CN118063640A

CN118063640A - 海金沙多糖的提取纯化方法及在制备防治泌尿系结石药物中的应用

Info

Publication number: CN118063640A
Application number: CN202410212183.7A
Authority: CN
Inventors: 孙新园; 黄玲红; 李春耀; 章泉; 虞邦宪; 曾国华
Original assignee: First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date: 2024-02-27
Filing date: 2024-02-27
Publication date: 2024-05-24

Abstract

本发明公开了一种海金沙多糖的提取纯化方法，包括以下步骤：1)海金沙成熟孢子样品通过热水提取，Sevag法进行脱蛋白，然后用石油醚试剂去除脂肪，用大孔树脂AB‑8去除色素，得到粗多糖；2)通过DEAE纤维素柱进行离子交换纯化，得到离子纯化的多糖；3)Sephacryl S‑400HR色谱柱进行凝胶色谱分离和纯化；4)用冻干法对样品进行干燥收集。本发明还公开了一种海金沙多糖在制备防治泌尿系结石药物中的应用。本发明提供一种提取、分离纯化得到一种新的海金沙多糖，对其结果进行表征，并提供海金沙多糖用于制备治疗肾结石的药物的新用途。

Description

海金沙多糖的提取纯化方法及在制备防治泌尿系结石药物中的应用

技术领域

本发明涉及海金沙多糖的制备及应用，属于中药再应用的技术领域，具体涉及一种海金沙多糖的提取纯化方法及在制备防治泌尿系结石药物中的应用。

背景技术

肾结石是一种全球性的常见病和多发病，由于其发病机制不明且缺乏有效的防治药物，其发病率和术后复发率一直居高不下，严重危害人们的身体健康。

全国范围流行病学调查结果显示肾结石发病率为6.5％，其中广东省患病率高达11.6％。结石术后极易复发，5-10年复发率约为50％，20年的复发率高达75％。

近年来，对肾结石发病机制、手术机械方面取得了一定的进展，但仍未发现特效的、可用于临床治疗且副作用小的药物。

海金沙(Lygodium japonicum)是海金沙科、海金沙属陆生攀援植物，药用部位为其干燥成熟孢子，具有清利湿热，通淋止痛的功能，是中医治疗尿路结石最常见的药物之一，但其复杂的化学成分影响了海金沙的开发利用。

存在于细胞基质中的多糖是海金沙中的最为重要的活性成分之一，是否在结石治疗中发挥主要作用还有待进一步探究。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取、分离纯化得到一种新的海金沙多糖，对其结果进行表征，并提供海金沙多糖用于制备治疗肾结石的药物的用途。

本发明提供一种海金沙多糖的提取纯化方法，包括以下步骤：

1)海金沙成熟孢子样品通过热水提取，Sevag法进行脱蛋白，然后用石油醚试剂去除脂肪，用大孔树脂AB-8去除色素，得到粗多糖；

2)通过DEAE纤维素柱进行离子交换纯化，得到离子纯化的多糖；

3)Sephacryl S-400HR色谱柱进行凝胶色谱分离和纯化；

4)用冻干法对样品进行干燥收集。

进一步地，所述步骤1)具体包括以下步骤：

1.1)将新鲜干燥的海金沙成熟孢子样品洗净、干燥、粉碎；过筛后的粉末用蒸馏水提取多糖；过滤上清液后浓缩，用无水乙醇沉淀，离心得初步粗多糖；

1.2)将得到的沉淀溶于水，用Sevag法进行脱蛋白，然后用石油醚试剂去除脂肪，用大孔树脂AB-8去除色素，然后通过蒸馏水进行透析、浓缩和冷冻干燥，得到进阶粗多糖(比步骤1.1的初步粗多糖纯度高一些的多糖，但还不是纯化完全的多糖)。

进一步地，所述用蒸馏水以1:10的比例(w/v)提取多糖，提取两次，每次45分钟；

所述浓缩使用旋转蒸发仪，温度为60℃；

所述无水乙醇的用量为4倍体积；所述离心时间为10分钟；

所述透析采用的透析袋的截取分子量为3000Da。

进一步地，所述步骤2)具体包括以下步骤：

将步骤1)得到的进阶粗多糖置于DEAE-纤维素柱上，用蒸馏水进行洗脱，然后依次加入0.1、0.2和0.3mol/L NaCl；收集所选的主要馏分。

进一步地，所述DEAE-纤维素柱为26mm×400mm；所述蒸馏水以4mL/min的速度依次进行洗脱。

进一步地，所述收集所选的主要馏分还包括通过苯酚-硫酸法在490nm波长下检测其多糖含量的步骤。

进一步地，所述步骤3)具体包括以下步骤：

将步骤2)得到的离子纯化的多糖装入Sephacryl S-400HR色谱柱；用蒸馏水进行洗脱，并用苯酚-硫酸法进行监测；收集初级多糖馏分，透析。

进一步地，所述Sephacryl S-400HR色谱柱为AKTA explorer系统，26mm×1000mm；所述用蒸馏水以1.0mL/min的流速进行洗脱；所述透析为用透析管以蒸馏水透析72小时。

另外，本发明还公开了一种上述方法制备得到的海金沙多糖在制备防治泌尿系结石药物中的应用。

上述海金沙多糖在制备防治泌尿系结石药物中的应用，将海金沙多糖制备成口服液，其工艺方法包括以下步骤：

1)将提取的海金沙多糖提取物和苯甲酸钠溶于水中，配置含5％-30％海金沙多糖、0.1％-0.3％苯甲酸钠的半成品口服液；

2)将步骤1)的半成品口服液进行灭菌、封装，即得到成品口服液。

本发明制备得到的海金沙多糖及其应用所具有的有益效果是：

1)本发明提供一种提取、分离纯化得到一种新的海金沙多糖，对其结果进行表征，并提供海金沙多糖用于制备治疗肾结石的药物的新用途。

2)该海金沙多糖口服液兼具抗氧化和防石功能，可用于以草酸钙为主要成分的肾结石疾病，特别是用于伴有肾损伤的含钙结石效果显著，制备工艺简单，生产成本低，易于实现产业化。

附图说明

图1为多糖离子纯化洗脱曲线(A)和凝胶纯化洗脱曲线(B)。

图2为LJP的分子量检测；(A)绝对分子量分析；(B)分子构象分析。

图3为LJP的单糖成分分析；(A)单糖标准峰图；(B)LJP中的单糖成分。

图4为LJP的傅立叶变换红外光谱分析。

图5为LJP的1D-NMR核磁共振谱；(A)¹H NMR光谱；(B)¹³C NMR光谱。

图6为LJP的2D-NMR核磁共振谱；(A)H-H COSY光谱；(B)NOESY光谱；(C)HSQC光谱；(D)HMBC光谱。

图7为LJP对草酸钙晶体的调控作用；(A)草酸钙晶体的SEM图；(B)XRD图；(C)FT-IR图。

图8为LJP对细胞活力影响和透射电镜观察；(A-C)LJP在HK-2，NRK-52E，NRK-49F细胞中的安全性；(D)COM对HK-2细胞的损伤；(E)LJP保护作用下对细胞活力的影响；(F)LDH释放量检测；(G)细胞表面黏附和内吞晶体检测。

图9为LJP在体内的生物分布和代谢情况；(A)正常小鼠整体ICG-LJP荧光在不同时间点表达情况；(B)正常小鼠各脏器荧光在不同时间点表达情况；(C)ICG-LJP的荧光以及在正常小鼠和GA造模小鼠体内和肾脏中的分布；(D)正常小鼠肾脏不同时间免疫荧光染色(绿色：CK-18；红色：ICG)；(E)不同时间正常小鼠肾脏中LJP-ICG荧光强度的半定量分析；(F)不同时间正常小鼠和GA改造小鼠肾脏中LJP-ICG荧光强度的半定量分析；(G)不同时间肾小管中LJP-ICG的免疫荧光半定量分析。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001。

图10为LJP抑制大鼠肾内草酸钙晶体沉积；(A)HE染色结果，(B)基于HE的损伤评分统计；(C)Pizzolato染色观察草酸钙沉积情况；(D)晶体沉积面积统计。

具体实施方式

本发明提供了一种海金沙多糖的提取纯化方法及在制备防治泌尿系结石药物中的应用。

实施例1

海金沙多糖(LJP)的提取和纯化

将新鲜干燥的海金沙成熟孢子样品洗净、晾干，在60℃下烘干，用高速粉碎机粉碎。过筛后的粉末用蒸馏水以1:10的比例(w/v)提取多糖，提取两次，每次45分钟。过滤上清液后，用旋转蒸发仪在60℃下浓缩，然后用4倍体积的无水乙醇沉淀，离心10分钟，得到的沉淀为纯度较低的粗多糖。将得到的干燥粗多糖溶于水，用Sevag法进行脱蛋白，然后用石油醚试剂去除脂肪，用大孔树脂AB-8去除色素，然后进行水透析(3000Da)、浓缩和冷冻干燥，得到粗多糖。

将粗多糖置于DEAE-纤维素柱(26mm×400mm)上，用蒸馏水以4mL/min的速度依次进行洗脱，然后依次加入0.1、0.2和0.3mol/L NaCl。收集所选的主要馏分，并通过苯酚-硫酸法在490nm波长下检测其多糖含量。

将离子纯化的多糖装入AKTA explorer系统上的26mm×1000mm Sephacryl S-400HR色谱柱。用蒸馏水以1.0mL/min的流速进行洗脱，并用苯酚-硫酸法进行监测。收集初级多糖馏分，并用透析管以蒸馏水透析72小时。然后用冻干法对样品进行干燥收集。

实施例2

将实施例1的海金沙多糖用来制备含海金沙多糖口服液，其制备工艺方法包括以下步骤：

1)将实施例1提取的海金沙多糖提取物和苯甲酸钠溶于水中，配置含5％-30％海金沙多糖、0.1％-0.3％苯甲酸钠的半成品口服液；

本实施例的海金沙多糖口服液兼具抗氧化和防石功能，可用于以草酸钙为主要成分的肾结石疾病，特别是用于伴有肾损伤的含钙结石效果显著，制备工艺简单，生产成本低，易于实现产业化。

功效试验例1海金沙多糖(LJP)的表征

1.LJP的均一性和分子量测定

将海金沙多糖样品溶解在0.1M NaNO₃水溶液中，其中含有浓度为1mg/mL的0.02％NaN₃。然后用孔径为0.45μm的过滤器过滤溶液。使用SEC-MALLS-RI测量各种馏分的均匀性和分子量。使用DAWN HELEOS-II激光光度计测量各种馏分的重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)和多分散指数(Mw/Mn)，仪器配备三根串联色谱柱(300×8毫米，Shodex OH-pak SB-805、804和803；Showa Denko K.K.，日本东京)，色谱柱加热器的温度保持在45℃。流速为0.4mL/min。馏分浓度和dn/dc值使用差分折射率检测器测定，dn/dc值为0.141mL/g。数据使用ASTRA6.1(Wyatt Technology)采集和处理。

结果：

LJP的提取和纯化：

LJP是通过热水萃取从海金沙成熟孢子的水提取物中纯化出来。LJP通过Sevag法进行脱蛋白，然后用石油醚试剂去除脂肪，用大孔树脂AB-8去除色素。随后LJP通过DEAE纤维素柱进行离子交换纯化和Sephacryl S-400HR色谱柱进行凝胶色谱分离和纯化(图1A，1B)。

海金沙多糖的分子量：

图2为LJP的绝对分子量分析图和分子构型分析图。LJP的数均分子量Mn为12.9kDa，重均分子量Mw为15.3kDa，z均分子量Mz为18.6kDa，多分散性Mw/Mn为1.184(图2A)。在分子构型图的结果中(图2B)，其斜率可以作为分子构型的参考，通常情况下，斜率＝1表示分子为棒状，斜率为0.5-0.6表示无规则线团，斜率＝1/3表示球形。LJP的斜率为0.25±0.05，表明为类球型的分子构型。

2.LJP的单糖成分分析

采用三氟乙酸(2mol/L)在121℃下水解样品(5mg)，在密封管中水解2小时。水解后，氮气干燥样品。加入甲醇清洗样品3次，然后吹干。残留物重新溶解在去离子水中，用0.22μm微孔过滤器过滤。使用CarboPac PA-20阴离子交换色谱柱(3×150毫米；Dionex)和脉冲安培检测器(PAD；Dionex ICS 5000+系统)对LJP样品进行分析。流速为0.5mL/min，进样量为5μL。溶剂系统包括A：ddH2O；B：0.1mol/L NaOH；C：0.1mol/L NaOH，0.2mol/L NaAc。使用ICS5000+采集数据，并使用Chromeleon 7.2CDS(Thermo Scientific)进行处理。

结果：

海金沙多糖的单糖组成：

采用高效阴离子交换色谱(HPAEC)对LJP的单糖组成进行了定量检测(图3A和3B)，结果显示LJP由葡萄糖(Glc)，半乳糖醛酸(Gal-UA)，葡萄糖醛酸(Glc-UA)，半乳糖(Gal)，鼠李糖(Rha)，阿拉伯糖(Ara)单糖组成(表1)，其组成百分比分别为94.05％，2.49％和2.48％，0.35％，0.32％，0.31％，摩尔比分别为94.299，2.317和2.308，0.351，0.352，0.373。

表1.原始海金沙多糖(LJP)的单糖组成和标准曲线信息

3.LJP的傅立叶变换红外光谱分析

使用Nicolet iZ-10光谱仪对LJP进行傅立叶变换红外光谱(FT-IR)检测。将LJP样品与KBr粉末混合，压成1mm的薄片，在4000至400cm^-1范围内进行FT-IR光谱检测。

结果：

海金沙多糖的FT-IR分析：

FT-IR分析结果中(图4)，吸收带在3600-3200cm^-1是-OH的伸缩振动吸收峰，这个区域的吸收峰是糖类的特征峰。3421cm^-1是O-H的伸缩振动吸收峰，是糖类的特征峰。在2925cm^-1处的吸收峰归属于C-H伸缩振动。在1635cm^-1吸收峰，归属于C＝O伸缩振动。在1076cm^-1处的吸收峰，归属于C-O的伸缩振动。

4.LJP的甲基化分析

将LJP溶解于DMSO中，然后在DMSO/NaOH中使用CH₃I进行甲基化。完全甲基化后，用2mol/L TFA在121℃下水解1.5小时，用NaBD₄还原，再用乙酸酐在100℃下乙酰化2.5小时。样品在配备Agilent BPX70色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm，澳大利亚SGE公司)的Agilent6890A-5975C上进行气相色谱-质谱分析。使用高纯度氦气(分离比10:1)作为载气，进样量为1μL。质谱分析在140℃的初始温度下进行2.0分钟，然后以3℃/min的速度升温至230℃，持续3分钟。扫描模式为SCAN，扫描范围(m/z)为50至350。

结果：

LJP的甲基化分析：

甲基化分析提供了多糖结构的信息，如糖苷键的类型和比例。表2显示了LJP中的糖苷键模式。共发现并鉴定了11种衍生物：t-Glc(p)、3-Glc(p)、2-Glc(p)、4-Glc(p)、2,3-Glc(p)、2,4-Glc(p)、3,6-Glc(p)、4,6-Glc(p)、2,6-Glc(p)、3,4,6-Glc(p)、2,4,6-Glc(p)。结果与单糖成分分析基本一致。

表2.基于甲基化分析的LJP糖苷键模式

5.LJP的核磁分析

将20毫克LJP溶解在0.5毫升D₂O中，使最终浓度达到40毫克/毫升。在25℃下使用布鲁克AVANCE NEO 500M光谱仪系统(Bruker，Rheinstetten，Germany)以500MHz的频率记录¹D-NMR和²D-NMR(¹H-NMR ¹³C-NMR、COSY、OESY、HMBC和HSQC)。采用一维NMR光谱(¹H NMR光谱和¹³C NMR光谱)和二维NMR光谱(COSY、NOESY、HSQC和HMBC)来分析LJP的结构特征。

结果：

LJP的NMR分析：

多糖在¹H NMR中的信号集中于3～6ppm(图5A)。通常β-糖苷键构型的异头氢信号主要分布在δ4.3～4.8ppm，α-糖苷键构型的异头氢信号主要分布在δ4.8～5.8ppm。LJP的氢谱信号主要集中在δ3.0～5.5ppm之间，在δ4.3-5.5ppm异头信号区共识别到多个偶合信号峰，表明此样品中含有多种糖残基，对应异头氢的化学位移分别为δ5.33、5.29、5.16、5.04、4.90、4.59和4.44ppm等。非异头氢信号主要集中在δ3.2～4.2ppm区域，个别信号还需要结合COSY和HSQC谱分别对各糖残基的H2-H6化学位移进行归属。

与¹H NMR相比，LJP在¹³C NMR中的化学位移信号分布较宽(图5B)。多糖在¹³C NMR中的异头碳信号集中于95-110ppm。LJP在异头碳区域识别到多个信号峰，结合¹³C NMR谱和HSQC谱异头区域的交叉峰，存在的异头信号为：δ4.90/97.74、δ5.33/99.72、δ5.29/99.55、δ4.44/102.70、δ4.59/103.00、δ5.04/96.12和δ5.16/102.29ppm，并分别记为糖残基A、B、C、D、E、F和G。结合样品键合结构(甲基化)信息、异头信号以及文献综合报道，从而推测糖残基A为α-D-Glcp-(1→，残基B为→4)-α-D-Glcp-(1→，残基C为→3)-α-D-Glcp-(1→，残基D为→4,6)-β-D-Glcp-(1→，残基E为→3,6)-β-D-Glcp-(1→，残基F为→2)-α-D-Glcp-(1→，残基G为→2,6)-α-D-Glcp-(1→。

并对其¹H和¹³C化学位移进行归属(表3)。主要糖残基的核磁信号归属如下：

糖残基A：异头信号δ4.90/97.74ppm(H1/C1)表明残基A为α-构型的葡萄糖残基，H1化学位移为δ4.90ppm，通过COSY图谱(图6A)交叉峰δ4.90/3.50ppm确定了残基A的H2的化学位移为3.50ppm。依次得出糖残基A的H3、H4、H5和H6a/(H6b)化学位移分别归属为δ3.67ppm、δ3.43ppm、δ3.35ppm和δ3.72ppm(3.77ppm)。随后通过HSQC图谱(图6C)信号归属了该糖环上C2～C6的化学位移，分别为δ71.48ppm、δ72.79ppm、δ75.71ppm、δ69.46ppm和δ60.41ppm。其中C1的化学位移向低场偏移，表明该残基在糖环O-1位置发生了取代，结合甲基化分析结果，推断糖残基A为-α-D-Glcp-(1→。

糖残基B：异头信号δ5.33/99.72ppm(H1/C1)表明残基B为α-构型的葡萄糖残基。糖残基B的H2-H6化学位移为δ3.58ppm、δ3.78ppm、δ3.59ppm、δ3.38ppm和δ3.81ppm，C2～C6的化学位移依次为δ69.48ppm、δ71.08ppm、δ76.84ppm、δ70.84ppm和δ60.06ppm。其中C1和C4的化学位移向低场偏移，表明该残基在糖环O-1和O-4位置发生了取代，结合甲基化分析结果，推断糖残基B为→4)-α-D-Glcp-(1→。

糖残基C：异头信号δ5.29/99.55ppm(H1/C1)表明残基C为α-构型的葡萄糖残基。糖残基C的H2-H6化学位移分别归属为δ3.52ppm、δ3.79ppm、δ3.66ppm、δ3.41ppm和δ3.90ppm，C2～C6的化学位移依次为δ73.26ppm、δ79.96ppm、δ71.44ppm、δ73.76ppm和δ59.99ppm。其中C1和C3的化学位移向低场偏移，表明该残基在糖环O-1和O-3位置发生了取代。结合甲基化分析结果，结合含量推断糖残基C为→3)-α-D-Glcp-(1→。

糖残基D：异头信号δ4.44/102.70ppm(H1/C1)表明残基D为β-构型的葡萄糖残基。糖残基D的H2-H6化学位移分别归属为δ3.26ppm、δ3.58ppm、δ3.41ppm、δ3.88ppm和δ3.91ppm(3.67ppm)，C2～C6的化学位移依次为δ73.15ppm、δ71.57ppm、δ77.04ppm、δ73.20ppm和δ65.68ppm。其中C1、C4和C6的化学位移向低场偏移，表明该残基在糖环O-1、O-4和O-6位置发生了取代，结合甲基化分析结果，推断糖残基D为→4,6)-β-D-Glcp-(1→。

糖残基E：异头信号δ4.59/103.00ppm(H1/C1)表明残基E为β-构型的葡萄糖残基。糖残基E的H2-H6化学位移分别归属为δ3.21ppm、δ3.56ppm、δ3.44ppm、δ3.87ppm和δ4.10ppm，C2～C6的化学位移依次为δ73.40ppm、δ78.27ppm、δ70.57ppm、δ70.34ppm和δ68.34ppm。其中C1、C3和C6的化学位移向低场偏移，表明该残基在糖环O-1、O-3和O-6位置发生了取代，结合甲基化分析结果，推断糖残基E为→3,6)-β-D-Glcp-(1→。

糖残基F：异头信号δ5.04/96.12ppm(H1/C1)表明残基F为α-构型的葡萄糖残基。糖残基F的H2-H6化学位移分别归属为δ3.51ppm、δ3.66ppm、δ3.90ppm、δ3.79ppm和δ3.58ppm，C2～C6的化学位移依次为δ78.50ppm、δ68.02ppm、δ71.50ppm、δ73.15ppm和δ60.72ppm。其中C1和C2的化学位移向低场偏移，表明该残基在糖环O-1和O-2位置发生了取代，结合甲基化分析结果，推断糖残基F为→2)-α-D-Glcp-(1→。

糖残基G：异头信号δ5.16/102.29ppm(H1/C1)表明残基G为α-构型的葡萄糖残基。糖残基G的H2-H6化学位移分别归属为δ3.50ppm、δ4.09ppm、δ3.54ppm、δ3.89ppm和δ3.77ppm，C2～C6的化学位移依次为δ79.23ppm、δ74.86ppm、δ73.26ppm、δ69.38ppm和δ66.07ppm。其中C1、C2和C6的化学位移向低场偏移，表明该残基在糖环O-1、O-2和O-6位置发生了取代，结合甲基化分析结果，推断糖残基G为→2,6)-α-D-Glcp-(1→。

根据LJP中各糖残基¹³C和¹H的化学位移(表3)，结合HMBC谱图(图6D)分析其中存在结构和连接方式：糖残基B-C1与残基B-H4存在交叉峰δ99.72/3.59ppm。由于HMBC谱交叉峰信号比较微弱，进一步结合NOESY谱图(图6B)判断推测该多糖中各残基的连接顺序，糖残基A-H1与残基D-H6存在交叉峰δ4.90/3.91ppm，与残基E-H3存在交叉峰δ4.90/3.56ppm，与残基G-H2存在交叉峰δ4.90/3.50ppm。糖残基B-H1与残基B-H4存在交叉峰δ5.33/3.59ppm，与残基G-H6存在交叉峰δ5.33/3.87ppm。糖残基C-H1与残基C-H3存在交叉峰δ5.29/3.79ppm，与残基F-H2存在交叉峰δ5.29/3.51ppm。糖残基D-H1与残基C-H3存在交叉峰δ4.44/3.79ppm，与残基D-H4存在交叉峰δ4.44/3.41ppm。糖残基E-H1与残基D-H4存在交叉峰δ4.59/3.41ppm。糖残基F-H1与残基B-H4存在交叉峰δ5.04/3.59ppm。糖残基G-H1与残基E-H6存在交叉峰δ5.16/4.10ppm。

表3.¹H NMR和¹³C NMR检测LJP中主要残基的化学位移

结合样品甲基化/键合结构信息可知，该多糖的主链主要是→4)-α-D-Glcp-(1→与少量→2)-α-D-Glcp-(1→、→2,6)-α-D-Glcp-(1→、→3,6)-β-D-Glcp-(1→、→4,6)-β-D-Glcp-(1→、→3)-α-D-Glcp-(1→连接而成，α-D-Glcp-(1→连接在→2,6)-α-D-Glcp-(1→的O-2、→3,6)-β-D-Glcp-(1→的O-3和→4,6)-β-D-Glcp-(1→的O-6形成支链。因此综合一维核磁和二维核磁信息分析，推断出LJP主链可能的结构如下结构式所示。

功效试验例2 LJP调控草酸钙的结晶

在Tris-HCl缓冲液(包含10mM的Tris-HCl和90mM的NaCl，pH＝7.4)中配制浓度为10mM的CaCl₂和1mM的Na₂C₂O₄溶液。在200mL的烧杯中加入50mL含有不同浓度LJP的10mM的CaCl₂溶液，随后在快速搅拌下加入50mL浓度为1mM的Na₂C₂O₄溶液，使CaCl₂和Na₂C₂O₄的最终浓度分别为5mM和0.5mM，LJP的最终浓度为0，0.04，0.2，0.8，1.6，2.4mg/mL。持续搅拌1h后，静置过夜。收集制备的CaOx晶体，并通过酒精和蒸馏水反复清洗后，离心，置于恒温箱中干燥24h。使用扫描电子显微镜(SEM)观察制备的晶体的形态和结构。制备的晶体的X射线粉末衍射(XRD)图样是用Cu-Kα辐射在5°至60°的2θ范围内以每分钟8°的扫描速度记录。傅立叶变换红外光谱(FT-IR)分析是用KBr圆片在4000cm^-1至400cm^-1区域进行。

结果：

LJP对草酸钙的结晶调控：

我们通过体外化学模拟探究了LJP对草酸钙形貌、尺寸、晶型等性质的影响。扫描电子显微镜结果显示(图7A)，在不添加LJP调控的情况下，形成的草酸钙主要呈六角菱形形貌，尺寸约为5μm。添加LJP后，形成的CaOx形貌发生明显的变化，逐渐由六角菱形转变为小尺寸的片层堆积的中间凹陷的六角菱形，尺寸减小到2.5μm左右。由XRD的结果可以看出，随着LJP浓度的增加，(101)/(020)晶面比值逐渐增大。

此外，随着LJP浓度的升高，形成晶体的晶相也发生了改变。当LJP浓度升至0.2mg/mL时，即出现了四角双锥形貌的COD晶体，且随着LJP浓度的升高，形成的COD晶体数量越多。在XRD的结果中(图7B)，也可以看出LJP浓度为0.2mg/mL时，出现了明显的指示COD晶型的(103)、(213)晶面；如图7C所示，同时在FT-IR图的谱指纹区中也看出COD晶体的916cm^-1衍射峰随着LJP浓度的增加逐渐增强。

功效试验例3细胞实验

1.细胞培养和分组

HK-2、NK-49F和NRK-52E细胞在添加10％胎牛血清和青霉素-链霉素抗生素的DMEM或DMEM-F12培养基中培养。然后将细胞置于37℃和5％ CO₂的恒温培养箱中培养。细胞分为以下几组a)正常对照组：其中仅加入无血清培养基，培养24小时；b)LJP对照组：加入含80μg/ml的LJP无血清培养基，培养24小时；c)COM损伤组：加入含200μg/ml草酸钙晶体的无血清培养基，培养24小时；d)LJP保护组：加入含80μg/ml的LJP和200μg/ml草酸钙晶体混合共同培养24小时。

2.细胞活力检测

1)不同浓度LJP对HK-2、NK-49F、NRK-52E细胞活力的影响

HK-2、NK-49F和NRK-52E细胞悬浮液在96孔板中铺板密度为8000个/孔，细胞贴壁长至汇合度70％时，去除培养基后用PBS缓冲液洗3遍。将细胞分成如下组：a)正常对照组；b)LJP保护组：分别在各细胞系中加入含有不同浓度(20、40、60、80、100、120、150、300、500μg/mL)LJP的无血清培养基100μL，并在5％CO₂湿润的环境中于37℃温育24小时。达到作用时间后，将培养基更换为新鲜的无血清培养基，并向每个孔中加入10μL CCK-8，并在37℃下孵育2小时，使用酶标记仪在450nm处测量OD值，检测各组细胞活力变化。

2)不同浓度COM晶体对HK-2细胞活力的影响

细胞分为正常对照组及COM损伤组，损伤组分别加入不同浓度(25、50、100、150、200、250、300、350、400μg/mL)的COM溶液损伤HK-2细胞24小时，待各组达到作用时间后，将培养基更换为新鲜的无血清培养基，并向每个孔中加入10μL CCK-8，并在37℃下孵育2小时，使用酶标记仪在450nm处测量OD值，检测各组细胞活力变化。

3)LJP对损伤HK-2细胞保护能力检测

实验分组为：a)正常对照组；b)损伤组：加入含200μg/ml草酸钙晶体的无血清培养基，培养24小时；c)LJP保护组：将不同浓度(10、20、40、60、80、100、120、150μg/ml)的LJP溶液和200μg/ml草酸钙晶体与细胞共培养24小时，达到作用时间后，将培养基更换为新鲜的无血清培养基，并向每孔中加入10μL CCK-8，37℃下孵育2小时，使用酶标记仪在450nm处测量OD值，检测各组细胞活力变化。

结果：

LJP提升细胞的活力：

为了检测LJP在不同类型肾脏细胞中的安全性，我们使用不同浓度(20-500μg/mL)的LJP处理HK-2、NK-49F、NRK-52E细胞24h，通过CCK-8法检测细胞活力的改变(图8A-C)。LJP在500μg/mL浓度下时对3种类型的肾细胞表现出良好的安全性。

我们进一步探究了不同浓度COM对HK-2细胞活力的影响。结果表明细胞活力与nano-COM的浓度成负相关，细胞活力随着晶体浓度增大而降低，其中浓度在200μg/mL时细胞活力降至51％(P＜0.0001，图8D)。为了探究LJP对HK-2细胞的保护作用，我们通过200μg/mL的nano-COM晶体对细胞进行损伤处理24h，构建损伤的细胞模型。在不同浓度的LJP保护下，细胞的损伤得到有效抑制，浓度为80μg/mL的LJP保护组的细胞活力已恢复至91％(图8E)，表明LJP在较低浓度下即对肾细胞具有良好的保护作用。

乳酸脱氢酶(LDH)释放是反映细胞膜完整性的重要指标。nano-COM损伤组的LDH水平较正常对照组显著升高(P<0.0001)，LJP保护组LDH释放水平显著下降(图8F)，说明LJP能明显抑制nano-COM导致的LDH的释放(P<0.0001)，有效减轻nano-COM引起的细胞膜的破坏，利于维持细胞膜的完整性。

透射电子显微镜是观察细胞损伤和晶体粘附和内吞的重要手段。我们发现nano-COM处理组的细胞表面粘附有大量晶体，粘附的晶体严重聚集，且大量的晶体被内吞到细胞内，导致线粒体数量减少，肿胀，嵴缩短，细胞核变形。

在LJP的保护下，细胞表面黏附的晶体明显减少，同时内吞的晶体数量也显著下降，线粒体形态得到有效恢复，接近于正常组的细胞(图8G)。

功效试验例4动物实验

4.1 LJP的荧光标记

称取20mgLJP溶于水中，与吲哚菁绿(ICG)按10：1混合，室温下避光搅拌反应过夜。透析处理后，向溶液中加入无水乙醇至80％浓度，沉淀析出，离心，去上清，得到LJP-ICG复合物。加dd水重新溶解多糖，向溶液中加入无水乙醇至80％浓度，醇沉，离心，去上清，重复3遍。获得LJP-ICG复合物，避光保存。

4.2 LJP的体内代谢检测

通过小动物成像系统观察LJP在正常小鼠和结石模型小鼠体内分布的差异。动物实验采用6-8周龄雄性C57BL/6小鼠。正常组：正常小鼠每天腹腔注射200μL生理盐水，持续1周。随后腹腔注射LJP-ICG，剂量为200mg/kg体重。乙醛酸结石模型组：小鼠腹腔注射乙醛酸(GA)70mg/kg/d，持续1周，建立结石模型。随后，以200mg/kg体重的剂量腹腔注射LJP-ICG。利用小动物成像系统在2、4、8、24和48小时检测小鼠以及小鼠各脏器的荧光表达情况。将收集的肾脏进行冰冻包埋，并制作冰冻切片，通过免疫荧光染色对肾脏内肾小管上皮标志物CK-18荧光染色并置于荧光显微镜下观察。

4.3 LJP的体内治疗评估

采用6-8周龄SD雄性大鼠(Sprague-Dawley male rats)，体重范围在180g-200g之间，购自广东省医学实验动物中心。大鼠随机进行分组，具体分组为：正常对照组(Control组)：自由正常饮食，分别于第一周和第三周的前三天进行对照给药，生理盐水2ml/只/天灌胃；肾结石模型组(EG组)：正常饲料喂养,自由饮用1％乙二醇28天，并于实验的第一、三周的前三天予以1％氯化铵2mL/天/只灌胃，连续喂养28天；LJP保护组(EG+LJP组)：与造模组作相应处理的同时，每天予以腹腔注射50、200mg/kg.wt的LJP溶液，连续注射28天。所有大鼠均可自由进食常规食物，并在实验期间保持在25℃和明暗循环下。所有程序均按照中华人民共和国卫生部动物管理规定执行，并经广州医科大学第一附属医院动物伦理委员会批准。

4.4动物组织H&E染色以及肾小管损伤评分

将大鼠肾脏分离切片，4％多聚甲醛固定，然后包埋在石蜡中。制备肾脏的最大面切片并用苏木精-伊红染料进行染色，随后通过PathScope^TM4S扫描仪(DigiPath,USA)进行观察。并对大鼠肾小管损伤情况进行了病理评分，具有以下组织病理学变化的肾小管被认为受损：刷状缘缺失、肾小管扩张和破裂、管型形成和细胞溶解。以盲法检查组织损伤，并以损伤小管的百分比评分：0表示无损伤；1表示<25％；2表示25％～50％；3表示50％～75％；4表示>75％。

4.5 Pizzolato法染色观察CaOx晶体沉积

将肾脏的石蜡切片置于60℃烤箱1-2h，添加二甲苯透明5min，依次放入乙醇(梯度为100％，100％，90％，80％，70％)各2min，ddH₂0洗涤2次，每次3min,将5％的硝酸银溶液与30％过氧化氢溶液等体积混合，将混合液滴加在肾组织上，放置在60W灯光下照射30min，去除残余混合液，放入ddH₂0洗涤2次，每次3min，将核固红染料滴加在肾组织切片上，染色25s，放入ddH₂0洗涤2次，每次3min，梯度酒精脱水，依次放入乙醇(梯度为70％，80％，90％，100％，100％)各2min，随后放入二甲苯中浸泡2遍，每遍3min，中性树脂封片，盖上盖玻片，室温干燥，随后通过组织扫描仪观察晶体形成情况，使用ImageJ对肾组织Ca0x晶体定量并统计。

4.6统计分析

采用SPSS19.0统计软件进行分析，用Graph pad Prism软件对实验结果进行可视化作图。多组比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P＜0.05为差别有统计学意义。*表示P＜0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P＜0.0001。

结果：

LJP在体内的生物分布和代谢情况：

我们通过小动物成像系统对ICG标记的LJP在小鼠体内的分布进行了观察，获得了LJP在体内可视化的生物分布和代谢情况。全身成像结果显示，荧光信号主要分布在腹部，4h时荧光最强，并随着时间的延长逐渐减弱，在24h时基本代谢完全(图9A)。为了进一步了解LJP在体内的具体分布，将各脏器离体观察，可以在肾脏，膀胱，肝脏，脾脏和胃肠部观察到荧光信号，这表明药物通过胃肠途径吸收后在肝脏和肾脏富集，肾脏中药物荧光信号在4h达到最强，随后逐渐衰减(图9B&9E)。

通过观察ICG-LJP荧光复合物在正常小鼠和乙醛酸造模小鼠的体内分布差异，我们发现在给药4h后结石造模组的小鼠肾脏中存在更高强度的荧光信号，这表明LJP对损伤肾脏具有高度敏感性，可以更多的富集在损伤肾脏中(图9C&9F)。在肾脏的冰冻切片的免疫荧光染色结果中(图9D&9G)，我们可以看到LJP-ICG在肾脏中的荧光信号与肾小管分布高度重合，说明LJP能有效进入肾小管，并且最后通过尿液排出体外。

LJP抑制大鼠肾内草酸钙晶体沉积和肾损伤：

我们通过乙二醇诱导大鼠肾脏内草酸钙结晶模型研究了LJP对草酸钙沉积及细胞损伤的抑制作用。HE染色结果显示(图10A)，对照组大鼠肾脏大小、形态良好，肾小管排列紧密整齐,肾小管上皮细胞形态正常；结石造模组肾脏有大量晶体沉积，肾小管有不同程度的肿胀和结构破坏。在50、200mg/kg体重的LJP的保护下，肾脏内的CaOx晶体沉积量、肾小管的破坏情况都随LJP浓度的升高而显著降低。与对照组相比，模型组大鼠的肾小管损伤评分显著升高，损伤及炎性浸润程度严重；而在LJP的保护下，肾小管的损伤评分随LJP浓度的升高明显降低(图10B)。肾脏内CaOx沉积情况进一步通过Pizzolato染色进行了观察(图10C-D)。对照组大鼠肾脏内未见晶体沉积，造模组肾脏内有大量棕黑色晶体沉积。LJP在大鼠体内抑制了CaOx结晶的形成和聚集，有效缓解了高草酸引起的肾损伤，降低了结石形成的风险。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种海金沙多糖的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

3)Sephacryl S-400HR色谱柱进行凝胶色谱分离和纯化；

4)用冻干法对样品进行干燥收集。

2.如权利要求1所述的海金沙多糖的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤1)具体包括以下步骤：

1.1)将新鲜干燥的海金沙成熟孢子样品洗净、干燥、粉碎；过筛后的粉末用蒸馏水提取多糖；过滤上清液后浓缩，用无水乙醇沉淀，离心；

1.2)将步骤1.1)得到的沉淀溶于水，用Sevag法进行脱蛋白，然后用石油醚试剂去除脂肪，用大孔树脂AB-8去除色素，然后通过蒸馏水进行透析、浓缩和冷冻干燥，得到粗多糖。

3.如权利要求2所述的海金沙多糖的提取纯化方法，其特征在于，所述用蒸馏水以1:10的比例(w/v)提取多糖，提取两次，每次45分钟；

所述浓缩使用旋转蒸发仪，温度为60℃；

所述无水乙醇的用量为4倍体积；所述离心时间为10分钟；

所述透析采用的透析袋的截取分子量为3000Da。

4.如权利要求1所述的海金沙多糖的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤2)具体包括以下步骤：

将步骤1)得到的粗多糖置于DEAE-纤维素柱上，用蒸馏水进行洗脱，然后依次加入0.1、0.2和0.3mol/L NaCl；收集所选的主要馏分。

5.如权利要求4所述的海金沙多糖的提取纯化方法，其特征在于，所述DEAE-纤维素柱为26mm×400mm；所述蒸馏水以4mL/min的速度依次进行洗脱。

6.如权利要求4所述的海金沙多糖的提取纯化方法，其特征在于，所述收集所选的主要馏分还包括通过苯酚-硫酸法在490nm波长下检测其多糖含量的步骤。

7.如权利要求1所述的海金沙多糖的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤3)具体包括以下步骤：

8.如权利要求7所述的海金沙多糖的提取纯化方法，其特征在于，所述Sephacryl S-400HR色谱柱为AKTA explorer系统，26mm×1000mm；

所述用蒸馏水以1.0mL/min的流速进行洗脱；

所述透析为用透析管以蒸馏水透析72小时。

9.如权利要求1-8任一项所述的方法制备得到的海金沙多糖在制备防治泌尿系结石药物中的应用。

10.如权利要求9所述的海金沙多糖在制备防治泌尿系结石药物中的应用，特征在于：将海金沙多糖制备成口服液，其工艺方法包括以下步骤：