CN118059091A - 复合烯二炔作为广谱抗冠状病毒药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种复合烯二炔作为广谱抗冠状病毒药物的应用。所述复合烯二炔中包含两个关键部分：烯二炔部分用于降解冠状病毒的关键性蛋白(包括S蛋白和/或N蛋白)，(多)硫酸盐部分用于为复合物提供足量的负电荷，使其无法进入正常细胞，从而降低化合物的细胞毒性，提高其使用安全性。本发明进一步提供了一系列复合烯二炔的示例，它们均由马来酰亚胺基烯二炔和单(多)硫酸盐通过适当的化学键合方式复合在一起。在一些方面的研究中发现，所述复合烯二炔在宿主细胞外降解冠状病毒的关键性蛋白，并对包括SARS‑CoV‑2在内的多种冠状病毒发挥明显抑制作用。与此同时，含有多硫酸盐的烯二炔表现出非常低的细胞毒性。
Description
技术领域
本发明属于药学和病毒学领域，更具体地，本发明涉及复合烯二炔作为广谱抗冠状病毒药物的应用。
背景技术
烯二炔类化合物具有独特的分子结构，在本领域中已被研究和用作抗肿瘤抗生素。这类化合物通过Bergman环化或者Myers-Saito环化反应可以生成苯基(或者苯基-苄基)双自由基，形成的自由基夺取DNA链上的H原子，从而导致DNA的单链或者双链断裂(Chemical Reviews.2007,107(7),2861-2890)。一些天然的烯二炔抗肿瘤抗生素如Dynemicins，Calicheamicins，Esperamcins，C1027等，其抗癌活性比阿霉素高1000倍以上。这些天然的烯二炔大都是从微生物的代谢中分离得到的。天然烯二炔很难被高效制备，或者，即使能制备出不稳定的烯二炔，鉴于其易于发生变化且结构复杂，面临很大的挑战。人工合成的烯二炔因其发生此类环化反应的条件相比天然烯二炔来说更为苛刻，限制了它们在生物学上的应用。
烯二炔的人工合成工作在本领域中已有所研究。除了合成天然烯二炔抗生素的同系物外，人工合成的烯二炔一部分集中在光致引发反应，这些反应需要紫外光的照射；一部分主要通过形成过渡金属配合物来促进环化反应。
在医药领域中，烯二炔类化合物一般被应用于肿瘤的抑制(Angewandte ChemieInternational Edition.2019,58(33),11206-11241)，而其可否应用于其它类型的适应症，在本领域中鲜有报道。
冠状病毒是一类直径约100nm的超微观传染因子。它们能感染多种脊椎动物(包括人类)并引发疾病。冠状病毒在人类中多经呼吸道感染并引起多组织器官的疾病，其中HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1一般引起人类上呼吸道感染，而SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2则可侵犯多系统，并可导致死亡。除此之外，冠状病毒也能感染猪、鸡、狗等多种动物并导致其发病。
冠状病毒的结构包含遗传物质RNA以及来自于宿主细胞的脂质膜和四种结构蛋白，即棘突蛋白(Spike)、包膜蛋白(Envelope)、膜蛋白(Membrane)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid)。冠状病毒入侵宿主细胞的过程大致可以归纳为：吸附-穿入-脱壳-生物合成-组装成熟与释放等五个步骤。首先冠状病毒通过棘突蛋白与宿主细胞结合，进入细胞内部并劫持细胞中的蛋白质合成系统，制造出子代病毒所需的蛋白、RNA，最后通过内质网膜系统组装出子代病毒。子代病毒离开原宿主细胞进一步感染新的宿主细胞。为此，抗病毒药物的设计合成可以针对此周期中的任意环节。
冠状病毒在每个复制周期中均存在一定的突变概率。突变的累积可能产生具有新的复制特性或传染特性的病毒株，这种特点使得“点对点”模式的药物设计和应用受到很大的影响。为此，发明一类能适用于广泛的冠状病毒，包括每种病毒的各种突变株的广谱抗病毒药物具有重要的价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复合烯二炔作为广谱抗冠状病毒药物的应用。
在本发明的第一方面，提供复合烯二炔在制备抑制冠状病毒的组合物(包括药物)或药盒中的用途；所述复合烯二炔包括相互连接的两个部分：马来酰亚胺基烯二炔，以及单/多(包括2及2以上)硫酸盐部分。
在一种或多种优选实施方式中，所述冠状病毒为表达N蛋白和/或S蛋白的冠状病毒(包括N蛋白介导的感染机制或毒性机制、S蛋白介导的感染机制或毒性机制)。
在一种或多种优选实施方式中，所述冠状病毒包括α、β、γ和δ属冠状病毒。
在一种或多种优选实施方式中，所述冠状病毒包括(但不限于)：HCoV-229E株、HCoV-OC43株、HCoV-NL63株、SARS-CoV-2株、SARS-CoV株、MERS-CoV株、HCoV-HKU1株、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)株、猪流行性腹泻病毒(PEDV)株等。
在一种或多种优选实施方式中，所述复合烯二炔中，所述马来酰亚胺基烯二炔部分降解冠状病毒蛋白(关键性蛋白)；较佳地降解S蛋白和/或N蛋白。
在一种或多种优选实施方式中，所述单/多硫酸盐部分提供负电荷，阻止该复合烯二炔进入正常细胞，降低细胞毒性。
在本发明的另一方面，提供一种复合烯二炔，其包括相互连接的两个部分：马来酰亚胺基烯二炔部分，以及单/多(包括2及2以上)硫酸盐部分；较佳地，所述马来酰亚胺基烯二炔部分降解冠状病毒蛋白(关键性蛋白，如S蛋白和/或N蛋白)；所述单/多硫酸盐部分提供负电荷，阻止该复合烯二炔进入正常细胞，降低细胞毒性。
在一种或多种优选实施方式中，所述复合烯二炔为式(I)所示化合物或其异构体、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐(包括钠盐、钾盐等)，
其中，X为CO或不存在；
U为CO或不存在；
V为CO或不存在；W为(CR7R8)j，该链中存在或不存在O；
Y为(CR9R10)k，该链中存在或不存在O；
R1为H，O；可选地能形成分子内吡喃环或呋喃环；
R6为H，O；可选地能形成分子内吡喃环或呋喃环；
R2或R3各自独立地选自(但不限于)H，CH3，NH2，R，OR’，C(O)R”，带有取代或非取代基团的烷基(如C1-C4烷基，包括C2，C3)、不饱和烷基、多不饱和烷基，芳基，芳杂基，(CR1OSO3H)i；
R4或R5各自独立地选自(但不限于)H，CH3，NH2，R，OR’，C(O)R”，带有取代或非取代基团的烷基(如C1-C4烷基，包括C2，C3)、不饱和烷基、多不饱和烷基，芳基，芳杂基，(CR6OSO3H)l；
R0、R7、R8、R9或R10各自独立地选自(但不限于)H，CH3，NH2，R，
OR’，C(O)R”，带有取代或非取代基团的烷基(如C1-C4烷基，包括C2，
C3)、不饱和烷基、多不饱和烷基，芳基，芳杂基；
R、R’、R”各自独立地选自(但不限于)H，O，CH3，卤素，C1-C10烷基，芳基，(CH2)nNH2，C(O)(CH2)nNH2；
m为选自0-6的整数(如1，2，3，4，5)，当m为0时，相应括号内基团被R4取代；
n为选自0-6的整数(如1，2，3，4，5)，当n为0时，相应括号内基团被R2取代；
i,j,k,l,p,q各自独立地选自0-10的整数(如1，2，3，4，5，6，7，8，9)。
在一种或多种实施方式中，所述的取代基团包括(但不限于)1-3个选自下组的基团：C1-10的烷基，C2-10链烯基，C2-10链炔基，卤素，-COORa，-NRaRb，-ORa，-CORa，-CONRaRb，＝O，-SRa，-SO3Ra，-SO2NRaRb，-SORa，SO2Ra，-NO2，-CN；其中Ra，Rb独立地选自：氢，C1-10烷基，C2-10链烯基，C2-10链炔基。
在一种或多种优选实施方式中，所述的化合物(盐)包括：
在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，所述的药物组合物包含：前面所述的复合烯二炔；和药学上可接受的载体。
在一种或多种实施方式中，所述的药物组合物的剂型包括：粉剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂、控速释剂、注射剂、输液剂、混悬剂。
在一种或多种实施方式中，所述的式(I)所示化合物或其异构体、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐在药物组合物中是有效量的。
在一种或多种实施方式中，所述的有效量按照重量含量为0.01-50％，例如但不限于，0.01-5％、0.03-3％、0.05-1％、20-30％、40-50％等；更佳地为0.03-30％；进一步更佳地为0.05-10％。
在本发明的另一方面，提供一种药盒，所述的药盒中包括：所述的复合烯二炔；或所述的药物组合物。
在本发明的另一方面，提供一种抑制冠状病毒的方法，包括：以所述的复合烯二炔抑制冠状病毒；或以所述的药物组合物抑制冠状病毒。
在一种或多种实施方式中，所述方法为“非治疗性”的方法，不以疾病的治疗为直接目的。
在一种或多种实施方式中，携带病毒的对象包括：体外细胞，细胞培养物，分离的细胞，附着所述病毒或携带病毒的细胞的物质(如容器、场所等等)、人、非人哺乳动物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、烯二炔化合物EDY-A，EDY-B在生理温度下产生自由基的自由基捕获电子顺磁共振谱图。
图2、烯二炔化合物EDY-A和其非硫酸盐化对照物的细胞摄入对比图(激光共聚焦，细胞用PI染色，烯二炔自带蓝色荧光)。
图3、EDY-A、EDY-B、EDY-C、EDY-D和EDY-E五种化合物对于冠状病毒HCoV-229E株的抑制作用分析。
图4、EDY-A、EDY-B、EDY-C、EDY-D和EDY-E五种化合物对于冠状病毒HCoV-OC43株的抑制作用分析。
图5、EDY-A、EDY-B、EDY-C、EDY-D和EDY-E五种化合物对于冠状病毒HCoV-NL63株的抑制作用分析。
图6、EDY-A、EDY-B、EDY-C、EDY-D和EDY-E五种化合物对于病毒SARS-CoV-2Omicron株的抑制作用分析。
图7、EDY-A、EDY-B、EDY-C、EDY-D和EDY-E五种化合物对于SARS-CoV-2的NP蛋白以及S蛋白的抑制作用。
图8、EDY-A抗SARS-CoV-2NP蛋白的时间-效应研究。
图9、维生素C抑制EDY-D对SARS-CoV-2蛋白的破坏作用实验研究。
图10、对照化合物MHC和THC对于SARS-CoV-2的N蛋白的抑制作用。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，揭示了一种复合烯二炔，所述复合烯二炔中包含两个关键部分：马来酰亚胺基烯二炔部分用于降解冠状病毒的关键性蛋白(包括S蛋白和/或N蛋白)，(多)硫酸盐部分用于为复合物提供足量的负电荷，使其无法进入正常细胞，从而降低化合物的细胞毒性，提高其使用安全性。本发明进一步提供了一系列复合烯二炔的示例，它们由马来酰亚胺基烯二炔和单(多)硫酸盐通过适当的化学键合方式复合在一起。在一些方面的研究中发现，所述复合烯二炔在宿主细胞外降解冠状病毒的关键性蛋白(包括S蛋白和/或N蛋白)，并对包括SARS-CoV-2在内的多种冠状病毒发挥明显抑制作用。与此同时，含有多硫酸盐的烯二炔表现出非常低的细胞毒性。
本文所用的术语“烷基”指直链或支链饱和的、含有1-10个碳原子(较佳地1-8个碳原子；更佳地1-6个或1-4个碳原子)的脂族烃类基团。例如，烷基包括但不限于甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，叔丁基。
术语“烷氧基”通常指的是通过一个氧原子连接的直链或支链烷烃基团，例如，甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、2-戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、正己氧基、2-己氧基、3-己氧基、3-甲基戊氧以及类似的基团。烷氧基通常有通过氧桥链接的1-6个碳原子。“短链烷氧基”通常指的是直链或支链烷氧基，其中烷基部分包括1-4个碳原子。
术语“链烯基”或“烯基”包括含有至少一个碳碳双键(C＝C)和2-10个碳原子(较佳地2-8个碳原子，更佳地2-6个或2-4个碳原子)的直链和支链烃基。例如，烯基包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基。
术语“链炔基”或“炔基”包括含有至少一个碳碳三键(C≡C)和2-10个碳原子(较佳地2-8个碳原子，更佳地2-6个或2-4个碳原子)的直链和支链烃基。例如，炔基包括但不限于乙炔基、2-丙炔基、2-丁炔基。
术语“环烷基”通常指的是含有3-12(如4、5、6、7、8、9、10、11)碳原子的饱和或部分不饱和的环状烷烃。例如，环烷基包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基和环辛基。环可以是饱和的，也可以含有一个或多个双键(即部分不饱和),但不是完全共轭的。
“芳基”包括：5-6元的碳芳香环，如，苯；双环，其中至少有一个环是碳芳香环，如，萘，茚和1，2，3，4-四氢喹啉；以及三环，其中至少有一个环是碳芳香环，如，芴。例如，芳基包括含5-6元的碳芳香环并一个5-7元杂环，这个杂环包含一个或多个选自氮、氧和硫的杂原子，条件是连接点在碳芳香环上。
术语“芳杂基”或“杂芳基”通常指的是：5-8元的单环芳烃，含一个或多个选自N、O和S的杂原子，如1-4个杂原子，在一些实施方案中，为1-3个杂原子，环上其它原子是碳原子；8-12元的双环芳烃，含一个或多个选自N、O和S的杂原子，如1-4个杂原子，在一些实施方案中，是1-3个杂原子，环上其它原子是碳原子；其中至少有一个环是芳香环；或11-14元的三环芳烃，含一个或多个选自N、O和S的杂原子，如1-4个杂原子，在一些实施方案中，是1-3个杂原子，环上其它原子是碳原子；其中至少有一个环是芳香环。例如，芳杂基包括一个5-7元的杂芳香环并一个5-7元的环烷基。对于这样的双环并起来的杂芳基，其中只有一个环含有一个或多个杂原子，链接位点在杂芳香环上。芳杂基的例子包括但不限于(连接位点优先标记为1)：2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2,3-吡嗪基、3,4–吡嗪基、2,4-嘧啶基、3,5-嘧啶基、1-吡唑基、2,3-吡唑基、2,4–咪唑基、异噁唑基、噁唑基、噻唑、噻二唑、四唑基、噻吩基、苯并噻吩基、呋喃基、苯并呋喃基、苯并咪唑啉基、二氢吲哚基、哒嗪基、三氮唑基、喹啉基、吡唑基和5,6,7,8-四氢异喹啉基。
术语“卤素”包括氟、氯、溴或碘；“卤代”包括氟代、氯代、溴代、碘代。
术语“杂环”通常指的是通常为3-7元的单环脂肪环，其包括至少2个碳原子和1-3个杂原子，杂原子独立的选自氧、硫和氮，以及包括前面所述至少一个杂原子的组合。“杂环”也包括一个5-7元含一个或多个氮、氧或硫杂原子的杂环并一个5-6元的碳芳香环，条件是连接位点在杂环上。杂环可以是饱和的，也可以有一个或多个双键(即部分不饱和)。杂环可能被氧代取代。与其他原子的链接位点可以是碳原子或杂原子。“杂环”不同于前面所述的“杂芳基”。相应的杂环包括，例如(连接位点优先标记为1)、1-吡咯啉基,2-吡咯啉基、2，4-咪唑烷基、2，3-吡唑烷基、1-哌啶基,2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基和2，5-哌嗪基。吗啉基也是这样设计的，包括2-吗啉基和3-吗啉基(氧原子优先记为1)。取代的杂环基也包括有一个或一个以上氧代基团的环，例如，N-氧哌啶基、N-氧吗啉基、1-氧代-1-硫代吗啉基和1,1-二氧代-1-硫代吗啉基。
本发明中，烷基、链烯基、链炔基、苯基、杂环、烷氧基等均可以含有或不含有取代基。例如，它们可以被含有1-6个(更佳地1-3个)选自(但不限于)：C1-10的烷基，C2-10链烯基，C2-10链炔基，卤素，-COORa，-NRaRb，-ORa，-CORa，-CONRaRb，＝O，-SRa，-SO3Ra，-SO2NRaRb，-SORa，SO2Ra，-NO2，-CN的基团所取代(其中Ra，Rb可以选自：氢，C1-10烷基，C2-10链烯基，C2-10链炔基等)。本领域人员应理解，适当的情况下，这些烷基、链烯基、链炔基、烷氧基、苯基等还可以进一步地被取代。
“取代的”通常是指在特定的原子或基团中的一个或多个氢原子被从指定范围选出的基团替换，前提是特定原子的价态正常。当取代基是氧代(例如：＝O)即意味着指定原子上的两个氢被取代了。只要组合能得到稳定的化合物或有用的合成中间体，取代基的组合和/或变化是允许的。稳定的化合物或稳定的结构意味着它稳定到能从反应混合物中分离出来，并至少在随后的制剂过程中有实用价值。除特别说明，取代基被命名进母核结构。例如，简单的说，当环烷基烷基是作为一个可能的取代基，母核上这个取代基的连接位点在烷基上。
“被一个或多个基团取代”可以是在特定的原子或基团中的两个氢原子分别被指定范围的基团中选出的相同或不同的基团替换。也可以是在特定的原子或基团中的三个氢原子分别被指定范围的基团中选出的相同或不同的基团替换。也可以是指在特定的原子或基团中的四个氢原子分别被指定范围的基团中选出的相同或不同的基团替换。
“任选的(optional)”或“任选地(optionally)”的意思是指后续描述的事件或情形可能会也可能不会发生，并且该描述包括事物或情形发生和不发生两种情况。例如，“被任选取代的烷基”包括下文定义的“烷基”和“取代烷基”。关于任一基团包含一个或多个取代基，本领域一般技术人员均可理解，但不包括不切实际的高位阻、合成上不可行的和(或)内在不稳定的取代基。
所述化合物包括但不限于：它们的光学异构体，如对映异构体和非对映异构体，对映异构体的混合物，包括外消旋体，非对映异构体的混合物，及其他本领域技术人员通过常规实验能够合成的混合物。在这些情况下，单一对映体或非对映体，例如具有光学活性的结构，可通过不对称合成或由外消旋混合物或非对映体混合物拆分得到。对于消旋混合物或非对映体混合物的拆分，可以用传统的方法分离，例如使用拆分试剂结晶；也可以用色谱法分离，例如手性高效液相色谱(HPLC)柱。另外，这类化合物包含Z-和E-型(或顺-和反-式)的含C＝C双键化合物。本文所述化合物存在各种互变异构体，术语“化合物”包括该化合物的所有互变异构形式。这里化合物也包括其不同的晶体形式，包含多晶和包合物。同样，术语“盐”也包括了本领域技术人员通过常规实验能够合成的该化合物的盐的所有异构体、消旋体、其他混合物、Z-和E-型、互变异构体和晶体形式。
本文所用的术语“溶剂合物”表示携带有溶剂分子的化合物，例如，所述的溶剂合物可以是水合物。
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。
本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的式(I)化合物、异构体、溶剂合物、前体，或它们的药学上可接受的盐传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。
此外，如果所述的化合物是一种与酸形成的盐，其游离碱可以通过碱化该盐溶液获得。相反地，如果化合物是游离碱，则其盐特别是药学上可接受的盐可以通过由碱制酸的常规程序制得，即将游离碱溶于合适的有机溶剂后用酸处理。本领域一般技术人员可识别各种可能用来制备无毒的药学上可接受的盐的合成方法。
“溶剂化物”如“水合物”，是由溶剂和化合物互相作用形成。术语“化合物”，应该包括了化合物的溶剂化物(包括化合物的水合物)。同样，“盐”也包括了盐的溶剂化物(如盐的水合物)。合适的溶剂化物是药学上可接受的，例如水合物，它包括了单水合物和半水合物。
“螯合物”，是由化合物与金属离子在两个(或更多的)点配位而成。术语“化合物”应该包括化合物的螯合物。同样，“盐”也包括盐的螯合物。
“基团”，“基”或“片段”为同义词，用于代表功能基团或连接于某一根键的片段或其他分子片段。
术语“活性成分”表示一种具有生物活性的化学物质。在一些方案中，“活性成分”是一种具有医药效用的化学物质。
“处理”、“给予治疗”、“治疗”或“减缓”通常指的是给予医患有一种疾病、具有一种疾病的症状、或有易患一种疾病体质的个体所述的至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐，用以治愈、治疗、缓和、抒解、改变、医治、改善、改良或是影响一种疾病、一种的症状、或易患一种疾病的体质。在一些实施方案中，一种疾病是病毒感染疾病。
术语“有效量”通常指的是，所述至少一种化合物和/或至少一种药学上可接受的盐对于能有效“治疗”个体的一种疾病或不适的用量，此用量是安全的、不带来过多的毒性。本领域技术人员可以理解，有效量可以随着给药的途径、赋形剂的剂量、以及与其他药物的合用而变化。
术语“抑制”通常指的是一种生物活动或生物过程的基础活性的降低，所述的“抑制”通常是具有统计学意义的“抑制”。例如对于病毒量/病毒毒力/病毒量而言，显著下降至原有病毒量/病毒毒力/病毒量90％、80％、50％、30％、20％、10％、5％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.001％等，或完全抑制。
本发明中，提供了一类能够产生自由基(如基于MARACA机理产生的自由基去)破坏病毒蛋白复合烯二炔，所述复合烯二炔包括相互连接的两个部分：马来酰亚胺基烯二炔部分，以及单/多硫酸盐部分。所述马来酰亚胺基烯二炔部分降解冠状病毒蛋白；所述单/多硫酸盐部分提供负电荷，阻止该复合烯二炔进入正常细胞，降低细胞毒性。
作为本发明的优选方式，提供了一种如结构式(I)所示的复合烯二炔类化合物：
本发明还包括上述式(I)化合物的异构体、溶剂合物、前体，或它们的药学上可接受的盐，只要它们也具有与式(I)化合物具有相同或基本相同的功能。
所述的“药学上可接受的盐”包括但不限于与无机酸、有机酸、碱金属或碱土金属等反应生成的盐。这些盐包括(但不限于)：(1)与如下无机酸形成的盐：如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸；(2)与如下有机酸形成的盐，如乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸、马来酸、或精氨酸。其它的盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯，或其它常规的“前体药物”的形式。
化合物具有一个或多个不对称中心。所以，这些化合物可以作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、顺式或反式异构体存在。
所述的“化合物的前体”指当用适当的方法服用后，该化合物的前体在病人体内进行代谢或化学反应而转变成结构式(I)的一种化合物，或化学结构式(I)的一个化合物所组成的盐或溶液。
作为本发明的优选方式，所述的化合物包括以下的式(II)～(VI)的化合物，其中式(V)化合物是特别优选的。
本领域人员应理解，在得知了本发明化合物的结构以后，可通过多种本领域熟知的方法、利用公知的原料，来获得本发明的化合物，比如化学合成或从生物(如动物或植物)中提取的方法，这些方法均包含在本发明中。
合成的化合物可以进一步通过柱层析法、高效液相色谱法等方式进一步纯化。
本发明公开了一种人工合成的复合烯二炔类化合物在抗冠状病毒中的应用，该化合物的烯二炔和多阴离子结构单元为抗病毒的活性成分，两个单元分别通过破坏病毒结构成分和阻止病毒吸附细胞实现抗病毒作用。
本发明中，所述复合烯二炔类化合物能够产生自由基(如基于MARACA机理产生的自由基去)破坏病毒的蛋白。从而应理解，式(I)通式的、能够基于MARACA机理产生自由基的一类化合物可被应用于本发明中。
基于本发明人的新发现，本发明提供了式(I)所示的化合物或其异构体、溶剂合物、前体，或它们的药学上可接受的盐的用途，用于制备抑制冠状病毒的组合物、药物或药盒。
本发明人在研究中发现，本发明的式(I)复合烯二炔类化合物能够显著抑制冠状病毒，其具有广谱性，这在多种冠状病毒株中已经得以验证。本发明通过病毒空斑实验，在细胞水平用活病毒验证了复合烯二炔对季节性冠状病毒HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoV-OC43以及SARS-CoV-2Omicron的抑制作用，证明其可作为一种潜在的广谱抗冠状病毒药物。
冠状病毒主要结构蛋白包括棘突蛋白(S蛋白，S，Spike Protein)、包膜蛋白(E蛋白，E，Envelope Protein)、膜蛋白(M蛋白，M，Membrane Protein)、核衣壳蛋白(N蛋白，NP，Nucleocapsid Protein)。而在冠状病毒的四种结构蛋白中，S蛋白上的突变位点最多，也最关键。S蛋白由S1和S2两部分组成，其中由N端结构域(NTD)和受体结合域(RBD)组成的S1负责与人体细胞表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)结合，而S2主要负责与细胞膜的融合，完成遗传物质的释放。功能上，S蛋白的主要功能是与ACE2结合，让冠状病毒颗粒融合到细胞内部，进行复制，生产更多的下一代病毒颗粒。N蛋白(NP)在病毒感染宿主细胞后会大量表达，引起强烈的免疫反应。N蛋白的基因序列相对保守稳定；相比S蛋白，N蛋白上随着时间推移产生的突变更少。
本发明人分析了式(I)复合烯二炔类化合物的半数有效浓度(EC50)，其可被作为用于衡量对病毒的“攻击指数”，浓度越小代表其攻击力越强。EC50是指在体外试验中当50％的病毒被抑制时的药物浓度，其单位为mol/L。EC50通常敏感度高，重复性好，是反应药效强度的重要定量指标。对于药物开发而言，只有半数有效浓度相对低的情况下才可能在临床上被实施。根据本发明的实施例研究结果，本发明化合物具有低的EC50值。
本发明人分析了式(I)复合烯二炔类化合物的半数毒性浓度(CC50)，其可被作为用于衡量药物的“毒性指数”，浓度越高说明其毒性越低，CC50是指在体外试验中50％的宿主细胞被破坏时的药物浓度。宿主细胞可以是人体的正常细胞，该指数衡量药物在杀病毒的同时，对于宿主细胞的影响情况。根据本发明的实施例研究结果，本发明化合物具有高的CC50值，安全性好。
本发明人分析了式(I)复合烯二炔类化合物的“选择指数(SI)”，SI＝CC50/EC50，指数越高，则安全性和有效性越有保障，越值得选择。根据本发明的实施例研究结果，本发明化合物具有相对较高的SI值。
本发明的复合烯二炔类化合物的抑制病毒的作用，可被应用于非疾病治疗(如针对病毒感染患者的治疗)相关的方法中，例如，对于一些潜在可能存在病毒留存的物体表面/场所，利用本发明的化合物进行病毒抑制。
本发明还提供了一种药物组合物，含有：(a)有效量的式(I)所述的化合物、或其异构体、溶剂合物、前体，或它们的药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
在本发明所述的药物组合物中，式(I)所示化合物或其异构体、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐的含量是有效量。例如，可以含有按照重量比例为0.001-50％的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐。较佳的，所述的药物组合物含有按照重量比例为0.01-20％的式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物机体的剂型都是可以的。比如可选自：粉剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂、控速释剂、注射剂、输液剂、混悬剂。根据本发明的化合物所治疗的疾病类型，本领域人员可以选择方便应用的剂型。
从易于制备和储存的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。从易于给药的立场看，优选的药物组合物是静脉注射或雾化吸入。本发明的化合物或其药物组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。
式(I)化合物作为活性成分的有效施用剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明的化合物每天以约0.01-100mg/kg动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以1-3次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、化合物4的合成
合成化合物4的主要反应过程如下：
将化合物1(7.95g，47.90mmol)置于100mL圆底烧瓶中，加入冰乙酸(50mL)。待固体完全溶解后降温至0℃，向体系中缓慢加入化合物2(5mL，43.55mmol)。待雾消失后室温搅拌1h，再升温至120℃回流搅拌反应20h。通过TLC(正己烷：乙酸乙酯＝19:1)对反应进行跟踪。待反应完全后65℃旋蒸除去溶剂，经柱层析法(正己烷：乙酸乙酯＝19:1)分离得到的产物置于50℃真空烘箱中干燥过夜，得到8.5g白色固体化合物3，收率82％。1H NMR(400MHz,CD4O)δ3.37(s,2H),0.93(s,9H)；13C NMR(101MHz,CD4O)δ165.1,134.1,51.6,34.2,28.2；HRMS(EI),m/zcalcd.for C9H11Cl2NO2[M]+:235.0167；found 235.0170。
将化合物3(8.0g，34.1mmol)，碘化钠(20.5g，136.4mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入乙腈(100mL)。待固体完全溶解后，升温至85℃回流搅拌反应24h。通过TLC(淋洗剂：DCM)对反应进行跟踪，待氯碘交换完全后45℃旋蒸除去溶剂。经柱层析法(二氯甲烷)分离得到的产物置于50℃真空烘箱中干燥过夜，得到13.4g红色固体化合物4，收率93％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.43(s,2H),0.92(s,9H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.1,117.5,51.6,33.7,28.0；HRMS(EI),m/z calcd.for C9H11I2NO2[M]+:418.8879；found 418.8884。
实施例2、化合物EDY-A的合成
合成化合物EDY-A的主要反应过程如下：
将化合物4(252mg，0.6mmol)、Pd-NHC(41mg，0.06mmol，根据文献Chemistry-aEuropean Journal 2006,12,4743所述方法合成)、碘化亚铜(46mg，0.24mmol)置于25mLSchlenk瓶中。抽真空置换氮气三次后，在氮气氛围下依次加入干燥的甲苯(4mL)、N，N-二异丙基乙胺(297μL，1.8mmol)、化合物5(68μL，0.9mmol)与化合物6(89μL，0.9mmol)的干燥四氢呋喃溶液(0.5mL)、干燥的四氢呋喃(2mL)，每一次加入后均需要抽真空置换氮气三次。在室温、氮气保护下搅拌反应16h，通过TLC(正己烷：乙酸乙酯＝1:1)对反应进行跟踪。待化合物4反应完全，经柱层析法(正己烷：乙酸乙酯＝1:1)对产物进行分离纯化，得到54.2mg深红色油状化合物7，收率27％。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.97(s,2H),3.87(t,J＝6.0Hz,2H),3.34(s,2H),2.85(t,J＝6.0Hz,2H),2.14(s,3H),0.91(s,9H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ170.3,167.6,130.4,127.0,110.5,102.2,76.2,73.0,60.4,52.6,50.3,33.7,28.0,25.1,20.8；HRMS(ESI),m/z calcd.for C18H21NO5Na[M+Na]+:354.1317；found 354.1316。
将化合物7(96mg，0.29mmol)的无水DMF溶液(1mL)置于10mL Schlenk瓶中，抽真空置换氮气三次。降温至0℃后加入SO3·DMF(133mg，0.87mmol)的无水DMF溶液(1mL)，抽真空置换氮气三次后反应1h。转移至室温下反应2h，通过TLC(正己烷：乙酸乙酯＝1:1)对反应进行跟踪。待化合物7反应完全后，将体系使用液氮冷冻至凝固状态，再转移至室温下使体系温度缓慢升高。随着体系温度升高搅拌恢复后，加入过量NaHCO3(127mg，1.51mmol)的超纯水溶液(1.5mL)对反应进行淬灭。无气泡生成后减压蒸馏(温度控制在30℃以下)除去溶剂。加入适量甲醇过滤，滤液相28℃旋蒸浓缩至少量溶剂存在，将其滴入到大量乙醚中产生沉淀，通过离心对固相进行分离得到125mg深红色油状化合物EDY-A，收率99％。1H NMR(600MHz,D2O)δ5.04(s,2H),4.23(t,J＝6.3Hz,2H),3.34(s,2H),3.03(t,J＝6.2Hz,2H),2.16(s,3H),0.87(s,9H)；13C NMR(151MHz,D2O)δ178.6,172.9,169.0,127.1,109.4,102.7,65.7,52.8,48.8,32.8,27.1,21.5,20.2；HRMS(ESI),m/zcalcd.for C18H20NO8S-[M]-:410.0915；found 410.0912。
实施例3、化合物EDY-B的合成
合成化合物EDY-B的主要反应过程如下：
化合物8的合成参照化合物7的合成方法，起始原料由化合物5和化合物6更换为仅使用化合物5(136μL，1.8mmol)。在室温、氮气保护下搅拌反应15h，通过TLC(正己烷：乙酸乙酯＝1:3)对反应进行跟踪。待化合物4反应完全，经柱层析法(正己烷：乙酸乙酯＝1:3)对产物进行分离纯化，得到124mg黄色油状化合物8，收率68％。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ3.85(t,J＝6.0Hz,4H),3.33(s,2H),2.83(t,J＝6.0Hz,4H),0.90(s,9H)；HRMS(ESI),m/z calcd.forC17H21NO4Na[M+Na]+:326.1368；found 326.1366。
化合物EDY-B的合成参照化合物EDY-A的合成方法，起始原料由化合物7更换为化合物8(94.5mg，0.3mmol)，起始投料比为eq化合物8：eqSO3·DMF：eqNaHCO3＝1:6:10.2。通过离心对产物进行分离纯化得到红色油状物EDY-B 107.4mg，收率68％。1H NMR(600MHz,D2O)δ4.24(t,J＝6.3Hz,4H),3.32(s,2H),3.03(t,J＝6.3Hz,4H),0.89(s,9H)；13C NMR(151MHz,D2O)δ169.8,164.9,128.4,108.2,87.6,71.8,65.9,55.4,50.1,36.9,32.7,31.4,27.0,20.9；HRMS(ESI),m/z calcd.for C17H19NO10NaS2 -[M]-:484.0354；found 484.0349。
实施例4、化合物11的合成
合成化合物11的主要反应过程如下：
将化合物9(6g，44mmol)，化合物10(2.16g，22mmol)，4-二甲氨基吡啶(537mg，4.4mmol)置于250mL圆底烧瓶，降温至0℃后向其中逐滴加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(4.2g，22mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(40mL)。随后升温至80℃搅拌反应24h。通过TLC(二氯甲烷：甲醇＝10:1)对反应进行跟踪，待化合物10反应完全后减压蒸馏除去溶剂。经柱层析法(二氯甲烷：甲醇＝10:1)对产物进行分离，得到2.1g无色油状化合物11，收率44％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.22(s,2H),3.65(s,6H),2.61(t,J＝6.7Hz,2H),2.52(td,J＝6.4,2.3Hz,2H),2.01(t,J＝2.5Hz,1H)；13C NMR(101MHz,CDCl3):δ172.8,82.2,69.4,63.5,63.2,45.3,33.4,14.5.
实施例5、化合物EDY-C的合成
合成化合物EDY-C的主要反应过程如下：
化合物12的合成参照化合物8的合成方法，起始原料由化合物5更换为化合物11(389.2mg，1.8mmol)。在室温、氮气保护下搅拌反应17h，通过TLC(二氯甲烷：甲醇＝8:1)对反应进行跟踪。待化合物4反应完全，经柱层析法(二氯甲烷：甲醇＝8:1)对产物进行分离纯化，得到230mg红色油状化合物12，收率64％。1H NMR(600MHz,CD4O)δ4.15(s,4H),3.59(s,12H),3.30(s,2H),2.91(t,J＝7.1Hz,4H),2.73(t,J＝7.1Hz,4H),0.90(s,9H)；13C NMR(151MHz,CD4O)δ171.8,167.9,128.2,109.4,71.3,63.3,61.0,47.6,44.9,32.9,32.4,26.9,15.5；HRMS(ESI),m/zcalcd.for C29H41NO12Na[M+Na]+:618.2526；found 618.2527。
化合物EDY-C的合成参照化合物EDY-A的合成方法，起始原料由化合物7更换为化合物12(97.2mg，0.16mmol)，起始投料比为eq化合物12：eqSO3·DMF：eqNaHCO3＝1:18:30.3。减压蒸馏(温度控制在30℃以下)除去溶剂后加入超纯水溶解得到澄清透明的红色溶液，使用透析袋MD31(MW100-500)在超纯水中分批透析24h(3h，9h，12h，23h换水)得到淡黄色透明溶液。分批冻干溶剂得到淡黄色粉末EDY-C 197mg，产率为100％。1H NMR(600MHz,D2O)δ4.18(s,4H),4.04(s,12H),3.22(s,2H),2.91–2.85(m,4H),2.74(t,J＝6.1Hz,4H),0.83(s,9H)；HRMS(ESI),m/z calcd.for C29H35NO30Na4S6 2-[M]-:580.4585；found 580.4524。
实施例6、化合物15的合成
合成化合物15的主要反应过程如下：
参考文献The Journal of organic chemistry.2003,68(5),1821-1826合成。向化合物13(2.56g,16.8mmol)的无水THF(48mL)悬浮液中加入化合物14(3.85g,37.0mmol)，之后室温反应15min，再加入L-(-)-樟脑磺酸(390.3mg,1.68mmol)，室温反应24h，最后加入无水碳酸钾(464.4mg,3.36mmol)淬灭。旋蒸除掉溶剂，用乙酸乙酯溶解后水洗三次，乙酸乙酯相干燥后旋蒸除掉溶剂，经柱层析法(正己烷：乙酸乙酯＝1:1)对产物进行分离纯化，得到1.95g无色油状化合物15，收率51％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.23–3.96(m,4H),3.90–3.77(m,2H),3.67–3.58(m,1H),1.46–1.40(m,9H),1.37(m,3H)。
实施例7、化合物18的合成
合成化合物18的主要反应过程如下：
参考文献Journal of Medicinal Chemistry.2013,56(17),6858-6870合成。在0℃条件下将化合物17(2.73g,14.3mmol)溶解在无水DCM(35mL)中，逐滴加入化合物16(1g,11.9mmol)和三乙胺(2.47mL,15.8mmol)，室温搅拌20h。旋蒸除去溶剂，用100mL乙醚稀释过滤，旋蒸除掉乙醚，经柱层析法(正己烷：乙酸乙酯＝7:1)对产物进行分离纯化，得到1.37g淡黄色油状化合物18，收率97％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.82–7.75(d,2H),7.34(d,2H),4.14(t,2H),2.44(s,3H),2.25(td,2H),1.91–1.81(m,3H)。
实施例8、化合物19的合成
合成化合物19的主要反应过程如下：
在0℃条件下，将化合物15(0.581g,2.5mmol)溶解在无水THF(15mL)中，在通氮气的条件下加入NaH(0.240g,10mmol)，室温反应一小时。逐滴加入化合物18(1.192g,5mmol)，50℃反应36h。加入甲醇(14mL)和水(1mL)，淬灭过量的化合物18并继续搅拌24h。旋蒸除掉甲醇和THF，用水和乙酸乙酯洗三次，取乙酸乙酯相干燥过滤，旋蒸除掉溶剂。经柱层析法(正己烷：乙酸乙酯＝5:1)对产物进行分离纯化，得到430mg无色油状化合物19，收率58％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.17(td,1H),4.04(tt,2H),3.90(dd,1H),3.84(dd,1H),3.61–3.52(m,4H),2.27(td,2H),1.93(t,1H),1.46-1.40(m,9H),1.36(m,3H)。
实施例9、化合物20的合成
合成化合物20的主要反应过程如下：
化合物20的合成参照化合物7的合成方法，起始原料由化合物5更换为化合物19(268.5mg,0.9mmol)，在室温、氮气保护下搅拌反应16h，通过TLC(正己烷：乙酸乙酯＝3:1)对反应进行跟踪。待化合物4反应完全，经柱层析法(正己烷：乙酸乙酯＝3:1)对产物进行分离纯化，得到35.4mg棕黄色油状化合物20，收率11％。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.98(s,2H),4.21–4.15(m,1H),4.08(dt,1H),4.04(dd,1H),3.90(dd,1H),3.87–3.82(m,1H),3.63(t,2H),3.59(d,2H),3.34(s,2H),2.69(t,2H),2.13(s,3H),1.93(m,2H),1.45–1.37(m,12H),0.91(s,9H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ109.9,109.8,77.2,71.8,65.8,52.6,50.3,29.8,28.2,28.0,27.2,27.1,26.4,21.2,17.6。
实施例10、EDY-D的合成
合成EDY-D的主要反应过程如下：
将化合物20(42mg,0.075mmol)溶于DCM(1mL)中，逐滴加入三氟乙酸(0.2g,1.75mmol)，室温搅拌2h，旋蒸除掉溶剂，得到35.5mg棕黄色油状化合物21，收率99％。
化合物EDY-D的合成参照化合物EDY-C的合成方法，起始原料由化合物12更换为化合物21(35.5mg，0.074mmol)，起始投料比为eq化合物20：eqSO3·DMF：eqNaHCO3＝1:20:40。减压蒸馏(温度控制在30℃以下)除去溶剂后加入超纯水溶解得到澄清透明的红色溶液，使用透析袋MD31(MW100-500)在超纯水中分批透析24h(3h，9h，12h，23h换水)得到黄色透明溶液。分批冻干溶剂得到67.5mg淡黄色粉末EDY-D，产率为100％。1H NMR(400MHz,D2O)δ5.10(d,2H),5.02(m,1H),4.97(m,1H),4.49(m,1H),4.40(m,1H),3.95(m,1H),3.77(t,2H),3.36(s,2H),2.76(m,2H),2.20(s,3H),1.96(m,2H),0.92(s,9H).
实施例11、化合物25的合成
合成化合物25的主要反应过程如下：
将化合物22(3.53g,36mmol)和化合物23(5.48g,43.2mmol)溶解在无水DCM(20mL)里，70℃回流1h，旋蒸除掉溶剂，得到4.19g暗红色油状化合物24，收率为100％。
把化合物15(1.4g,6mmol)滴加到N,N-二异丙基乙胺(4mL)与无水DCM(20mL)的混合溶液中去，然后在冰水浴的条件下，逐滴加入化合物24(2.10g,18mmol)，室温反应15h，通过TLC(正己烷：乙酸乙酯＝4:1)对反应进行跟踪。待化合物15反应完全，使用饱和碳酸钾水溶液水洗三次，取有机相干燥过滤，旋蒸除掉溶剂，经柱层析法(正己烷：乙酸乙酯＝4:1)对产物进行分离纯化，得到461mg淡黄色油状化合物25，收率25％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.38–4.29(m,1H),4.23–4.11(m,3H),4.06(dd,1H),3.93–3.84(m,2H),2.64–2.58(m,2H),2.54–2.48(m,2H),1.97(t,1H),1.46–1.35(m,12H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ171.6,110.3,110.0,82.4,77.5,69.8,69.4,69.3,65.6,64.8,64.6,64.1,33.3,27.2,27.1,27.1,27.0,26.3,25.5,18.5,14.4。
实施例12、化合物26的合成
合成化合物26的主要反应过程如下：
化合物26的合成参照化合物20的合成方法，起始原料由化合物19更换为化合物25(281.1mg,0.9mmol)，在室温、氮气保护下搅拌反应16h，通过TLC(正己烷：乙酸乙酯＝3:1)对反应进行跟踪。待化合物4反应完全，经柱层析法(正己烷：乙酸乙酯＝3:1)对产物进行分离纯化，得到47.7mg棕黄色油状化合物26，收率14％。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ4.98(s,2H),4.35(m,1H),4.23–4.10(m,2H),3.92–3.84(m,2H),3.33(s,2H),2.92(dt,2H),2.80–2.71(m,2H),2.14(s,3H),1.46–1.35(m,12H),0.90(s,9H)；13C NMR(151MHz,CDCl3)δ127.1,110.0,74.9,52.6,50.3,33.7,32.7,29.8,28.0,27.2,27.1,26.3,20.8,16.4,14.3。
实施例13、EDY-E的合成
合成EDY-E的主要反应过程如下：
将化合物26(43mg,0.075mmol)溶于DCM(1mL)中，逐滴加入三氟乙酸(0.2g,1.75mmol)，室温搅拌2h，旋蒸除掉溶剂，得到37mg棕黄色油状化合物27，收率100％。
化合物EDY-E的合成参照化合物EDY-C的合成方法，起始原料由化合物12更换为化合物21(37mg，0.075mmol)，起始投料比为eq化合物20：eqSO3·DMF：eqNaHCO3＝1:20:40。减压蒸馏(温度控制在30℃以下)除去溶剂后加入超纯水溶解得到澄清透明的红色溶液，使用透析袋MD31(MW100-500)在超纯水中分批透析24h(3h，9h，12h，23h换水)得到黄色透明溶液。分批冻干溶剂得到69.4mg淡黄色粉末EDY-E，产率为100％。1H NMR(400MHz,D2O)δ5.00(m,5H),4.53-4.28(m,4H),3.07(s,2H),2.82(m,2H),2.19(m,5H),0.92(s,9H).
实施例14、化合物在生理温度下形成高活性自由基的实验
配制浓度为100mM自由基捕捉剂N-叔丁基-α-苯基硝酮(PBN)的DMSO溶液，随后依据化合物的质量加入一定量PBN的DMSO溶液，并将(多)硫酸化烯二炔母液配制浓度为20mM，另外设置一组不加烯二炔且浓度为20mM PBN的DMSO溶液作为对照组。将所有样品置于37℃水浴锅中反应12h后即可进行EPR测试。
如图1所示，两种烯二炔EDY-A和EDY-B均在EPR谱图的3520G处展示出对应于氮氧自由基信号的典型三重峰，表明这些烯二炔在生理温度下具有产生自由基的能力。另外，EDY-A产生的自由基信号比EDY-B更强，这与我们的MARACA机理(Journal of organicchemistry.2020,85(15),9808-9819)计算结果相吻合。MARACA机理指明在烯二炔的炔丙位上存在杂原子(如氧原子)时，其发生重排及环化反应(对应于形成高活性双自由基)的速度明显加速。
实施例15、烯二炔复合硫酸盐基团后降低细胞摄入量的实验
采用一种未硫酸化的烯二炔(化合物7，EDY-A的前体)作为对照。将化合物7和EDY-A均配制为1μM的DMEM溶液。使用移液枪将Hela细胞的旧培养基吸出后加入2mL烯二炔的DMEM溶液作为实验组，未加入烯二炔的孔板作为对照组。将所有孔板置于无菌细胞培养箱培养12h后，将所有孔板内旧的培养基吸出后使用PBS缓冲液缓慢洗涤孔板1次，随后在室温下加入350μL多聚甲醛(4％)固定细胞形态15-20min，PBS缓冲液洗涤3次(3min/次)后加入350μL Triton X-100对细胞通透化10min，PBS缓冲液洗涤3次(3min/次)后加入350μL浓度为15μg/mL碘化丙啶(PI)溶液对细胞核染色5min，PBS缓冲液洗涤3次(5min/次)后用于激光共聚焦实验。
如图2所示，化合物7可以轻易进入Hela细胞，并在激光共聚焦显微镜中展现出烯二炔的本征蓝色荧光。与之相对的是，EDY-A则仅有极少量进入Hela细胞，视场中主要表现出PI染色过的细胞核的红色荧光。
实施例16、化合物对于冠状病毒HCoV-229E株的抑制作用分析
以前述制备的EDY-A、EDY-B、EDY-C、EDY-D和EDY-E五种化合物作为测试药物，分析所述化合物对于冠状病毒HCoV-229E株的抑制作用。
药物孵育前一天，将单层Huh7细胞铺于12孔细胞培养板，细胞密度为覆盖板底的60％。将药物用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至40mM作为母液，再用PBS分别梯度稀释到8mM、800μM、80μM、8μM和800nM。
将滴定好的HCoV-229E和各梯度浓度药物稀释液进行混合(病毒液175μL+药物稀释液25μL)，并设置对照组(病毒液175μL+PBS 25μL)。低转速涡旋混合5s后，于37℃孵育2h。孵育完成后，将孵育后的病毒液进行10倍梯度稀释，起始稀释度为10-1(80μL病毒液+720μLDMEM)，依次稀释到10-6。
移除培养板内的细胞培养上清，每孔加入300μL病毒稀释液，晃动均匀后于32℃二氧化碳培养箱中孵育感染2h。孵育完成后取出培养板，移除上清，每孔加入1.5mL重悬的空斑培养基(DMEM+2％胎牛血清+1％青链霉素+1.2％微晶纤维素)。于32℃培养箱中静置培养72h。
培养结束后移除培养基，每孔加入1mL PBS洗去残留培养基。移除PBS后，每孔加入500μL 4％多聚甲醛固定液。室温固定30min后，弃去固定液，每孔加入500μL 1％结晶紫染色液，室温静置20min后，用流动自来水洗去染色液，室温晾干后即可对空斑进行计数。
计算EDY-A、EDY-B、EDY-C、EDY-D和EDY-E五种化合物的半数有效浓度(EC50，浓度越小表明药物的抑制作用越强)；半数毒性浓度(CC50，浓度越高说明药物的毒性越低)。进一步地，计算选择指数(SI)：
选择指数(SI)＝CC50/EC50(两者均以μM计)
结果如图3及表1。
表1
| EDY-A | EDY-B | EDY-C | EDY-D | EDY-E | |
| EC50(μM) | 13.50 | 87.75 | 38.48 | 3.86 | 14.78 |
| CC50(mM) | 0.76 | 0.85 | >1000 | 0.93 | 0.10 |
| SI | 56 | 10 | >30 | 242 | 7 |
结果可见，五种药物均具有显著的抑制冠状病毒HCoV-229E株的作用，具有应用价值。其中，EDY-D具有最为显著的抑制作用，其次为EDY-A，而EDY-C具有最低的细胞毒性。
实施例17、化合物对于冠状病毒HCoV-OC43株的抑制作用分析
以前述制备的EDY-A、EDY-B、EDY-C、EDY-D和EDY-E五种化合物作为测试药物，分析所述化合物对于冠状病毒HCoV-OC43株的抑制作用。
药物孵育前一天，将单层RD细胞铺于12孔细胞培养板，细胞密度为覆盖板底的60％。将药物用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至40mM作为母液，再用PBS分别梯度稀释到8mM、800μM、80μM、8μM和800nM。
将滴定好的HCoV-OC43病毒液和各梯度浓度药物稀释液进行混合(病毒液175μL+药物稀释液25μL)，并设置对照组(病毒液175μL+PBS 25μL)。低转速涡旋混合5s后，于37℃孵育2h。孵育完成后，将孵育后的病毒液进行10倍梯度稀释，起始稀释度为10-1(80μL病毒液+720μL DMEM)，依次稀释到10-6。
移除培养板内的细胞培养上清，每孔加入300μL病毒稀释液，晃动均匀后于32℃二氧化碳培养箱中孵育感染2h。孵育完成后取出培养板，移除上清，每孔加入1.5mL重悬的空斑培养基(DMEM+2％胎牛血清+1％青链霉素+1.2％微晶纤维素)。于32℃培养箱中静置培养72h。
培养结束后移除培养基，每孔加入1mL PBS洗去残留培养基。移除PBS后，每孔加入500μL 4％多聚甲醛固定液。室温固定30min后，弃去固定液，每孔加入500μL 1％结晶紫染色液，室温静置20min后，用流动自来水洗去染色液，室温晾干后即可对空斑进行计数。
计算EDY-A、EDY-B、EDY-C、EDY-D和EDY-E五种化合物的半数有效浓度(EC50)；半数毒性浓度(CC50)。进一步地，计算选择指数(SI)：
结果如图4表2。
表2
| EDY-A | EDY-B | EDY-C | EDY-D | EDY-E | |
| EC50(μM) | 9.68 | 94.22 | 22.22 | 9.46 | 4.33 |
| CC50(mM) | 0.78 | 0.89 | >1.00 | 0.74 | 0.08 |
| SI | 80 | 9 | >45 | 78 | 18 |
结果可见，EDY-A、EDY-B、EDY-C、EDY-D和EDY-E五种药物均具有显著的抑制冠状病毒HCoV-OC43株的作用，具有应用价值。其中，EDY-D和EDY-A具有最为显著的抑制作用，而EDY-C具有最低的细胞毒性。
实施例18、化合物对于冠状病毒HCoV-NL63株的抑制作用分析
以前述制备的EDY-A、EDY-B和EDY-C三种化合物作为测试药物，分析所述化合物对于冠状病毒HCoV-NL63株的抑制作用。
药物孵育前一天，将单层Caco-2细胞铺于12孔细胞培养板，细胞密度为覆盖板底的60％。将药物用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至40mM作为母液，再用PBS分别梯度稀释到8mM、800μM、80μM、8μM和800nM。
将滴定好的HCoV-NL63病毒液和各梯度浓度药物稀释液进行混合(病毒液175μL+药物稀释液25μL)，并设置对照组(病毒液175μL+PBS 25μL)。低转速涡旋混合5s后，于37℃孵育2h。孵育完成后，将孵育后的病毒液进行10倍梯度稀释，起始稀释度为10-1(80μL病毒液+720μL DMEM)，依次稀释到10-6。
移除培养板内的细胞培养上清，每孔加入300μL病毒稀释液，晃动均匀后于32℃二氧化碳培养箱中孵育感染2h。孵育完成后取出培养板，移除上清，每孔加入1.5mL重悬的空斑培养基(DMEM+2％胎牛血清+1％青链霉素+1.2％微晶纤维素)。于32℃培养箱中静置培养72h。
培养结束后移除培养基，每孔加入1mL PBS洗去残留培养基。移除PBS后，每孔加入500μL 4％多聚甲醛固定液。室温固定30min后，弃去固定液，每孔加入500μL 1％结晶紫染色液，室温静置20min后，用流动自来水洗去染色液，室温晾干后即可对空斑进行计数。
计算EDY-A、EDY-B、EDY-C、EDY-D和EDY-E五种化合物的半数有效浓度(EC50)；半数毒性浓度(CC50)。进一步地，计算选择指数(SI)：
结果如图5以及表3。
表3
| EDY-A | EDY-B | EDY-C | EDY-D | EDY-E | |
| EC50(μM) | 11.52 | 137.20 | 44.77 | 16.90 | 15.31 |
| CC50(mM) | 0.86 | 0.78 | >1.00 | 9.92 | 0.11 |
| SI | 75 | 6 | >22 | 586 | 7 |
结果可见，EDY-A、EDY-B、EDY-C、EDY-D和EDY-E五种药物均具有显著的抑制冠状病毒HCoV-NL63株的作用，具有应用价值。其中，EDY-D具有最为显著的抑制作用，EDY-D和EDY-C具有非常低的细胞毒性。
实施例19、化合物对于新冠病毒SARS-CoV-2Omicron株的抑制作用分析
以前述制备的EDY-A、EDY-B、EDY-C、EDY-D和EDY-E五种化合物作为测试药物，分析所述化合物对于新冠病毒SARS-CoV-2Omicron株的抑制作用。
药物孵育前一天，将单层VeroE6细胞以1×105个细胞每孔的数目均匀接种在24孔板中，置于37℃培养16h。将药物用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至40mM作为母液，再用PBS分别梯度稀释到8mM、800μM、80μM、8μM和800nM。
将5×105PFU/mL的SARS-CoV-2和各梯度浓度药物稀释液进行混合(病毒液175μL+药物稀释液25μL)，并设置对照组(病毒液175μL+PBS 25μL)。低转速涡旋混合5s后，于37℃孵育2h。孵育完成后，将孵育后的病毒液进行10倍梯度稀释，起始稀释度为10-1(80μL病毒液+720μL DMEM)，依次稀释到10-6。
移除培养板内的细胞培养上清，每孔加入300μL病毒稀释液，晃动均匀后于37℃二氧化碳培养箱中孵育感染2h。孵育完成后取出培养板，移除上清，每孔加入0.5mL重悬的空斑培养基(DMEM+2％胎牛血清+1％青链霉素+1％甲基纤维素)。于37℃培养箱中静置培养120h。
培养结束后移除培养基，每孔加入500μL 4％多聚甲醛固定液。室温固定120min后，弃去固定液，每孔加入500μL 1％结晶紫染色液，室温静置30min后，用流动自来水洗去染色液，室温晾干后即可对空斑进行计数。
计算EDY-A、EDY-B、EDY-C、EDY-D和EDY-E五种化合物的半数有效浓度(EC50)；半数毒性浓度(CC50)。进一步地，计算选择指数(SI)：
选择指数(SI)＝CC50/EC50(两者均以μM计)
结果如图6以及表4。
表4
| EDY-A | EDY-B | EDY-C | EDY-D | EDY-E | |
| EC50(nM) | 99.60 | 796.40 | 256.20 | 56.19 | 132.20 |
| CC50(mM) | 0.78 | 0.70 | >1.00 | 1.20 | 0.82 |
| SI | 7831 | 878 | >3903 | 21327 | 6209 |
结果可见，EDY-A、EDY-B、EDY-C、EDY-D和EDY-E五种化合物均具有显著抑制新冠病毒SARS-CoV-2Omicron株的作用，具有应用价值。其中，EDY-D具有最为显著的抑制作用，其次为EDY-A，而EDY-D和EDY-C具有最低的细胞毒性。
实施例20、EDY对于新冠病毒蛋白的降解实验
以前述制备的EDY-A、EDY-B、EDY-C、EDY-D和EDY-E五种化合物作为测试药物，分析所述化合物对于冠状病毒的N蛋白(NP)以及S蛋白的降解情况。
新冠病毒N蛋白(NP)的GenBank登录号为：YP_009724397，为发明人在大肠杆菌体内表达的N蛋白全长，蛋白N端加了6×His融合标签，经镍柱亲和层析纯化获得。
新冠病毒S蛋白的GenBank登录号为：YP_009724390，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，产品货号CG202-01，该蛋白为截短S蛋白，具体为S蛋白的Val16-Pro1213位，蛋白C端加了6×His融合标签。
将药物用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解成80mM作为母液，再用PBS稀释至4mM作为稀母液(PBS 950μL+EDY母液50μL)。将待测蛋白(N蛋白或S蛋白)用PBS稀释至0.1mg/mL。将EDY溶液、蛋白稀释液和PBS按照下表进行配制，其中0.25和1mM组使用4mM的EDY稀母液(星号*标记)：
药物配制如表5所示。
表5
| 药物浓度/mM | 蛋白/μL | EDY/μL | PBS/μL |
| 0 | 8 | 0 | 8 |
| 0 | 8 | 0 | 8 |
| 0.25 | 8 | 1* | 7 |
| 1 | 8 | 4* | 4 |
| 5 | 8 | 1 | 7 |
| 20 | 8 | 4 | 4 |
低转速涡旋混合5s后，于37℃孵育12h。孵育完成后，每份样品加入4μL5×蛋白上样缓冲液(索莱宝，P1040-10ml)。低转速涡旋混合5s后，于100℃煮样10min，短暂离心。每份样品取5μL用于SDS-PAGE电泳，电泳完成后将蛋白转印至NC膜(90V，90min)。5％脱脂奶粉封闭2h后，加小鼠抗His-tag一抗(ABclonal，AE003)于4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，加HRP标记山羊抗小鼠二抗(碧云天，A0216)于室温孵育1h。TBST洗膜3次后，用ECL Western BlottingSubstrate(Tanno，180-5001)发光显影。
结果如图7所示，EDY-A、EDY-B、EDY-C、EDY-D和EDY-E对于N蛋白以及S蛋白均具有显著的抑制作用。随着EDY-A、EDY-B、EDY-C、EDY-D和EDY-E浓度的增加，N蛋白以及S蛋白均发生显著的降低，化合物对于蛋白的抑制作用呈现一定的剂量依赖性。
实施例21、EDY对于新冠病毒蛋白的降解实验
以前述制备的EDY-A作为测试药物，分析所述化合物对于新冠病毒的N蛋白(NP)的降解情况。
新冠病毒N蛋白(NP)的GenBank登录号为：YP_009724397，为发明人在大肠杆菌体内表达的N蛋白全长，蛋白N端加了6×His融合标签，经镍柱亲和层析纯化获得。
将药物用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解成80mM作为母液，再用PBS稀释至4mM作为稀母液(PBS 950μL+EDY母液50μL)。将待测N蛋白用PBS稀释至0.1mg/mL。将EDY溶液、蛋白稀释液和PBS按照下表进行配制，其中0.25和1mM组使用4mM的EDY稀母液(星号*标记)：
药物配制如表6所示。
表6
| 药物浓度/mM | 蛋白/μL | EDY/μL | PBS/μL |
| 0 | 8 | 0 | 8 |
| 0 | 8 | 0 | 8 |
| 0.25 | 8 | 1* | 7 |
| 1 | 8 | 4* | 4 |
| 5 | 8 | 1 | 7 |
低转速涡旋混合5s后，于37℃孵育分别12h、24h、36h和48h。孵育完成后，每份样品加入4μL 5×蛋白上样缓冲液(索莱宝，P1040-10ml)。低转速涡旋混合5s后，于100℃煮样10min，短暂离心。每份样品取5μL用于SDS-PAGE电泳，电泳完成后将蛋白转印至NC膜(90V，90min)。5％脱脂奶粉封闭2h后，加小鼠抗His-tag一抗(ABclonal，AE003)于4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，加HRP标记山羊抗小鼠二抗(碧云天，A0216)于室温孵育1h。TBST洗膜3次后，用ECL Western Blotting Substrate(Tanno，180-5001)发光显影。
结果如图8所示，EDY-A对于N蛋白具有显著的抑制作用。随着EDY-A和N蛋白作用时间的增加，N蛋白降低程度增加，即化合物EDY-A对于N蛋白的抑制作用呈现一定的时间依赖性。
实施例22、维生素C抑制EDY-D对病毒蛋白的破坏作用实验
以前述制备的EDY-D作为测试药物，验证在水溶性自由基淬灭剂维生素C(Vc，其能淬灭自由基物种从而保护蛋白的结构)的作用下，EDY-D对于新冠病毒的N蛋白(NP)以及S蛋白的降解情况。
新冠病毒N蛋白(NP)的GenBank登录号为：YP_009724397，为发明人在大肠杆菌体内表达的N蛋白全长，蛋白N端加了6×His融合标签，经镍柱亲和层析纯化获得。
新冠病毒S蛋白的GenBank登录号为：YP_009724390，购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，产品货号CG202-01，该蛋白为截短S蛋白，具体为S蛋白的Val16-Pro1213位，蛋白C端加了6×His融合标签。
将EDY-D用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解成80mM作为母液，将维生素C用PBS溶解成100mM母液。将待测蛋白(N蛋白或S蛋白)用PBS稀释至0.2mg/mL。将维生素C溶液、EDY溶液、蛋白稀释液和PBS按照下表进行配制：
药物配制如表7所示。
表7
低转速涡旋混合5s后，于37℃孵育12h。孵育完成后，每份样品加入4μL5×蛋白上样缓冲液(索莱宝，P1040-10ml)。低转速涡旋混合5s后，于100℃煮样10min，短暂离心。每份样品取10μL用于SDS-PAGE电泳，电泳完成后将蛋白转印至NC膜(90V，90min)。5％脱脂奶粉封闭2h后，加小鼠抗His-tag一抗(ABclonal，AE003)于4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，加HRP标记山羊抗小鼠二抗(碧云天，A0216)于室温孵育1h。TBST洗膜3次后，用ECL WesternBlotting Substrate(Tanno，180-5001)发光显影。
结果如图9所示，随着维生素C浓度的升高，化合物EDY-D对新冠N蛋白和S蛋白的破坏能力明显下降。当维生素C浓度升高到10mM时可显著抑制EDY-D对新冠N蛋白和S蛋白的破坏作用；当维生素C浓度升高到50mM时可完全抑制EDY-D对新冠N蛋白和S蛋白的破坏作用。
实施例23、对照化合物对于新冠病毒蛋白的降解实验
1、对照化合物THC的合成
室温下分别称取双三苯基膦二氯化钯(70mg，0.1mmol)、碘化亚铜(76mg，0.4mmol)加入25mL Schlenk瓶中。抽真空置换氮气三次(抽换气三次)后，通氮气条件下依次加入干燥的甲苯(8mL)、1，2-二碘苯(329.91mg，1mmol)、N，N-二异丙基乙胺(247μL)、分别加入两种炔各1.5mmol、干燥的THF(4mL)，每一次加入后均需要抽换气三次。反应在室温通氮气保护条件下进行，通过TLC点板对反应进行跟踪。待1，2-二碘苯反应完全，抽真空将体系中的溶剂浓缩至1.5mL左右，通过硅胶柱层析法(正己烷：乙酸乙酯＝4：1)对产物进行分离纯化，最终得到浅黄色油状液体80mg，产率为17％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.46-7.35(m,2H),7.28-7.18(m,2H),4.95-4.93(s,2H),4.21-3.98(m,5H),3.93-3.80(dd,1H),3.70-3.64(t,2H),3.61-3.58(dd,2H),2.59-2.54(t,2H),2.15-2.10(s,3H),1.95-1.87(p,2H),1.45-1.40(d,12H)。将以上所得化合物于10mL茄形瓶中溶于无水DCM溶液(2mL)，滴加0.4mL三氟乙酸，室温反应2h，得到脱保护后的产物。室温下称取SO3·DMF(628mg，4.1mmol)，DMF(3mL)加入10mL Schlenk瓶中，抽换气三次。在0℃冰水浴中加入脱保护产物的4mL无水DMF溶液，抽换气三次后反应1h。转移至室温下反应2h。通过TLC点板对反应进行跟踪。当化合物反应完全后，将体系用液氮冷冻至凝固状态，再转移至室温下使体系温度缓慢升高。随着体系温度升高搅拌恢复后，加入NaHCO3(689mg，8.2mmol)的超纯水溶液对反应淬灭，产生大量气泡。无气泡生成后转移至25mL茄形瓶中，减压蒸馏(温度控制在30℃以下)除去溶剂。加入适量甲醇过滤，滤液相减压蒸馏(温度控制在30℃以下)除去溶剂，得到浅黄色固体118.9mg，产率为72％。1H NMR(400MHz,D2O)δ7.56-7.49(m,2H),7.45-7.32(m,2H),5.06-4.95(d,2H),4.05-3.54(m,6H),2.66-2.56(t,2H),2.21-2.15(d,3H),1.99-1.86(d,2H).
2、对照化合物MHC的合成
室温下分别称取1,2-二碘苯(165mg，0.5mmol)、双三苯基膦二氯化钯(35mg，0.05mmol)、碘化亚铜(38mg，0.20mmol)加入25mL Schlenk瓶中。抽真空置换氮气三次(抽换气三次)后，通氮气条件下依次加入干燥的甲苯(4mL)、N，N-二异丙基乙胺(247L，1.5mmol)、分别加入两种反应所需要的炔各0.75mmol、干燥的THF(2mL)，每一次加入后均需要抽换气三次。反应在室温通氮气保护条件下进行(室温反应17h)，通过TLC点板对反应进行跟踪。待1,2-二碘苯反应完全，抽真空将体系中的溶剂浓缩至1.5mL左右，通过硅胶柱层析法(淋洗剂：正己烷：乙酸乙酯＝2:1)对产物进行分离纯化，得到红色油状物19.1mg，产率为15％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.42(dd,J＝15.5,8.1Hz,2H),7.32–7.18(m,2H),4.94(s,2H),3.83(t,J＝6.0Hz,2H),2.74(t,J＝6.0Hz,2H),2.13(s,3H)。室温下称取上述烯二炔的无水DMF溶液(1mL)加入10mL Schlenk瓶中，抽换气三次。在0℃冰水浴中加入SO3·DMF(1eq羟基对应3eq SO3·DMF)的1mL无水DMF溶液，抽换气三次后反应1h。转移至室温下反应过夜，通过TLC点板对反应进行跟踪。待烯二炔原料反应完全后，将体系使用液氮冷冻至凝固状态，再转移至室温下使体系温度缓慢升高。随着体系温度升高搅拌恢复后，加入过量NaHCO3的超纯水溶液对反应淬灭，产生大量气泡。无气泡生成后转移至25mL茄形瓶中，减压蒸馏(温度控制在30℃以下)除去溶剂。加入适量甲醇过滤，滤液相28℃旋蒸浓缩至少量溶剂存在，将其滴入到大量乙醚中产生沉淀，吸去上层清液再将其滴到乙醚中反沉淀(重复三次)，旋蒸除去乙醚，得到白色粉末产物，产率为38％。
3、对于新冠病毒蛋白的降解实验
以制备的MHC和THC两种化合物作为测试药物，分析所述化合物对于冠状病毒的N蛋白(NP)的降解情况。
新冠病毒N蛋白(NP)的GenBank登录号为：YP_009724397，为发明人在大肠杆菌体内表达的N蛋白全长，蛋白N端加了6×His融合标签，经镍柱亲和层析纯化获得。
将药物用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解成80mM作为母液，再用PBS稀释至4mM作为稀母液(PBS 950μL+化合物母液50μL)。将待测N蛋白用PBS稀释至0.1mg/mL。将测试化合物溶液、蛋白稀释液和PBS按照下表进行配制，其中0.25和1mM组使用4mM的EDY稀母液(星号*标记)：
药物配制如表8所示。
表8
| 药物浓度/mM | 蛋白/μL | MHV或THC/μL | PBS/μL |
| 0 | 8 | 0 | 8 |
| 0 | 8 | 0 | 8 |
| 0.25 | 8 | 1* | 7 |
| 1 | 8 | 4* | 4 |
| 5 | 8 | 1 | 7 |
| 20 | 8 | 4 | 4 |
低转速涡旋混合5s后，于37℃孵育12h。孵育完成后，每份样品加入4μL5×蛋白上样缓冲液(索莱宝，P1040-10ml)。低转速涡旋混合5s后，于100℃煮样10min，短暂离心。每份样品取5μL用于SDS-PAGE电泳，电泳完成后将蛋白转印至NC膜(90V，90min)。5％脱脂奶粉封闭2h后，加小鼠抗His-tag一抗(ABclonal，AE003)于4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，加HRP标记山羊抗小鼠二抗(碧云天，A0216)于室温孵育1h。TBST洗膜3次后，用ECL Western BlottingSubstrate(Tanno，180-5001)发光显影。
结果如图10所示，对照化合物MHC和THC对于N蛋白几乎无抑制作用。
采用与EDY-A和EDY-D结构相似但是无法通过MARACA机制产生自由基的烯二炔类似物(MHC和THC)则几乎不能造成蛋白降解，说明烯二炔经过MARACA形成自由基是其破坏病毒蛋白的关键。采用水溶性自由基淬灭剂(维生素C)则可抑制EDY-D对病毒蛋白的破坏作用(实施例23)，更进一步说明本发明中的复合烯二炔是通过自由基来破坏病毒蛋白的。
以上机理研究显示，烯二炔化合物经由MARACA产生自由基，并破坏病毒关键蛋白质N蛋白和/或S蛋白。N蛋白为病毒结构成分，保护病毒核酸；S蛋白为病毒与宿主(如人体)细胞的关键性蛋白，因此可见，该烯二炔化合物通过破坏病毒结构成分和阻止病毒吸附/侵染宿主细胞而实现抗病毒作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
Claims (12)
1.复合烯二炔在制备抑制冠状病毒的组合物或药盒中的用途；所述复合烯二炔包括相互连接的两个部分：马来酰亚胺基烯二炔部分，以及单/多硫酸盐部分。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述冠状病毒为表达N蛋白和/或S蛋白的冠状病毒；较佳地，所述冠状病毒包括α、β、γ和δ属冠状病毒；较佳地，所述冠状病毒包括但不限于：HCoV-229E株、HCoV-OC43株、HCoV-NL63株、SARS-CoV-2株、SARS-CoV株、MERS-CoV株、HCoV-HKU1株、鸡传染性支气管炎病毒株、猪流行性腹泻病毒株等。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述复合烯二炔中，所述马来酰亚胺基烯二炔部分降解冠状病毒蛋白；较佳地降解S蛋白和/或N蛋白；所述单/多硫酸盐部分提供负电荷，阻止该复合烯二炔进入正常细胞，降低细胞毒性。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述复合烯二炔为式(I)所示化合物或其异构体、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐，
其中，X为CO或不存在；
U为CO或不存在；
V为CO或不存在；W为(CR7R8)j，该链中存在或不存在O；
Y为(CR9R10)k，该链中存在或不存在O；
R1为H，O；可选地能形成分子内吡喃环或呋喃环；
R6为H，O；可选地能形成分子内吡喃环或呋喃环；
R2或R3各自独立地选自H，CH3，NH2，R，OR’，C(O)R”，带有取代或非取代基团的烷基、不饱和烷基、多不饱和烷基，芳基，芳杂基，(CR1OSO3H)i；
R4或R5各自独立地选自H，CH3，NH2，R，OR’，C(O)R”，带有取代或非取代基团的烷基、不饱和烷基、多不饱和烷基，芳基，芳杂基，(CR6OSO3H)l；
R0、R7、R8、R9或R10各自独立地选自H，CH3，NH2，R，OR’，C(O)R”，带有取代或非取代基团的烷基、不饱和烷基、多不饱和烷基，芳基，
芳杂基；
R、R’、R”各自独立地选自H，O，CH3，卤素，C1-C10烷基，芳基，(CH2)nNH2，C(O)(CH2)nNH2；
m为选自0-6的整数，当m为0时，相应括号内基团被R4取代；
n为选自0-6的整数，当n为0时，相应括号内基团被R2取代；
i,j,k,l,p,q各自独立地选自0-10的整数。
5.如权利要求1或4所述的用途，其特征在于，所述的化合物包括：
6.一种复合烯二炔，其包括相互连接的两个部分：马来酰亚胺基烯二炔部分，以及单/多硫酸盐部分；较佳地，所述马来酰亚胺基烯二炔部分降解冠状病毒蛋白所述单/多硫酸盐部分提供负电荷，阻止该复合烯二炔进入正常细胞，降低细胞毒性。
7.如权利要求6所述的复合烯二炔，其特征在于，其为式(I)所示化合物或其异构体、溶剂合物或前体，或它们的药学上可接受的盐，
其中，X为CO或不存在；
U为CO或不存在；
V为CO或不存在；W为(CR7R8)j，该链中存在或不存在O；
Y为(CR9R10)k，该链中存在或不存在O；
R1为H，O；可选地能形成分子内吡喃环或呋喃环；
R6为H，O；可选地能形成分子内吡喃环或呋喃环；
R2或R3各自独立地选自H，CH3，NH2，R，OR’，C(O)R”，带有取代或非取代基团的烷基、不饱和烷基、多不饱和烷基，芳基，芳杂基，(CR1OSO3H)i；
R4或R5各自独立地选自H，CH3，NH2，R，OR’，C(O)R”，带有取代或非取代基团的烷基、不饱和烷基、多不饱和烷基，芳基，芳杂基，(CR6OSO3H)l；
R0、R7、R8、R9或R10各自独立地选自H，CH3，NH2，R，OR’，C(O)R”，带有取代或非取代基团的烷基、不饱和烷基、多不饱和烷基，芳基，
芳杂基；
R、R’、R”各自独立地选自H，O，CH3，卤素，C1-C10烷基，芳基，(CH2)nNH2，C(O)(CH2)nNH2；
m为选自0-6的整数，当m为0时，相应括号内基团被R4取代；
n为选自0-6的整数，当n为0时，相应括号内基团被R2取代；
i,j,k,l,p,q各自独立地选自0-10的整数。
8.如权利要求7所述的复合烯二炔，其特征在于，所述的化合物包括：
9.一种药物组合物，包含：权利要求6-8任一所述的复合烯二炔；和药学上可接受的载体。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的剂型包括：粉剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂、控速释剂、注射剂、输液剂、混悬剂。
11.一种药盒，其中包括：权利要求6-8任一所述的复合烯二炔；或权利要求10或11所述的药物组合物。
12.一种抑制冠状病毒的方法，包括：以权利要求6-8任一所述的复合烯二炔抑制冠状病毒；或以权利要求10或11所述的药物组合物抑制冠状病毒。
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