CN118047853A - 识别肿瘤相关抗原的tcr分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种能够特异性结合肿瘤抗原PRAME衍生多肽SLLQHLIGL的TCR，所述多肽可以由HLA‑A02分子呈递到细胞表面。结合PRAME多肽的HLA‑A02复合物可以作为TCR的靶点，开发TCR相关的疗法。本发明还提供了编码所述TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体。另外，本发明还提供了转导本发明TCR的细胞。

Description

识别肿瘤相关抗原的TCR分子及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及能够识别源自PRAME抗原短肽的TCR及其编码序列，转导有上述TCR的T细胞，及它们在预防和治疗PRAME相关疾病中的用途。
背景技术
TCR(T cell receptor，TCR)一般以异源二聚体形式特异性表达于T细胞表面。TCR异源二聚体以非共价键形式与多个不同的CD3亚基以特定比例结合，形成TCR-CD3复合物。T细胞可以分为两类：αβT细胞和γδT细胞。相应的TCR也可以分为两类：αβTCR和γδTCR。αβTCR由α和β两条链组成，γδTCR由γ和δ两条链组成。αβTCR和γδTCR差异在于多样性的不同。αβTCR具有更多的多样性，是细胞免疫中起主要作用的分子。外周血中，90％-95％的T细胞表达αβTCR。αβTCR每条肽链又可分为可变区(V区)、恒定区(C区)、跨膜区和胞内区。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性由V区序列决定；V区(Vα、Vβ)又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3变异最大，直接决定了TCR的抗原结合特异性(Xu,X.,Li,H.&Xu,C.Structural understanding of T cell receptor triggering.Cell Mol Immunol17,193-202(2020).)。
TCR通过识别多肽和主要组织相容性抗原(MHC；Major histocompatibilitycomplex)形成的复合物而介导T细胞识别靶细胞。MHC主要分成两种类型分别是MHCⅠ和MHCⅡ，两者在结构和组织细胞表达分布上差异较大。MHCⅠ是由α链和β2-microglobulin(B2M)链组成，MHCⅡ由α链和β链组成。MHC分子在细胞内分泌运输到细胞膜的过程中负载特异性的多肽分子，从而形成多肽-MHC复合物(R.A.Mariuzza,P.Agnihotri and J.Orban.Thestructural basis of T-cell receptor(TCR)activation:An enduring enigma.J BiolChem 295(4)；914-925(2020))。在TCR识别多肽-MHC复合物时，TCR可变区CDR3直接与抗原肽相结合，决定了TCR的特异性。TCR可以开发为TCR-T细胞疗法或者双抗药物。
T细胞激活作为人体免疫保护机制的一环，在抵抗病原微生物、外源蛋白、环境有害分子入侵，以及肿瘤、增生等疾病防治中都发挥着重要的作用。T细胞表面表达用于识别短肽抗原的受体分子TCR，这些短肽抗原与主要组织相容性复合体(MHC)分子(也被称为人白细胞抗原(HLA))组合并由抗原提呈细胞(APC)进行递呈表达(Davis et al.Ligandrecognition by alpha beta T cell receptors.Annu Rev Immunol 16,523-44(1998))。CD8+T细胞也被称为细胞毒性T细胞，具有特异性识别与MHC 1类分子结合的多肽的TCR。CD8+T细胞通常负责发现和介导病变细胞的破坏，包括癌变细胞和病毒感染细胞。
TCR-T是一种过继性细胞疗法，通过筛选和鉴定能够特异性结合靶点抗原的TCR序列，然后采用基因工程手段将其转入到外周血来源的T细胞中，从而制备出可以识别特异性靶点的T细胞，称为TCR-T细胞。TCR双抗是通过分子设计将TCR和抗CD3抗体结合形成同时靶向肿瘤抗原和T细胞的双特异性抗体。目前基于TCR的疗法主要是TCR-T细胞疗法和TCR双抗药物。由于识别和作用机制的特殊性，TCR可以识别细胞内靶点，靶点选择的范围扩大了。但是可以选择的靶点仍然有限。选择合适的靶点对TCR疗法的成功至关重要。
PRAME(Protein Preferentially Expressed Antigen in Melanoma)是一种由PRAME基因编码的高表达于人黑色素肿瘤的蛋白。作为癌-睾抗原家族成员之一，PRAME在正常人体组织中仅有少量、选择性地表达，而在多种肿瘤中均有较高水平的表达，例如黑色素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌等，这些特性使得PRAME成为理想的肿瘤靶向治疗靶点。PRAME蛋白经处理后，有一段特殊的多肽序列：SLLQHLIGL，可以由HLA-A02分子呈递到细胞表面。结合PRAME多肽的HLA-A02复合物可以作为TCR的靶点，开发TCR相关的疗法。
因此，本领域急需能够识别PRAME多肽的TCR。
发明内容
本发明的目的在于提供识别肿瘤相关抗原，特别是PRAME多肽的T细胞受体。
在第一方面，本发明提供一种T细胞受体(TCR)，所述TCR能够与SLLQHLIGL多肽-HLA-A*02复合物结合。
在优选的实施方式中，所述TCR包含TCRα链可变域和TCRβ链可变域，所述TCRα链可变域的CDR1的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:12、22、32；
所述TCRα链可变域的CDR2的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:13、23、33；
所述TCRα链可变域的CDR3的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:14、24、34、42；
所述TCRβ链可变域的CDR1的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:17、27、37、45；
所述TCRβ链可变域的CDR2的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:18、28、38、46；和/或
所述TCRβ链可变域的CDR3的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:19、29、39、47。
在优选的实施方式中，所述TCRα链可变域的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列选自以下的组合：SEQ ID NO:12、13和14；SEQ ID NO:22、23和24；SEQ ID NO:32、33和34；SEQ IDNO:22、23和42；
和/或
所述TCRβ链可变域的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列选自以下的组合：SEQ IDNO:17、18和19；SEQ ID NO:27、28和29；SEQ ID NO:37、38和39；SEQ ID NO:45、46和47。
在优选的实施方式中，所述TCRα链可变域的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列和所述TCRβ链可变域的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列选自以下的组合：
SEQ ID NO:12、13和14以及SEQ ID NO:17、18和19；
SEQ ID NO:22、23和24以及SEQ ID NO:27、28和29；
SEQ ID NO:32、33和34以及SEQ ID NO:37、38和39；
SEQ ID NO:22、23和42以及SEQ ID NO:45、46和47。
在优选的实施方式中，所述TCR包含TCRα链可变域和TCRβ链可变域，所述TCRα链可变域为与SEQ ID NO:11、21、31或41具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列相同性的氨基酸序列；和/或所述TCRβ链可变域为与SEQ ID NO:16、26、36或44具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列相同性的氨基酸序列。
在优选的实施方式中，所述TCR的TCRα链可变域的氨基酸序列如SEQ ID NO:11、21、31或41所示；和/或所述TCRβ链可变域的氨基酸序列如SEQ ID NO:16、26、36或44所示。
在优选的实施方式中，所述TCR的TCRα链可变域的氨基酸序列和所述TCRβ链可变域的氨基酸序列选自以下组合：
SEQ ID NO:11和16；SEQ ID NO:21和26；SEQ ID NO:31和36；SEQ ID NO:41和44。
在优选的实施方式中，所述TCR包含TCRα链和TCRβ链，所述TCRα链为与SEQ ID NO:10、20、30或40具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列相同性的氨基酸序列；和/或所述TCRβ链可变域为与SEQ ID NO:15、25、35或43具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列相同性的氨基酸序列。
在优选的实施方式中，所述TCR的α链氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:10、20、30和40；和/或
所述TCR的β链氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:15、25、35和43。
在优选的实施方式中，所述TCR的α链氨基酸序列和β链氨基酸序列选自以下组合：SEQ ID NO:10和15；SEQ ID NO:20和25；SEQ ID NO:30和35；SEQ ID NO:40和43。
在优选的实施方式中，所述TCR是可溶的。
在优选的实施方式中，所述TCR为单链TCR。
在优选的实施方式中，所述TCR是由α链可变域与β链可变域通过肽连接序列连接而成。
在优选的实施方式中，所述TCR包含(i)TCRα链可变域和除跨膜结构域以外的全部或部分TCRα链恒定区；和(ii)TCRβ链可变域和除跨膜结构域以外的全部或部分TCRβ链恒定区。
在优选的实施方式中，所述TCR包含α链可变域和β链可变域以及除跨膜结构域以外的全部或部分β链恒定域，但其不包含α链恒定域，所述TCR的α链可变域与β链形成异质二聚体。
在优选的实施方式中，所述TCR的α链和/或β链的C-或N-末端结合有偶联物。
在优选的实施方式中，与所述T细胞受体结合的偶联物为可检测标记物、治疗剂、PK修饰部分或任何这些物质的组合；优选地，所述治疗剂为抗-CD3抗体。
在第二方面，本发明提供一种多价TCR复合物，其包含至少两个TCR分子，并且其中的至少一个TCR分子为第一方面所述的TCR。
在第三方面，本发明提供一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的TCR。
在第四方面，本发明提供一种载体，所述的载体含有第三方面所述的核酸分子；优选地，所述的载体为病毒载体；更优选地，所述的载体为慢病毒载体。
在第五方面，本发明提供一种分离的宿主细胞，所述的宿主细胞中含有第四方面所述的载体或基因组中整合有外源的第三方面所述的核酸分子。
在第六方面，本发明提供一种细胞，所述细胞在其表面表达第一方面所述的TCR。
在优选的实施方式中，所述细胞转导有第四方面所述的核酸分子或第五方面所述的载体。
在优选的实施方式中，所述细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞或干细胞。
在优选的实施方式中，所述细胞共表达CD8分子。
在优选的实施方式中，所述CD8分子是人CD8分子。
在优选的实施方式中，所述人CD8分子是人CD8a分子。
在优选的实施方式中，所述人CD8a分子具有SEQ ID NO:53所示的序列。
在第七方面，本发明提供一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及第一方面所述的TCR、第二方面所述的TCR复合物、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的载体、或第六方面所述的细胞。
在第八方面，本发明提供第一方面所述的T细胞受体、第二方面所述的TCR复合物或第六方面所述的细胞的用途，用于制备治疗肿瘤的药物。
在优选的实施方式中，所述肿瘤是PRAME相关肿瘤。
在优选的实施方式中，所述肿瘤是特异性表达完整或部分肿瘤抗原PRAME的肿瘤。
在优选的实施方式中，所述肿瘤是特异性表达SLLQHLIGL肽段的肿瘤。
在优选的实施方式中，所述肿瘤为黑色素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌。
在优选的实施方式中，所述肿瘤为非小细胞肺癌。
在第九方面，本发明提供第一方面所述的T细胞受体、第二方面所述的TCR复合物或第六方面所述的细胞，用作治疗肿瘤的药物。
在优选的实施方式中，所述肿瘤是PRAME相关肿瘤。
在优选的实施方式中，所述肿瘤是特异性表达完整或部分肿瘤抗原PRAME的肿瘤。
在优选的实施方式中，所述肿瘤是特异性表达SLLQHLIGL肽段的肿瘤。
在优选的实施方式中，所述肿瘤为黑色素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌。
在优选的实施方式中，所述肿瘤为非小细胞肺癌。
在第十方面，本发明提供一种治疗肿瘤的方法，包括给需要治疗的对象施用治疗有效量的第一方面所述的T细胞受体、第二方面所述的TCR复合物或第五方面所述的细胞、或第六方面所述的药物组合物。
在优选的实施方式中，所述肿瘤是PRAME相关肿瘤。
在优选的实施方式中，所述肿瘤是特异性表达完整或部分肿瘤抗原PRAME的肿瘤。
在优选的实施方式中，所述肿瘤是特异性表达SLLQHLIGL肽段的肿瘤。
在优选的实施方式中，所述肿瘤为黑色素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌。
在优选的实施方式中，所述肿瘤为非小细胞肺癌。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明筛选出的TCR分子在报告基因细胞表面与靶点的亲和力水平；
图2显示了负载靶多肽的T2细胞对表达本发明TCR分子报告基因细胞的激活效应；
图3显示了负载不同浓度靶多肽的T2细胞对表达本发明TCR分子报告基因细胞的激活效应；
图4显示了本发明TCR分子结合靶点的专一性；
图5显示了本发明TCR分子在原代T细胞上的表达效率；
图6显示了候选TCR-T在不同效靶比条件下对靶细胞的杀伤作用；
图7显示了靶细胞特异性激活携带本发明TCR序列的TCR-T细胞并释放细胞因子；
图8显示了候选TCR-T细胞的动物体内药效评价结果；
图9显示了不同组别T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力检测结果，其中E：effector；T：Target；
图10显示了不同组别T细胞释放细胞因子能力检测结果。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现与PRAME衍生多肽SLLQHLIGL(SEQID NO:1)能够特异性结合的TCR，所述肽段SLLQHLIGL由HLA-A02分子呈递到细胞表面。本发明还提供了编码所述TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体。另外，本发明还提供了转导本发明TCR的细胞。在此基础上完成了本发明。
术语定义
本文所用的术语具有本领域技术人员通常理解的含义。为清晰理解本发明，对一些术语定义如下。
MHC分子
MHC分子是免疫球蛋白超家族的蛋白质，可以是I类或II类MHC分子。因此，其对于抗原的呈递具有特异性，不同的个体有不同的MHC，能呈递一种蛋白抗原中不同的短肽到各自的APC细胞表面。人类的MHC通常称为HLA基因或HLA复合体。
SLLQHLIGL肽段
本发明的SLLQHLIGL肽段是衍生自肿瘤PRAME的多肽序列。所述肽段由HLA-A02分子呈递到细胞表面。因此，SLLQHLIGL多肽-HLA-A*02复合物为TCR-T免疫治疗PRAME相关肿瘤提供了理想的靶点。所述肿瘤是PRAME相关肿瘤。
在优选的实施方式中，所述肿瘤是特异性表达完整或部分肿瘤抗原PRAME的肿瘤。
T细胞受体
本文所用的T细胞受体具有本领域技术人员通常理解的含义。其是呈递在主组织相容性复合体(MHC)上的特异性抗原肽的唯一受体。在免疫系统中，通过抗原特异性的TCR与pMHC复合物的结合引发T细胞与抗原呈递细胞(APC)直接的物理接触，然后T细胞及APC两者的其他细胞膜表面分子就发生相互作用，这就引起了一系列后续的细胞信号传递和其他生理反应，从而使得不同抗原特异性的T细胞对其靶细胞发挥免疫效应。
TCR是由α链/β链或者γ链/δ链以异质二聚体形式存在的细胞膜表面的糖蛋白。在95％的T细胞中TCR异质二聚体由α和β链组成，而5％的T细胞具有由γ和δ链组成的TCR。天然αβ异质二聚TCR具有α链和β链，α链和β链构成αβ异源二聚TCR的亚单位。广义上讲，α和β各链包含可变区、连接区和恒定区，β链通常还在可变区和连接区之间含有短的多变区，但该多变区常视作连接区的一部分。各可变区包含嵌合在框架结构(framework regions)中的3个CDR(互补决定区)，CDR1、CDR2和CDR3。CDR区决定了TCR与pMHC复合物的结合，其中CDR3由可变区和连接区重组而成，被称为超变区。TCR的α和β链一般看作各有两个“结构域”即可变域和恒定域，可变域由连接的可变区和连接区构成。TCR恒定域的序列可以在国际免疫遗传学信息系统(IMGT)的公开数据库中找到，如TCR分子α链的恒定域序列为“TRAC*01”，TCR分子β链的恒定域序列为“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。此外，TCR的α和β链还包含跨膜区和胞质区，胞质区很短。
在本发明中，术语“本发明多肽”、“本发明的TCR”、“本发明的T细胞受体”可互换使用。
在抗原加工过程中，抗原在细胞内被降解，然后通过MHC分子携带至细胞表面。T细胞受体能够识别抗原呈递细胞表面的肽-MHC复合物。因此，本发明的提供了一种能够结合SLLQHLIGL多肽-HLA-A*02复合物的TCR分子。优选地，所述TCR分子是分离的或纯化的。该TCR的α和β链各具有3个互补决定区(CDR)。
在本发明的优选地实施方式中，所述TCRα链可变域的CDR1的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:12、22、32；所述TCRα链可变域的CDR2的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:13、23、33；所述TCRα链可变域的CDR3的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:14、24、34、42；所述TCRβ链可变域的CDR1的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:17、27、37、45；所述TCRβ链可变域的CDR2的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:18、28、38、46；和/或所述TCRβ链可变域的CDR3的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:19、29、39、47。
可以将上述本发明的CDR区氨基酸序列嵌入到任何适合的框架结构中来制备嵌合TCR。只要框架结构与本发明的TCR的CDR区兼容，本领域技术人员根据本发明公开的CDR区就能够设计或合成出具有相应功能的TCR分子。因此，本发明TCR分子是指包含上述α和/或β链CDR区序列及任何适合的框架结构的TCR分子。本发明TCRα链可变域为与SEQ ID NO:11、21、31或41具有至少90％，优选地95％，更优选地98％序列相同性的氨基酸序列；和/或本发明TCRβ链可变域为与SEQ ID NO:16、26、36或44具有至少90％，优选地95％，更优选地98％序列相同性的氨基酸序列。
在本发明的优选例中，本发明的TCR分子是由α与β链构成的异质二聚体。具体地，一方面所述异质二聚TCR分子的α链包含可变域和恒定域，所述α链可变域氨基酸序列包含上述α链的CDR1、CDR2和CDR3。优选地，所述TCR分子包含α链可变域氨基酸序列SEQ ID NO:11、21、31或41。另一方面，所述异质二聚TCR分子的β链包含可变域和恒定域，所述β链可变域氨基酸序列包含上述β链的CDR1、CDR2和CDR3。优选地，所述TCR分子包含β链可变域氨基酸序列SEQ ID NO:16、26、36或44。
在本发明的优选实施方式中，本发明的TCR分子是由α链的部分或全部和/或β链的部分或全部组成的单链TCR分子。有关单链TCR分子的描述可以参考文献Chung et al(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,12654-12658。根据文献中所述，本领域技术人员能够容易地构建包含本发明CDRs区的单链TCR分子。具体地，所述单链TCR分子包含Vα、Vβ和Cβ，优选地按照从N端到C端的顺序连接。
所述单链TCR分子的α链可变域氨基酸序列包含上述α链的CDR1、CDR2和CDR3。优选地，所述单链TCR分子包含α链可变域氨基酸序列SEQ ID NO:11、21、31或41。所述单链TCR分子的β链可变域氨基酸序列包含上述β链的CDR1、CDR2和CDR3。优选地，所述单链TCR分子包含β链可变域氨基酸序列SEQ ID NO:16、26、36或44。
在本发明的优选实施方式中，本发明的TCR分子的恒定域是人的恒定域。本领域技术人员知晓或可以通过查阅相关书籍或IMGT(国际免疫遗传学信息系统)的公开数据库来获得人的恒定域氨基酸序列。例如，本发明TCR分子α链的恒定域序列可以为“TRAC*01”，TCR分子β链的恒定域序列可以为“TRBC1*01”或“TRBC2*01”。IMGT的TRAC*01中给出的氨基酸序列的第53位为Arg，在此表示为：TRAC*01外显子1的Arg53，其他以此类推。优选地，本发明TCR分子α链的氨基酸序列为SEQ ID NO:10、20、30和40，和/或β链的氨基酸序列为SEQ IDNO:15、25、35和43。
天然存在的TCR是一种膜蛋白，通过其跨膜区得以稳定。如同免疫球蛋白(抗体)作为抗原识别分子一样，TCR也可以被开发应用于诊断和治疗，这时需要获得可溶性的TCR分子。可溶性的TCR分子不包括其跨膜区。可溶性TCR有很广泛的用途，它不仅可用于研究TCR与pMHC的相互作用，也可用作检测感染的诊断工具或作为自身免疫病的标志物。类似地，可溶性TCR可以被用来将治疗剂(如细胞毒素化合物或免疫刺激性化合物)输送到呈递特异性抗原的细胞，另外，可溶性TCR还可与其他分子(如，抗-CD3抗体)结合来重新定向T细胞，从而使其靶向呈递特定抗原的细胞。本发明的TCR分子都为可溶性的，从而为TCR-T细胞疗法或TCR类蛋白药物的开发提供更多的选择性。
为获得可溶性TCR，可去除TCR的跨膜区。优选地，这样的TCR可以包含(i)除其跨膜结构域以外的全部或部分TCRα链，和(ii)除其跨膜结构域以外的全部或部分TCRβ链，其中(i)和(ii)均包含TCR链的可变域和至少一部分恒定域，α链与β链形成异质二聚体。更优选地，这样的TCR可以包含α链可变域和β链可变域以及除跨膜结构域以外的全部或部分β链恒定域，但其不包含α链恒定域，所述TCR的α链可变域与β链形成异质二聚体。
本发明的TCR可以是由一柔性肽链连接TCR的α与β链的可变域而构成的稳定性可溶单链TCR。应注意，本发明中柔性肽链可以是任何适合连接TCRα与β链可变域的肽链。
本发明的TCR也可以多价复合体的形式提供。本发明的多价TCR复合体包含两个、三个、四个或更多个本发明TCR相结合而形成的多聚物，如可以用p53的四聚结构域来产生四聚体，或多个本发明TCR与另一分子结合而形成的复合物。本发明的TCR复合物可用于体外或体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞，也可用于产生具有此类应用的其他多价TCR复合物的中间体。
本发明的TCR可以单独使用，也可与偶联物以共价或其他方式结合，优选以共价方式结合。所述偶联物包括可检测标记物(为诊断目的，其中所述TCR用于检测呈递GLSPTVWLSV多肽-HLA-A*02复合物的细胞的存在)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明TCR结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素(Koppe等，2005，Cancer metastasis reviews 24，539)；2.生物毒素(Chaudhary等，1989，Nature339，394；Epel等，2002，Cancer Immunology and Immunotherapy 51，565)；3.细胞因子，如IL-2等(Gillies等，1992，PNAS 89，1428；Card等，2004，Cancer Immunology andImmunotherapy 53，345；Halin等，2003，Cancer Research 63，3202)；4.抗体Fc片段(Mosquera等，2005，The Journal Of Immunology 174，4381)；5.抗体scFv片段(Zhu等，1995，International Journal of Cancer 62,319)；6.金纳米颗粒/纳米棒(Lapotko等，2005，Cancer letters 239，36；Huang等，2006，Journal of the American ChemicalSociety 128，2115)；7.病毒颗粒(Peng等，2004，Gene therapy11，1234)；8.脂质体(Mamot等，2005，Cancer research 65，11631)；9.纳米磁粒；10.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；11.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
另外，本发明的TCR还可以是包含衍生自超过一种物种序列的杂合TCR。例如，有研究显示鼠科TCR在人T细胞中比人TCR能够更有效地表达。因此，本发明TCR可包含人可变域和鼠的恒定域。这一方法的缺陷是可能引发免疫应答。因此，在其用于过继性T细胞治疗时应当有调节方案来进行免疫抑制，以允许表达鼠科的T细胞的植入。
应理解，本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母或三英文字母表示，氨基酸名称的单英文字母与三英文字母的对应关系如下：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。
免疫偶联物
本文所用的术语“免疫偶联物”具有本领域技术人员通常理解的含义。该术语是指包括不同的部分(通常是蛋白质)，经由化学手段偶联得到并且具有免疫学效应的人工合成的分子。
核酸分子
本发明提供了编码本发明TCR或其部分的核酸分子，所述部分可以是一个或多个CDR，α和/或β链的可变域，以及α链和/或β链。
本发明的核酸分子的核苷酸序列可以是单链或双链的，该核酸分子可以是RNA或DNA，并且可以包含或不包含内含子。优选地，本发明核酸分子的核苷酸序列不包含内含子但能够编码本发明多肽。
应理解，由于遗传密码的简并，不同的核苷酸序列可以编码相同的多肽。因此，编码本发明TCR的核酸序列可以与本发明所示的核酸序列相同或是简并的变异体。
核苷酸序列可以经密码子优化。不同的细胞在具体密码子的利用上是不同的，可以根据细胞的类型，改变序列中的密码子来增加表达量。哺乳动物细胞以及多种其他生物的密码子选择表是本领域技术人员公知的。
本发明的核酸分子全长序列或其片段通常可以用但不限于PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明TCR(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。DNA可以是编码链或非编码链。
载体
本发明还涉及包含本发明的核酸分子的载体，包括表达载体，即能够在体内或体外表达的构建体。常用的载体包括细菌质粒、噬菌体和动植物病毒。
病毒递送系统包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体。
优选地，载体可以将本发明的核苷酸转移至细胞中，例如T细胞中，使得该细胞表达HBV抗原特异性的TCR。理想的情况下，该载体应当能够在T细胞中持续高水平地表达。
细胞
本发明还涉及用本发明的载体或编码序列经基因工程产生的宿主细胞。所述宿主细胞中含有本发明的载体或染色体中整合有本发明的核酸分子。宿主细胞选自：原核细胞和真核细胞，例如大肠杆菌、酵母细胞、CHO细胞等。
另外，本发明还包括表达本发明的TCR的分离的细胞，可以但不仅限为T细胞、NK细胞、NKT细胞、干细胞，特别是T细胞。该T细胞可衍生自从受试者分离的T细胞，或者可以是从受试者中分离的混合细胞群，诸如外周血淋巴细胞(PBL)群的一部分。如，该细胞可以分离自外周血单核细胞(PBMC)，可以是CD4+辅助T细胞或CD8+细胞毒性T细胞。该细胞可在CD4+辅助T细胞/CD8+细胞毒性T细胞的混合群中。一般地，该细胞可以用抗体(如，抗-CD3或抗-CD28的抗体)活化，以便使它们能够更容易接受转染，例如用包含编码本发明TCR分子的核苷酸序列的载体进行转染。
备选地，本发明的细胞还可以是或衍生自干细胞，如造血干细胞(HSC)。将基因转移至HSC不会导致在细胞表面表达TCR，因为干细胞表面不表达CD3分子。然而，当干细胞分化为迁移至胸腺的淋巴前体(lymphoid precursor)时，CD3分子的表达将启动在胸腺细胞的表面表达该引入的TCR分子。
有许多方法适合于用编码本发明TCR的DNA或RNA进行T细胞转染(如，Robbins等.，(2008)J.Immunol.180:6116-6131)。表达本发明TCR的T细胞可以用于过继免疫治疗。本领域技术人员能够知晓进行过继性治疗的许多合适方法(如，Rosenberg等.，(2008)Nat RevCancer8(4):299-308)。
为提高本发明TCR分子在CD4阳性T细胞中的生物活性，表达本发明TCR的细胞可以进一步共表达CD8分子，例如人CD8分子，优选人CD8a分子。
治疗方法
可以通过分离感染HBV病毒诱发的HCC或慢性肝炎的病人或志愿者的T细胞，并将本发明的TCR导入上述T细胞中，随后将这些基因工程修饰的细胞回输到病人体内来进行治疗。因此，本发明提供了一种治疗HBV相关疾病的方法，包括将分离的表达本发明TCR的T细胞，优选地，该T细胞来源于病人本身，输入到病人体内。一般地，包括(1)分离病人的T细胞，(2)用本发明核酸分子或能够编码本发明TCR分子的核酸分子体外转导T细胞，(3)将基因工程修饰的T细胞输入到病人体内。分离、转染及回输的细胞的数量可以由医师决定。
本发明的优点：
(1)本发明的TCR能够与GLSPTVWLSV肽段和HLA-A*02组成的复合物特异性结合，同时转导了本发明TCR的效应细胞能够被特异性激活；
(2)转导了本发明TCR的效应细胞能够特异性杀伤GLSPTVWLSV肽段阳性靶细胞；
(3)经靶细胞刺激后，转导了本发明TCR的效应细胞能够大量分泌细胞因子；和
(4)本发明提供了与靶点pMHC复合物具有不同水平亲和活性的TCR分子，且都为可溶性的，可为TCR-T细胞疗法或TCR类蛋白药物的开发提供更多的选择性。
下面的具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook和Russell等.,(分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning-A LaboratoryManual)(第三版)(2001)CSHL出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例：
实施例一：获取候选TCR分子
1.1抗原特异性T细胞激活
通过体外激活健康供体PBMCs(Peripheral blood mononuclear cells，妙顺(上海)生物科技有限公司)或者使用多肽免疫的方法或者使用负载多肽的DCs免疫的方法激活外周血T细胞，然后使用带有荧光标签的多聚体(Tetramer等)对T细胞进行染色，并使用流式细胞仪分选能被多聚体染色的T细胞。这群T细胞可能是被抗原特异性激活的T细胞。本研究使用的多肽序列为：SLLQHLIGL(SEQ ID NO:1)。本实施例使用的多肽序列来源于PRAME蛋白。
1.2TCR序列获取
参考已发表文献(Paria BC,Levin N,Lowery FJ,et al.Rapid Identificationand Evaluation of Neoantigen-reactive T-Cell Receptors From SingleCells.Journal of Immunotherapy(Hagerstown,Md.:1997).2021Jan；44(1):1-8.Pai,J.A.,Satpathy,A.T.High-throughput and single-cell T cell receptor sequencingtechnologies.Nat Methods 18,881-892(2021).De Simone M,Rossetti G and Pagani M(2018)Single Cell T Cell Receptor Sequencing:Techniques and FutureChallenges.Front.Immunol.9:1638.doi:10.3389/fimmu.2018.01638)进行TCR的筛选和克隆。筛选得到的TCR克隆，分别命名为：TCR-01、TCR-02、TCR-03和TCR-04。TCR可变区全长氨基酸序列见表1。通过IMGT网站分析TCR的可变区亚型以及CDR区序列，获取不同TCR的CDR1区、CDR2区和CDR3区的序列(氨基酸序列见表1)。
表1.氨基酸序列表
实施例二：候选TCR分子表达情况和生物学功能评价
2.1 TCR基因载体构建
将实施例一克隆到的TCR alpha和TCR beta基因可变区序列分别连接小鼠TCRalpha和TCR beta的恒定区构建TCR alpha和TCR beta全长序列。
然后通过2A片段将配对的TCR alpha和TCR beta全长序列连接后构建到慢病毒载体中，进行慢病毒包装。慢病毒经高速离心浓缩后放置于-80冰箱保存。实验基本步骤如下：
1)第一天，接种HEK-293T细胞(购自中国科学院细胞库)：按照约1.0×10^7个/T175瓶(30mL培养基培养)接种细胞，使其第二天细胞密度达到80-90％时可转染。
2)第二天，质粒转染：转染前培养基需换成有10％ FBS但无双抗的DMEM培养基。首先分别准备质粒复合物：将以下质粒加入到1.5ml Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific；31985-070)内并混匀：18μg的psPAX2质粒(Addgene；货号：12260)，9μg的pMD2.G质粒(Addgene；货号：12259)，18μg的病毒载体质粒。将携带TCR-01、TCR-02、TCR-03和TCR-04基因的慢病毒载体质粒，分别命名为：lenti-TCR-01、lenti-TCR-02、lenti-TCR-03和lenti-TCR-04。再准备转染试剂复合物：按照质粒与PEI质量比1:3，将45μL(3mg/mL)PEI(polysciences：24765)加入到1.5mL Opti-MEM内混匀，室温静置5min；再将转染试剂复合物逐滴加入到质粒复合物中，混匀后静置20min。最后将转染复合物缓慢滴入到293T细胞培养瓶中，轻轻混匀，置于37℃含5％ CO2的细胞培养箱中培养。
3)第五天，收病毒：转染72h收取培养基上清，2000rpm离心10min去除细胞碎片。使用0.45μM滤膜过滤上清，滤液转移到专用离心管中配平。使用超速离心机25000rpm超速离心2h。倒掉上清后，使用X-VIVO-15培养基重悬慢病毒，并将慢病毒分装后保存在-80℃超低温冰箱中。按照该流程分别制备含有TCR-01、TCR-02、TCR-03和TCR-04基因的慢病毒。
2.2TCR-报告基因细胞系制备。
本研究使用的报告基因细胞系为敲除内源TCRα和β基因，携带NFAT启动子和荧光素酶基因，以及表达CD8a和CD8b基因的Jurkat细胞，命名为Jurkat-TCRKO-031(Smith-Garvin J.E.et al.,2009.T Cell Activation.Ann.Rev.Immunol.27:591-619)。将携带有候选TCR基因的慢病毒分别加入到报告基因细胞中。2-3天以后，通过多聚体染色和流式细胞术检测TCR的表达情况。基本步骤如下：
1)合成HLA-A2限制性PRAME靶点多肽(南京金斯瑞生物科技有限公司，SEQ IDNo.:1)，按照试剂盒(Immudex，货号：U-LX02)说明书先制备PE荧光素耦联的MHCⅠ-peptide复合物多聚体Dextramer，用于检测特异性识别靶点多肽的TCR；
2)取生长至对数期的Jurkat-TCRKO-031细胞，按照5×105/孔的密度接种到6孔板中，每孔补足培养基体积至2mL；
3)取100μL包装好的慢病毒液，逐滴加入孔板中，轻轻摇晃使病毒液与培养基充分混匀；
4)将孔板置于37℃，5％CO2培养箱培养48h，将分别转染TCR-01、TCR-02、TCR-03和TCR-04基因的工具细胞分别命名为：TCR-P1、TCR-P2、TCR-P3和TCR-P4；NTD组为未转染细胞，作为阴性对照细胞；
5)48h后，取出200μL细胞悬液，离心收集细胞，用FACS buffer(含2％FBS的PBS)清洗细胞一次；
6)分别用100μL FACS buffer重悬细胞，每管加入1μL APC anti-huam CD3和2μL上述制备的Dextramer，混合均匀后置于4℃孵育30分钟；
7)孵育完成后，用FACS buffer清洗细胞2次，离心收集细胞；
8)用100μL FACS buffer重悬细胞，流式上机检测CD3和Dextramer阳性细胞群体比例，流式检测结果如图1所示。
结果表明，本发明筛选出的4个TCR序列可以通过慢病毒转染的方式整合到细胞基因组并表达于细胞表面，且转染阳性率较高；Dextramer染色结果表明，4个TCR分子均能与Dextramer结合，其中TCR-P1和TCR-P2的结合水平较高，(>50％)；而TCR-P3和TCR-P4仅有微弱的结合。
2.3T细胞激活效应评价
使用T2细胞作为靶细胞，负载不同浓度多肽，激活reporter细胞，计算EC50数值。基本步骤如下：
1)取生长至对数期的T2细胞，用完全培养基重悬至2×106/mL；
2)使用完全培养基稀释靶点多肽至60μM，将稀释的多肽溶液与细胞悬液按1：1的体积比混合均匀，置于37℃培养箱孵育1-2小时，使多肽装载到T2细胞表面；
3)孵育完成后，用培养基清洗掉多余的多肽，离心收集细胞，用培养基重悬细胞至2×105/mL，按照50μL/孔将负载不同浓度多肽的T2细胞接种到96孔白色不透明细胞培养板中；
4)取实施例二中制备的表达本发明TCR分子的TCR-P1、TCR-P2、TCR-P3和TCR-P4细胞，以及阴性对照细胞NTD组，用完全培养基将细胞密度调整至1×106/mL，按照50μL/孔加入到96孔板中，置于微孔板振荡器混合均匀后，将细胞转移至37℃培养箱孵育4-6小时；
5)孵育结束后，将D-luciferin反应底物(购自赛默飞，货号L2912)按100μL/孔加入到培养板中，室温避光反应10分钟并后，使用酶标仪(Thermo Fisher Scientific，Varioskan.LUX)检测荧光信号值(RLU)，结果如图2所示。
结果表明，表达本发明所示4个TCR分子的Jurkat-TCRKO-031细胞均能被负载靶点多肽的T2细胞激活并表达荧光素信号，其中TCR-P1和TCR-P2激活效应较高，与阳性对照水平相当，显示出较好的生物学活性；TCR-P3和TCR-P4分子激活水平较低，仅表达微弱的荧光信号。
2.4候选TCR分子的生物活性评价
为了更全面的评价候选TCR分子的生物学活性，本实施例使用负载不同浓度多肽的T2细胞作为靶细胞，激活Reporter细胞，拟合剂量曲线，计算EC50数值。基本步骤如下：
1)取生长至对数期的T2细胞，用完全培养基重悬至2×106/mL，将细胞悬液按照100μL/孔接种至96孔U底深孔板中；
2)使用完全培养基稀释靶点多肽，起始浓度50μM，4倍梯度至10个浓度点，将稀释的多肽溶液按照100μL/孔对应地加入到步骤1的细胞中，混合均匀，置于37℃培养箱孵育1-2小时，使多肽装载到T2细胞表面；
3)孵育完成后，用培养基清洗掉多余的多肽，离心收集细胞，每孔添加0.9mL培养基重悬细胞，按照50μL/孔将负载不同浓度多肽的T2细胞接种到96孔白色不透明细胞培养板中；
4)取实施例二中制备的表达本发明TCR分子的TCR-P1、TCR-P2、TCR-P3和TCR-P4细胞，用完全培养基将细胞密度调整至1×106/mL，按照50μL/孔加入到96孔板中(以未转染的Jurkat-TCRKO-031细胞作为阴性对照)，置于微孔板振荡器混合均匀后，将细胞转移至37℃培养箱孵育4-6小时；
5)孵育结束后，将D-luciferin底物(购自赛默飞，货号L2912)按100μL/孔加入到培养板中，室温避光反应10分钟并后，使用酶标仪(Thermo Fisher Scientific，Varioskan.LUX)检测荧光信号值(RLU)；
6)使用Graphpad Prism软件进行数据分析，拟合剂量依赖曲线，计算EC50值，结果如图3所示。
结果表明，表达本发明所示4个TCR分子的报告基因细胞均能被负载靶点多肽的T2细胞激活并表达荧光素信号，其中TCR-P1和TCR-P2激活信号较高，EC50值分别为0.02409和0.02163μM，且呈现明显的剂量依赖效应，显示出较好的生物学活性；TCR-P3和TCR-P4的激活信号较弱，且没有剂量依赖性，推测是由其分子亲和力低下导致。
实施例三：候选TCR分子脱靶效应分析
参考实施例2.4实验步骤，使用序列相似的多肽(南京金斯瑞生物科技有限公司，SEQ ID No.:2-9)作为潜在的脱靶多肽，以负载不同脱靶多肽的T2细胞作为靶细胞。多肽序列见表2。表达本专利所述TCR分子的Jurkat-TCRKO-031作为效应细胞，共培养后检测荧光素酶活性。基本步骤如下：
1)分别用DMSO溶解脱靶多肽至10mM的储存液，取3μL多肽储存液加到1mL完全培养基(含10％FBS的RPMI 1640培养基)中，使其工作浓度为30μM；
2)取生长状态良好的T2细胞，离心收集细胞，分别用上述含不同多肽的培养基重悬细胞至1×106/mL的密度，将细胞悬液置于细胞培养箱孵育1小时；
3)取实施例一中制备的表达候选TCR的Jurkat-TCRKO-031细胞，用培养基重悬至1×106/mL，按照50μL/孔将细胞悬液加到96孔白色不透明细胞培养板(购自Thermo，货号136101)中；
4)将负载好多肽的T2细胞用培养基清洗2次，按照2×105/mL的密度重悬细胞，将负载不同多肽的T2细胞按50μL/孔加到对应的孔中，以不负载多肽的T2细胞作为阴性对照，负载PRAME靶点多肽的T2细胞作为阳性对照；
5)将孔板置于微孔板振荡器振荡10分钟混匀细胞，取下孔板置于培养箱孵育4-6小时；
6)孵育结束后，将D-luciferin底物(购自赛默飞，货号L2912)按100μL/孔加入到培养板中，室温避光反应10分钟并后，使用酶标仪(Thermo Fisher Scientific，Varioskan.LUX)检测荧光信号值(RLU)；
7)使用Graphpad Prism软件进行数据分析，结果如图4所示。
结果表明，4个候选TCR分子均显示出较好的专一性和安全性，仅能被呈递靶多肽的T2细胞特异性激活，而不能识别8个脱靶多肽，具有进一步开发的价值。
表2.本发明使用的脱靶分析多肽序列表：
序号 多肽名称 多肽序列
1 Target SLLQHLIGL
2 OTP-01 LLLAHIIAL
3 OTP-02 ALMYHTITL
4 OTP-03 FLPIHLLGL
5 OTP-04 YLDGHLITT
6 OTP-05 ILAMHLIDV
7 OTP-06 KLYQHEINL
8 OTP-07 SLADRLIGV
9 OTP-08 SLLGHVIRL
实施例四：候选TCR分子在人原代T细胞中的功能评价
4.1 TCR-T细胞制备
将实施例二中制备的携带候选TCR基因的慢病毒液分别感染原代人T细胞，制备携带不同TCR基因的TCR-T细胞。将携带4种TCR克隆型T基因的TCR-T细胞分别命名为：TCR-T-01、TCR-T-02、TCR-T-03和TCR-T-04。使用抗小鼠恒定区的抗体检测TCR基因的表达。具体步骤如下：
1)复苏健康人外周血来源的CD3+T细胞(妙顺(上海)生物科技有限公司生物)，用含300IU/mL IL-2的T细胞培养基重悬细胞，使其密度为1×106/mL，按照细胞与磁珠1：1的比例添加T细胞激活剂CD3/CD28磁珠(购自ACROBiosystems，货号：MBS-C001)，充分混匀后，将细胞接种在6孔板中进行培养；
2)培养48小时后，吸出细胞，用磁性吸附的方式去除磁珠，离心收集细胞；
3)用新鲜的培养基重悬细胞并接种到新的6孔板中，每孔接种5×105细胞，加入100μL携带不同TCR基因的慢病毒液，不加病毒液的T细胞作为阴性对照NTD，将细胞置于培养箱继续培养5天；
4)取100μL细胞悬液，离心收集细胞，用100μL FACS buffer重悬细胞，每管细胞分别加入1μL APC anti-mouse TCRβ(Biolegend，货号：109212)抗体，混合均匀，4℃孵育30分钟；
5)清洗细胞2次，用100μL FACS buffer重悬细胞，流式检测TCR在T细胞上的表达效率。
结果表明，本发明所述4个TCR分子均能成功在T细胞上表达，表达阳性率为40-80％(图5)。本发明制备的TCR-T细胞可以用于后续的生物学功能评价。
4.2细胞杀伤检测
本发明制备的TCR-T细胞可以特异性识别并杀伤靶细胞，本实验采用4种HLA-A2及PRAME靶点表达双阳性细胞系作为靶细胞，分别为非小细胞肺癌NCI-H1755、卵巢癌OVCAR-3、黑色素瘤HS695T和骨肉瘤U2OS细胞系；分别采用PRAME阴性、HLA-A2阳性的MCF-7细胞，以及PRAME及HLA-A2表达阴性的A549细胞作为阴性细胞，将上述实施例制备的TCR-T细胞分别与靶细胞进行共培养检测杀伤效应，评估TCR-T的生物学功能。具体步骤如下：
1)按照实施例2.1的方法制备表达GFP荧光素酶的慢病毒液，并用慢病毒液转染不同靶细胞，得到标记有荧光素酶的细胞系，标记为：NCI-H1755-GFP、OVCAR-3-GFP、HS695T-GFP、U2OS-GFP、MCF-7-GFP和A549-GFP；
2)用培养基将不同肿瘤细胞系重悬至2×105/mL，按照50μL/孔分别将肿瘤细胞接种至96孔平底不透明细胞培养板中，暂时放置于37℃孵育；
3)用NTD细胞调整4种TCR-T细胞的阳性比率至40％，用培养基分别将4种TCR-T重悬至3×106/mL、1×106/mL和2×105/mL 3个不同的细胞密度(效靶比分别为15:1、5:1和1:1)，以NTD细胞作为阴性对照，分别按照50μL/孔将上述不同密度的效应细胞接种至96孔培养板中，充分混匀后，放置于37℃培养箱孵育24小时；
4)取出共培养后的不透明96孔平底板，向孔中加入100μL的等体积D-luciferin底物(Thermo Fisher Scientific：88293)混匀避光反应10分钟，在酶标仪用化学发光模式检测荧光强度。由于荧光素酶仅在靶细胞中表达，孔中的剩余荧光素酶活性与活靶细胞的数量直接相关，将培养基加入靶细胞来获得最大荧光素酶活性作为对照，通过扣除活细胞荧光信号值来计算靶细胞凋亡比率，即为TCR-T细胞对靶细胞的杀伤效应，结果如图6所示(图6A：NCI-H1755-GFP；图6B：OVCAR-3-GFP；图6C：HS695T-GFP；图6D：U2OS-GFP；图6E：MCF-7-GFP；图6F：A549-GFP；)。
结果表明，本发明所述4个TCR分子均能介导T细胞杀伤3种靶点阳性的细胞，其中对NCI-H1755细胞杀伤效果最强。
4.3细胞因子分泌检测
为了进一步评价靶细胞特异性激活功能，本实施例将候选TCR-T细胞与靶点表达阳性及阴性的靶细胞分别按1:1的效靶比共培养24小时后，检测培养上清中T细胞分泌IFN-γ细胞因子的水平。具体步骤如下：
1)取实施例4.2中使用的肿瘤细胞以及HepG2细胞(靶点表达阴性)和T2细胞，用完全培养基重悬至2×106/mL，将细胞悬液按照50μL/孔接种至96孔U底深孔板中；
2)取实施例4.1中制备的4种TCR-T细胞(以未转染的NTD细胞作为阴性对照)，用NTD细胞将转染阳性率调整至40％左右，用完全培养基将细胞密度调整至2×106/mL，按照50μL/孔加入到96孔板中，置于微孔板振荡器混合均匀后，将细胞转移至37℃培养箱孵育24小时；
3)孵育结束后，收集50μL培养上清，转移至新的U底96孔板，使用ELISA试剂盒(Thermo Fisher Scientific；货号88-7316)检测T细胞中IFN-γ细胞因子的分泌情况，平板制备和上清细胞因子的检测按照试剂盒提供的说明书进行；
结果表明(图7)，候选TCR-T细胞均能有效识别靶点表达阳性的肿瘤细胞，激活TCR-T细胞并传导免疫信号，分泌IFN-γ细胞因子，其中TCR-T-01分子生物活性相对更好。
综合以上结果来看，本发明所述的TCR序列具有较好的亲和活性和生物学功能，其中TCR-01分子和TCR-02分子的抗原结合活性、生物学功能以及专一性等方面均展现出更高的潜力，提示其具有进一步开发应用的价值。
实施例五：动物体内药效评价
在本实施例中，进一步对TCR分子TCR-P1和TCR-P2进行小鼠体内药效评价。参考实施例四制备两种TCR-T细胞：TCR-T-01和TCR-T-02。未进行慢病毒转染的T细胞作为对照T细胞(NTD，no transduction)。在常规培养条件下扩增培养人黑色素瘤A375肿瘤细胞系(ATCC；货号CRL-1619)，至少传代3次后收获对数生长期的细胞。离心收集肿瘤细胞后，以1xPBS重悬至2.5×107个/mL，按照1:1比例加入基质胶。取30只雌性全免疫缺陷NOG小鼠(维通利华有限公司)。在无菌条件，所有动物右后背皮下接种A375肿瘤细胞悬液0.2mL(5x 106肿瘤细胞)。接种肿瘤细胞后7天，使用尺子测量肿瘤大小，当肿瘤达到100mm3时，将小鼠随机分组。
本试验中，将小鼠随机分为4组：缓冲液组、未转染对照T细胞组(NTD)、TCR-T-01组、TCR-T-02组，每组5只小鼠。将制备好的不同组别的T细胞以1800rpm条件下离心5min。使用1x PBS缓冲液重悬细胞后，调整供试品细胞密度。供试品各组动物给予1×107个总T细胞/只(约5×106个转染TCR阳性细胞)，通过调整给药容量进行进行尾静脉注射给药。回输T细胞后，当天对实验组小鼠进行腹腔注射IL-2细胞因子溶液(20万IU/小鼠)。每周两次用游标卡尺测量肿瘤直径，对小鼠肿瘤大小进行测量和评估，持续观察30天，并同时观察小鼠的饮食和活动情况等健康指标。实验结束后使用肿瘤体积作为纵坐标，天数作为横坐标进行作图。
研究发现，TCR-T-01组和TCR-T-02组都可以消除肿瘤并抑制肿瘤的生长。从第20天开始，TCR-T-02组的肿瘤开始重新长大。但TCR-T-01组长期很好的控制肿瘤的生长(见图8)，显示出良好的抗肿瘤效果。因此，TCR-T-01细胞和TCR-T-02细胞都表现出很好的体内动物药效。TCR-T-01细胞完全消除了小鼠体内的肿瘤细胞，并且很好的控制了肿瘤的复发，因此该分子TCR-P1可以作为候选分子进行进一步的开发。
实施例六：TCR分子结构的优化
本研究发现的TCR分子都为CD8依赖性，需要在CD8分子的辅助下才能够较好的识别HLA-A分子。因此，在CD4阳性T细胞中，本研究发现的TCR分子不能很好的识HLA-A分子。CD4阳性T细胞在激活以后可以大量释放细胞因子，提高CD8阳性T细胞的活性。为了提高本发明TCR分子在CD4阳性T细胞中的生物活性，本研究将实施例TCR分子(TCR01，将其信号肽替换为人信号肽，粗体显示)和人CD8a分子(Uniprot：P01732)连接后共表达。连接CD8a分子后的TCR命名为：TCR-P1-CD8，氨基酸序列见表3。
表3.TCR-P1-CD8分子氨基酸序列
参考实施例四，制备共表达CD8的T细胞，命名为TCR-T-01CD8。参考实施例四设计实验组别：未转染对照组(NTD)、TCR-T-01和TCR-T-01CD8三组T细胞。本研究参考实施例四，分别评价三种T细胞对靶细胞OVCAR3(中国科学院细胞库)的细胞杀伤能力和细胞因子IFN-gamma释放能力。细胞杀伤能力检测结果见图9。细胞因子释放能力检测结果见图10。
结果表明：共表达CD8的TCR-T细胞TCR-T-01CD8表现出比无CD8表达的TCR-T-01细胞更好的杀伤能力(图9)。同时共表达CD8a的TCR-T细胞释放更多的IFN-gamma细胞因子(图10)。以上结果提示共表达CD8的TCR-T细胞具有更好的生物活性。共表达CD8的TCR可作为候选分子进行后续进一步开发。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (32)

1.一种T细胞受体(TCR)，所述TCR能够与SLLQHLIGL多肽-HLA-A*02复合物结合。
2.如权利要求1所述的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述TCR包含TCRα链可变域和TCRβ链可变域，
所述TCRα链可变域的CDR1的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:12、22、32；
所述TCRα链可变域的CDR2的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:13、23、33；
所述TCRα链可变域的CDR3的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:14、24、34、42；
所述TCRβ链可变域的CDR1的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:17、27、37、45；
所述TCRβ链可变域的CDR2的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:18、28、38、46；和/或
所述TCRβ链可变域的CDR3的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:19、29、39、47。
3.如权利要求2所述的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述TCRα链可变域的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列选自以下的组合：SEQ ID NO:12、13和14；SEQ ID NO:22、23和24；SEQID NO:32、33和34；SEQ ID NO:22、23和42；
和/或
所述TCRβ链可变域的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列选自以下的组合：SEQ ID NO:17、18和19；SEQ ID NO:27、28和29；SEQ ID NO:37、38和39；SEQ ID NO:45、46和47。
4.如权利要求3所述的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述TCRα链可变域的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列和所述TCRβ链可变域的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列选自以下的组合：
SEQ ID NO:12、13和14以及SEQ ID NO:17、18和19；
SEQ ID NO:22、23和24以及SEQ ID NO:27、28和29；
SEQ ID NO:32、33和34以及SEQ ID NO:37、38和39；
SEQ ID NO:22、23和42以及SEQ ID NO:45、46和47。
5.如权利要求1所述的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述TCR包含TCRα链可变域和TCRβ链可变域，所述TCRα链可变域为与SEQ ID NO:11、21、31或41具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列相同性的氨基酸序列；和/或所述TCRβ链可变域为与SEQ ID NO:16、26、36或44具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列相同性的氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述TCR的TCRα链可变域的氨基酸序列如SEQ ID NO:11、21、31或41所示；和/或所述TCRβ链可变域的氨基酸序列如SEQ IDNO:16、26、36或44所示。
7.如权利要求6所述的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述TCR的TCRα链可变域的氨基酸序列和所述TCRβ链可变域的氨基酸序列选自以下组合：
SEQ ID NO:11和16；SEQ ID NO:21和26；SEQ ID NO:31和36；SEQ ID NO:41和44。
8.如权利要求1所述的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述TCR包含TCRα链和TCRβ链，所述TCRα链为与SEQ ID NO:10、20、30或40具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列相同性的氨基酸序列；和/或所述TCRβ链可变域为与SEQ IDNO:15、25、35或43具有至少90％(例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列相同性的氨基酸序列。
9.如权利要求8所述的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述TCR的α链氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:10、20、30和40；和/或
所述TCR的β链氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:15、25、35和43。
10.如权利要求9所述的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述TCR的α链氨基酸序列和β链氨基酸序列选自以下组合：SEQ ID NO:10和15；SEQ ID NO:20和25；SEQ ID NO:30和35；SEQID NO:40和43。
11.如权利要求1所述的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述TCR是可溶的。
12.如权利要求1所述的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述TCR为单链TCR。
13.如权利要求1所述的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述TCR是由α链可变域与β链可变域通过肽连接序列连接而成。
14.如权利要求1所述的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述TCR包含(i)TCRα链可变域和除跨膜结构域以外的全部或部分TCRα链恒定区；和(ii)TCRβ链可变域和除跨膜结构域以外的全部或部分TCRβ链恒定区。
15.如权利要求1所述的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述TCR包含α链可变域和β链可变域以及除跨膜结构域以外的全部或部分β链恒定域，但其不包含α链恒定域，所述TCR的α链可变域与β链形成异质二聚体。
16.如权利要求1所述的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述TCR的α链和/或β链的C-或N-末端结合有偶联物。
17.如权利要求16所述的T细胞受体(TCR)，其特征在于，与所述T细胞受体结合的偶联物为可检测标记物、治疗剂、PK修饰部分或任何这些物质的组合；优选地，所述治疗剂为抗-CD3抗体。
18.一种多价TCR复合物，其包含至少两个TCR分子，并且其中的至少一个TCR分子为权利要求1-17中任一项所述的TCR。
19.一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1-17中任一项所述的TCR。
20.一种载体，所述的载体含有权利要求19所述的核酸分子；优选地，所述的载体为病毒载体；更优选地，所述的载体为慢病毒载体。
21.一种分离的宿主细胞，所述的宿主细胞中含有权利要求20所述的载体或基因组中整合有外源的权利要求19所述的核酸分子。
22.一种细胞，所述细胞在其表面表达权利要求1-19中任一项所述的TCR。
23.一种如权利要求22所述的细胞，其特征在于，所述细胞转导有权利要求19所述的核酸分子或权利要求20所述的载体。
24.如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞或干细胞。
25.如权利要求24所述的细胞，其特征在于，所述细胞共表达CD8分子；优选人CD8分子；更优选人CD8a分子，例如具有SEQ ID NO:53所示序列的人CD8a分子。
26.一种药物组合物，所述组合物含有药学上可接受的载体以及权利要求1-17中任一项所述的TCR、权利要求18所述的TCR复合物、权利要求19所述的核酸分子、权利要求20所述的载体、或权利要求23-25中任一项所述的细胞。
27.权利要求1-17中任一项所述的T细胞受体、权利要求18所述的TCR复合物、权利要求23-25中任一项所述的细胞的用途，用于制备治疗肿瘤的药物。
28.如权利要求27所述的用途，其特征在于，所述肿瘤是PRAME相关肿瘤。
29.如权利要求28所述的用途，其特征在于，所述肿瘤是特异性表达完整或部分肿瘤抗原PRAME的肿瘤。
30.如权利要求29所述的用途，其特征在于，所述肿瘤是特异性表达SLLQHLIGL肽段的肿瘤。
31.如权利要求30所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为黑色素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌。
32.如权利要求31所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为非小细胞肺癌。
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