干，即得到除磷菌的固定化体。
其中，竹质活性炭的制备过程如下：
①烘干：将楠竹破碎后在100～150℃下烘干2～4h，得到烘干料。
②炭化：在氮气气氛下对烘干料进行一次炭化，炭化温度为400～800℃，炭化时间为2～4h，升温速率为2～5℃/min，氮气流速为2～8L/h，冷却后得到一次炭化料。
③破碎：将一次炭化料破碎后采用>200目的筛网过筛，得到竹炭粉。
④捏合：将竹炭粉置于捏合机中，均匀缓慢地加入适量煤焦油（沥青含量为20～80%），之后均匀缓慢加入适量水，捏合后挤压成型，自然阴干，得到成型料。
⑤炭化：在氮气气氛下对成型料进行二次炭化，炭化温度为400～600℃，炭化时间为1～2h，升温速率为2～5℃/min，氮气流速为2～8L/h，冷却后得到二次炭化料。
⑥活化：在水蒸气和氮气气氛下对二次炭化料进行活化，活化温度为500～1000℃，活化时间为2～5h，水量为50～100mL/min，氮气流速为2～8L/h，冷却后得到活化料。
⑦烧结：将活化料超声清洗数次，于80～120℃烘箱中干燥3～8小时，烘干后在400～800℃的马弗炉内烧结2～4小时，冷却后即得到作为固定化载体的竹质活性炭，测试得到其比表面积为1207.5974m2/g，平均孔径为2.8725nm。
图4为本发明的除磷菌的固定化体的SEM照片。如图4所示，固定化体具有多孔结构。
（四）除磷性能测试
分别取2g竹质活性炭和2g除磷菌的固定化体至100mL总磷（TP）浓度不同的两种模拟的废水中，在30℃、150r/min条件下连续降解72h，分别在6h、12h、24h、48h及72h时取10mL降解水样离心过滤，采用《水质 总磷的测定 钼酸铵分光光度法》（GB11893-89）测试TP浓度。
其中：两种模拟的废水中，废水A中无水乙酸钠的浓度为3.32g/L，采用KH2PO4调节TP浓度为10.66mg/L，废水B无水乙酸钠的浓度为3.32g/L，采用KH2PO4调节TP浓度为50.47mg/L。
图5为本发明的竹质活性炭和除磷菌的固定化体的除磷性能测试结果图。如图5所示，在两种模拟的废水中，固定化体均表现出远高于竹质活性炭的除磷率，当初始TP浓度为10.66mg/L时，降解24h时的TP浓度为0.28mg/L，除磷率为97.4%。当初始TP浓度为50.47mg/L时，降解24h时的TP浓度为0.85mg/L，除磷率为98.3%。可见，本发明的固定化体对两种废水均能在24小时以内实现95%以上的除磷率，具有较高的应用价值。
其中，生理盐水成分为：每1L蒸馏水中加入氯化钠9g。
聚磷菌分离培养基的成分为：每1L蒸馏水中加入蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g，pH为7.2。
固体培养基的成分为：每1L蒸馏水中加入蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂20g，pH为7.2。
缺磷液体培养基的成分为：每1L蒸馏水中加入无水乙酸钠3.32g、Na2HPO4·2H2O0.023g、MgSO4·7H2O 0.081g、K2SO4 0.018g、NH4Cl 0.153g、CaCl2·2H2O 0.011g、微量元素2mL、HEPES缓冲液7g。微量元素的成分为：每1L蒸馏水中加入FeCl3·6H2O 1.50g、H3BO3 0.15g、CuSO4•5H2O 0.03g、KI 0.03g、Na2MoO4•2H2O 0.06g、MnCl2·4H2O 0.12g、ZnSO4·7H2O0.12g、CoCl6•6H2O 0.12g。
所有培养基均121℃灭菌20min后使用。
本发明中总磷是水样经消解后将各种形态的磷转变成正磷酸盐后测定的结果。
以上对本说明书提供的发明创造的实施例的有关内容进行了说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本说明书提供的发明创造的实施例。基于本说明书提供的发明创造的实施例的上述内容，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他优选实施方式和实施例，都应当属于本说明书提供的发明创造的实施例保护的范围。
Claims (8)
1.除磷菌的菌株，其特征在于：所述菌株为鞘氨醇单胞菌Sphingobium yanoikuyaeNBRC 15102 DQ002，于2023年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M20232608。
2.除磷菌的种子液，其特征在于：由权利要求1所述的除磷菌的菌株经活化培养后制备得到。
3.权利要求2所述的除磷菌的种子液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将除磷菌的菌株接种到缺磷液体培养基中震荡培养至OD600≥1，然后将经过生理盐水离心清洗后的菌株保存于生理盐水中，即得到除磷菌的种子液。
4.除磷菌的固定化体，其特征在于：包括活性炭和附着于活性炭孔隙表面的生物膜，所述生物膜包括权利要求1所述的除磷菌的菌株。
5.权利要求4所述的除磷菌的固定化体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将活性炭和除磷菌种子液接触，然后烘干，即得到除磷菌的固定化体。
6.权利要求1所述的除磷菌的菌株在污水除磷处理中的应用。
7.权利要求2所述的除磷菌的种子液在污水除磷处理中的应用。
8.权利要求4所述的除磷菌的固定化体在污水除磷处理中的应用。
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