CN118048250A - 分泌表达葡萄糖氧化酶的工程菌 - Google Patents
分泌表达葡萄糖氧化酶的工程菌 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118048250A CN118048250A CN202211434096.3A CN202211434096A CN118048250A CN 118048250 A CN118048250 A CN 118048250A CN 202211434096 A CN202211434096 A CN 202211434096A CN 118048250 A CN118048250 A CN 118048250A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glucose oxidase
- protein
- gox
- ost2
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 title claims abstract description 95
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 title claims abstract description 81
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 title claims abstract description 81
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 title claims abstract description 81
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 39
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 35
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title abstract description 5
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 35
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 25
- 101000884921 Homo sapiens Dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase subunit DAD1 Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 102100039104 Dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase subunit DAD1 Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims abstract description 20
- 102100025326 Golgin-45 Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 101100122513 Homo sapiens BLZF1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 101150024689 OST3 gene Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 101100453261 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) JEM1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 33
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 33
- 101150108662 KAR2 gene Proteins 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 28
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 26
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 24
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 15
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 15
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 15
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 108050001186 Chaperonin Cpn60 Proteins 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 102000052603 Chaperonins Human genes 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 101150094958 gox gene Proteins 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dimethoxybenzidine Chemical compound C1=C(N)C(OC)=CC(C=2C=C(OC)C(N)=CC=2)=C1 JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 4
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PHOQVHQSTUBQQK-SQOUGZDYSA-N D-glucono-1,5-lactone Chemical compound OC[C@H]1OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O PHOQVHQSTUBQQK-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 2
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- NUXKIZBEPYVRKP-RWBWKAGLSA-N 1xa5 Chemical compound O([C@]12[C@@H]3N(C)C4=C([C@]53CCN3CC=C[C@@]([C@@H]53)(CC)C2)C=C(C(=C4)OC)[C@]2(C(=O)OC)C3=C(C4=CC=CC=C4N3)CCN3C[C@H](C2)C[C@@](C3)(O)CC)C(=O)N(CCCl)C1=O NUXKIZBEPYVRKP-RWBWKAGLSA-N 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 241000079253 Byssochlamys spectabilis Species 0.000 description 1
- 101150080924 CNE1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101001094827 Homo sapiens Phosphomannomutase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 description 1
- 102100035367 Phosphomannomutase 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000206572 Rhodophyta Species 0.000 description 1
- 102000018673 SEC Translocation Channels Human genes 0.000 description 1
- 108010091732 SEC Translocation Channels Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- CBMPTFJVXNIWHP-UHFFFAOYSA-L disodium;hydrogen phosphate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O CBMPTFJVXNIWHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000009962 secretion pathway Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了分泌表达葡萄糖氧化酶的工程菌。本发明提供了重组菌，为共表达葡萄糖氧化酶和分子伴侣的毕赤酵母；所述分子伴侣为如下三种中任一种：OST2蛋白、OST3蛋白和JEM1蛋白，或三种中任意两种组合，或三种中任一种或任2种与其他分子伴侣蛋白组合。本发明将多种伴侣蛋白分别与GOX共表达，结果部分伴侣蛋白能够提高GOX的酶活，各种伴侣蛋白组合过表达的策略对于提高细胞GOX分泌能力具有明显的效果，优于单独过表达伴侣蛋白的菌株。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种分泌表达葡萄糖氧化酶的工程菌。
背景技术
葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，GOX)是目前最为常用的工具酶之一，在食品、制药、临床和生物技术领域都取得了广泛应用，具有较高的经济效益。
在食品行业中，GOX被用于去除食品和饮料中残存的氧气和葡萄糖，此过程伴随着过氧化氢的生成，对微生物的生长繁殖进行双重抑制，以延长商品货架期。GOX也作为一种绿色食品添加剂广泛应用于面包烘焙，不仅能够氧化面筋蛋白的二硫键提高面团的弹性，又能避免蛋白质氨基和还原糖发生美拉德褐变影响产品风味及外观。
在临床诊断行业中，GOX是制作血糖传感器的关键工具酶。血糖中的微量葡萄糖被固定在电极上的GOX氧化为易于检测的过氧化氢信号，铂电极接收的信号强弱即可反映血液中葡萄糖含量的高低。另外以GOX蛋白的电子变化和GOX结构内FAD变化为输出信号的血糖传感器也被陆续开发出来，并得到广泛应用。
在纺织行业中，GOX在催化过程中产生的过氧化氢可应用于织物的漂白脱色环节。固定在氧化铝和玻璃托板上的GOX在处理织物后可以回收再利用，有效降低织物的生产成本。相较于直接加入过氧化氢，GOX处理后的织物更加柔软舒适，具有更高的经济价值。
GOX的天然来源包括昆虫、红藻、细菌和霉菌等。前三类来源的GOX存在提取困难和产酶量低等局限性，不适用于工业化生产。目前，黑曲霉是商业应用最广泛的GOX生产菌种，除此之外，黄青霉和拟青霉也是生产GOX的优势菌株。
利用霉菌发酵生产GOX时会出现过程控制复杂、GOX分离提取困难和酶稳定性差等问题。为了避免以上问题的出现，可以用酵母表达系统代替霉菌表达系统对GOX进行异源表达。其中，毕赤酵母表达系统遗传操作简单、副产物少且具有适当的翻译后修饰，是生产GOX的优选菌株。
研究表明，通过增加GOX基因拷贝数可以实现其在毕赤酵母表达系统的大量表达。然而细胞对蛋白的加工与分泌能力有限，容易触发胞内的非折叠蛋白响应机制，使得滞留在胞内的GOX被降解，大大影响了GOX的生产效率。为了改善GOX在毕赤酵母中的表达效果，要对分泌途径进行分析，识别出与GOX高效分泌表型相关的潜在分子伴侣蛋白基因靶点，并以此为依据，对毕赤酵母分泌途径进行改造以提高GOX的生产水平。
发明内容
本发明的目的是提供分泌表达葡萄糖氧化酶的工程菌。
一方面，本发明提供了重组菌，为共表达葡萄糖氧化酶和分子伴侣的毕赤酵母；
所述分子伴侣为如下三种中任一种：OST2蛋白、OST3蛋白和JEM1蛋白，或三种中任意两种组合，或三种中任一种或任2种与其他分子伴侣蛋白组合。
上文重组菌中，其他分子伴侣蛋白为KAR2蛋白等。
上文重组菌中，所述分子伴侣为OST2蛋白、OST3蛋白、JEM1蛋白、OST2蛋白和OST3蛋白组合、JEM1蛋白和OST2蛋白组合、或JEM1蛋白和KAR2蛋白组合。
上文重组菌中，葡萄糖氧化酶为序列2第1196位至2944位所示DNA分子编码的蛋白；
OST2蛋白为序列3所示DNA分子编码的蛋白；
OST3蛋白为序列4所示DNA分子编码的蛋白；
JEM1蛋白为序列7所示DNA分子编码的蛋白；
KAR2蛋白为序列8所示DNA分子编码的蛋白。
上文重组菌中，所述葡萄糖氧化酶的编码基因为单拷贝葡萄糖氧化酶基因或多拷贝葡萄糖氧化酶基因。
上文重组菌中，所述多拷贝葡萄糖氧化酶基因为2个或3个拷贝的葡萄糖氧化酶基因。
上文重组菌中，葡萄糖氧化酶的编码基因以葡萄糖氧化酶的编码基因表达盒的形式存在，其核苷酸序列为序列2。
另一方面，本发明提供了一种制备第一方面所述重组菌的方法，包括如下步骤：
将第一方面中的所述葡萄糖氧化酶的编码基因和所述分子伴侣编码基因整合到毕赤酵母基因组中，得到重组菌。
上文方法中，所述整合为通过表达所述葡萄糖氧化酶的编码基因和所述分子伴侣编码基因的载体导入所述毕赤酵母中，得到重组菌。
在本发明实施例中，
若分子伴侣为一种，所述葡萄糖氧化酶的编码基因通过pMPICZhisα-3GOX导入毕赤酵母，所述分子伴侣编码基因通过pPICH-OST2、pPICH-OST3或pPICH-JEM1导入毕赤酵母；
若分子伴侣为2种组合，所述葡萄糖氧化酶的编码基因通过pMPICZhisα-3GOX导入毕赤酵母，所述分子伴侣编码基因通过pPICHhis-OST2-OST3、pPICHhis-JEM1-KAR2或pPICHhis-JEM1-OST2导入毕赤酵母。
上文中，各质粒具体制备方式如下：
将GOX基因通过酶切连接，插入pMPICZα载体(序列1)的XhoI和NotI位点，即构建得到pMPICZα-GOX质粒。
pMPICZhisα-3GOX为将2GOX(2GOX为2个GOX基因表达盒依次排列组成，GOX基因表达盒的序列为序列2，其中第1196位至2944位为GOX基因)连接到pMPICZα-GOX载体的SphI和BglII酶切位点间，且将HIS4基因(序列10)同源重组到pMPICZα-GOX载体中得到的载体。
质粒pPICH-OST2按照如下方法制备：以毕赤酵母GS115基因组为模板，用OST2_F引物和OST2_R引物进行PCR扩增，得到OST2扩增产物。将上述OST2扩增产物通过同源重组的方法与pPICHA载体骨架连接，得到pPICH-OST2。
质粒pPICH-OST3为将OST3扩增产物(基因序列为序列4，该片段以毕赤酵母GS115基因组为模板，用OST3_F引物和OST3_R引物扩增获得)通过同源重组的方法与pPICHA载体骨架连接，得到的质粒；
质粒pPICH-JEM1为将JEM1扩增产物(基因序列为序列7，该片段以毕赤酵母GS115基因组为模板，用JEM1_F引物和JEM1_R引物扩增获得)通过同源重组的方法与pPICHA载体骨架连接，得到的质粒；
pPICHhis-OST2-OST3为OST3基因表达盒通过同源重组的方法插入pPICHhis-OST2表达载体的NotI位点处，得到的重组载体。
pPICHhis-JEM1-KAR2为KAR2基因表达盒通过同源重组的方法插入pPICHhis-JEM1表达载体的NotI位点处，得到的重组载体。
pPICHhis-JEM1-OST2为OST2基因表达盒通过同源重组的方法插入pPICHhis-JEM1表达载体的NotI位点处，得到的重组载体。
pPICHhis-JEM1为将HIS4基因扩增产物(基因序列为序列10，该片段以毕赤酵母GS115基因组为模板，用HIS4_F和HIS4_R为引物扩增得到)通过同源重组的方法连接至pPICH-JEM1表达载体的BamHI位点处，得到重组载体pPICHhis-JEM1；
pPICHhis-OST2为将HIS4基因扩增产物通过同源重组的方法连接至pPICH-OST2表达载体的BamHI位点处，得到重组载体pPICHhis-OST2。
第三方面，本发明提供了第一方面的所述重组菌(或由第二方面方法制备的重组菌)在制备葡萄糖氧化酶中的应用；
或，本发明提供了第一方面的所述重组菌(或由第二方面方法制备的重组菌)在提高葡萄糖氧化酶酶活中的应用。
第四方面，本发明提供了第一方面中的分子伴侣在提高葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的表达量或酶活中的应用；
或本发明提供了第一方面中的分子伴侣在作为葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中分泌表达的伴侣基因靶点中的应用。
第五方面，本发明提供了一种制备葡萄糖氧化酶的方法，包括如下步骤：发酵第一方面所述重组菌(或由第二方面方法制备的重组菌)，得到葡萄糖氧化酶。
上文中的发酵采用培养基为BMMY培养基。
本发明的实验证明，本发明将多种伴侣蛋白分别与GOX共表达，结果部分伴侣蛋白能够提高GOX的酶活，各种伴侣蛋白组合过表达的策略对于提高细胞GOX分泌能力具有明显的效果，优于单独过表达伴侣蛋白的菌株。
附图说明
图1为3拷贝葡萄糖氧化酶基因表达载体。
图2为单个伴侣蛋白表达载体。
图3为整合了HIS4基因的单个伴侣蛋白表达载体。
图4为伴侣蛋白组合表达载体。
图5为不同伴侣蛋白分别过表达的重组菌株发酵酶活浓度水平。
图6为不同伴侣蛋白组合过表达的重组菌株发酵酶活浓度水平。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的检测方法：一个单位的GOX活性定义为每分钟将1.0μmolβ-D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸-δ-内酯和H2O2的酶量。
通过邻联茴香胺的偶联反应测定GOX的酶活：
反应条件：在试管中加入0.5mL邻联茴香胺溶液，60μL18％(质量体积百分比g：ml)的D-葡萄糖和20μL的90U/mL辣根过氧化物酶溶液(溶剂为水)，35℃保温2min，加入20μL待测样品，反应3min后加入400μL的2mol/L硫酸终止反应，在540nm下测定反应液吸光值
邻联茴香胺溶液：0.1g邻联茴香胺溶于10mL甲醇作为储存液，实验前取0.1mL储存液溶于12mL的0.1mol/L，pH6.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中。
GOX将葡萄糖底物氧化为D-葡萄糖酸-δ-内酯和H2O2，H2O2在辣根过氧化物酶的作用下分解为水和氧气，氧气使邻联茴香胺变红。
将不同酶活浓度的GOX标准品(购自Solarbio/索莱宝公司，货号G8030-10ku)在540nm的吸光值绘制成标准曲线即可用于测定待测样品的酶活浓度。
表1为本发明构建的菌株
表2为本发明构建的质粒
表3为本发明所用引物
下面实施例中所用的培养基如下：
LB培养基：蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，酵母粉5g/L，余量为水；固体培养基另加入15g/L琼脂粉。
YPD培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，余量为水；固体培养基另加入15g/L琼脂粉。
BMMY培养基：蛋白胨20g/L，酵母基础氮源13.4g/L，酵母粉10g/L，生物素4×10-5％(质量体积，g：ml)，磷酸钾100mM，0.5％(体积百分含量)甲醇，余量为水；调节pH至6.0。
实施例1、单个伴侣蛋白过表达对GOX分泌途径的影响
1、单个伴侣蛋白过表达重组菌的制备
分别以pPICH质粒和毕赤酵母基因组为模板扩增载体骨架及目的基因，Gibson连接后(Gibson连接酶商品名称GibsonMaster Mix，购自NEB公司，货号为E2611S)将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞中，并涂布于Hygromycin抗性(50mg/L)的LB平板，37℃培养12h。将鉴定正确的单克隆转接至Hygromycin抗性的液体LB培养基中，提取质粒送测序公司测序。对测序结果正确的质粒进行SacI或PmeI单酶切得到线性化表达载体。通过电转将线性化表达载体转入GS-3GOX感受态细胞中，涂布于Hygromycin抗性(200mg/L)的YPD平板，30℃培养48h。对平板上的单克隆进行菌落PCR鉴定，挑取鉴定结果正确的单克隆于YPD液体培养基中，30℃培养48h后保存于15％的甘油中，于-80℃冰箱中储存。
具体以重组菌株GS-3GOX-OST2为例：
GOX基因序列由金斯瑞公司合成(序列2，其中第1196位至2944位为GOX基因)，并在序列5’端和3’端分别加入XhoI和NotI位点。
将GOX基因通过酶切连接，插入pMPICZα载体(序列1)的XhoI和NotI位点，即构建得到pMPICZα-GOX质粒。
用SphⅠ和BamHⅠ从pMPICZα-GOX质粒上切出约3.3kb的GOX单拷贝表达盒(序列2)，再用SphI和BglII酶切pMPICZα-GOX载体；利用BglII和BamHI同尾酶的特性，采用T4 DNA连接酶将GOX单拷贝表达盒连入SphI和BglII酶切后的pMPICZα-GOX载体，得到2拷贝GOX的表达载体pMPICZα-2GOX。
用同样的方法用SphⅠ和BamHⅠ在pMPICZα-2GOX表达载体上切出6.6kb GOX双拷贝表达盒，再连入SphI和BglII酶切后的pMPICZα-GOX载体，得到pMPICZα-3GOX。
以毕赤酵母GS115基因组为模板，用HIS4_F引物和HIS4_R引物进行PCR扩增，得到HIS4扩增产物。将上述HIS4扩增产物通过同源重组连接到pMPICZα-3GOX表达载体，得到pMPICZhisα-3GOX(图1)。
pMPICZhisα-3GOX质粒为将2GOX(2GOX为2个GOX基因表达盒依次排列组成，GOX基因表达盒的序列为序列2，其中第1196位至2944位为GOX基因)连接到pMPICZα-GOX载体的SphI和BglII酶切位点间，且将HIS4基因(序列10)同源重组到pMPICZα-GOX载体中得到的载体。
将上述pMPICZhisα-3GOX质粒通过StuI单酶切线性化后通过电转的方式转入毕赤酵母GS115，得到GS-3GOX重组菌株。
重组菌GS-3GOX为将3GOX(3GOX为3个GOX基因表达盒依次排列组成)整合到P.pastoris GS115基因组HIS4基因的StuI位点，得到的重组菌。
以毕赤酵母GS115基因组为模板，用OST2_F引物和OST2_R引物进行PCR扩增，得到OST2扩增产物。
将上述OST2扩增产物通过同源重组的方法与pPICHA载体骨架连接，得到pPICH-OST2；
将上述pPICH-OST2质粒经过PmeI酶切后进行线性化处理，转入GS-3GOX中，得到重组菌株GS-3GOX-OST2。
重组菌GS-3GOX-OST2为将OST2基因(序列3)整合到GS-3GOX基因组AOX启动子PmeI位点中，得到的重组菌(通过菌落PCR鉴定，引物为5’AOX1和3’AOX1通用引物，大小为OST2基因长度加250bp)。
重组菌GS-3GOX-OST3、GS-3GOX-CNE1、GS-3GOX-JEM1、GS-3GOX-KAR2、GS-3GOX-SEC53和GS-3GOX-SEC61与重组菌GS-3GOX-OST2构建方法相同，不同的仅为将pPICH-OST3、pPICH-CNE1、pPICH-JEM1、pPICH-KAR2、pPICH-SEC53或pPICH-SEC61转入GS-3GOX中，得到对应的重组菌。上述各个重组菌的鉴定通过菌落PCR鉴定对应的基因。
图2为单个伴侣蛋白表达载体示意图，pPICH-chaperone代表pPICH-OST2、pPICH-OST3、pPICH-CNE1、pPICH-JEM1、pPICH-KAR2、pPICH-SEC53或pPICH-SEC61。
质粒pPICH-OST3为将OST3扩增产物(基因序列为序列4，该片段以毕赤酵母GS115基因组为模板，用OST3_F引物和OST3_R引物扩增获得)通过同源重组的方法与pPICHA载体骨架连接，得到的质粒；
质粒pPICH-SEC53为将SEC53扩增产物(基因序列为序列5，该片段以毕赤酵母GS115基因组为模板，用SEC53_F引物和SEC53_R引物扩增获得)通过同源重组的方法与pPICHA载体骨架连接，得到的质粒；
质粒pPICH-SEC61为将SEC61扩增产物(基因序列为序列6，该片段以毕赤酵母GS115基因组为模板，用SEC61_F引物和SEC61_R引物扩增获得)通过同源重组的方法与pPICHA载体骨架连接，得到的质粒。
质粒pPICH-JEM1为将JEM1扩增产物(基因序列为序列7，该片段以毕赤酵母GS115基因组为模板，用JEM1_F引物和JEM1_R引物扩增获得)通过同源重组的方法与pPICHA载体骨架连接，得到的质粒；
质粒pPICH-KAR2为将KAR2扩增产物(基因序列为序列8，该片段以毕赤酵母GS115基因组为模板，用KAR2_F引物和KAR2_R引物扩增获得)通过同源重组的方法与pPICHA载体骨架连接，得到的质粒；
质粒pPICH-CNE1为将CNE1扩增产物(基因序列为序列9，该片段以毕赤酵母GS115基因组为模板，用CNE1_F引物和CNE1_R引物扩增获得)通过同源重组的方法与pPICHA载体骨架连接，得到的质粒。
2、GOX酶活检测
以含三拷贝GOX的GS-3GOX为阴性对照，对重组菌株GS-3GOX-OST2、GS-3GOX-OST3、GS-3GOX-CNE1、GS-3GOX-JEM1、GS-3GOX-KAR2、GS-3GOX-SEC53和GS-3GOX-SEC61进行发酵评价。具体如下：
先将各个重组菌从甘油管中分别接入含有10mL新鲜YPD培养基的试管中生长48h，5000g离心5min，收集菌体；转接到含25ml BMMY培养基的250ml挡板摇瓶中培养，使初始OD约为3-4，30℃，200rpm，发酵培养96h，发酵中每12h添加一次甲醇，使体系中的甲醇浓度为0.5％(体积百分含量)。
发酵结束后，收集发酵产物，测发酵产物的OD600值，5000g离心10min取上清，作为待测样品进行GOX的酶活测定，结果如图5和表4所示。
表4为伴侣蛋白单独过表达对GOX分泌途径的影响
/>
上表中，单位菌体GOX酶活为GOX酶活除以菌体量。
从表4数据可以看出，GS-3GOX-OST2、GS-3GOX-OST3、GS-3GOX-KAR2、GS-3GOX-SEC53和GS-3GOX-CNE1的酶活浓度比对照菌株GS-3GOX分别高出了25.2％、31.6％、21.8％、21.6％和41.9％，单位菌体的酶活浓度提高了22.0％、27.6％、25.9％、14.5％和25.1％，效果一般。GS-3GOX-JEM1酶活浓度比对照菌株GS-3GOX高出了97.7％，单位菌体的酶活浓度提高了147.5％，效果最好。不过GS-3GOX-JEM1出现了生长抑制现象，发酵结束后的细胞密度与出发菌株相比有一定的差距。但是GS-3GOX-SEC61的酶活无显著变化。
实施例2、伴侣蛋白组合表达对GOX分泌途径的影响
1、重组菌的制备
根据潜在靶点基因的过表达验证结果和蛋白功能的协同作用分析，对靶点基因进行了两两组合，分别是OST2/OST3、JEM1/OST2和JEM1/KAR2，由于表达载体转入酵母之前需要线性化才能有效整合到酵母基因组中，而靶点基因组合后的表达载体将存在两个AOX启动子，即两个线性化位点，因此，需要在载体中引入一段整合序列。
本研究克隆了最常用的HIS4基因序列，通过同源重组的方法分别连接至pPICH-JEM1和pPICH-OST2表达载体的BamHI位点处得到pPICHhis-JEM1和pPICHhis-OST2表达载体。
图3为整合了HIS4基因的单个伴侣蛋白表达载体，pPICHhis-chaperone代表pPICHhis-JEM1或pPICHhis-OST2。
pPICHhis-JEM1为将HIS4基因扩增产物(基因序列为序列10，该片段以毕赤酵母GS115基因组为模板，用HIS4_F和HIS4_R为引物扩增得到)通过同源重组的方法连接至pPICH-JEM1表达载体的BamHI位点处，得到重组载体pPICHhis-JEM1；
pPICHhis-OST2为将HIS4基因扩增产物通过同源重组的方法连接至pPICH-OST2表达载体的BamHI位点处，得到重组载体pPICHhis-OST2。
根据设计好的引物JKO_F和JKO_R分别以pPICH-OST2、pPICH-OST3、pPICH-KAR2为模板进行PCR扩增，得到2300bpOST3基因表达盒、1758bp OST2基因表达盒和3328bp KAR2基因表达盒。将OST3基因表达盒通过同源重组的方法连入pPICHhis-OST2表达载体的NotI位点中，得到pPICHhis-OST2-OST3重组载体。将OST2基因表达盒和KAR2基因表达盒分别通过同源重组的方法连入pPICHhis-JEM1的NotI位点出得到pPICHhis-JEM1-OST2重组载体和pPICHhis-JEM1-KAR2重组载体。
图4为伴侣蛋白组合表达载体，pPICH-chaperone1-chaperone2代表pPICHhis-OST2-OST3、pPICHhis-JEM1-OST2重组载体或pPICHhis-JEM1-KAR2。
pPICHhis-OST2-OST3为OST3基因表达盒通过同源重组的方法插入pPICHhis-OST2表达载体的NotI位点处，得到的重组载体。
pPICHhis-JEM1-KAR2为KAR2基因表达盒通过同源重组的方法插入pPICHhis-JEM1表达载体的NotI位点处，得到的重组载体。
pPICHhis-JEM1-OST2为OST2基因表达盒通过同源重组的方法插入pPICHhis-JEM1表达载体的NotI位点处，得到的重组载体。
利用StuI将pPICHhis-OST2-OST3、pPICHhis-JEM1-KAR2和pPICHhis-JEM1-OST2表达载体进行线性化，将线性化载体电转到GS-3GOX宿主。
用OST2-F-seq引物和OST3-R-seq引物进行菌落PCR，大小为2400bp的条带即为阳性，得到重组菌株GS-3GOX-OST2-OST3，命名为K1。
用JEM1-F-seq引物和KAR2-R-seq引物进行菌落PCR，大小为2100bp的条带即为阳性，得到重组菌株GS-3GOX-JEM1-KAR2，命名为K2。
用JEM1-F-seq引物和OST2-R-seq引物进行菌落PCR，大小为1500bp的条带即为阳性，得到重组菌株GS-3GOX-JEM1-OST2，命名为K3。
2、GOX酶活性检测
以三拷贝的GS-3GOX为阴性对照，对重组菌株K1、K2和K3进行发酵评价。具体如下：
先将重组菌株从甘油管中分别接入含有10mL新鲜YPD培养基的试管中生长48h，5000g离心5min，收集菌体；转接到含25ml BMMY培养基的250ml挡板摇瓶中培养，使初始OD600约为3-4，30℃，200rpm，发酵培养96h，每12h添加一次甲醇，使体系中的甲醇浓度为0.5％(体积百分含量)。
发酵结束后，收集发酵产物，测发酵产物的OD600值，5000g离心10min取上清，作为待测样品进行GOX的酶活测定，结果如图6和表5所示。
表5为伴侣蛋白组合过表达对GOX分泌途径的影响
根据表5中数据可以看出，K2菌株分泌GOX的能力得到了明显提高，单位菌体酶活浓度较GS-3GOX提高了159.6％，比单独过表达JEM1和KAR2的作用效果更好。不过K2菌株的生长受到了较为明显的抑制，发酵结束后的细胞密度仅为GS-3GOX的三分之二，所以GOX总酶活浓度比出发菌株只提高了64.0％。K3菌株GOX总酶活浓度最高，较出发菌株提高了95.3％，单位菌体GOX酶活浓度也比出发菌株提高了139.5％，效果介于单独过表达OST2和JEM1之间。但K3的生长也受到了一定程度的抑制，细胞的最终密度与出发菌株相比有一定差距。K1菌株GOX总酶活浓度比出发菌株提高了67.7％，单位菌体酶活浓度提高了62.8％，效果优于OST2和OST3单独表达，并且没有表现出生长抑制。
Claims (9)
1.重组菌，为共表达葡萄糖氧化酶和分子伴侣的毕赤酵母；
所述分子伴侣为如下三种中任一种：OST2蛋白、OST3蛋白和JEM1蛋白，或三种中任意两种组合，或三种中任一种或任2种与其他分子伴侣蛋白组合。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：
所述分子伴侣为OST2蛋白、OST3蛋白、JEM1蛋白、OST2蛋白和OST3蛋白组合、JEM1蛋白和OST2蛋白组合或JEM1蛋白和KAR2蛋白组合。
3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：
所述葡萄糖氧化酶的编码基因为单拷贝葡萄糖氧化酶基因或多拷贝葡萄糖氧化酶基因。
4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于：
所述多拷贝葡萄糖氧化酶基因为2个或3个拷贝的葡萄糖氧化酶基因。
5.一种制备权利要求1-4任一所述重组菌的方法，包括如下步骤：
将权利要求1-4任一中的所述葡萄糖氧化酶的编码基因和所述分子伴侣的编码基因整合到毕赤酵母基因组中，得到重组菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述整合为通过载体导入所述毕赤酵母中，得到重组菌。
7.权利要求1-4任一所述重组菌在制备葡萄糖氧化酶中的应用；
或权利要求1-4任一所述重组菌在提高葡萄糖氧化酶酶活中的应用。
8.权利要求1-4任一中的分子伴侣在提高葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的表达量或酶活中的应用；
或权利要求1-4任一中的分子伴侣在作为葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中分泌表达的伴侣基因靶点中的应用。
9.一种制备葡萄糖氧化酶的方法，包括如下步骤：发酵权利要求1-4任一所述重组菌，得到葡萄糖氧化酶。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211434096.3A CN118048250A (zh) | 2022-11-16 | 2022-11-16 | 分泌表达葡萄糖氧化酶的工程菌 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211434096.3A CN118048250A (zh) | 2022-11-16 | 2022-11-16 | 分泌表达葡萄糖氧化酶的工程菌 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118048250A true CN118048250A (zh) | 2024-05-17 |
Family
ID=91045578
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211434096.3A Pending CN118048250A (zh) | 2022-11-16 | 2022-11-16 | 分泌表达葡萄糖氧化酶的工程菌 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118048250A (zh) |
-
2022
- 2022-11-16 CN CN202211434096.3A patent/CN118048250A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3805378A1 (en) | Glucose oxidase god mutant and gene and application thereof | |
| CN101348794B (zh) | 一种高活力葡萄糖氧化酶的编码基因及制备方法和应用 | |
| EP3978602A1 (en) | Thermostable glucose oxidase | |
| JP2021520836A (ja) | エタノール生産経路が抑制された耐酸性酵母及びこれを用いた乳酸の製造方法 | |
| CN101348795B (zh) | 一种葡萄糖氧化酶的编码基因及制备方法和应用 | |
| CN113186147A (zh) | 一种提高毕赤酵母工程菌生产猪肌红蛋白的发酵方法 | |
| CN114058637A (zh) | 一种黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的高效表达方法 | |
| CN112779173B (zh) | 一种高产谷胱甘肽毕赤酵母菌株g3-sf及其应用 | |
| EP0565172A1 (en) | Cloning and expression of DNA encoding a ripening form of a polypeptide having sulfhydryl oxidase activity | |
| CN115807023B (zh) | 一种提高α-乳白蛋白在酵母菌中表达的分子伴侣及其组合 | |
| CN118048250A (zh) | 分泌表达葡萄糖氧化酶的工程菌 | |
| Camattari et al. | Induction by hypoxia of heterologous-protein production with the Kl PDC1 promoter in yeasts | |
| WO2013058516A1 (en) | Recombinant vector, recombinant yeast containing the vector, and mass-producing method of glucose oxidase using the yeast | |
| JP2001321159A (ja) | 酒類製造用酵母変異株及び当該酵母変異株を用いた酒類の製造方法 | |
| JP7421801B2 (ja) | フラビン結合型グルコース脱水素酵素 | |
| JP5105691B2 (ja) | アスペルギルス属糸状菌由来の環状ヌクレオチド、アスペルギルス属糸状菌セルフクローニング株の製造方法及びセルフクローニング株 | |
| Papagianni et al. | Cloning and functional expression of the mitochondrial alternative oxidase gene (aox1) of Aspergillus niger in Lactococcus lactis and its induction by oxidizing conditions | |
| CN107460175B (zh) | 基于代谢工程优化进行葡萄糖氧化酶分泌表达的方法、重组菌及其应用 | |
| Ibragimova et al. | A strategy for construction of industrial strains of distiller's yeast | |
| Valdivieso‐Ugarte et al. | Expression of an Aspergillus niger Glucose Oxidase in Saccharomyces cerevisiae and Its Use to Optimize Fructo‐oligosaccharides Synthesis | |
| EP1728854A1 (en) | Process for the production of yeast biomass | |
| JP2003093060A (ja) | 耐酸性微生物を用いた有機酸及びアルコールの製造方法 | |
| CN114958853B (zh) | 一种来源于黑曲霉的低糖响应诱导型启动子、方法及其应用 | |
| CN112961852B (zh) | 一种启动子及其在棘孢曲霉基因自克隆表达中的应用 | |
| KR101038900B1 (ko) | 크리포넥트리아 파라시티카 유래의 신규한 프로모터 및 이의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |