CN117887645A - 低温除磷菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物的技术领域，公开了一种低温条件下除磷效果好的低温除磷菌菌株及其应用。一种低温除磷菌菌株，所述菌株为包氏不动杆菌（Acinetobacter bouvetii）DQ003，于2023年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20232609。与现有技术相比，本发明的优点主要在于：本发明的低温除磷菌菌株表现出较高的除磷活性，在碳源和氮源存在下对实际水体具有较高的除磷率，除磷活性受温度影响较小，在15～30℃条件下都保持了较好的除磷效果，可用于实际环境中不同温度条件下污水总磷的降解，具有较高的应用价值。

Description

低温除磷菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物的技术领域，具体而言，涉及低温除磷菌菌株及其应用。

背景技术

随着我国工业化和城市化的不断提高，大量有机洗涤剂和各种杀虫剂化肥的过度使用，致使生成大量含氮、含磷废水。总磷作为造成水体富营养化的关键元素，其浓度过高会破坏生态系统中物质与能量的流动，使整个水生生态系统逐渐走向灭亡。我国也陆续颁布相关条例，严格限制城市污水处理厂出口水排放总磷标准。因此，开发安全、高效、绿色的除磷技术成为当下研究的一大热点。

废水处理中磷是以正磷酸盐、次磷酸盐、亚磷酸盐和有机磷等形式存在。常规除磷方法包括化学除磷和生物除磷。化学除磷实质是利用化学试剂和水体中不同存在形式的磷发生化学反应，生成沉淀。应用到实际生产不仅成本较高，而且容易产生大量含磷污泥，容易造成二次污染。生物除磷是利用除磷菌对有机磷和部分磷酸盐的消化分解作用。一部分磷被微生物吸收，通过活性污泥被排出；另一部分被分解，转化为小分子的正磷分子。相比之下，生物除磷技术有操作简单、运行成本低、除磷效果好、无二次污染等优势，也是当下应用最为广泛，最具发展前景的方法之一。

环境因素，如温度、碳氮比等是影响微生物生长的关键因素。与此同时，我国一年四季温度相差较大，低温对微生物的生物活性和代谢效率影响较大，严重阻碍了除磷菌的作用，从而导致除磷效果达不到国家排放标准。因此，通过分离纯化筛选出一株可以在较大温差条件下都具备高效除磷活性的菌株对我国总磷污染的处理具有建设性的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种低温条件下除磷效果好的低温除磷菌菌株及其应用。

为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了低温除磷菌菌株，技术方案如下：

一种低温除磷菌菌株，所述菌株为包氏不动杆菌（Acinetobacter bouvetii）DQ003，于2023年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20232609。

为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了除磷菌种子液，技术方案如下：

一种除磷菌种子液，由上述第一方面所述的低温除磷菌菌株经活化培养后制备得到。

为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了低温除磷菌菌株的制备方法，技术方案如下：

除磷菌种子液的制备方法，包括以下步骤：将上述第一方面所述的低温除磷菌菌株接种到富集培养基中震荡培养至对数增长期，然后使用NaCl溶液进行离心清洗以去除富集培养基，即得到除磷菌种子液。

为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了上述第一方面所述的低温除磷菌菌株在污水除磷处理中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点主要在于：本发明的低温除磷菌菌株表现出较高的除磷活性，在碳源和氮源存在下对实际水体具有较高的除磷率，除磷活性受温度影响较小，在15～30℃条件下都保持了较好的除磷效果，可用于实际环境中不同温度条件下污水总磷的降解，具有较高的应用价值。

下面结合附图和具体实施方式对本说明书提供的发明创造的实施例做进一步的说明.本说明书提供的发明创造的实施例附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本说明书提供的发明创造的实施例的实践了解到。

附图说明

构成本说明书提供的发明创造的实施例的一部分的附图用来辅助对本说明书提供的发明创造的实施例的理解，附图中所提供的内容及其在本说明书提供的发明创造的实施例中有关的说明可用于解释本说明书提供的发明创造的实施例，但不构成对本说明书提供的发明创造的实施例的不当限定。

图1为本发明实施例中低温除磷菌菌株的菌落形态图（a）和细胞形态图（b）。

图2为本发明实施例中低温除磷菌菌株的同源性分析图。

图3为本发明实施例中低温除磷菌菌株对富磷培养基的除磷性能测试结果图。

图4为本发明实施例中低温除磷菌菌株对实际水体的除磷性能测试结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本说明书提供的发明创造的实施例进行清楚、完整的说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本说明书提供的发明创造的实施例。在结合附图对本说明书提供的发明创造的实施例进行说明前，需要特别指出的是：

本说明书提供的发明创造的实施例中在包括下述说明在内的各部分中所提供的技术方案、技术特征，在不冲突的情况下，这些技术方案、技术特征可以相互组合。

此外，下述说明中涉及到的本说明书提供的发明创造的实施例通常仅是本说明书提供的发明创造的实施例的一分部实施例而不是全部实施例，因此，基于本说明书提供的发明创造中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本说明书提供的发明创造的实施例保护的范围。

关于本说明书提供的发明创造的实施例中术语和单位：本说明书提供的发明创造的实施例的说明书和权利要求书及有关的部分中的术语“包括”、“包含”、“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。此外，本说明书提供的发明创造的实施例中的其他相关术语和单位，均可基于本说明书提供的发明创造的实施例相关内容得到合理的解释。

本发明的低温除磷菌菌株的具体实施方式为所述菌株为包氏不动杆菌（Acinetobacter bouvetii）DQ003，于2023年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M20232609。

上述的低温除磷菌菌株的具体筛选过程包括以下步骤：

（1）将污水处理厂的活性污泥加入到富集培养基中进行低温驯化；

（2）取步骤（1）中经过低温驯化过后的菌液到富磷培养基中进行培养；

（3）取步骤（2）中所得到的上清液加入新的富磷培养基中进行传代；传代重复至少3次；

（4）取步骤（3）中传代所得到的上清液进行梯度稀释；稀释完成后均匀涂布在富磷固体培养基平板上进行培养；

（5）挑选步骤（4）平板中得到的单个菌落，分别接种到富集培养基里活化；

（6）将步骤（5）中活化过后的上清液在富集固体培养基上面进行划线分离，划线分离重复至少3次，即得到纯化的低温除磷菌菌株；纯化的低温除磷菌菌株在富集固体培养基上划线并于-4℃保存。

其中，富集培养基的成分为：每1L蒸馏水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g和NaCl 10g，pH为7.0～7.2；

富集固体培养基的成分为：每1L蒸馏水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g和琼脂20g，pH为7.0～7.2；

富磷培养基的成分为：每1L蒸馏水中加入乙酸钠（CH₃COONa）3.68g、磷酸氢二钾（K₂HPO₄）0.03g、氯化铵（NH₄Cl）0.3g、硫酸镁（MgSO₄）0.1g、氯化钙（CaCl₂）0.025g、HEPES（4-羟乙基哌嗪乙磺酸，分子式为C₈H₁₈N₂O₄S）8.5g和微量元素液2mL，pH为7.0~7.2；

富磷固体培养基的成分为：每1L蒸馏水中加入乙酸钠3.68g、磷酸氢二钾0.03g、氯化铵0.3g、硫酸镁0.1g、氯化钙0.025g、HEPES 8.5g、微量元素液2mL和琼脂20g，pH为7.0~7.2；

微量元素液的成分为：每1L蒸馏水中加入硼酸（H₃BO₃）1.5g、硫酸锌（ZnSO₄）0.03g、硫酸锰（MnSO₄）0.7g、硫酸铜（CuSO₄）0.06g、硫酸钴（CoSO₄）0.01g、七钼酸铵（(NH₄)₆Mo₇O₂₄）0.19g、碘化钾（KI）0.18g。

本发明的除磷菌种子液的具体实施方式由上述的低温除磷菌菌株经活化培养后制备得到。

本发明的除磷菌种子液的制备方法的具体实施方式包括以下步骤：将低温除磷菌菌株接种到富集培养基中震荡培养至对数增长期，然后使用NaCl溶液进行离心清洗以去除富集培养基，即得到除磷菌种子液。

本发明的低温除磷菌菌株在污水除磷处理中的应用的具体实施方式为将由上述的低温除磷菌菌株经活化培养后制备得到的除磷菌种子液加入到待除磷处理的污水中进行生物除磷反应。

以下通过具体实施例来说明本发明的有益效果。

（一）低温除磷菌菌株的实施例的筛选方法包括以下步骤：

（1）从成都科雅污水处理处理有限公司的活性污泥中称取5g泥土并将其加入到富集培养基中，在恒温气浴摇床（常州金坛良友仪器有限公，型号THZ-82A）中于15℃、150rpm条件下驯化3天；

（2）取步骤（1）中经过低温驯化过后的上清液1mL，添加到100mL富磷培养基中在恒温气浴摇床中于15℃、150rpm条件下培养3天；

（3）取步骤（2）中所得到的上清液1mL加入新的100mL富磷培养基中进行传代，传代重复；

（4）取步骤（3）中传代3次得到的上清液1mL进行梯度稀释，依次稀释10、10²、10³、10⁴和10⁵倍，然后均匀涂布在富磷固体培养基平板上，倒扣置于恒温培养箱，在15℃条件下培养2天；

（5）挑选步骤（4）平板中得到的单个菌落，分别接种到富集培养基中活化12 h；

（6）将步骤（5）中活化过后的上清液在富集固体培养基上面进行划线分离，划线分离重复至少3次，即可得到纯化的低温除磷菌；纯化的低温除磷菌菌株在富集固体培养基上划线并于-4℃保存。

图1为本发明实施例中低温除磷菌菌株（a）的菌落形态图和细胞形态图（b，放大1000倍）。从图1a可以看出，该菌株在平板上呈圆形、灰白色、光滑、湿润、边缘整齐、直径2~3mm的菌落，无色素形成，部分菌落可呈粘液状。从图1b可以看出，该菌株为球杆状，无芽孢，无鞭毛。

采用16S rDNA基因作为序列分析对象对微生物进行测序分析，用于判定细菌的种属。将低温除磷菌菌株的16S rDNA基因PCR产物纯化后进行测序，进行NCBI同源性分析，结果如图2所示，低温除磷菌菌株与包氏不动杆菌（Acinetobacter bouvetii）的同源度高达99.14%，因此将其命名为Acinetobacter bouvetii DQ003。

（二）除磷菌种子液的制备方法的实施例为包括以下步骤：将上述分离得到低温除磷菌菌株按照1%接菌量接种到富集培养基中，在恒温气浴摇床中于15℃、150rpm条件下活化至单菌株富集液进入对数增长期时，使用质量分数为0.9%的NaCl溶液进行3次离心清洗以去除富集培养基，即得到除磷菌种子液，用无菌水将种子液OD₆₀₀调至1.0。

（三）除磷性能测试

（1）对富磷培养基的除磷性能测试

按照1%的接种量将除磷菌种子液接种于已经过高压蒸汽灭菌（120℃，20min）处理的富磷培养基中，总磷含量为6.7mg/L。然后置于15～30℃，150rpm的恒温气浴摇床中进行除磷反应。在反应1天、2天和3天时取上清液，将上清液在12000rpm条件下离心10分钟，并使用0.45μm的微孔滤膜过滤。利用利用水质总磷检测钼酸铵分光光度计法（GB 11893-89）检测总磷的浓度。

图3为本发明实施例中低温除磷菌菌株对富磷培养基的除磷性能测试结果图。结果表明，低温除磷菌菌株的除磷效果较好，在15℃、20℃和30℃条件下都保持了较好的除磷效果，并且都在1天内达到最大除磷量85%。由此可见，该低温除磷菌菌株在不同温度条件下（15～30℃）都具有较好的除磷活性。

（2）对实际水体加标现场水的除磷性能测试

取成都科雅污水处理处理有限公司的二沉池水体，每1L水体中加入碳源（乙酸钠CH₃COONa）6.1g、氮源（氯化铵NH₄Cl）0.305g和磷酸氢二钾0.013g。按照1%的接种量将除磷菌种子液接种于已经过高压蒸汽灭菌（120℃，20min）处理的水体中，水样加标后总磷含量为2.0mg/L。然后置于15～30℃，150rpm的恒温气浴摇床中进行除磷反应。在反应1天、2天和3天时取上清液，将上清液在12000rpm条件下离心10分钟，并使用0.45μm的微孔滤膜过滤。利用水质总磷检测钼酸铵分光光度计法（GB 11893-89）检测总磷的浓度。

图4为本发明实施例中低温除磷菌菌株对实际水体加标现场水的除磷性能测试结果图。结果表明，低温除磷菌菌株在实际水体中表现出较高的去除活性，反应一天的除磷率可以达到50%，反应2天的除磷率可以达到60%以上，在15℃、20℃和30℃条件下除磷后的总磷值均低于国家《污水综合排放标准》中的总磷一级A标准（限制为1.0mg/L）。

从图3和图4可知，本发明的低温除磷菌菌株在15℃、20℃和30℃条件下表现出接近的除磷活性，说明温度对低温除磷菌菌株的除磷活性影响较小，能够适应环境温度变化，具有极强的实用性。

在图3和图4的纵坐标中，C为上清液的总磷浓度，C₀为总磷的初始浓度。

本发明中总磷是水样经消解后将各种形态的磷转变成正磷酸盐后测定的结果。

以上对本说明书提供的发明创造的实施例的有关内容进行了说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本说明书提供的发明创造的实施例。基于本说明书提供的发明创造的实施例的上述内容，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他优选实施方式和实施例，都应当属于本说明书提供的发明创造的实施例保护的范围。

Claims (4)

1.一种低温除磷菌菌株，其特征在于：所述菌株为包氏不动杆菌（Acinetobacterbouvetii）DQ003，于2023年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M20232609。

2.一种除磷菌种子液，其特征在于：由权利要求1所述的低温除磷菌菌株经活化培养后制备得到。

3.权利要求2所述的除磷菌种子液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将低温除磷菌菌株接种到富集培养基中震荡培养至对数增长期，然后使用NaCl溶液进行离心清洗以去除富集培养基，即得到除磷菌种子液。

4.权利要求1所述的低温除磷菌菌株在污水除磷处理中的应用。